CN117886907A - 一种pht纳米孔突变体蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种PHT纳米孔突变体蛋白及其应用，PHT纳米孔突变体蛋白包括将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的一个或多个氨基酸突变为其他氨基酸，或者敲除SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的一个或多个氨基酸。本发明提供的PHT纳米孔突变体蛋白能够用于核酸的测序检测。
Description
本申请要求享有2022年10月14日向国家知识产权局提交的，专利申请号为202211262290.8，发明名称为“一种PHT纳米孔突变体蛋白及其应用”的在先申请的优先权权益。所述在先申请的全文通过引用的方式结合于本申请中。
技术领域
本发明涉及一种表征目标多核苷酸的方法，特别涉及一种PHT纳米孔突变体蛋白及其应用，属于基因工程和遗传工程领域。
背景技术
纳米孔测序技术是近年被开发出来的新型核酸测序技术。依据孔道类型可分为固态孔和生物纳米孔，生物纳米孔即能够允许底物通过的孔道蛋白，以下纳米孔测序单指生物纳米孔测序技术。在电场力的作用下，带电核酸底物能够通过生物纳米孔。当核酸通过纳米孔时，能够阻碍纳米孔的电流，产生不同的电流信号，通过对电流信号的解析，可以获得核酸的碱基信息。和其它测序方法相比，它具有设备低廉，样品准备简便，测序速度快等优势，已经开始得到广泛应用。具体优势如下：在无需扩增的情况下，即可简便的建库；信号读取速度快，通常能达到200-300bp/s；读取长度长，通常可以达到数千个碱基；并且可以直接检测DNA上存在的修饰；可以直接测RNA，基于纳米孔测序的特点，RNA不再需要逆转录为DNA进行序列分析，由此便可以保存RNA上的修饰信息。
孔道蛋白是影响纳米孔测序的关键技术之一，孔道蛋白的收缩区(读取头)特征对于获取原始电流信号具有较大影响。目前孔道蛋白种类单一，常用的大肠杆菌CsgG突变体收缩区能够容纳4-5个碱基，因此单次记录的电流信号由4-5个碱基的阻碍作用产生，造成后续信号分析难度较大，造成准确率难以达到二代测序的水平。因此，需要发掘具有新型收缩区的孔道蛋白，一方面能够增加纳米孔的可选择种类，另一方面减少电流信号解析难度，进一步提高测序的准确率。
发明内容
本发明针对现有来源于大肠杆菌的纳米孔蛋白收缩区较厚，导致电流信号检测涉及连续多个核苷酸协同作用的缺点，寻找到一种收缩区厚度较薄的pht纳米孔蛋白，该蛋白收缩区仅包含一个氨基酸残基，从而减少所能容纳的连续多核苷酸的数量，降低电流信号解码难度，提高碱基分辨效率。同时，目前能够用于测序的孔蛋白种类比较少，所以，本发明提供了一种新型纳米孔蛋白，该蛋白野生型不能够直接用于测序，并证明经过收缩区氨基酸突变改造后，该蛋白具有核苷酸测序能力。
本发明通过系统的氨基酸序列比对、选择，蛋白表达、纯化，结构解析等手段，并通过氨基酸突变手段，分别表达、纯化了收缩区氨基酸不同突变体蛋白，结合磷脂膜电流信号检测手段，确定了不同突变体蛋白的膜信号特征；选取噪音较小的突变体蛋白，确定了其核酸检测能力。本发明涉及技术包括，大肠杆菌膜蛋白表达载体的构建、突变体蛋白的载体构建；膜蛋白的表达、纯化；冷冻电镜样品制备、数据收集、结构解析、结构搭建、结构分析；纳米孔蛋白磷脂膜嵌入技术、电流信号记录、处理等。
第一方面，本发明提供一种PHT纳米孔突变体蛋白，所述PHT纳米孔突变体蛋白将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的一个或多个氨基酸突变为其他氨基酸(例如F87、F84、N83、A85、E235)，或者敲除SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的一个或多个氨基酸(例如敲除第80-86位氨基酸中的一个或多个)。
其他氨基酸包括天然氨基酸和/或非天然氨基酸。天然氨基酸为其他19种氨基酸。
在一些实施方案中，所述PHT纳米孔突变体蛋白选自：
1)将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的F87、F84、N83、A85氨基酸中的一个或多个突变为其他19种氨基酸；
2)将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的E235氨基酸突变为其他19种氨基酸；
