CN117187287A - 一种改造表达人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的序列的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改造表达人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的序列的方法，该方法的特点在于，通过对所选的人源Ⅲ型胶原蛋白α1链片段序列的第10～16位氨基酸之后，将其Gly‑X‑Y甘氨酸三肽中的第二位或第三位氨基酸突变为脯氨酸(Pro)或酪氨酸(Tyr)，能够显著减少蛋白酶对胶原蛋白产物的降解，经巴斯德毕赤酵母X33(Pichia pastorisX33)分泌表达生产出的胶原蛋白分子量较高。其中第三位的氨基酸突变为脯氨酸或酪氨酸后抵抗蛋白酶降解的能力比第二位氨基酸突变后更强。
Description
技术领域
本发明涉及人源Ⅲ型胶原蛋白的改造方法技术领域，尤其涉及一种改造表达人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的序列的方法。
背景技术
胶原蛋白(Collagen)是一类细胞外基质蛋白，在哺乳动物体内的含量最多，一般达到蛋白质总量的25％～30％。胶原蛋白是结缔组织的主要蛋白成份，也存在于几乎所有实质器官的间质组织中，在维持细胞结构的完整性和各种生理功能方面扮演着重要角色。胶原蛋白一直以来广泛应用在医药、美容、保健和食品等领域。胶原蛋白具有良好的可生物降解、生物吸收性、极低的抗原性，同时还具有止血功能和促进细胞生长的功能。这些优良特性使胶原蛋白受到越来越多研究者的关注。迄今已在人体中发现二十多种不同类型的胶原蛋白，几乎所有的胶原蛋白都是含有重复的甘氨酸三肽(即Gly-X-Y)结构域，这些结构域是胶原蛋白形成三螺旋结构的基础。
根据胶原蛋白形成的结构可将其分为多个种类，它们分别被命名为I型胶原，II型胶原……XX，VII，XIX，XXI型等胶原蛋白。其中III型胶原蛋白是一种成纤维胶原，在血管中的含量很高，一方面它能增强血管的强度与弹性，另一方面它提供细胞充足的营养。III型胶原蛋白还能直接与血管母细胞结合，经过生长过程形成新血管。III型胶原蛋白进入人体后，能迅速被人体吸收，补充皮肤中随着年龄的增加而逐渐流失的胶原蛋白，从而使得皮肤具有弹性，保持水分充足并且能够明显减少皮肤的鱼尾纹与抬头纹。目前，III型胶原蛋白已广泛应用于整容手术中的皮肤填充剂，以治疗皱纹和皮肤老化，还可作为烧伤患者的康复辅助工具，也能用于骨骼重建以及各种牙科、整形外科和外科手术以达到人工修复效果。除此之外III型胶原蛋白的独特性质如渗透性、亲水性，以及在体内的稳定引导和趋化功能，使其在骨移植、组织再生、伤口愈合和其他临床治疗方面的应用也具备显著的优势。III型胶原蛋白甚至可以用做食品添加剂，主要可用做肉制品改良剂、饮料酒类等食品澄清剂以及乳制品添加剂等，此类添加剂具有显著延缓食品老化时间且增加食物松软度、提升口感等作用。
一直以来工业化生产的胶原蛋白主要是通过化学和生物酶法来提取动物皮肤和骨骼中的胶原蛋白，即主要来源为动物结缔组织。然而从动物组织中提取的胶原蛋白存在产率和纯度太低、造成环境污染以及动物源疾病等风险，并且大规模的胶原蛋白制备会对供给侧的动物饲养造成挤兑。随着近年来基因工程技术的飞速发展，基因工程重组表达胶原蛋白技术成为了制备和生产胶原蛋白的主要方式，也成功地解决了胶原蛋白大规模制备的瓶颈。胶原蛋白基因可以来源于任何哺乳动物，经过改造后可以在模式生物如大肠杆菌、酵母和动物细胞中表达，再经过高密度发酵后获得产品。重组胶原蛋白具有人胶原相同的特性，同时也有效避免了动物源疾病。同时生产周期短，节约成本，可以快速放大，适于工业化大规模生产。近年来国内外对重组胶原蛋白有大量报道，其中具有代表性的工作有西北大学范代娣教授利用大肠杆菌及巴斯德毕赤酵母X33(Pichia pastoris X33)生产类人源胶原蛋白，同时胞内高表达脯氨酸羟化酶，使重组胶原蛋白的产量稳定在20g/L以上(专利：CN1196712C；CN114539389B；CN 103725622A；CN 103725623A等)。由于巴斯德毕赤酵母X33(Pichia pastoris X33)表达的胶原蛋白分子量较大，会对巴斯德毕赤酵母X33(Pichiapastoris X33)表达系统造成一定的表达负担，且重组胶原蛋白序列中存在多个蛋白酶降解位点，因而最终获得的长链胶原蛋白会被降解，发酵生产过程中亟需解决蛋白降解问题。有研究报道在诱导表达过程中添加酪蛋白氨基酸15g/L，可竞争性地减少重组胶原蛋白的降解(专利CN 202111190388.2)；
