CN117486991A - 一种角蛋白及其在毛发产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种重组角蛋白及其氨基酸序列，以及编码所述重组角蛋白的核苷酸序列，本申请的重组角蛋白具有防脱生发的效果，可以用于各种防脱生发的产品，本申请进一步公开了使用所述重组角蛋白制备的防脱生发微针，其具有非常好的防脱生发效果，以及制备方法和用途。

Description

一种角蛋白及其在毛发产品中的应用

技术领域

本申请涉及生物医药技术领域，具体涉及一种角蛋白(尤其是一种重组角蛋白)及其在毛发产品中的应用、包括该角蛋白的组合物和微针及其制备方法与用途。

背景技术

现代医学认为，正常情况下，人体头发毛乳头内有丰富的血管，为毛乳头、毛球部提供充足的营养，从而头发生长激素顺利合成。各种不良刺激(激素水平影响，神经性刺激影响等)造成供应毛发营养的血管发生痉挛，使毛乳头、毛球部的营养运转功能发生障碍。当营养合成在毛乳头、毛球部的形成发生障碍，或虽然形成但因某种因素，具有细胞能量作用的ATP物质的制造会因此而受阻。当作为热量源的ATP无法产生出来，因此无法进行毛发的蛋白合成，毛母细胞失去活力，毛发髓质、皮质部分的营养减少，开始角质化，毛囊开始萎缩或者坏死，头发大量进入休止期，头发就会大量脱落。

脱发是一个古老又巨大的市场，但却一直缺乏创新。自非那雄胺首次获得FDA批准以来，已经将近30年没有新疗法上市了，非那雄胺是FDA批准的唯一可用于治疗雄激素性脱发的口服用药，但不适用于妇女以及儿童，而其口服给药方式使药物作用于全身，长期使用可能造成乳房触痛或肿大、性欲减退以及阳痿等副作用，故临床应用大大受限。

目前最常见的治疗脱发的外用药为5％米诺地尔，米诺地尔进入毛囊后代谢为活性物质米诺地尔硫酸盐发挥促毛发生长的作用。但由于米诺地尔的水溶性差，所以市售的大部分米诺地尔制剂由高比例的乙醇或丙二醇配制而成，重复使用时可引起非常严重的副反应(如头皮干燥、刺激感、烧灼感、发红和接触性皮炎等)；而米诺地尔硫酸盐为水溶性，但其性质不稳定，直接外用透皮率低且不能稳定发挥效用，需直接传递至皮肤内发挥效应。目前的临床应用或者临床试验中局部外用的药物如糖皮质激素曲安奈德、倍他米松，Wnt通路调节剂SM04554以及雄激素拮抗剂CB-03-01等，有一定的疗效；另外也有研究表明丙戊酸具有促进毛发生长的效应。但这些药物由于与米诺地尔有类似的脂溶性特点，故同样限制它们在脱发中的应用。另外，所有的局部外用药物应用都存在皮内、皮下药物分布不均匀的缺点。

另外，最新的研究表明毛囊周围的Treg细胞在毛发生长过程中起到必不可少的作用，而低剂量的白介素2能够有效的增加Treg数目，且在一项Ⅱ期临床试验中，斑秃患者皮下注射低剂量的白介素2能够有效促进毛发生长，但是白介素2的皮下注射过程痛苦，需要专业人士操作，而使其应用受到限制。

除此之外，植发也是脱发患者的治疗方案之一，但是植发因价格贵、需要专业人士参与限制其在脱发中的应用。

因此，目前上市的疗法并没有长期阻止脱发的能力，甚至在许多人种压根不起作用，更别说实现再生毛囊了。

角蛋白类似于胶原，具有氨基酸长链，角蛋白有两种主要蛋白，一种为含硫元素较多的细胞间质蛋白，含有胱氨酸，而胱氨酸是一种含硫氨基酸，多含于角蛋白中，是人体必需的氨基酸之一，其具有促进细胞氧化还原、细胞增殖的功能。角蛋白是人体毛发的主要结构成分，是维持毛囊结构并在毛囊中表达最丰富的蛋白质，是形成皮肤毛囊细胞的主要结构蛋白。角蛋白可以保护皮肤、毛囊细胞免受机械和非机械性损伤，并参与细胞信号转导和凋亡。研究表明，外源性的角蛋白能够激活内源角蛋白的表达，并促进相关细胞的增殖和迁移。角蛋白是一种理想的生物材料，可用于毛发护理和再生、皮肤创面及皮肤疾病的治疗。

发明内容

已有报道，采用基因工程技术，通过微生物发酵表达并通过纯化分离工艺制备出单一的角蛋白物质，能够促进毛发生长，基于此，本申请提供了一种角蛋白，其在促进毛发生长，防止脱发具有明显的效果。

具体的，本申请采用如下技术方案，

1、一种角蛋白，所述角蛋白包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

2、一种编码如项1所述的角蛋白的核苷酸序列。

3、根据项2所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4、一种重组载体，所述重组载体包含如项2或3所述的核苷酸序列。

5、根据项4所述的重组载体，所述重组载体为原核细胞重组表达载体。

6、根据项5所述的重组载体，所述原核细胞重组表达载体为选自pET3a、pET9a、pET14b、pET15b、pET16b、pET20b、pET21a、pET22b、pET23a、pET28a、pET30a中的任意一种，优选的，所述原核细胞重组表达载体为pET22b。

7、一种宿主细胞，所述宿主细胞包含项4～6任一所述的重组载体。

8、根据项7所述的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌；优选的，所述大肠杆菌选自BL21、BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、Rosetta-gami(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysS、OrigamiB(DE3)、OrigamiB(DE3)pLysS中的任意一种，优选的，所述宿主细胞为BL21(DE3)。

9、一种制备如项1所述角蛋白的方法，包括：

首先合成编码项2或3所述的角蛋白的核苷酸序列，随后将核苷酸序列与原核细胞重组表达载体结合，得到重组载体；

将重组载体转入宿主细胞，随后诱导表达，并经过纯化得到角蛋白。

10、一种防脱生发的微针，包括：

针尖部分，所述针尖部分包含项1所述的角蛋白和针尖基质；以及

基座部分，所述基座部分包含基座基质。

11、根据项10的微针，所述角蛋白在针尖基质中的浓度为50-200mg/ml。

12、根据项10或11所述的微针，所述针尖中还包括第二活性成分，优选的，所述第二活性成分选自KGF、FGF或米诺地尔中的一种或两种以上。

13、根据项10～12中任一项所述的微针，所述微针含有下述药物中的一种或多种组合：疫苗、激素、基因工程药物、多肽、多糖、核苷类、蛋白质类、化学药物或天然药物成分。