3)敲除SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的第80、81、82、83、84、85、86位氨基酸中的一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个等)。
其他19种氨基酸指的是除原位点氨基酸外的20种常见氨基酸中的其他19种氨基酸。20种常见氨基酸为：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
在一些实施方案中，所述PHT纳米孔突变体蛋白是将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白收缩区氨基酸F87突变为其他19种氨基酸。
在一些实施方案中，所述PHT纳米孔突变体蛋白是将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白收缩区氨基酸F87突变为：F87M、F87P、F87L、F87G、F87I、F87Q、F87E、F87C、F87R、F87H、F87K、F87T、F87A、F87S、F87Y、F87N、F87V或F87D。
在一些实施方案中，所述PHT纳米孔突变体蛋白是将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白收缩区氨基酸F87突变为F87T、F87L、F87N。
在一些实施方案中，所述PHT纳米孔突变体蛋白是将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸N83突变为其他19种氨基酸。
在一些实施方案中，所述PHT纳米孔突变体蛋白是将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸N83突变为：N83D、N83S。在一些实施方案中，所述PHT纳米孔突变体蛋白是将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸F84突变为其他19种氨基酸。在一些实施方案中，所述PHT纳米孔突变体蛋白是将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸F84突变为：F84S、F84N、F84K、F84H、F84D、F84W、F84R、F84S、F84E、F84P、F84L、F84A、F84V、F84G、F84M；优选为F84S、F84N、F84K。
在一些实施方案中，所述PHT纳米孔突变体蛋白是将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸A85突变为其他19种氨基酸。
在一些实施方案中，所述PHT纳米孔突变体蛋白是将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸A85突变为：A85F、A85N、A85H、A85Q、A85S、A85L、A85D、A85C、A85I、A85P、A85T、A85G、A85M、A85W、A85R；优选为A85I。
在一些实施方案中，所述PHT纳米孔突变体蛋白是将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸E235突变为其他19种氨基酸。
在一些实施方案中，所述PHT纳米孔突变体蛋白是将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸E235突变为：E235N。
在一些实施方案中，所述PHT纳米孔突变体蛋白是敲除SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的第85、86位氨基酸中的一个或多个(例如1个、2个)；例如敲除第85和第86位氨基酸。
在一些实施方案中，所述PHT纳米孔突变体蛋白是敲除SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的第80、81、82、83位氨基酸中的一个或多个(例如1个、2个、3个、4个)；例如敲除第80至第83位氨基酸。
在一些实施方案中，所述PHT纳米孔突变体蛋白是敲除SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的第80、81、82位氨基酸中的一个或多个(例如1个、2个、3个)；例如敲除第80至第82位氨基酸。
第二方面，本发明提供编码上述PHT纳米孔突变体蛋白的编码基因。
在一些实施方案中，所述编码基因选自：
1)编码上述PHT纳米孔突变体蛋白的核酸序列；