另外还有专利报道的方法，即在甲醇诱导84h后，向发酵罐中一次性添加0.2～0.5ML赖氨酸或0.3LML精氨酸能有效防止目的产物被蛋白酶降解(专利CN201810049618.5)。这种额外添加氨基酸的方法虽然一定程度上能够阻止胶原蛋白的降解，但外加氨基酸会提高生产成本，同时也增加了产物纯化的难度。本发明提供一种简单有效的巴斯德毕赤酵母X33(Pichia pastoris X33)分泌表达重组人源Ⅲ型胶原蛋白α1链方法，该方法能够显著减少蛋白酶对胶原蛋白产物的降解，经巴斯德毕赤酵母X33(Pichiapastoris X33)分泌表达生产出的胶原蛋白分子量较高。
发明内容
本发明主要以巴斯德毕赤酵母X33(Pichia pastoris X33)为表达宿主，分泌表达人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的一段改造序列，该改造序列有以下特征：在该段序列的第10～16位氨基酸之后，将其Gly-X-Y甘氨酸三肽中的第二位或第三位氨基酸突变为脯氨酸(Pro)或酪氨酸(Tyr)，其中第三位的氨基酸突变为脯氨酸或酪氨酸后抵抗蛋白酶降解的能力比第二位氨基酸突变后更强。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种改造表达人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的序列的方法，包括以下步骤：
S1、选择合适的宿主菌以及合适的胶原蛋白基因片段；
S2、通过PCR技术对基因片段COL3A2和COL3A2M进行克隆；
S3、制备Pichia pastoris X33感受态细胞；
进一步地，所述宿主菌优选为巴斯德毕赤酵母X33(Pichia pastoris X33)，所述胶原蛋白基因片段COL3A优选自人源Ⅲ型胶原蛋白αⅠ链(NCBI序列号：NM_000090.4)，来源于人源C端的部分连续基因，其序列位于人源Ⅲ型胶原蛋白α1链基因序列的第2701至3420位核苷酸，将此段序列去掉N段36个核苷酸后重复连接在第一段序列之后，形成胶原蛋白基因片段COL3A2。
进一步地，所述序列经巴斯德毕赤酵母X33(Pichia pastoris X33)编好密码子优化后进行合成，对应基因序列为SEQ ID NO.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。将第26～97位的Gly-X-Y甘氨酸三肽中的第二位或第三位氨基酸突变为脯氨酸(Pro)或酪氨酸(Tyr)，获得氨基酸序列SEQ ID NO:3所示，形成的胶原蛋白基因片段命名为COL3A2M，其对应的基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
进一步地，步骤S2中克隆方面包括：
S2-1、通过PCR技术并用引物pPICZαA-F/R(SEQ ID NO:6)将巴斯德毕赤酵母X33(Pichia pastoris X33)表达载体pPICZαA进行扩增获得载体连接片段，将克隆得到的基因片段COL3A2和COL3A2M，以及pPICZαA载体片段分别按照浓度比3:1混合；
S2-2、使用Gibson Assembly无缝连接技术将两个片段在载体pPICZαA的EcoRI位点进行连接，依次连接构建重组质粒pPICZαA-A2和pPICZαA-A2M；
S2-3、反应条件为：50℃水浴或金属浴孵育30分钟后冰上冷却；然后采用42℃热激法转化大肠杆菌T1感受态细胞，经过过夜培养后挑取在含卡纳霉素平板上生长的阳性克隆，将克隆接种在3mL试管中30℃，220rpm过夜，提取质粒后送测序公司测序验证重组基因是否与设计一致。
进一步地，步骤S3中感受态细胞制备包括：
S3-1、将1μg线性化的质粒pPICZαA-A2和pPICZαA-A2M与Pichia pastoris X33感受态细胞以总体积100μL混匀，电击转化使重组质粒进入感受态细胞中；