14、一种制备项10～13中任一项所述的微针的方法，包括，

将角蛋白和针尖基质配置为针尖溶液；

将基座基质配置为基座溶液；

采用注模工艺将针尖溶液注入微针模具中，保持一定时间后去除表面气泡及多余液体，等待其形成角蛋白水凝胶；

随后，在模具基底加入基座溶液，干燥后从模具上取下得到所述微针。

15、根据项14的方法，所述保持为在真空下保持，所述保持时间为5～20min。

16、一种防脱生发的组合物，包含项1所述的角蛋白和生理学上可接受的载体。

17、根据项16所述的组合物，所述组合物为选自以下的制剂的形式：浆液、溶液、悬浮液、乳液、软膏、泡沫、糊剂、凝胶、乳膏、洗剂、喷雾剂或粉末。

18、根据项16或17所述的组合物，所述组合物是微针输注在皮肤内或局部施用在皮肤表面的形式。

19、根据项18所述的组合物，所述组合物为局部施用在皮肤表面的形式并且包含渗透增强剂。

20、根据项1所述的角蛋白或项16～19中任一项所述的组合物在促进毛发生长或毛囊再生和/或用于预防或治疗毛发脱落或脱发的制剂中的用途。

21、根据项20的用途，所述制剂为洗发水、护发液、生发液、护发素、生发精华或生发膏。

发明效果

1、本申请提供的重组角蛋白，基于氨基酸之间化学结构和电子密度图相似性，对氨基酸进行系统和特定的替换，用亲水性氨基酸理性替换蛋白质中特定的疏水性氨基酸，对现有技术中的人发蛋白的氨基酸序列进行改造，增强其亲水性，设计水溶性变体，且不会影响蛋白质的结构或功能。改造后的重组角蛋白具有比改造之前更好的促进毛发生长，防止脱发的效果。

2、本申请提供的重组角蛋白的氨基酸序列，通过在蛋白的N-末端添加短肽亲和标签例如6xHis标签以提高蛋白纯化的效率。蛋白序列的设计改造能够减少包涵体的产生，简化了处理过程和提高纯化效率，降低生产成本。

3、本申请提供的微针，形貌和机械性能良好，可以较好的刺入皮肤，同时使用本申请提供的重组角蛋白，无毒无害，能够刺激毛囊上皮干细胞增殖和发育，增加毛囊数量，诱导毛囊进入生长期，促进毛发生长、增粗增强，效果明显优于现有现有技术中的常用的米诺地尔，以及改造之前的人发角蛋白。

4、本申请还提供了多种使用本申请重组角蛋白的防脱生发产品，均具有很好的防脱生发效果。

附图说明

附图用于更好地理解本申请，不构成对本申请的不当限定。其中：

图1为目标蛋白的SDS-PAGE电泳鉴定结果；

图2重组角蛋白微针的具体形貌(扫描电子显微镜拍摄)；

图3为重组角蛋白微针的具体形貌(荧光标记，荧光显微镜拍摄)；

图4为重组角蛋白微针的机械性能测试结果；

图5为重组角蛋白微针的皮肤刺入性能测试结果；

图6为实验组和对照组小鼠的心、肝、脾、肺和肾的组织切片形貌；

图7为微针给药动物实验示意图；

图8为空白对照组、重组角蛋白组、米诺地尔组、人发角蛋白组石蜡包埋切片的毛囊组织学变化；

图9为空白对照组、重组角蛋白组、米诺地尔组、人发角蛋白组石蜡包埋切片的毛囊数量；

图10为空白对照组、重组角蛋白组、米诺地尔组、人发角蛋白组石蜡包埋切片的毛囊周期评分；

图11为空白对照组、重组角蛋白组、米诺地尔组、人发角蛋白组石蜡切片进行鼠单克隆抗体K14免疫组化染色的实验结果；

图12为空白对照组、重组角蛋白组、米诺地尔组、人发角蛋白组石蜡切片进行鼠单克隆抗体β-连蛋白免疫组化染色的实验结果；

图13为空白对照组、重组角蛋白组、米诺地尔组、人发角蛋白组石蜡切片进行鼠单克隆抗体K15免疫组化染色的实验结果；

图14为空白对照组、重组角蛋白组、米诺地尔组、人发角蛋白组小鼠皮肤内侧血管生成情况。

其中，图中的*有显著差异(p<0.05)；**表示有非常显著差异(p<0.01)；***表示有极其显著差异(p<0.001)

具体实施方式

以下对本申请的示范性实施例做出说明，其中包括本申请实施例的各种细节以助于理解，应当将它们认为仅仅是示范性的。因此，本领域普通技术人员应当认识到，可以对这里描述的实施例做出各种改变和修改，而不会背离本申请的范围和精神。同样，为了清楚和简明，以下的描述中省略了对公知功能和结构的描述。

“氨基酸”是指可以并入肽、多肽或蛋白的任何单体单元。如本文所用，术语“氨基酸”包括以下20种天然或遗传编码的α-氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。在其中“X”残基未定义的情况下，这些应该定义为“任何氨基酸”。这些20种天然氨基酸的结构显示于例如Stryer等人，BioChemistry,第5版,Freeman and Company。额外的氨基酸如硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸也能够被遗传编码(Stadtman(1996)“Selenocysteine,”AnnuRevBiochem.65:83-100和Ibba等人。“Genetic code:introducingpyrrolysine,”Curr Biol.12(13):R464-R466)。术语“氨基酸”还包括非天然氨基酸、修饰的氨基酸(例如，具有修饰的侧链和/或骨架)和氨基酸类似物。

为了进一步举例说明，氨基酸通常为包括取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的羧基和一种或多种侧链或基团，或这些基团的任一种的类似物的有机酸。示例性的侧链包括，例如巯基、硒基、磺酰基、烷基、芳基、酰基、酮基、叠氮基、羟基、肼、氰基、卤素、酰肼、链烯基、炔基、醚基、硼酸酯(borate)、硼酸盐(boronate)、二氧磷基、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺或这些基团的任何组合。其他代表性的氨基酸包括，但不限于，包含光敏交联剂的氨基酸、金属结合氨基酸、自旋标记的氨基酸、发荧光的氨基酸、包含金属的氨基酸、含新官能团的氨基酸、与其他分子共价或非共价相互作用的氨基酸、对光不稳(photocaged)和/或可光异构化的氨基酸、放射性氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化的氨基酸、其他碳水化合物修饰的氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、化学可裂解的和/或光可裂解的氨基酸、包含碳连接糖的氨基酸、氧化还原活性氨基酸、包含氨基硫代酸的氨基酸和包含一个或多个毒性部分的氨基酸。

术语“核苷酸”，除了是指天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体以外，本文中还应当理解为是指其相关的结构变体，包括衍生物和类似物，其关于使用该核苷酸的具体上下文在功能上是等效的，除非上下文明确另外指明。