2)与1)中的核酸序列至少具有85％的同源性，且编码上述PHT纳米孔突变体蛋白的核酸；
3)与1)或2)互补的核酸。
在一些实施方案中，同源性在85％-99％之间。
在一些实施方案中，同源性为85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。
第三方面，本发明提供包含上述编码基因的重组载体。
第四方面，本发明提供一种基因工程化的细胞，所述的细胞含有上述重组载体，或者其基因组中包含上述编码基因。
包含上述编码基因可以为整合上述编码基因或者其他方式。
第五方面，本发明提供包含上述PHT纳米孔突变体蛋白的产品。
在一些实施方案中，所述产品是组合物、复合物、试剂盒。
第六方面，本发明提供包含上述重组载体的重组菌。
第七方面，本发明提供上述PHT纳米孔突变体蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1)构建PHT纳米孔突变体蛋白载体；
2)PHT纳米孔突变体蛋白表达、纯化。
第八方面，本发明提供一种膜层，所述膜层中嵌入上述PHT纳米孔突变体蛋白。
在一些实施方案中，所述膜层是磷脂膜层。
在一些实施方案中，所述膜层是磷脂单层膜层。
第九方面，本发明提供一种检测系统，包括上述PHT纳米孔突变体蛋白或者上述膜层。
第十方面，本发明提供一种装置，包括上述PHT纳米孔突变体蛋白、上述膜层或者上述检测系统。
第十一方面，本发明提供上述PHT纳米孔突变体蛋白、上述膜层或上述检测系统在制备样品测序和/或检测的装置中的应用。
在一些实施方案中，所述样品为核苷酸、核酸、氨基酸、寡聚肽、多肽、蛋白质中的一种或多种。
第十二方面，本发明提供上述PHT纳米孔突变体蛋白、上述膜层、上述检测系统或上述装置在样品测序和/或检测中的应用。
在一些实施方案中，所述样品为核苷酸、核酸、氨基酸、寡聚肽、多肽、蛋白质中的一种或多种。
有益效果
本发明通过冷冻电镜技术，解析了高分辨率pht纳米孔三维结构结构分析发现pht纳米孔蛋白收缩区宽度为/>厚度仅由一个氨基酸(F87)决定。同时，本发明发现，野生型的pht在磷脂膜上具有较高的噪音，不能用于核酸底物检测。进一步通过突变实验发现，改变该位置氨基酸的种类，不影响纳米孔蛋白的表达，但突变后的不同氨基酸种类对其电流信号有较大影响。
本发明提供一种PHT纳米孔突变体蛋白，所述突变体蛋白经氨基酸的突变或敲除后，相比于野生型蛋白，其电流性质、电流信号得到显著改善。其中，F87T、E235N、F87L、F87N、A85I、F84S、F84N和F84K突变体蛋白的效果更优，可用于DNA等样品的测序和/或检测。
附图说明
图1是野生型pht蛋白表达纯化图；
图2是野生型pht蛋白分子筛结果图；
图3是野生型pht蛋白冷冻电镜map图；
图4是野生型pht纳米孔整体结构图；
图5是野生型pht纳米孔收缩区整体构象图；
图6是野生型pht纳米孔收缩区单体构象图；
图7是F87位点PHT纳米孔突变体蛋白表达纯化图；
图8是敲除PHT纳米孔突变体蛋白表达纯化图；
图9是E235位点PHT纳米孔突变体蛋白表达纯化图；
图10是N83位点PHT纳米孔突变体蛋白表达纯化图；
图11是F84位点PHT纳米孔突变体蛋白表达纯化图；
图12是A85位点PHT纳米孔突变体蛋白表达纯化图；
图13是野生型pht纳米孔电流性质图；
图14是F87、E235位点PHT纳米孔突变体蛋白纳米孔电流性质图；
图15是F87位点PHT纳米孔突变体蛋白纳米孔电流性质图；
图16是位点敲除的PHT纳米孔突变体蛋白纳米孔电流性质图；
图17是N83位点PHT纳米孔突变体蛋白纳米孔电流性质图；
图18是F84位点PHT纳米孔突变体蛋白纳米孔电流性质图；
图19是A85位点PHT纳米孔突变体蛋白纳米孔电流性质图。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例1野生型pht纳米孔蛋白表达载体构建与蛋白的制备
1.野生型pht纳米孔蛋白载体的构建
野生型pht纳米孔蛋白来源于Nitratireductor pacificus pht-3B(ACCESSION：WP_008595533，SEQ ID NO:1)，该蛋白表达基因通过人工合成的方式获得，合成过程进行适用于大肠杆菌表达的密码子优化。合成后基因通过无缝克隆的方式构建到pET-28a载体，蛋白C端添加6×his，作为亲和纯化标签。
载体构建步骤如下：
以合成基因为模板，使用正反向引物(primer F：GGGCTAACAGGAGGAATTAACCATGTCATCACGCTCACATCA primer R：TCAATGATGATGATGATGATGCTGCTGAACAGGGTTAGGTTC)