S3-2、转化后的菌株置于30℃恒温培养箱倒置培养2～4天，直至有单菌落出现，挑取单菌落提取基因组进行PCR并送测序公司测序验证；
S3-3、对验证正确的重组子进行加压筛选，即接种后48h在100μg/mL～1mg/mL的G418浓度范围内进行筛选，将能长出克隆的重组菌株挑出保种；
S3-4、挑取经过验证的重组单菌落加入到5mL YPD液体培养基中，30℃，200rpm培养过夜进行活化；
S3-5、以1％的接种量接种于100mL的BMGY液体培养基，30℃，200rpm培养至OD600＝3.0～6.0；25℃离心6min收集菌体，并将其悬浮于200mL的BMMY液体培养基中，使其起始浓度为OD600＝1.0，在30℃，200rpm条件下培养，每隔24h加终浓度为0.5～1.0％的甲醇进行诱导表达；
S3-6、诱导72h之后取培养液在12000rpm条件下离心2min，取上清液通过SDS-PAGE实验验证蛋白表达情况。
相比现有技术，本发明的有益效果为：
本发明提供一种简单有效获得巴斯德毕赤酵母X33(Pichia pastoris X33)分泌表达重组人源Ⅲ型胶原蛋白α1链方法，该方法的特点在于，通过对所选的人源Ⅲ型胶原蛋白α1链片段序列的第10～16位氨基酸之后，将其Gly-X-Y甘氨酸三肽中的第二位或第三位氨基酸突变为脯氨酸(Pro)或酪氨酸(Tyr)，能够显著减少蛋白酶对胶原蛋白产物的降解，经巴斯德毕赤酵母X33(Pichia pastoris X33)分泌表达生产出的胶原蛋白分子量较高。其中第三位的氨基酸突变为脯氨酸或酪氨酸后抵抗蛋白酶降解的能力比第二位氨基酸突变后更强。
附图说明
图1为本发明提出的重组质粒pPICZαA-A2和pPICZαA-A2M构建示意图；
图2为本发明提出的胶原蛋白电泳结果.M,marker；1-3,COL3A2；4-5,COL3A2M示意图
图3为本发明提出的胶原蛋白电泳结果.M,marker；1-3,COL3A2；2-3,COL3A2M-2；5,COL3A2M示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
如图1-3所示，本发明所述宿主菌优选为巴斯德毕赤酵母X33(Pichia pastorisX33)，胶原蛋白基因片段COL3A优选自人源Ⅲ型胶原蛋白αⅠ链(NCBI序列号：NM_000090.4)，来源于人源C端的部分连续基因，其序列位于人源Ⅲ型胶原蛋白α1链基因序列的第2701至3420位核苷酸，将此段序列去掉N段36个核苷酸后重复连接在第一段序列之后，形成胶原蛋白基因片段COL3A2；
优选的序列经巴斯德毕赤酵母X33(Pichia pastoris X33)编好密码子优化后进行合成，对应基因序列为SEQ ID NO.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
SEQ ID NO.2
将第26～97位的Gly-X-Y甘氨酸三肽中的第三位氨基酸突变为脯氨酸(Pro)或酪氨酸(Tyr)，获得氨基酸序列SEQ ID NO:3所示：
SEQ ID NO.3
形成的胶原蛋白基因片段命名为COL3A2M，其对应的基因片段核苷酸序列如SEQID NO:4所示：
SEQ ID NO.4
另外为了比对Gly-X-Y甘氨酸三肽中的第二位氨基酸和第三位氨基酸被突变后的效果，另外设计了主要在第二位氨基酸突变的胶原蛋白基因片段，命名为COL3A2M-2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示：
SEQ ID NO.7
对应的核苷酸片段如SEQ ID NO:8所示：
SEQ ID NO.8
基因片段COL3A2、COL3A2M和COL3A2M-2均送至通用生物(安徽)合成公司进行全序列合成。
进一步，通过PCR技术并用引物COL3A2-F/R(SEQ ID NO:5，其氨基酸序列下所示：
SEQ ID NO.5
COL3A2-F：gaaaagagaggctgaagctgGGCAAGGATG GGCCCCCA
COL3A2-R：GCCTGCAGGTCCTGGACTGacggccggctgggccacgtgaatt)