术语“密码子优化的”、“密码子-优化的(codon-optimized)”、“密码子-优化的(codon-optimised)”或“密码子使用偏好”是指以使得根据需要优化或定制表达的方式选择密码子(即密码子使用)的实践(即通过增加目标基因的翻译效率来改进生物体中蛋白表达的技术)。换句话说，密码子优化是一种调整密码子以匹配宿主tRNA丰度的方法，并且传统上已用于表达异源基因。用于优化异源表达的新策略考虑全局核苷酸含量，诸如局部mRNA折叠、密码子对偏倚、密码子斜坡(codon ramp)或密码子相关性。密码子优化是可能的，因为密码子的简并性是固有的。因为存在比可编码的氨基酸更多的密码子，导致简并性。因此，绝大多数氨基酸由多个密码子编码，这意味着存在多种携带任何给定氨基酸的tRNA(具有不同的反-密码子环)。因此，可以使用不同的密码子，而不改变编码的氨基酸序列。也就是说，可以突变/改变(或从头合成)核酸的基因或片段以改变用于编码特定氨基酸的密码子，而不改变多肽/蛋白本身的氨基酸序列。例如，稀有密码子可以用更丰富的密码子替换，同时保持氨基酸序列不变。

术语“宿主细胞”是指单细胞的原核生物和真核生物生物体(例如细菌、酵母和放线菌)以及当在细胞培养物中生长时来自高等植物或者动物的单细胞。“宿主细胞”可以为动物宿主细胞、植物宿主细胞、酵母宿主细胞、真菌宿主细胞、原生动物宿主细胞和原核宿主细胞。

表达：本文上下文中术语“表达”包括多肽生产涉及的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

术语“载体”指一段DNA，通常是双链的，其可以已经向其中插入一段外源DNA。载体可以是例如质粒来源的。载体含有在宿主细胞中促进载体的自主复制的“复制子”多核苷酸序列。外源DNA被定义为异源DNA，其为在宿主细胞中天然未发现的DNA，其例如复制载体分子，编码可选择或可筛选的标记，或编码转基因。载体用于将外源的或异源的DNA转运入合适的宿主细胞。一旦在宿主细胞中，所述载体可以独立于宿主染色体DNA复制或与宿主染色体DNA同时复制，并且可以生成几个拷贝的载体及其插入的DNA。另外，载体还可以含有允许插入的DNA转录为mRNA分子或者以其他方式引起插入的DNA复制为多拷贝的RNA的必要元件。一些表达载体另外含有插入的DNA附近的序列元件，其增加表达的mRNA的半衰期，和/或允许所述mRNA翻译为蛋白分子。因此，可以迅速地合成插入的DNA编码的mRNA和多肽的许多分子。

表达载体：本文上下文中术语“表达载体”包括线性或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的片段，并且该片段可以可操作地连接到使其转录的其它片段上。

所述重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，它可以方便地用重组DNA方法处理，并可表达所述核苷酸序列。选择载体通常取决于所述载体与所述载体被引入的宿主细胞的相容性。所述载体可以是线性的或闭合环状质粒。

所述载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如，质粒，染色体外元件，微型染色体，或人工染色体的复制。

所述载体可包含任何确保自身复制的工具(means)。或者，所述载体可以在引入所述宿主细胞时，被整合进入基因组并与它所整合进入的染色体一起复制。另外，可用单个载体或质粒，或者总共包含要引入所述宿主细胞的基因组的全部DNA的两个或多个载体或质粒，或可用转座子。

角蛋白是存在于多种结构中的一家族坚韧蛋白的总称。它是被许多类的动物用作结构元件的蛋白，并且是纤维蛋白的经典例子。为了实现此结构功能，角蛋白分子是螺旋和纤维状的，从而围绕彼此缠绕形成称为中间丝的链。据认为，这使得角蛋白难以在一开始就被酶消化。另外，角蛋白含有高百分比的含硫氨基酸，主要是半胱氨酸，这些氨基酸在各个分子之间形成二硫键并有助于形成相当刚性的角蛋白结构。遗憾的是，二硫键也使得角蛋白的消化和降解相当困难。按照二级结构的不同，角蛋白主要分为α-角蛋白和β-角蛋白。α-角蛋白主要存在于哺乳动物的毛发(包括羊毛)、兽角、指/趾甲、爪子和兽蹄中。更硬的β-角蛋白存在于爬行动物的趾甲中及鳞和爪子中，它们的壳中(龟鳖目，诸如乌龟、海龟、水龟)，鸟类的羽毛、鸟喙、爪子中，以及豪猪的刚毛中。β-角蛋白主要以β-折叠的形式形成，但一些β-折叠也存在于α-角蛋白中。

本申请提供了一种角蛋白，尤其是一种重组角蛋白，所述角蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

角蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，蛋白全长(505)个氨基酸。本申请中的SEQID NO.1来源于Ⅱ型人发角蛋白的基因序列信息，keratin 81，记为K81。

SEQ ID NO.1如下：

MTCGSGFGGRAFSCISACGPRPGRCCITAAPYRGISCYRGLTGGFGSHSVCGGFRAGSCGRSFGYRSGGVCGPSPPCITTVSVNESLLTPLNLEIDPNAQCVKQEEKEQIKSLNSRFAAFIDKVRFLEQQNKLLETKLQFYQNRECCQSNLEPLFEGYIETLRREAECVEADSGRLASELNHVQEVLEGYKKKYEEEVSLRATAENEFVALKKDVDCAYLRKSDLEANVEALIQEIDFLRRLYEEEILILQSHISDTSVVVKLDNSRDLNMDCIIAEIKAQYDDIVTRSRAEAESWYRSKCEEMKATVIRHGETLRRTKEEINELNRMIQRLTAEVENAKCQNSKLEAAVAQSEQQGEAALSDARCKLAELEGALQKAKQDMACLIREYQEVMNSKLGLDIEIATYRRLLEGEEQRLCEGIGAVNVCVSSSRGGVVCGDLCVSGSRPVTGSVCSAPCNGNVAVSTGLCAPCGQLNTTCGGGSCGVGSCGISSLGVGSCGSSCRKC

本申请在此基础上，进一步对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行改造：基于氨基酸之间化学结构和电子密度图相似性，对氨基酸进行系统和特定的替换，用亲水性氨基酸理性替换蛋白质中特定的疏水性氨基酸，即亮氨酸(Leu，L)替换为谷氨酰胺(Gln，Q)、异亮氨酸(Ile，I)和缬氨酸(Val，V)替换成苏氨酸(Thr，T)、苯丙氨酸(Phe，F)替换成酪氨酸(Tyr，Y)，增强其亲水性，设计水溶性变体，且替换一些具有相似结构的氨基酸残基不会影响蛋白质的结构或功能。并通过在蛋白的N-末端添加短肽亲和标签例如6xHis标签以提高蛋白纯化的效率。蛋白序列的设计改造能够减少包涵体的产生，简化了处理过程和提高纯化效率，降低生产成本。

本申请的重组角蛋白同时保留SEQ ID NO.1所示的氨基酸序的活性区域。改造后的角蛋白序列如下SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2如下：