PCR扩增目的基因片段，胶回收后与线性化的pET-28a载体连接，后转入DH5α感受态细胞进行阳性克隆的筛选。挑取2个克隆进行测序，测序正确后保存构建质粒于-20℃备用。
PCR体系如下(20μL)：
PCR程序如下：
无缝连接体系(10μL)如下：
2×无缝连接缓冲液 5μL
目的片段(50ng/μL) 3μL
线性化载体(10ng/μL)2μL
50℃反应15min后取2μL转入DH5α细胞，挑点测序。
2.野生型pht纳米孔蛋白表达、纯化
野生型pht纳米孔蛋白经过Ni柱亲和层析、分子筛纯化后，蛋白纯度较高(附图1)，蛋白性质均一(附图2)。且在SDS-PAGE上看，加热产生单体蛋白(分子量约为30kDa)；不加热时，蛋白为寡聚状态(即成孔状态，分子量大于marker最大条带180kDa)。
表达纯化步骤如下：
1)野生型pht载体测序正确后，转入BL21(DE3)，进行表达。37℃200rpm获取种子液1mL后转入1L LB培养基，37℃200rpm至OD600为1.2，降温至26℃0.2mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导过夜；
2)4000rpm收集菌体，使用裂解缓冲液重悬(20mL/L菌)，高压破碎后18000rpm 4℃离心1小时，收集沉淀膜组分；
3)使用溶膜缓冲液(10mL/L菌)重悬膜组分，4℃磁力搅拌1小时进行膜蛋白抽提，18000rpm 4℃离心1小时，收集上清膜蛋白组分；
4)上清中加入终浓度30mM的咪唑后与溶膜缓冲液平衡后的Ni beads进行孵育，4℃结合1小时后进行亲和纯化；
5)将上清和Ni beads导入柱子中，重力自然流穿；10mL洗涤液清洗，5mL洗脱液洗脱蛋白；
6)目的蛋白进行分子筛纯化后SDS-PAGE检测纯度，结果如附图1所示，分子筛结果如附图2所示。
裂解缓冲液：20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0。
溶膜缓冲液：20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0，1％ LDAO(十二烷基二甲基氧化胺)。
洗涤液：20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0，0.5％ LDAO，50mM咪唑。
洗脱液：20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0，0.1％ LDAO，200mM咪唑。
分子筛缓冲液：20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0，0.06％ LDAO。
实施例2：野生型pht纳米孔蛋白原子水平结构
得到纯度和均一度较高的野生型pht纳米孔蛋白后(实施例1)，利用冷冻电镜技术，解析了其分辨率为的原子水平结构。
冷冻电镜结构解析步骤如下：
1)准备筛好的样品，并在相同的冻样条件下制备几个备用样品，选取8个合适的样品上到Talos Arctica 200kV高端电镜中；
2)上样后等待真空和温度稳定后，开启镜筒在低倍下选择合适的方形孔。这一步和冷冻样品的筛选类似，其目的使选择合适的方形孔用于后面数据的收集；
3)根据电镜的机时空余以及每个方形孔能够采集的照片数量，计算大概需要选择的方形孔数量，选择完成后进行地图的拍摄；
4)地图拍摄过程中，可以离线选择地图中能够用于数据收集的孔，这样可以节省一部分的时间；
5)待地图拍摄完成后既可以对电镜进行调机，以备数据的收集工作。主要包括电镜的合轴、背底扣除及数据收集基本参数(欠焦量-1.5μm到-2.5μm，电子计量拍照帧数32帧和像素尺寸/>)的设置；
后续经过数据处理，结构解析，得到了其电子密度，整体如附图3所示，整体map为9聚体结构，单体位置如图所示(附图3左图为顶视图，右图为俯视图)，右图标注该纳米孔蛋白跨膜区位置。随后，通过同源建模，结构搭建、精修获得了野生型pht纳米孔蛋白氨基酸的原子坐标(附图4，左图为顶视图，右图为俯视图)。结构分析可见，pht纳米孔蛋白收缩区为单层结构，区别于大肠杆菌纳米孔蛋白的三层结构。其中，收缩区由单个氨基酸决定，为第87位苯丙氨酸(Phe，F)，收缩区宽度为(附图5)，单体结构分析只有F87侧链指向孔道内测(附图6)。收缩区厚度薄(附图5)，仅为/>
实施例3：野生型以及PHT纳米孔突变体蛋白在人工膜上电流性质的确定
