CN117511978B - 一种提高外源蛋白表达量的方法 - Google Patents
一种提高外源蛋白表达量的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117511978B CN117511978B CN202410025519.9A CN202410025519A CN117511978B CN 117511978 B CN117511978 B CN 117511978B CN 202410025519 A CN202410025519 A CN 202410025519A CN 117511978 B CN117511978 B CN 117511978B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- expression
- pichia pastoris
- ypd
- exogenous
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 43
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 32
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims abstract description 24
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 claims abstract description 16
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 11
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 11
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 3
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 claims description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 13
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 7
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 238000010446 CRISPR interference Methods 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical group 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 108020005087 unfolded proteins Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/84—Pichia
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种提高外源蛋白表达量的方法，属于生物技术领域，本发明在目的蛋白的N端引入两个组氨酸，使得蛋白的表达量得到了显著提高；相比于其它技术，本发明方法操作更简便，并且维持了外源蛋白的理化性质如蛋白质的高级结构和生物活性。本发明还提供了高表达的重组胶原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1或2所示。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种提高外源蛋白表达量的方法。
背景技术
外源蛋白表达面临表达量低、纯度低和功能性差等问题。在真核生物中，过表达外源蛋白可能造成内质网内聚集大量的未折叠蛋白，超越内质网的加工能力，导致蛋白容易发生错误折叠，从而限制其高水平表达。
目前提高蛋白质表达量的宏观方法包括有改造分泌信号肽、启动子工程、提高胞内拷贝数、共表达分子伴侣等，微观方法包括有CRISPRi干扰技术等。
在真核系统中，重组蛋白从转录到翻译的调控较为复杂，而通过优化mRNA二级结构带来翻译效率的提升是一种优化微生物表达蛋白的策略。
发明内容
目前最为有效的方法是通过翻译暂停技术达到减缓蛋白质翻译速率，从而提升表达量的方法，本发明旨在通过引入少量的碱基找到适合目的蛋白的N端的前导肽，起到与翻译暂停技术相类似的效果。
本发明的技术原理：首先，将重组蛋白N端前多个碱基序列转换为RNA序列作为输入信号，使用Mfold软件进行RNA二级结构预测，然后在蛋白序列的N端引入不同种类及个数的的氨基酸，发明人发现引入两个组氨酸能够增强RNA二级结构稳定性，起到减缓蛋白质翻译速率的作用，从而使得肽链能够更好地折叠形成目的蛋白，后面通过SDS-PAGE实验也证实了该方法能够提高外源蛋白在毕赤酵母中产量。
本发明的第一目的在于提供一种提高外源蛋白表达量的方法，在编码外源蛋白的核苷酸序列的5’端添加编码连续两个组氨酸的核苷酸进行表达，即在外源蛋白的N端引入了两个组氨酸。