MHHHHHHEAAAKEAAAKEAAAKHHHHHHENLYFQGMTCGSGFGGRAFSCISACGPRPGRCCITAAPYRGISCYRGLTGGFGSHSVCGGFRAGSCGRSFGYRSGGVCGPSPPCITTVSVNESLLTPLNLEIDPNAQCVKQEEKEQTKSQNSRYAAYTDKTRYQEQQNKQQETKQQYYQNRECCQSNLEPQYEGYTETQRREAECTEADSGRQASEQNHTQETQEGYKKKYEEETSQRATAENEYTAQKKDTDCAYQRKSDQEANTEAQTQETDYQRRQYEEETQTQQSHISDTSVVVKLDNSRDLNMDCTTAETKAQYDDTTTRSRAEAESWYRSKCEEMKATTTRHGETQRRTKEETNEQNRMTQRQTAETENAKCQNSKQEAATAQSEQQGEAAQSDARCKQAEQEGAQQKAKQDMACQTREYQETMNSKQGQDTETATYRRQQEGEEQRLCEGIGAVNVCVSSSRGGVVCGDLCVSGSRPVTGSVCSAPCNGNVAVSTGLCAPCGQLNTTCGGGSCGVGSCGISSLGVGSCGSSCRKC。

本申请还提供了一种编码上述角蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

SEQ ID NO.3如下：

atgcatcatcatcatcatcatgaagcggcggcgaaagaagcggcggcgaaagaagcggcggcgaaacatcatcatcatcatcatgaaaacctgtattttcagggcatgacctgcggcagcggctttggcggccgcgcgtttagctgcattagcgcgtgcggcccgcgcccgggccgctgctgcattaccgcggcgccgtatcgcggcattagctgctatcgcggcctgaccggcggctttggcagccatagcgtgtgcggcggctttcgcgcgggcagctgcggccgcagctttggctatcgcagcggcggcgtgtgcggcccgagcccgccgtgcattaccaccgtgagcgtgaacgaaagcctgctgaccccgctgaacctggaaattgatccgaacgcgcagtgcgtgaaacaggaagaaaaagaacagaccaaaagccagaacagccgctatgcggcgtataccgataaaacccgctatcaggaacagcagaacaaacagcaggaaaccaaacagcagtattatcagaaccgcgaatgctgccagagcaacctggaaccgcagtatgaaggctataccgaaacccagcgccgcgaagcggaatgcaccgaagcggatagcggccgccaggcgagcgaacagaaccatacccaggaaacccaggaaggctataaaaaaaaatatgaagaagaaaccagccagcgcgcgaccgcggaaaacgaatataccgcgcagaaaaaagataccgattgcgcgtatcagcgcaaaagcgatcaggaagcgaacaccgaagcgcagacccaggaaaccgattatcagcgccgccagtatgaagaagaaacccagacccagcagagccatattagcgataccagcgtggtggtgaaactggataacagccgcgatctgaacatggattgcaccaccgcggaaaccaaagcgcagtatgatgataccaccacccgcagccgcgcggaagcggaaagctggtatcgcagcaaatgcgaagaaatgaaagcgaccaccacccgccatggcgaaacccagcgccgcaccaaagaagaaaccaacgaacagaaccgcatgacccagcgccagaccgcggaaaccgaaaacgcgaaatgccagaacagcaaacaggaagcggcgaccgcgcagagcgaacagcagggcgaagcggcgcagagcgatgcgcgctgcaaacaggcggaacaggaaggcgcgcagcagaaagcgaaacaggatatggcgtgccagacccgcgaatatcaggaaaccatgaacagcaaacagggccaggataccgaaaccgcgacctatcgccgccagcaggaaggcgaagaacagcgcctgtgcgaaggcattggcgcggtgaacgtgtgcgtgagcagcagccgcggcggcgtggtgtgcggcgatctgtgcgtgagcggcagccgcccggtgaccggcagcgtgtgcagcgcgccgtgcaacggcaacgtggcggtgagcaccggcctgtgcgcgccgtgcggccagctgaacaccacctgcggcggcggcagctgcggcgtgggcagctgcggcattagcagcctgggcgtgggcagctgcggcagcagctgccgcaaatgc。

本申请提供的序列不限于上述如SEQ ID NO:2所示具有特定氨基酸序列的角蛋白，在所述氨基酸序列的基础上经过修饰、和/或一个或几个氨基酸的取代、和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸并与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列具有95％以上同一性、且具有相同功能的氨基酸序列的角蛋白也在本申请的保护范围内。

本申请还提供了一种重组载体，所述重组载体包括上述核苷酸序列；优选地，所述重组载体为原核细胞重组载体；进一步优选地，所述原核细胞重组载体为pET3a、pET9a、pET14b、pET15b、pET16b、pET20b、pET21a、pET22b、pET23a、pET28a、pET30a中的任意一种，优选的，所述原核细胞重组表达载体为pET22b。

本申请还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述重组载体；优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌，优选的，所述宿主细胞为BL21、BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、Rosetta-gami(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysS、OrigamiB(DE3)、OrigamiB(DE3)pLysS中的任意一种，优选的，所述宿主细胞为BL21(DE3)。

在本申请的一些实施方式中，按照大肠杆菌密码子使用偏爱性数据表中大肠杆菌的密码子使用偏好，对上述经初筛的重组角蛋白的编码区序列进行优化，在保证重组角蛋白的蛋白质序列不变，只利用密码子的简并性的前提下，将在大肠杆菌中使用频率较低、会影响翻译过程中核糖体通过效率的密码子，用使用频率较高的密码子进行替换，得到密码子优化后的核酸序列，得到的序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。

根据所示的目的基因的核酸序列，经全基因合成并测序验证，得到模板基因，如SEQ ID NO:3所示。

本申请还提供了一种上述重组角蛋白的制备方法，包括：

首先合成编码SEQ ID NO.2所述的角蛋白的核苷酸序列，随后将核苷酸序列与原核细胞重组表达载体结合，得到重组载体；

将重组载体转入宿主细胞，随后诱导表达，并经过纯化得到角蛋白。

本申请还提供了一种防脱生发的微针，包括针尖部分，所述针尖部分包含上述重组角蛋白和针尖基质；以及基座部分，所述基座部分包含基座基质。

术语“微针”是指具有至少一个尺寸小于约1000微米(μm)的区域(例如，长度，基部直径等)的针状结构。在一些实施方式中，术语“微针”是指具有约1微米至约1000微米(例如，约1、5、10、25、50、75、100、200、300、400、500，600、700、800、900或约1000微米)的尺寸的结构。微针可以具有圆锥形或金字塔形的形状，或可以是大致棒状形状，但包括包含圆锥形或金字塔形的结构的一个末端/尖端。

所述脱发可以是指包括雄激素性脱发、斑秃、由维生素缺乏、微量元素缺乏、感染、化疗、合成代谢类固醇、口服避孕药或创伤引起的脱发。

所述针尖基质和基座基质包括透明质酸及其钠盐、聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物、聚乙烯醇及其衍生物、乙烯基吡咯烷酮与醋酸乙烯酯共聚物、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙二醇PEG、PVM/MA共聚物二酸及其钠/钙盐、羧化壳聚糖、果糖、乳糖、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、甘油、丙二醇、乙醇中的一种或两种以上，优选为透明质酸及其钠盐。