检测野生型pht纳米孔蛋白在人工膜上的孔道电流性质。同时，针对其收缩区决定氨基酸(F87)及其附近的氨基酸N83、F84、A85以及E235、80-83、85-86等，进行突变分析。
F87(F，苯丙氨酸Phe)的突变：F87M(蛋氨酸Met)、F87P(脯氨酸Pro)、F87L(亮氨酸Leu)、F87G(甘氨酸Gly)、F87I(异亮氨酸Ile)、F87Q(谷氨酰胺Gln)、F87E(谷氨酸Glu)、F87C(半胱氨酸Cys)、F87R(精氨酸Arg)、F87H(组氨酸His)、F87K(赖氨酸Lys)、F87T(苏氨酸Thr)、F87A(丙氨酸Ala)、F87S(丝氨酸Ser)、F87Y(酪氨酸Tyr)、F87N(天冬酰胺Asn)、F87V(缬氨酸Val)、F87D(天冬氨酸Asp)。
敲除部分氨基酸：D2(敲除氨基酸85-86)、D3(敲除氨基酸80-82)、D4(敲除氨基酸80-83)。
E235(E，谷氨酸Glu)的突变：E235N(天冬酰胺Asn)。
N83(N，天冬酰胺Asn)的突变：N83D(天冬氨酸Asp)、N83S(丝氨酸Ser)。
F84(F，苯丙氨酸Phe)的突变：F84S(丝氨酸Ser)、F84N(天冬酰胺Asn)、F84K(赖氨酸Lys)、F84H(组氨酸His)、F84D(天冬氨酸Asp)、F84W(色氨酸Trp)、F84R(精氨酸Arg)、F84S(丝氨酸Ser)、F84E(谷氨酸Glu)、F84P(脯氨酸Pro)、F84L(亮氨酸Leu)、F84A(丙氨酸Ala)、F84V(缬氨酸Val)、F84G(甘氨酸Gly)、F84M(蛋氨酸Met)。
A85(A，丙氨酸Ala)的突变：A85F(苯丙氨酸Phe)、A85N(天冬酰胺Asn)、A85H(组氨酸His)、A85Q(谷氨酰胺Gln)、A85S(丝氨酸Ser)、A85L(亮氨酸Leu)、A85D(天冬氨酸Asp)、A85C(半胱氨酸Cys)、A85I(异亮氨酸Ile)、A85P(脯氨酸Pro)、A85T(苏氨酸Thr)、A85G(甘氨酸Gly)、A85M(蛋氨酸Met)、A85W(色氨酸Trp)、A85R(精氨酸Arg)。
经SDS-PAGE检测(附图7-12)，突变后蛋白寡聚状态没有受到影响。在不加热时含有寡聚状态的蛋白(Marker 180kDa上方)，加热后产生单体大小条带。与野生型pht相比，上述突变蛋白，从表达量、寡聚状态、热稳定性上均没有明显变差，由此可以说明，突变没有造成蛋白的生化性质发生明显变化。
涉及材料与方法如下：
1.突变蛋白载体构建与蛋白表达纯化
突变蛋白与野生型pht蛋白的表达纯化方式相同(实施例1中所述)；
1)引物如下：f：正向引物r：反向引物
F87引物信息：
F87-r CTGAGCAAAGTTATCTTCAGGT
F87G-f GATAACTTTGCTCAGggcTCCAAAGCGGTCTCACAGG
F87R-f GATAACTTTGCTCAGcgcTCCAAAGCGGTCTCACAGG
F87D-f GATAACTTTGCTCAGgatTCCAAAGCGGTCTCACAGG
F87Y-f GATAACTTTGCTCAGtatTCCAAAGCGGTCTCACAGG
F87T-f GATAACTTTGCTCAGacaTCCAAAGCGGTCTCACAGG
F87S-f GATAACTTTGCTCAGtcaTCCAAAGCGGTCTCACAGG
F87E-f GATAACTTTGCTCAGgaaTCCAAAGCGGTCTCACAGG
F87K-f GATAACTTTGCTCAGaaaTCCAAAGCGGTCTCACAGG
F87H-f GATAACTTTGCTCAGcatTCCAAAGCGGTCTCACAGG
F87L-f GATAACTTTGCTCAGttaTCCAAAGCGGTCTCACAGG
F87I-f GATAACTTTGCTCAGattTCCAAAGCGGTCTCACAGG
F87V-f GATAACTTTGCTCAGgttTCCAAAGCGGTCTCACAGG
F87P-f GATAACTTTGCTCAGcctTCCAAAGCGGTCTCACAGG
F87M-f GATAACTTTGCTCAGatgTCCAAAGCGGTCTCACAGG
F87C-f GATAACTTTGCTCAGtgtTCCAAAGCGGTCTCACAGG
F87Q-f GATAACTTTGCTCAGcaaTCCAAAGCGGTCTCACAGG
F87N-f GATAACTTTGCTCAGaatTCCAAAGCGGTCTCACAGG
F87A-f GATAACTTTGCTCAGgctTCCAAAGCGGTCTCACAGG