优选地，所述的表达是在毕赤酵母中表达。
优选地，所述的外源蛋白为胶原蛋白；更优选地，所述的外源蛋白为重组胶原蛋白。
优选地，包括以下步骤：
i）将目的片段通过克隆组装至载体质粒上，转化至大肠杆菌中扩增，抽提质粒；
ii）用快切酶对质粒进行线性化，电转化至毕赤酵母，使用YPD抗性平板进行初筛和复筛；
iii）将转化子挑取至BMGY培养基中，培养后离心弃上清；使用BMMY培养基将菌体重悬，诱导培养；培养液经分离纯化得到目的蛋白。
更优选地，所述的载体质粒为pPICZαA，所述的大肠杆菌为大肠杆菌JM109，所述的快切酶为酶SacI，所述的毕赤酵母为毕赤酵母GS115。
更优选地，使用YPD抗性平板进行初筛和复筛是指使用100μg/mL的YPD抗性平板进行初步筛选，800μg/mL的YPD抗性平板进行复筛。
更优选地，所述的诱导培养是使用1%的甲醇，每24小时补加一次，共计诱导培养96小时。
本发明第二个目的是提供高表达的重组胶原蛋白，其氨基酸序列与SEQ ID No.1或2所示的氨基酸序列有90%以上同源性。
优选地，其氨基酸序列如SEQ ID No.1或2所示。
关于氨基酸序列同源性，一方面是基于保守氨基酸取代，这种保守性使得某氨基酸被结构相似的氨基酸取代而不会对所得变体多肽的性质产生大的影响，例如是被具有相似侧链的氨基酸残基取代。另一方面，本发明考虑到在SEQ ID No.1或SEQ ID No.2基础上增添一段或多段冗余序列，而这种改变未带来生物活性明显增加的现象，即原来的生物活性片段不会因为冗余序列的介入而更好地发挥生物功能。
本发明提供了编码所述的高表达的重组胶原蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列与SEQ ID No.3或SEQ ID No.4的核苷酸序列有80%以上同源性；优选地，所述基因的核苷酸序列与SEQ ID No.3或SEQ ID No.4的核苷酸序列有90%以上同源性；最优选地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。
关于核苷酸序列同源性，一方面是由于存在密码子的简并性，导致编码蛋白的核苷酸序列并不唯一，因此能够编码产生如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列，均在本发明的保护范围内。另一方面，如前述的氨基酸序列同源性，相应地编码与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2具有同源性90%的氨基酸序列的核苷酸序列，也落在本发明的保护范围内。
本发明的第三个目的是提供两个组氨酸组成的标签在促进外源蛋白表达中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过在目的蛋白的N端引入两个组氨酸，使得蛋白的表达量得到了显著提高，实验结果显示提高了5倍以上；相比于其它技术，本发明方法操作更简便，并且维持了外源蛋白的理化性质如蛋白质的高级结构和生物活性。
附图说明
图1为填加组氨酸前，重组胶原蛋白N端二级结构的预测。
图2为填加组氨酸后，重组胶原蛋白N端二级结构的预测。
图3为重组胶原蛋白S9在N端添加标签前后的SDS-PAGE对比图，其中泳道S9-1为重组胶原蛋白S9，泳道HH-S9-1为N端添加两个组氨酸的重组胶原蛋白S9，泳道M（Marker）为分子量标记。
图4为重组胶原蛋白S10在N端添加标签前后的SDS-PAGE对比图，其中泳道S10-1和S10-2为重组胶原蛋白S10，泳道HH-S10-1、HH-S10-2为N端添加两个组氨酸的重组胶原蛋白S10，泳道M（Marker）为分子量标记。
图5为重组胶原蛋白S9在N端添加标签后的圆二色谱（CD）图。
具体实施方式
在本发明中，所述基因可以通过生物技术公司合成获得。本发明对所述分离纯化的方法没有特殊限定，采用本领域常规的蛋白分离纯化方法即可。优选的技术方案参见实施例记载。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1 对目的蛋白进行N端二级结构的预测
本实施例提供的外源蛋白为重组胶原蛋白S9，其氨基酸序列具体如下：
GEPGPRGERGPPGPPGPPGPAGKDGRPGERGFPGMKGHRGFDGRNGEKGLPGENGAPGERGPPGPPGINGSPGGKGPRGQPGVMGFPGPKGDKGDTGPPGPQGKPGEPGPKGAPGERGAPGLRGGAGPPGPEGGKGAAGPPGPPGMPGERGDKGEPGGPGADGDKGEGGAPGLPGERGETGPPGPAGFPGAPGEGGPPGVAGPPGGSGPAGPPGPQGVKGGPGAAGFPGARGLSGERGGKGDRGENGSPGAPGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGIKGHRGFPGNPGAP。
将重组蛋白N端前24个碱基序列转置为RNA序列作为输入信号，使用Mfold软件进行二级结构预测，以可视化形式导出（图1）。发明人在对N端序列长度和N端具体碱基序列的筛选中，发现在N端引入两个组氨酸形成HH-S9进行结构预测，其RNA二级结构具有稳定性（图2），推测该密码子是适合在毕赤酵母菌株中表达的，并且在后来实验中证实了有提高外源蛋白产量的作用。