所述重组角蛋白在针尖基质中的浓度为50～200mg/ml，例如可以为60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、110mg/ml、120mg/ml、130mg/ml、140mg/ml、150mg/ml、160mg/ml、170mg/ml、180mg/ml、190mg/ml、优选为100～200mg/ml，进一步优选为200mg/ml。

本申请中，所述微针中的针尖部分还包括第二活性成分，所述第二活性成分可以是起到促进毛发生长的其他活性物质，与本申请提供的角蛋白共同起到促进毛发生长，防止脱发的的作用，第二活性成分可以是例如，包括但不限于KGF(角质细胞生长因子)、FGF(成纤维细胞生长因子)或米诺地尔中的一种或两种以上。

所述微针可以进一步包括本领域内可以常规接受的药物，以补强所述微针的效果，所述药物可以是一种也可以是多种药物的组合，所述药物包括但不限于疫苗、激素、基因工程药物、多肽、多糖、核苷类、蛋白质类、化学药物或天然药物成分。

本申请还提供了一种制备上述微针的方法，包括，

将角蛋白和针尖基质配置为针尖溶液；

将基座基质配置为基座溶液；

采用注模工艺将针尖溶液注入微针模具中，保持一定时间后去除表面气泡及多余液体，等待其形成角蛋白水凝胶；

随后，在模具基底加入基座溶液，干燥后从模具上取下得到所述微针。

所述保持为在真空下保持，所述保持时间为5～20min，例如可以为6、7、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min，优选为10min。

一种具体的实施方式中，所述微针模具的材料为聚二甲基硅氧烷、聚甲基苯基硅氧烷、聚四氟乙烯的一种或几种。

一种具体的实施方式中，所述注模工艺为真空注模、离心注模、超声注模、震荡注模中的一种或者多种的组合。

本申请还提供了一种防脱生发的组合物，组合物中包含上述的重组角蛋白和生理学上可接受的载体。

所述组合物可以以任何本领域内熟知的形式存在，只要能够起到防脱生发的效果即可，所述形式包括但不限于浆液、溶液、悬浮液、乳液、软膏、泡沫、糊剂、凝胶、乳膏、洗剂、喷雾剂或粉末等。

所述组合物在用于人类或动物用于起到防脱生发效果时，可以以任何本领域内常见的方法进行施用，例如可以以微针的形式输注在皮肤内，例如可以以局部施用在皮肤表面，例如可以是涂抹施用在皮肤表面，等等。

一种具体的实施方式中，当以局部施用在皮肤表面的形式时，所述组合物还包括渗透增强剂，所述渗透增强剂包括但不限于二甲亚砜及其类似物、氮酮类化合物、吡咯酮衍生物、醇类化合物及脂肪酸类化合物，等等。

本申请的防脱生发的重组角蛋白或者组合物，可以用于制备各种防脱生发产品，包括但不限于洗发水、护发液、生发液、护发精油、头皮涂抹精华液、头皮喷雾、发膜倒膜、焗油膏、护发营养液、护发弹力素等等。

本申请的防脱生发的重组角蛋白可以单独用于制备上述防脱生发产品，也可以先形成上述组合物再用于制备上述防脱生发产品。

本申请进一步提供了如上所述组合物在促进毛发生长或毛囊再生和/或用于预防或治疗毛发脱落或脱发的制剂中的用途。所述制剂包括但不限于洗发水、护发液、生发液、护发素、生发精华或生发膏等等。

本申请提供的重组角蛋白通过对现有技术中的人发角蛋白进行氨基酸序列改造：基于氨基酸之间化学结构和电子密度图相似性，对氨基酸进行系统和特定的替换，用亲水性氨基酸理性替换蛋白质中特定的疏水性氨基酸，即亮氨酸(Leu，L)替换为谷氨酰胺(Gln，Q)、异亮氨酸(Ile，I)和缬氨酸(Val，V)替换成苏氨酸(Thr，T)、苯丙氨酸(Phe，F)替换成酪氨酸(Tyr，Y)，增强其亲水性，设计水溶性变体，且替换一些具有相似结构的氨基酸残基不会影响蛋白质的结构或功能。改造后的重组角蛋白就有明显更加优越的防脱生发功能。

本申请改造后的重组角蛋白氨基酸序列通过在蛋白的N-末端添加短肽亲和标签例如6×His标签以提高蛋白纯化的效率。蛋白序列的设计改造能够减少包涵体的产生，简化了处理过程和提高纯化效率，降低生产成本。

本申请提供的微针的形貌呈阵列形态，质地均一、大小均一、排列整齐，且具有较好的力学性能，具有较好的皮肤刺入能力，针尖刺破效率较高，能够有效的穿透角质屏障并将微针内容物传递至皮肤内。包含了本申请的重组角蛋白，无毒无害，可以透过皮肤表皮和真皮层而增强皮肤给药效果，作为微创给药工具广泛使用。

通过与现有技术中常用的防脱生发药物如米诺地尔，以及改造之前的人发角蛋白相比，通过本申请制备的微针形式对防脱生发的功能进行评价，通过本申请的小鼠实验可以得出，本申请的重组角蛋白组能够有效增加毛囊密度，增大毛球体积，毛球部有大量黑色素生成，毛球位置更深且多位于皮下组织，而对照组包括米诺地尔组和人发角蛋白组毛囊密度相对小且体积小，毛球多位于皮肤浅表层。本申请的重组角蛋白能够加快毛囊由静止期进入生长期。

在促进毛囊数量增加方面，本申请的重组角蛋白组的毛囊数量明显多于米诺地尔组和人发角蛋白，与原始序列的人发角蛋白组具有非常显著差异，与米诺地尔组也具有显著性差异。

在毛囊生产发育方面，本申请的重组角蛋白组比米诺地尔组、人发角蛋白具有更高的表达，与米诺地尔组、人发角蛋白组都均有极其显著性的差异，本申请的提供的重组角蛋白更有利于毛囊的增殖和发育。

在对毛囊的刺激方面，本申请的提供的重组角蛋白能更好的上调毛囊标志物的表达，从而促进毛发的生长，与米诺地尔、人发角蛋白具有非常显著性差异。本申请提供的重组角蛋白可以刺激毛囊上皮干细胞增殖，从而诱导毛囊进入生长期，促进毛发生长，能够使得毛囊细胞增殖、迁移活动频繁，毛发生长旺盛。

在刺激毛囊周围的血管生成方面，与米诺地尔相比，本申请的重组角蛋白能够促进小鼠的皮下血管的形成，数量更多、血管更长，血管网络也更密集。本申请的重组角蛋白能够更加明显的刺激毛囊周围的血管分支和更为成熟的血管形成。