其中，F87G、F87R、F87D、F87Y、F87T、F87S、F87E、F87K、F87H、F87L、F87I、F87V、F87P、F87M、F87C、F87Q、F87N、F87A的反向引物均为F87-r。
D2引物信息：
D2-f ATAACTTTTTCTCCAAAGCGGTCTCAC
D2-r TGGAGAAAAAGTTATCTTCAGGTTTCTGCT。
D3引物信息：
D3-f GGACAGCAGAAAAACTTTGCTCAGTTCTCCAAAG
D3-r AAAGTTTTTCTGCTGTCCGGTCTTATCA。D4引物信息：
D4-f CAGCAGAAATTTGCTCAGTTCTCCAAAGCG
D4-r CTGAGCAAATTTCTGCTGTCCGGTCTTA。
E235N引物信息：
E235N-f AGGCTaacGCTGGCTTTACACGCAAC
E235N-r AGCCAGCgttAGCCTGAAGAATTTCATCAAT。N83引物信息：N83-rATCTTCAGGTTTCTGCTGTCC
N83D-f CAGAAACCTGAAGATgatTTTGCTCAGTTCTCCAAAGCG N83S-f CAGAAACCTGAAGATtctTTTGCTCAGTTCTCCAAAGCG其中，N83D、N83S的反向引物均为N83-r。
F84引物信息：
F84-r ATCTTCAGGTTTCTGCTGTCC
F84S-f CAGAAACCTGAAGATtctTTTGCTCAGTTCTCCAAAGCG F84N-f CAGAAACCTGAAGATaatTTTGCTCAGTTCTCCAAAGCG F84K-f CAGAAACCTGAAGATaaaTTTGCTCAGTTCTCCAAAGCGF84H-f CAGAAACCTGAAGATcatTTTGCTCAGTTCTCCAAAGCG F84D-f CAGAAACCTGAAGATgatTTTGCTCAGTTCTCCAAAGCG F84W-f CAGAAACCTGAAGATtggTTTGCTCAGTTCTCCAAAGCG F84R-f CAGAAACCTGAAGATcgtTTTGCTCAGTTCTCCAAAGCG F84S-f CAGAAACCTGAAGATtctTTTGCTCAGTTCTCCAAAGCG F84E-f CAGAAACCTGAAGATgaaTTTGCTCAGTTCTCCAAAGCG F84P-f CAGAAACCTGAAGATcctTTTGCTCAGTTCTCCAAAGCG F84L-f CAGAAACCTGAAGATttaTTTGCTCAGTTCTCCAAAGCG F84A-f CAGAAACCTGAAGATgctTTTGCTCAGTTCTCCAAAGCG
F84V-f CAGAAACCTGAAGATgttTTTGCTCAGTTCTCCAAAGCG
F84G-f CAGAAACCTGAAGATggtTTTGCTCAGTTCTCCAAAGCG
F84M-f CAGAAACCTGAAGATatgTTTGCTCAGTTCTCCAAAGCG
其中，F84S、F84N、F84K、F84H、F84D、F84W、F84R、F84S、F84E、F84P、F84L、F84A、F84V、F84G、F84M的反向引物均为F84-r。
A85引物信息：
A85-r AAAGTTATCTTCAGGTTTCTGCTG
A85F-f CCTGAAGATAACTTTtttCAGTTCTCCAAAGCGGTC
A85N-f CCTGAAGATAACTTTaatCAGTTCTCCAAAGCGGTC
A85H-f CCTGAAGATAACTTTcatCAGTTCTCCAAAGCGGTC
A85Q-f CCTGAAGATAACTTTcaaCAGTTCTCCAAAGCGGTC
A85Y-f CCTGAAGATAACTTTtatCAGTTCTCCAAAGCGGTC
A85L-f CCTGAAGATAACTTTttaCAGTTCTCCAAAGCGGTC
A85D-f CCTGAAGATAACTTTgatCAGTTCTCCAAAGCGGTC
A85C-f CCTGAAGATAACTTTtgtCAGTTCTCCAAAGCGGTC
A85I-f CCTGAAGATAACTTTattCAGTTCTCCAAAGCGGTC
A85P-f CCTGAAGATAACTTTcctCAGTTCTCCAAAGCGGTC
A85T-f CCTGAAGATAACTTTactCAGTTCTCCAAAGCGGTC
A85G-f CCTGAAGATAACTTTggtCAGTTCTCCAAAGCGGTC