实施例2 本发明HH-S9的SDS-PAGE验证实验
本实施例使用的重组胶原蛋白HH-S9，其氨基酸序列具体如下：
HHGEPGPRGERGPPGPPGPPGPAGKDGRPGERGFPGMKGHRGFDGRNGEKGLPGENGAPGERGPPGPPGINGSPGGKGPRGQPGVMGFPGPKGDKGDTGPPGPQGKPGEPGPKGAPGERGAPGLRGGAGPPGPEGGKGAAGPPGPPGMPGERGDKGEPGGPGADGDKGEGGAPGLPGERGETGPPGPAGFPGAPGEGGPPGVAGPPGGSGPAGPPGPQGVKGGPGAAGFPGARGLSGERGGKGDRGENGSPGAPGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGPQGPRGDKGIKGHRGFPGNPGAP（SEQ ID No.1）。
首先，由金斯瑞生物科技股份有限公司合成编码HH-S9的核酸片段（SEQ IDNo.3）。将目的片段通过一步克隆组装至载体质粒pPICZαA上，转化至大肠杆菌JM109中，扩增，抽提质粒。
用快切酶SacI对质粒进行线性化，电转化至GS115，使用100ug/mL的YPD抗性平板进行初步筛选，800ug/mL的YPD抗性平板进行复筛。
将阳性转化子挑取至BMGY培养基中，30℃培养至OD600大于15，离心弃上清；使用BMMY培养基将菌体重悬，然后诱导培养：使用1%的甲醇，每24小时补加一次，共计诱导96小时后结束培养。
分离纯化：
将菌液进行12000 g离心，弃菌体，上清用0.22 μm的膜进行过滤，随后使用5kDa孔径的透析袋进行透析，透析缓冲液为20mM， pH5.0的PB 缓冲液。每12h换一次透析缓冲液，共计透析36h。
接着用层析柱HiTrap SP HP 5ml（Cytiva）进行洗脱，设置参数如下：
样品环境：20mM PB pH5.0；
缓冲液A（平衡液）：20mM PB pH5.0，
缓冲液B（洗脱液）：20mM PB pH5.0，1M NaCl；
实验流速：4ml/min；
梯度洗脱：直接用100%缓冲液B洗脱，收集220nm处的洗脱峰， 15CV体积。
SDS-PAGE分析纯化后蛋白纯度及表达量，并以N端未添加标签的重组蛋白作为对照，结果如图3所示，可见在重组蛋白S9的N端添加两个组氨酸提高外源蛋白产量的作用，并且提高了5倍以上。将蛋白进行浓缩或冻干保存。
实施例3 本发明HH-S10的SDS-PAGE验证实验
为验证本发明方法的通用性，本实施例使用另一重组蛋白HH-S10（是指S10的N端添加两个组氨酸）进行实验，其氨基酸序列具体如下：
HHGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRDGERGAPGPAGPRGAAGEPGRD（SEQ ID No.2）。
合成编码HH-S10的核酸片段如SEQ ID No.4所示。实验方法及过程参考实施例2。
SDS-PAGE结果如图4所示，可见在重组蛋白S10的N端添加两个组氨酸提高外源蛋白产量的作用，并且提高了5倍以上。
实施例4 本发明HH-S9的SDS-PAGE验证实验
本发明对胶原蛋白的结构表征是采用本领域常用的圆二色谱法(circulardichroism，CD)，CD是用于测定具有手性结构、能产生左右旋光差异性吸收的化合物结构，主要用于测定分子结构不对称性的光谱学方法。一般生物大分子中均含有手性的基团和结构，因而CD常用来测量和观察生物大分子的结构和构象的变化。胶原蛋白三螺旋结构的CD特征一般是在225 nm附近有一个正吸收峰，在197 nm附近有一个负吸收峰，吸收峰的位置随着氨基酸序列和长度的变化会发生偏移。
将实施例2制备得到的重组胶原蛋白HH-S9冻干粉末溶解在的PB缓冲液中进行CD检测。结果如图5所示，实施例2中制备的重组胶原蛋白HH-S9在约221nm处具有最大特征正峰，小于200nm处出现负峰，根据已知的胶原蛋白三螺旋结构的圆二色谱特征，判断添加标签的重组胶原蛋白样品仍具有三螺旋结构。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1. 一种提高外源蛋白表达量的方法，其特征在于，是在编码外源蛋白的核苷酸序列的5’端添加编码两个组氨酸的核苷酸进行表达，所述的表达是在毕赤酵母中表达，所述的外源蛋白为胶原蛋白。
2. 根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
i）将目的基因通过克隆组装至载体质粒上，转化至大肠杆菌中扩增，抽提质粒；
ii）用快切酶对质粒进行线性化，电转化至毕赤酵母，使用 YPD 抗性平板进行初筛和复筛；
iii）将转化子挑取至 BMGY 培养基中，培养后离心弃上清；使用 BMMY 培养基将菌体重悬，诱导培养；培养液经分离纯化得到目的蛋白。
3. 根据权利要求 2 所述的方法，其特征在于，所述的载体质粒为 pPICZαA，所述的大肠杆菌为大肠杆菌 JM109，所述的快切酶为酶 SacI，所述的毕赤酵母为毕赤酵母 GS115。