本申请的重组角蛋白和微针具有良好的刺激毛囊上皮干细胞增殖和发育，增加毛囊数量，诱导毛囊进入生长期，促进毛发生长、增粗增强的效果。

实施例

实施例1

1.1重组角蛋白氨基酸序列的合成和筛选

原始角蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(记为K81)，本申请在SEQ ID NO.1基础上，基于氨基酸之间化学结构和电子密度图相似性，对氨基酸进行系统和特定的替换，用亲水性氨基酸理性替换蛋白质中特定的疏水性氨基酸，即亮氨酸(Leu，L)替换为谷氨酰胺(Gln，Q)、异亮氨酸(Ile，I)和缬氨酸(Val，V)替换成苏氨酸(Thr，T)、苯丙氨酸(Phe，F)替换成酪氨酸(Tyr，Y)，增强其亲水性，设计水溶性变体，且替换一些具有相似结构的氨基酸残基不会影响蛋白质的结构或功能，对SEQ ID NO.1进行改造。并通过在蛋白的N-末端添加短肽亲和标签例如6×His标签以提高蛋白纯化的效率。本申请的重组角蛋白同时保留SEQ IDNO.1所示的氨基酸序的活性区域。经改造后，本申请的角蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示(记为K81-改)。

1.2重组角蛋白的制备

1.2.1扩增目的片段

1)目的基因的合成

按照大肠杆菌密码子使用偏爱性数据表中大肠杆菌的密码子使用偏好，对上述经初筛的重组角蛋白的编码区序列进行优化，在保证重组角蛋白的蛋白质序列不变，只利用密码子的简并性的前提下，将在大肠杆菌中使用频率较低、会影响翻译过程中核糖体通过效率的密码子，改为用使用频率较高的密码子进行替换，得到密码子优化后的核酸序列，得到的序列如序列表中SEQ ID No.3所示

根据所示的目的基因的核酸序列，经全基因合成并测序验证，得到模板基因，如SEQ ID NO:3所示。

2)根据目的基因的核酸序列，分别设计引物。以合成的模板基因为模板，以F-K81:atgcatcatcatcatcatcatgaagcggcgg(SEQ ID No.4)和R-K81:gcatttgcggcagctgctgccgcagctgcccac(SEQ ID No.5)为引物进行PCR扩增。

PCR反应体系：10μmol/L的引物1μL，1μL目的基因或线性化pET28a-His-TEV载体基因，dNTP(各2.5mM)4μL，10×Buffer(含Mg²⁺)5μL，1μL Pfu DNA Polymerase，加水补至总体积为50μL。

PCR反应条件：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸5min。

3)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。扩增得到的目的片段(1.0kb左右)与预期片段大小相同，即获得目的基因片段及pET22b-His-TEV载体基因片断。

1.2.2构建重组质粒

1)将纯化的目的基因片段4μL及pET22b-His-TEV线性化载体6μL，10XCloneEZBuffer 2μL，CloneEZ Enzyme 2μL，去离子水补足20μL，混合，22℃保持30分钟，之后在冰上保持5分钟。

2)取100μL的DH5α或者Top10大肠杆菌感受态细胞，加入上述混合液，轻弹数下，置冰上孵育30分钟；42℃水浴中热激90秒，冰上孵育5分钟；向细胞中加入1mL SOC培养基，37℃轻摇1小时，转速为200rpm；5000rpm离心5分钟收集菌体，用100μL SOC液体培养基重悬菌体。

3)将菌体均匀地涂布在含抗生素平板上，37℃过夜培养。分别挑取3个阳性克隆接于含50μg/mL卡那霉素(Kan)抗生素的5mL LB培养基中37℃，220rpm/min过夜培养。

4)分别对每一个样品的菌液取3mL提取质粒(天根质粒提取试剂盒)，送南京金斯瑞进行测序，测序正确的命名为pET22b-His-TEV-K81质粒。

1.2.3构建大肠杆菌基因工程菌

1)取BL21(DE3)感受态细胞于冰中溶解，取1μL重组质粒加入BL21(DE3)感受态细胞轻轻混匀。在冰中静置30min后，于42℃热激60s迅速放回冰中。然后向感受态细胞中加入450μL室温LB培养基并于摇床37℃，220rpm摇1小时。

2)再从管中取100μL菌液涂于含Kan抗生性的LB平板，37℃过夜培养。从平板上挑2个阳性克隆接于含50μg/mL Kan抗生素的5mL LB培养基中，37℃，220rpm摇菌培养3h左右，OD600＝0.6，取菌液保种。即获得大肠杆菌基因工程菌。

1.2.4诱导重组蛋白表达

1)取20μL上述保种的大肠杆菌基因工程菌于含Kan抗性的200mL的LB液体培养基中，37℃，140rpm过夜培养。

2)再将上述培养过夜的细菌培养液，按2％的接种量转接到含有Kan的LB液体培养基中，37℃110rpm培养3h左右，测OD600＝0.6左右，分别向培养基中加入0.5mM的IPTG诱导剂，16℃诱导培养16h，测OD600＝2.0-2.5，停止诱导。将菌液于3800rpm，4℃离心10min，收沉淀菌体。

1.2.5HisFF亲和层析纯化蛋白

1)取上述收集的沉淀菌体细胞20g，用100mL Tris缓冲液重悬，缓冲液中50mMTris(pH 8.0)，500mM NaCl，5％wt Glycerol。均质机破碎2次，混匀，4000rpm 4℃离心0.5h，由于目的蛋白主要存在于包涵体中，所以收集沉淀备用。

2)将收集的沉淀用40mL变性buffer(50mM Tris(pH 8.0)，500mM NaCl，5％甘油，20mMβ-巯基乙醇，8M尿素，余量为去离子水)重悬溶解。充分溶解后，20000rpm离心1h取上清液，再将上清液转入5mL HisFF亲和柱中(经变性Buffer平衡)。

3)用10倍变性buffer冲洗层析柱。然后依次用含有10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、300mM和500mM咪唑的变性buffer进行阶段洗脱，收集洗脱蛋白液，以透析液(25mMTris pH＝8.0，10mM咪唑，20mMβ-巯基乙醇，20mM半胱氨酸，余量为去离子水)脱盐换缓冲。

4)向步骤3)获得的蛋白液中加入TEV酶，在25℃条件下酶解2小时，除去蛋白N-末端的融合His标签，离心收集上清液。转入5mL HisFF亲和柱中(经透析液平衡)，用3倍透析液冲洗，收集流穿液。

5)以透析液(20mMβ-巯基乙醇，20mM半胱氨酸，余量为去离子水)透析脱盐，透析时间为12h，冻干，即得目标蛋白，SDS-PAGE电泳鉴定结果如图1所示。

实施例2微针的制备

1)配制200mg/ml的角蛋白溶液作为微针针尖溶液；

2)用PBS缓冲溶液配制100mg/ml的HA溶液作为微针的基座溶液；

3)取100μl的针尖溶液滴于微针PDMS模板，置于真空下保持10min填充针尖，随后取出去除表面气泡及多余液体，放置于室温中待其自然形成角蛋白水凝胶。随后，在模具基底加入200μl配制好的HA溶液并在室温下进行干燥。完全干燥后，将制备好的微针贴片从PDMS模具中取下待进一步使用。

实施例3微针测试

3-1微针形貌

制备的微针使用SEM(扫描电子显微镜)拍摄以观察具体形貌，如图2所示，图中显示，表明本申请制备的微针呈阵列形态，质地均一、大小均一、排列整齐。使用罗丹明B标记针尖，FITC(异硫氰酸荧光素)标记微针基底进行荧光显微镜观察，如图3所示，图中显示，微针呈阵列形态，质地均一、大小均一、排列整齐。

3-2微针机械性能

使用万能实验压缩机对实施例2制备微针进行力学性能测试，测试前观察微针完整，无弯曲、破损。将每个待测样品针尖向上放置于实验台上，每次实验保证探头与底板位移一致。然后使探头的预设位移距离为600微米，触发力为0.01N，每2s采集一次数据进行压缩，记录力与位移的曲线，实验过程和结果如图4所示，图中可以看出本申请所制备的微针具有较好的力学性能可以刺破皮肤。

3-3微针皮肤刺入性能

取裸鼠皮肤，将实施例2制备的微针刺入皮肤组织并保持5-8分钟。取下微针，用4％的台盼蓝染料处理微针作用的部位5分钟。用生理盐水洗去多余的台盼蓝染液，相机或显微镜拍照，统计微针刺入皮肤情况。

将微针处理后的皮肤组织浸泡在10％的福尔马林，制作H&E切片后，显微镜观察、拍照。

结果如图5所示，表明本申请制备的微针对染色针孔进行统计分析穿刺效率达到92.56％，说明其具有较好的皮肤刺入能力，针尖刺破效率较高，能够有效的穿透角质屏障并将微针内容物传递至皮肤内。

3-4微针安全性

取实施例3中经过微针刺入的实验组小鼠和对照组小鼠(未被微针刺入)的器官组织心、肝、脾、肺和肾进行染色切片观察微针是否会产生毒副作用，以此来评价微针的安全性。

实验过程中实验组和对照组均没有动物死亡，治疗部位没有出现感染。观测阶段，动物均没有出现发声、呼吸困难、移动困难、食欲不振等临床不良反应。实验动物的术后行为和生理症状在一定程度上能反映植入材料的急性毒性。换言之，如果微针治疗诱发毒性反应，由于炎症细胞的大量聚集，会使宿主的脏器显著增大，生理状态会明显不佳，食欲不振、少动，体重衰减等。急性毒性实验结果表明微针治疗不会造成组织器官的损伤，与正常小鼠进行比较也没有发现明显的病理变化。具体地，如图6中显示，在心、肝、脾、肺和肾的组织切片中没有发现明显的局部杂乱的心肌衰细胞侵蚀、肝脏部位散乱的炎症细胞堆积、肾脏充血等病理性组织。因此，本申请的微针治疗不会引起实验小鼠的急性毒性和组织损伤，具有较好的组织相容性。

试验例1

实验步骤

1)C57BL/6J小鼠(16只)培养六周，适应培养一周后，进行剃毛建立脱发模型，平均分为四组，分别为空白对照组、重组角蛋白组、米诺地尔组、人发角蛋白组；

2)将重组角蛋白、米诺地尔(蔓迪米诺地尔酊，浙江万晟药业有限公司)、人发角蛋白按照实施例2的方法配置成微针的针尖溶液，并按照实施例2的方法制备微针，同时按照实施例2的方法制备空白微针，其中针尖溶液中的角蛋白用生理盐水代替；

本申请所使用的人发角蛋白以人发为原料通过还原法提取，提取方法如下，

①清洗头发

称取十二烷基磺酸钠4g，溶解于800ml二蒸水中配制成浓度为0.5％的溶液备用。再称取头发20g，用清水冲洗后放入盛有SDS溶液的烧杯中，搅拌清洗6h。(清洗液体积≥头发质量的40倍。)将清洗完后的头发用自来水冲洗5次，再用二蒸水冲洗两次，放入烘箱干燥。

②还原反应

用量筒量取15.4ml硫代乙醇酸倒入1000ml烧杯中，加入400ml二蒸水稀释成浓度为0.5M的TGA溶液，用NaOH调节PH至11备用。将清洗并干燥后的头发放入TGA溶液中，搅拌反应15h。(还原液体积≥头发质量的20倍。)反应完成后，将反应液过滤，留取头发与滤液1。

③Tris液提取

称取9.68g三羟甲基氨基甲烷溶解于800ml二蒸水中配制成浓度为100mM的Tris液备用。将步骤2中过滤留取的头发倒入其中，搅拌反应2h。(Tris液体积≥头发质量40倍。)反应之后，过滤，留取头发与滤液2。

④蒸馏水提取

将步骤③中反应过的头发，再用800ml蒸馏水提取，搅拌反应2h。(蒸馏水体积≥头发质量40倍。)反应之后，过滤，留取头发与滤液3。

⑤调节pH并离心

将上述滤液1、2、3混合，用盐酸调节其pH为7.4，离心后弃去沉淀取上清液。(离心参数为：6000rpm，4℃，30min)

⑥再次调节PH并离心

取步骤5离心后的上清液用盐酸再次调节其pH为4.0—4.2(等电点)，令角蛋白沉淀，再次离心，弃去上清液留取沉淀。(离心参数为：6000rpm，4℃，30min)

⑦溶解并透析

称取4g氢氧化钠溶于100ml二蒸水中备用。将上一步所得的沉淀溶解于NaOH溶液中，并置于透析袋，透析3d。(透析液每12h更换一次。)

⑧冷冻干燥

将步骤7所得透析过的角蛋白溶液置于培养皿中，-40℃冰箱中预冷后，置于冷冻干燥器中干燥3d，再将制得的角蛋白于研钵中研磨成粉末状，待用。

3)在1/3/5/7/9天施用步骤微针2)制备的四种微针分别对步骤1)中相应的小鼠分组进行给药，拇指按压5min使其充分刺破皮肤表面，使贴片吸收液体，4h后移除微针基底，使针尖停留在皮肤中持续给药，如图7所示；

4)在1d、10d、14d、18d进行拍照记录观察毛发的变化。

5)实验第18天，将空白对照组、重组角蛋白组、米诺地尔组、人发角蛋白组分别颈椎脱臼处死小鼠，背部平行脊柱相同部位取材，10％甲醛固定进行石蜡包埋切片，H&E染色(苏木精—伊红染色法)。

实验结果

光镜下观察毛囊组织学变化，并对毛囊进行形态学分期。如图8所示，从图中可以看出，本申请的重组角蛋白组的毛囊密度最大，毛球体积增大且毛球部有黑色素生成，毛球位置更深且多位于皮下组织，而对照组包括米诺地尔组和人发角蛋白组毛囊密度相对小且体积小，毛球多位于皮肤浅表层。提示重组角蛋白微针处理后能够加快毛囊由静止期进入生长期，而对照组处理毛囊多处于静止期。

显微镜下统计每个视野中毛囊数量，结果如图9所示，重组角蛋白组的毛囊数量明显多于对照组、米诺地尔组和人发角蛋白组，与对照组具有极其显著差异，与原始序列的人发角蛋白组具有非常显著差异，与米诺地尔组也具有显著性差异。

同时，确定各组毛囊所处的周期，计算平均毛囊周期评分。评分标准采用以下表1所示(参考文献：Sven Müller-Kerstin Foitzik,Ralf Paus,Bori Handjiski,Carina van der Veen,Stefan Eichmüller,Ian A.McKay,Kurt S.Stenn,AComprehensive Guide for the Accurate Classification of Murine Hair Folliclesin Distinct Hair Cycle Stages,Journal of Investigative Dermatology,Volume117,Issue 1,2001,Pages 3-15,ISSN 0022-202X)

毛囊评分是以数字化的形式反映毛囊周期的重要指标之一。毛囊的动态生长周期主要包括生长期、退行期以及静止期，其中生长期又细分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ期。根据毛囊的形态、位置、组成等统计H&E切片中处于生长期各阶段或静止期的毛囊数目，并参照表1的毛囊评分标准对毛囊进行评分，毛囊周期评分＝(静止期毛囊数量×0+生长期Ⅰ-Ⅲa毛囊数量×100+生长期Ⅲb-Ⅲc毛囊数量×200+生长期Ⅳ-Ⅵ毛囊数量×300)/总毛囊数量。

评分结果如图10所示，重组角蛋白组的的毛囊周期评分最高，与空白对照组合好原始序列的人发角蛋白组都具有极其显著性差异，与米诺地尔组也具有非常显著性差异。提示重组角蛋白微针处理能够显著加快毛囊从静止期向生长期的转变，从而诱导比米诺地尔组更快速的毛发再生。

表1毛囊周期评分标准

通过H&E检测表明与对照组或经米诺地尔组及人发角蛋白组相比，重组角蛋白微针处理皮肤组织，毛囊位于皮肤深处并且毛囊的数量更多。

试验例2

将试验例1制备的空白对照组、重组角蛋白组、米诺地尔组、人发角蛋白组石蜡切片进行鼠单克隆抗体K14、β-连蛋白和K15免疫组化染色。镜检拍照，用ImageJ软件进行统计分析。

K14分布于表皮的基底层细胞和毛囊外根鞘细胞内，是基底角质形成细胞分裂的典型标志，具有维持细胞形状、抗机械应力的作用。基底层细胞内由K14形成的角蛋白纤维网架极富弹性，既有一定的抗张强度，又便于细胞分裂和细胞运动。生长期毛囊细胞增殖、迁移活动频繁，K14表达增强，对维持角质形成细胞形态，防止细胞溶解起重要作。而退化期和静止期毛囊细胞活动减少，K14表达逐渐降低。空白对照组、重组角蛋白组、米诺地尔组、人发角蛋白组石蜡切片进行鼠单克隆抗体K14免疫组化染色的实验结果如图11所示，与空白对照组相比，本申请的重组角蛋白组K14表达最显著，作为细胞的标志物，提示该组毛囊细胞增殖、迁移活动频繁，毛发生长旺盛。

研究报道称Wnt信号途径在毛囊生长发育过程中发挥重要作用。其中参与毛发的生长最主要的是Wnt/β-连蛋白(β-catenin)信号通路，它具有调控皮肤上皮组织的形态发生和调节毛囊的发育及相关细胞的分化作用。β-catenin对毛囊的生长具有重要的促进作用，是毛囊生长、周期维持重要的调节因子，通过影响β-catenin表达能够影响毛囊干细胞的活性，进而维持毛囊周期。空白对照组、重组角蛋白组、米诺地尔组、人发角蛋白组石蜡切片进行鼠单克隆抗体β-连蛋白免疫组化染色统计其表达情况的实验结果如图12所示，图中显示，本申请的重组角蛋白组比空白对照组、米诺地尔组、人发角蛋白组具有更高的表达，与空白对照组、米诺地尔组、人发角蛋白组都均有极其显著性的差异，说明本申请的提供的重组角蛋白更有利于毛囊的增殖和发育。

K15是毛囊的标志物角蛋白，空白对照组、重组角蛋白组、米诺地尔组、人发角蛋白组石蜡切片进行鼠单克隆抗体K15免疫组化染色的实验结果如图13所示，对其标志物的表达情况进行免疫荧光的验证，发现本申请的提供的重组角蛋白能更好的上调毛囊标志物的表达，从而促进毛发的生长，与空白对照组具有极其显著性差异，与米诺地尔组、人发角蛋白组也具有非常显著性差异。说明本申请提供的重组角蛋白可以刺激毛囊上皮干细胞增殖，从而诱导毛囊进入生长期，促进毛发生长。

试验例3

毛囊周围的血管生成与毛发周期密切相关，在毛发生长期有大量的血管生成，而在毛发退行期及静止期，毛囊周围的血管减少并退化。丰富的血管可携带血液、氧气和营养物质通过新生毛细血管网供给给毛囊，从而促进毛发生长。

本申请进一步对空白对照组、重组角蛋白组、米诺地尔组、人发角蛋白组处理的小鼠的毛发再生部位的皮肤内侧血管生成进行观察。

试验方法，剃除小鼠背部再生毛发后用脱毛膏完全去除，切开背部皮肤全层观察皮肤内侧血管生成情况，结果如图14所示。

与空白对照组和米诺地尔组相比，重组角蛋白组和人发角蛋白组小鼠背部皮下血管明显增加，且能够清晰的看见血管分支和更为成熟的血管形成，而本申请的重组角蛋白组治疗的小鼠，其皮下血管数量更多、血管更长，血管网络也更密集。

尽管以上结合对本申请的实施方案进行了描述，但本申请并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本申请权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本申请保护之列。

Claims (10)

1.一种角蛋白，其特征在于，所述角蛋白包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

2.一种编码如权利要求1所述的角蛋白的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含如权利要求2或3所述的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为原核细胞重组表达载体。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述原核细胞重组表达载体为选自pET3a、pET9a、pET14b、pET15b、pET16b、pET20b、pET21a、pET22b、pET23a、pET28a、pET30a中的任意一种，优选的，所述原核细胞重组表达载体为pET22b。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求4～6任一所述的重组载体。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌；优选的，所述大肠杆菌选自BL21、BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、Rosetta-gami(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysS、OrigamiB(DE3)、OrigamiB(DE3)pLysS中的任意一种，优选的，所述宿主细胞为BL21(DE3)。

9.一种制备如权利要求1所述角蛋白的方法，其特征在于，包括：

首先合成编码权利要求2或3所述的角蛋白的核苷酸序列，随后将核苷酸序列与原核细胞重组表达载体结合，得到重组载体；

将重组载体转入宿主细胞，随后诱导表达，并经过纯化得到角蛋白。

10.一种防脱生发的微针，包括：

针尖部分，所述针尖部分包含权利要求1所述的角蛋白和针尖基质；以及

基座部分，所述基座部分包含基座基质。