A85M-f CCTGAAGATAACTTTatgCAGTTCTCCAAAGCGGTC
A85W-f CCTGAAGATAACTTTtggCAGTTCTCCAAAGCGGTC
A85R-f CCTGAAGATAACTTTcgtCAGTTCTCCAAAGCGGTC
其中，A85F、A85N、A85H、A85Q、A85S、A85L、A85D、A85C、A85I、A85P、A85T、A85G、A85M、A85W、A85R的反向引物均为A85-r。
PCR程序与PCR体系如实施例1所述，PCR模板为野生型pht纳米孔蛋白质粒。PCR后胶回收，直接转入DH5α中进行阳性克隆筛选。挑取单菌落测序，正确后于-20℃冻存备用。
2)突变体蛋白采用实施例1蛋白纯化步骤，获取蛋白。
2.膜上电流性质检测
在获得野生型和PHT纳米孔突变体蛋白之后，对这些蛋白的电流性质进行检测。采用人工形成磷脂单层膜(DPhPC)，再嵌入单个纳米孔蛋白，后在150mV或180mV电压下记录电流变化。
嵌入纳米孔步骤如下：
在缓冲液(600mM KCl，75mM K3[Fe(CN)6，25mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，100mM Hepes，pH 8.0)中，由嵌入到DPhPC磷脂双分子层的纳米孔获得电信号测量值。在实现单孔插入磷脂双分子层后，用2mL缓冲液(600mM KCl，75mM K3[Fe(CN)6，25mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，100mMHepes，pH 8.0)流过系统以除去残留的过量纳米孔。分别记录野生型和PHT纳米孔突变体蛋白在磷脂膜上的电流信号，记录结果如图所示(附图13-19)。
如附图13所示，野生型pht电流大小，信号噪音较大存在自发封阻现象。150mV下，整个电流在0.3-0.4nA之间波动，杂乱。
比较附图13和附图14-19可知，相比于野生型pht，突变体pht蛋白的电流信号噪音和自发封阻现象均显著减少，电流性质、电流信号得到显著改善。其中，F87T、E235N、F87L、F87N、A85I、F84S、F84N和F84K突变体蛋白的效果更优，电流性质稳定，自发封堵的情况很少，电流信号宽度更窄(上下幅度)、毛刺更少，可用于DNA等样品的测序和/或检测。
序列信息
SEQ ID NO:1
>WT
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种PHT纳米孔突变体蛋白，其特征在于，所述PHT纳米孔突变体蛋白将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的一个或多个氨基酸突变为其他氨基酸，或者敲除SEQ IDNO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白中的一个或多个氨基酸。
2.根据权利要求1所述的纳米孔蛋白，其特征在于，所述PHT纳米孔突变体蛋白选自：
1)将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸F87、F84、N83、A85中的一个或多个突变为其他19种氨基酸；
2)将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的E235氨基酸突变为其他19种氨基酸；
3)敲除SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的第80、81、82、83、84、85、86位氨基酸中的一个或多个；
优选地，所述PHT纳米孔突变体蛋白是将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸F87突变为其他19种氨基酸；优选地，所述PHT纳米孔突变体蛋白是将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸F87突变为：F87M、F87P、F87L、F87G、F87I、F87Q、F87E、F87C、F87R、F87H、F87K、F87T、F87A、F87S、F87Y、F87N、F87V或F87D；优选地，所述PHT纳米孔突变体蛋白是将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸F87突变为F87T、F87L或F87N；