4. 根据权利要求 2 所述的方法，其特征在于，使用 YPD 抗性平板进行初筛和复筛是指使用100μg/mL 的 YPD 抗性平板进行初步筛选，800μg/mL 的 YPD 抗性平板进行复筛。
5. 根据权利要求 2 所述的方法，其特征在于，所述的诱导培养是使用 1%的甲醇，每24 小时补加一次，共计诱导培养 96 小时。
6. 两个组氨酸组成的标签在促进外源蛋白表达中的应用，其特征在于， 所述的表达是在毕赤酵母中表达，所述的外源蛋白为胶原蛋白。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410025519.9A CN117511978B (zh) | 2024-01-08 | 2024-01-08 | 一种提高外源蛋白表达量的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410025519.9A CN117511978B (zh) | 2024-01-08 | 2024-01-08 | 一种提高外源蛋白表达量的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117511978A CN117511978A (zh) | 2024-02-06 |
| CN117511978B true CN117511978B (zh) | 2024-03-22 |
Family
ID=89742473
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410025519.9A Active CN117511978B (zh) | 2024-01-08 | 2024-01-08 | 一种提高外源蛋白表达量的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117511978B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2002254426A1 (en) * | 2001-03-28 | 2002-10-15 | General Hospital Corporation | Methods of delivery of exogenous proteins to the cytosol and uses thereof |
| CN102732548A (zh) * | 2012-05-16 | 2012-10-17 | 中国农业大学 | 一种表达蛇毒激肽原酶的高效麦胚无细胞蛋白合成系统的建立及应用 |
| CN105063138A (zh) * | 2015-09-14 | 2015-11-18 | 河南省科学院生物研究所有限责任公司 | 一种利用毕赤酵母表达系统生产云芝免疫调节蛋白的方法 |
| WO2023221787A1 (zh) * | 2022-05-19 | 2023-11-23 | 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 | 重组i型胶原蛋白毕赤酵母工程菌及其构建方法与应用 |
| CN117187287A (zh) * | 2023-02-27 | 2023-12-08 | 广东筑美生物医疗科技有限公司 | 一种改造表达人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的序列的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110603046B (zh) * | 2016-03-20 | 2022-10-18 | 宾夕法尼亚州立大学托管会 | 用于提高高等植物叶绿体中转基因表达的密码子优化和核糖体图谱分析 |
-
2024
- 2024-01-08 CN CN202410025519.9A patent/CN117511978B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2002254426A1 (en) * | 2001-03-28 | 2002-10-15 | General Hospital Corporation | Methods of delivery of exogenous proteins to the cytosol and uses thereof |
| CN102732548A (zh) * | 2012-05-16 | 2012-10-17 | 中国农业大学 | 一种表达蛇毒激肽原酶的高效麦胚无细胞蛋白合成系统的建立及应用 |
| CN105063138A (zh) * | 2015-09-14 | 2015-11-18 | 河南省科学院生物研究所有限责任公司 | 一种利用毕赤酵母表达系统生产云芝免疫调节蛋白的方法 |
| WO2023221787A1 (zh) * | 2022-05-19 | 2023-11-23 | 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 | 重组i型胶原蛋白毕赤酵母工程菌及其构建方法与应用 |