将合成得到的基因片段COL3A2、COL3A2M和COL3A2M-2进行克隆；用引物pPICZαA-F/R(SEQ ID NO:6，其氨基酸序列下所示：
SEQ ID NO.6
pPICZαA-F：aattcacgtggcccagccggc
pPICZαA-R：cagcttcagcctctcttttctcgagagataccc)
将巴斯德毕赤酵母X33(Pichia pastoris X33)表达载体pPICZαA进行扩增获得载体连接片段，将克隆得到的基因片段COL3A2、COL3A2M和COL3A2M-2，以及pPICZαA载体片段分别按照浓度比3:1混合；使用Gibson Assembly无缝连接技术将两个片段依次连接构建重组质粒pPICZαA-A2、pPICZαA-A2M和pPICZαA-A2M-2；
反应条件为：50℃水浴或金属浴孵育30分钟后冰上冷却；然后采用42℃热激法转化大肠杆菌T1感受态细胞，经过过夜培养后挑取在含卡纳霉素平板上生长的阳性克隆，将克隆接种在3mL试管中30℃，220rpm过夜，提取质粒后送测序公司测序验证重组基因是否与设计一致。
制备Pichia pastoris X33感受态细胞。在YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)平板上挑取Pichia pastoris X33单菌落，接种于YPD液体培养基的试管中，30℃，220rpm振荡培养过夜；取500μL培养液接种于含有50mL新鲜YPD培养基的三角瓶中，培养至OD600＝1.2。将上述培养物导入无菌离心管中，4℃的6000rpm离心10min，去除上清；
将上述菌体用20mL的LiAc溶液(100mM LiAc，10mM DTT，0.6M山梨醇，10mM Tris-HCl，pH 7.5)重悬，30℃摇床培养30min，离心并去除上清；
将1μg线性化的质粒pPICZαA-A2和pPICZαA-A2M与Pichia pastoris X33感受态细胞以总体积100μL混匀，转移到0.2cm的预冷电转杯中，置于冰上5-10min；
按照电转化参数：电击电压1.5kV，电容25μF，电阻200Ω，电击时间5msec。电击结束立即将1mL预冷的1M山梨醇溶液加入电转杯中，轻轻吹打混匀，并迅速转至1.5mL离心管中，30℃，220rpm静置培养1～2h。
取200μL菌体涂布于终浓度100μg/mL G418的YPD平板上。置于30℃恒温培养箱倒置培养2-4天，直至有单菌落出现，挑取单菌落提取基因组进行PCR并送测序公司测序验证。对验证正确的重组子进行加压筛选，即接种后48h在100μg/mL～1mg/mL的G418浓度范围内进行筛选且每隔3天更换1次培养液，保持G418浓度不变，将能长出克隆的重组菌株挑出保种。
挑取经过验证的重组单菌落加入到5mL YPD液体培养基中，30℃200rpm培养过夜进行活化；以1％的接种量接种于100mL的BMGY液体培养基，30℃，200rpm培养至OD600＝3.0～6.0；25℃离心6min收集菌体，并将其悬浮于200mL的BMMY液体培养基中，使其起始浓度为OD600＝1.0，在30℃，200rpm条件下培养；每隔24h加终浓度为0.5～1.0％的甲醇进行诱导表达；诱导72h，取培养液在12000rpm条件下离心2min，取上清液通过SDS-PAGE实验验证蛋白表达情况。
实验结果见图2：突变的胶原蛋白COL3A2M与未经突变的蛋白COL3A2的分子量基本相同，均为25.1kD。从SDS-PAGE蛋白电泳结果可以看出，未经突变的原始胶原蛋白COL3A2的分子量约为30kD,比生物信息学预测的25.1kD大。而经过突变的胶原蛋白COL3A2M的分子量约为32～35kD，同样比预测值大，推测原因可能是酵母细胞的糖基化修饰所致。并且经过突变的胶原蛋白COL3A2M的分子量大于未经突变的蛋白COL3A2，很可能由于该突变体被蛋白酶降解的影响较小。
另外，实验还发现如图3所示，泳道1为原始序列的胶原蛋白；泳道2～3为第二位氨基酸突变的胶原蛋白；泳道5为第三位氨基酸突变的胶原蛋白，结果显示原始的胶原蛋白片段第26～97位的Gly-X-Y甘氨酸三肽中，第三位的氨基酸突变为脯氨酸或酪氨酸后抵抗蛋白酶降解的能力比第二位氨基酸突变后更强。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种改造表达人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的序列的方法，包括以下步骤：
S1、选择合适的宿主菌以及合适的胶原蛋白基因片段；
S2、通过PCR技术对基因片段COL3A2和COL3A2M进行克隆；
S3、制备Pichia pastoris X33感受态细胞。
2.根据权利要求1所述的一种改造表达人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的序列的方法，所述宿主菌优选为巴斯德毕赤酵母X33(Pichia pastoris X33)，所述胶原蛋白基因片段COL3A优选自人源Ⅲ型胶原蛋白αⅠ链(NCBI序列号：NM_000090.4)，来源于人源C端的部分连续基因，其序列位于人源Ⅲ型胶原蛋白α1链基因序列的第2701至3420位核苷酸，将此段序列去掉N段36个核苷酸后重复连接在第一段序列之后，形成胶原蛋白基因片段COL3A2。
3.根据权利要求2所述的一种改造表达人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的序列的方法，所述序列经巴斯德毕赤酵母X33(Pichia pastoris X33)编好密码子优化后进行合成，对应基因序列为SEQ ID NO.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，将第26～97位的Gly-X-Y甘氨酸三肽中的第二位或第三位氨基酸突变为脯氨酸(Pro)或酪氨酸(Tyr)，获得氨基酸序列SEQ IDNO:3所示，形成的胶原蛋白基因片段命名为COL3A2M，其对应的基因片段核苷酸序列如SEQID NO:4所示。
4.根据权利要求1所述的一种改造表达人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的序列的方法，步骤S2中克隆方面包括：
S2-1、通过PCR技术并用引物pPICZαA-F/R(SEQ ID NO:6)将巴斯德毕赤酵母X33(Pichia pastoris X33)表达载体pPICZαA进行扩增获得载体连接片段，将克隆得到的基因片段COL3A2和COL3A2M，以及pPICZαA载体片段分别按照浓度比3:1混合；
S2-2、使用Gibson Assembly无缝连接技术将两个片段在载体pPICZαA的EcoRI位点进行连接，依次连接构建重组质粒pPICZαA-A2和pPICZαA-A2M；
S2-3、反应条件为：50℃水浴或金属浴孵育30分钟后冰上冷却；然后采用42℃热激法转化大肠杆菌T1感受态细胞，经过过夜培养后挑取在含卡纳霉素平板上生长的阳性克隆，将克隆接种在3mL试管中30℃，220rpm过夜，提取质粒后送测序公司测序验证重组基因是否与设计一致。
5.根据权利要求1所述的一种改造表达人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的序列的方法，步骤S3中感受态细胞制备包括：
S3-1、将1μg线性化的质粒pPICZαA-A2和pPICZαA-A2M与Pichia pastoris X33感受态细胞以总体积100μL混匀，电击转化使重组质粒进入感受态细胞中；
S3-2、转化后的菌株置于30℃恒温培养箱倒置培养2～4天，直至有单菌落出现，挑取单菌落提取基因组进行PCR并送测序公司测序验证；
S3-3、对验证正确的重组子进行加压筛选，即接种后48h在100μg/mL～1mg/mL的G418浓度范围内进行筛选，将能长出克隆的重组菌株挑出保种；
S3-4、挑取经过验证的重组单菌落加入到5mL YPD液体培养基中，30℃，200rpm培养过夜进行活化；
S3-5、以1％的接种量接种于100mL的BMGY液体培养基，30℃，200rpm培养至OD600＝3.0～6.0；25℃离心6min收集菌体，并将其悬浮于200mL的BMMY液体培养基中，使其起始浓度为OD600＝1.0，在30℃，200rpm条件下培养，每隔24h加终浓度为0.5～1.0％的甲醇进行诱导表达；
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