优选地，所述PHT纳米孔突变体蛋白是将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸N83突变为其他19种氨基酸；优选地，所述PHT纳米孔突变体蛋白是将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸N83突变为：N83D或N83S；
优选地，所述PHT纳米孔突变体蛋白是将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸F84突变为其他19种氨基酸；优选地，所述PHT纳米孔突变体蛋白是将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸F84突变为：F84S、F84N、F84K、F84H、F84D、F84W、F84R、F84S、F84E、F84P、F84L、F84A、F84V、F84G或F84M；优选为F84S、F84N或F84K；
优选地，所述PHT纳米孔突变体蛋白是将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸A85突变为其他19种氨基酸；优选地，所述PHT纳米孔突变体蛋白是将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸A85突变为：A85F、A85N、A85H、A85Q、A85S、A85L、A85D、A85C、A85I、A85P、A85T、A85G、A85M、A85W或A85R；优选为A85I；
优选地，所述PHT纳米孔突变体蛋白是将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸E235突变为其他19种氨基酸；优选地，所述PHT纳米孔突变体蛋白是将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸E235突变为：E235N；
优选地，所述PHT纳米孔突变体蛋白是敲除SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的第85、86位氨基酸中的一个或多个；优选为敲除第85和第86位氨基酸；
优选地，所述PHT纳米孔突变体蛋白是敲除SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的第80、81、82、83位氨基酸中的一个或多个；优选为敲除第80至第83位氨基酸；
优选地，所述PHT纳米孔突变体蛋白是敲除SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的第80、81、82位氨基酸中的一个或多个；优选为敲除第80至第82位氨基酸。
3.一种编码权利要求1或2所述的PHT纳米孔突变体蛋白的编码基因；
优选地，所述编码基因选自：
1)编码权利要求1或2所述的PHT纳米孔突变体蛋白的核酸序列；
2)与1)中的核酸序列至少具有85％的同源性，且编码权利要求1或2所述的PHT纳米孔突变体蛋白的核酸；
3)与1)或2)互补的核酸；
优选地，同源性在85％-99％之间。
4.一种包含如权利要求3所述的编码基因的重组载体；或，一种包含如所述重组载体的重组菌；或，一种包含如权利要求1或2所述的PHT纳米孔突变体蛋白的产品；优选地，所述产品是组合物、复合物、试剂盒。
5.一种基因工程化的细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求4所述的重组载体，或者所述细胞的基因组中包含权利要求3所述的编码基因。
6.一种如权利要求1或2所述的PHT纳米孔突变体蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建PHT纳米孔突变体蛋白载体；
2)PHT纳米孔突变体蛋白表达、纯化。
7.一种膜层，其特征在于，所述膜层中嵌入权利要求1或2所述的PHT纳米孔突变体蛋白；优选地，所述膜层是磷脂膜层；优选地，所述膜层是磷脂单层膜层。
8.一种检测系统，其特征在于，包括权利要求1或2所述的PHT纳米孔突变体蛋白或者权利要求7所述的膜层。
9.一种装置，其特征在于，包括权利要求1或2所述的PHT纳米孔突变体蛋白、权利要求7所述的膜层或者权利要求8所述的检测系统。
10.权利要求1或2所述的PHT纳米孔突变体蛋白、权利要求7所述的膜层、权利要求8所述的检测系统或权利要求9所述的装置在样品测序和/或检测中的应用；
优选地，所述样品为核苷酸、核酸、氨基酸、寡聚肽、多肽、蛋白质中的一种或多种。
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