| CN117187287A (zh) * | 2023-02-27 | 2023-12-08 | 广东筑美生物医疗科技有限公司 | 一种改造表达人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的序列的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Effect of N-terminal solubility enhancing fusion proteins on yield of purified target protein;Martin Hammarstrom et al.;《Journal of Structural and Functional Genomics》;20061231;第1-14页 * |
| Impact of an N‑terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability;William T. Booth et al.;《ACS Omega》;20180122;第760-768页 * |
| 影响外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中表达和分泌的研究进展;张丞斌 等;《现代生物医学进展》;20081231;第8卷(第7期);第1382-1384页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117511978A (zh) | 2024-02-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI81379C (fi) | Anvaendning av kluyveromyces-jaest saosom vaerd foer transformering och uttryckning av fraemmande gener. | |
| CA2235468C (en) | Chaperone expression plasmids | |
| WO2006069403B1 (en) | Methods for producing soluble multi-membrane-spanning proteins | |
| JP2003501035A (ja) | 安定性に関して改変されたサイトカイン | |
| JP5860413B2 (ja) | タンパク質のグリコシル化を低下させる方法、その産生方法およびタンパク質 | |
| CN111218477B (zh) | 靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体及其应用 | |
| EP0641861B1 (en) | Process for producing hydrophobic polypeptides, proteins or peptides | |
| KR20140135959A (ko) | 온-컬럼 효소적 절단 | |
| JP2003504069A (ja) | ヒト顆粒球コロニー刺激因子修飾体およびその生産方法 | |
| CN117511978B (zh) | 一种提高外源蛋白表达量的方法 | |
| CN112608933B (zh) | 一种重组蓝铜肽前体-寡肽的高纯度制备方法 | |
| US20180127837A1 (en) | Construction and application of one innovative expression vector for virus-like particles | |
| CN115873837A (zh) | 高表达的新型的苯丙氨酸解氨酶 | |
| CN116041451B (zh) | 一种内含肽变体及其在生物法制备蓝铜胜肽中的应用 | |
| CN116425853B (zh) | 一种改造体抗菌肽及其应用 | |
| CN104136459A (zh) | 减少1-＞2读框移位的方法 | |
| CN110951634B (zh) | 大黄鱼il-4/13a基因毕赤酵母表达产物制备方法及其应用 | |
| CN104136460A (zh) | 减少1->3读框移位的方法 | |
| JP6801675B2 (ja) | 形質転換体、およびトランスフェリンの製造方法 | |
| JP2662044B2 (ja) | Ｄｎａ配列、発現ベクターおよびポリペプチドの周辺質生産方法 | |
| WO2019187691A1 (ja) | コラゲナーゼ活性を有するポリペプチド及びその製造方法 | |
| WO2017170418A1 (ja) | エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド及びその製造方法 | |
| CN115838437A (zh) | 人NT-proBNP融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN117720668A (zh) | 制备人前白蛋白的方法 | |
| CN117886907A (zh) | 一种pht纳米孔突变体蛋白及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |