CN116925202A - 一种伸展蛋白的制备及其防脱发应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过基因工程方法制备特定氨基酸序列的伸展蛋白，并对其防脱发效果进行了研究。伸展蛋白的制备包括三步：菌株的构建与试表达，菌株的发酵培养，蛋白的分离纯化。本发明制备的伸展蛋白纯度高，适合放大生产，用作化妆品原料，防脱发效果显著。

Description

一种伸展蛋白的制备及其防脱发应用

技术领域

本发明属于日用化妆品技术领域，具体涉及通过基因工程技术制备一种特定氨基酸序列的伸展蛋白，特别涉及了其防脱发应用。

背景技术

随着环境污染日趋严重、人们生活压力不断提高，以及洗发产品的刺激，头皮敏感人群比例正在不断扩大，受脱发困扰的人群越来越多，40%的35岁以上的男士、65%的60岁以上的男士以及80%的80岁以上的男士正在面对脱发的尴尬。而且脱发不再是男性的专利，每4名女性当中就有一位出现脱发和发丝偏脆弱的问题。

目前针对脱发的主要解决手段包括手术治疗和药物治疗。手术治疗以植发为主，将自体毛囊移植到脱发部位，费用较高，且毛囊存活率低。药物治疗主要以米诺地尔、非那雄胺为主，米诺地尔是抗高血压的血管舒张药，通过延长头发生长期来缓解脱发，需要长期使用，成本较高，副作用会导致多毛症、眼睛发红发痒等；非那雄胺是处方药，通过抑制5α-还原酶缓解脱发，只对雄秃有效，副作用会导致性功能障碍、不孕不育等。这两种手段都存在以下问题：成本高，副作用多。面对庞大的脱发群体，对高效、低成本且副作用少的防脱成分的需求极为迫切。

毛发发育再生与伤口愈合相似，需要组织形成、细胞生长和细胞迁移之间高度协调的相互作用，依赖于细胞信号通路。最近研究发现，缺氧诱导因子（HIF-1）途径是控制真皮毛乳头的分子信号传导的新模式，HIF-1是一种异源二聚体,主要由120kD的HIF-1α和91~94kD的HIF-1β两个亚单位组成。缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在伤口愈合过程中驱动新生血管、胶原蛋白和弹性蛋白的产生，在毛囊可以增强血管新生和组织再生，恢复毛囊健康状态。Julia等（Skin Pharmacol Physiol. 2021, 33(6): 309-316）测试咖啡因、米诺地尔和HIF-1α刺激剂去铁酮均显著增强了真皮乳头细胞的增殖，改善了脱发症状。Bernard等人（JInvest Dermatol. 2013, 133: 2094-2097）提出HIF-1介导的缺氧信号对于毛囊在毛发重新进入新的毛发周期非常重要。但HIF-1α亚基会受到由von Hippel-Lindau（VHL）蛋白介导的氧依赖性泛素化和蛋白酶体降解，失去活性，抑制HIF-1α与VHL的结合，保证HIF-1α活性，有助于缓解脱发，恢复毛囊健康状态。Buckley等（Angew Chem Int Ed Engl. 2012, 51(46): 11463-11467）报道了一系列VHL配体，能够竞争性地抑制HIF-1α与VHL结合，这些配体的一个重要特征是含有一个羟脯氨酸残基。

伸展蛋白（Extensin）是植物细胞壁中的一类非常重要的结构蛋白，其重量占细胞壁20%，伸展蛋白富含羟脯氨酸，蛋白质核心氨基酸组成中羟脯氨酸的含量一般为总氨基酸摩尔数的30%-40%。一直以来，伸展蛋白在植物中的作用研究很多，其可以参与植物细胞壁的组装，强韧细胞壁，起到抵抗微生物和机械应力的作用，关于其他方面的应用研究甚少。通过分子对接（Molecular Docking）技术确定能够与VHL对接的伸展蛋白片段，将伸展蛋白基因转化到微生物中使其表达，再进行发酵分离纯化，可得到高产量高纯度的伸展蛋白，应用到头皮护理产品中，为脱发问题提供新的解决方案。

发明内容

本发明的目的一方面在于通过基因工程技术制备一种特定氨基酸序列的伸展蛋白，以获得高产量高纯度的伸展蛋白片段。

为解决上述问题，解决方案如下。

一种重组伸展蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；所述SEQ ID NO: 1氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或与上述氨基酸序列至少有80%同源性的，且功能相同或相似的氨基酸序列。

进一步的，一种重组伸展蛋白的制备方法，包括如下步骤。

步骤A、在质粒pET28α-SUMO上插入如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列，获得重组伸展蛋白的目的片段和表达载体。

步骤B、提取步骤A中的构建质粒的DNA，然后与大肠杆菌底盘混合，转化完成后将其涂布于抗性筛选培养基平板上，筛选阳性克隆，即获得含有重组伸展蛋白基因的大肠杆菌生物底盘。

步骤C、将步骤B中得到的表达重组伸展蛋白的大肠杆菌菌株，接种至YPD培养基，并于200rpm、37℃摇床内培养至对数期，加入终浓度为0.2mM的IPTG进行诱导，于200rpm、23℃摇床内继续培养6小时，通过离心、浓缩等工艺富集发酵产物，并对其进行高压均质破碎，破碎后得到含有重组伸展蛋白的产物。

步骤D、将步骤C中收集的发酵产物，通过Ni柱纯化后，并去除融合标签SUMO，过分子筛后得到伸展蛋白EXTs。

进一步的，一种重组伸展蛋白的制备，所述去除融合标签SUMO的方法为使用SUMO蛋白酶，于4℃下酶切，低温酶切可更好地保护蛋白活性。

进一步的，对收集的伸展蛋白EXTs，可以进行冷冻干燥，同时添加蛋白保护剂，该方法可有效保持蛋白活性。

本发明在第二方面提供了伸展蛋白防脱方面的应用，伸展蛋白防脱机制如下：伸展蛋白片段能与VHL结合，竞争性抑制HIF-1α与VHL的结合，保证HIF-1α活性，HIF-1介导的缺氧信号对于毛囊在毛发重新进入新的生长周期非常重要，可以增强血管新生和组织再生，有助于缓解脱发，恢复毛囊健康状态。

进一步的，按照本发明制备出的伸展蛋白，水溶性好，易应用于毛发护理日化领域，包括但不限于生发液、洗发水、护发素、发膜、发胶、发蜡、毛发营养霜、焗油膏、染发剂、头皮按摩精华、头皮按摩霜、眉粉、睫毛膏。

进一步的，本发明制备的伸展蛋白可以用于各种制剂，包括但不限于水剂、精华、乳液、膏霜、凝胶、固体、冻干粉、脂质体。

进一步的，本发明制备的伸展蛋白可用于制备防脱及毛发生长相关的医药用品和化妆品，所述的毛发包括头发、眉毛、睫毛。

有益效果

1.对天然植物蛋白进行截断、重组，人工设计其氨基酸序列，该序列首次在皮肤中应用。

2.本发明提供的制备方法，可以获得活性稳定的伸展蛋白，且通过优化蛋白诱导条件，蛋白表达量有所提高。

3.通过实验验证了制备的伸展蛋白的防脱发效果，为防脱发产品提供了新的解决方案，同时拓展了伸展蛋白的功效，扩大了其在日化领域的应用范围。

具体实施例

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合以下实施例进行具体说明。应理解，本发明实施例仅用于说明本发明的技术效果，而非用于限制本发明的保护范围。

实施例1：表达载体的构建。

本发明实施例1为获得伸展蛋白EXTs目的片段和表达载体。

（1）使用带有融合蛋白标签的载体pET28α-SUMO，根据相关序列位置设计酶切位点，并插入伸展蛋白EXTs的基因序列。伸展蛋白EXTs的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1：PPPLRPLPTADPAPLHRRSPPPPPPHRRLP，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 2：CCGCCTCCACTGCGGCCTCTCCCCACCGCGGATCCGGCGCCTCTCCACCGCCGGTCCCCTCCTCCTCCGCCACCTCACCGCCGCCTGCCA。

（2）通过PCR法扩增伸展蛋白EXTs，引物分别为F1：5`-tgaccatgattacgccaATGCCGCCTCCACT-3`和R1：5`-acctgcaggcatgcaTTATGGCAGGCGGCGGT-3`，使用普通DNA产物纯化试剂盒对目的片段进行纯化。

（3）构建的载体质粒为pET28α-SUMO，带有一个能够促进蛋白正确折叠且可以无痕切割的标签SUMO，使用MscI酶对pET28α-SUMO进行单酶切，酶切方法如产品说明书所述，酶切完成后使用普通DNA产物纯化试剂盒对线性载体进行纯化。

（4）上述纯化后的片段和线性载体，使用无缝克隆的方法进行连接，方法参照Gibson Method试剂盒说明书。

（5）连接后的质粒，转化至DH5α感受态细胞，孵育后涂布含有Kan抗性的LB培养皿中，筛选连接正确的阳性克隆，并提取质粒。

（6）对质粒进行外送测序并比对序列信息，比对无误的质粒即为本实施例所构建的表达载体，命名为pET28α-SUMO-EXTs。

实施例2：底盘细胞的构建。

本发明实施例2为获得含有伸展蛋白EXTs基因的大肠杆菌底盘。大肠杆菌底盘使用BL21(DE3)，具体实施步骤如下。

（1）将大肠杆菌BL21(DE3)菌株，划线至LB培养基的无菌培养皿中，于37℃恒温培养箱内倒置培养60h以上，得到活化的菌落。

（2）从平板上挑取新鲜菌落，转接至7ml的LB试管中，于37℃、200rpm摇床内培养约4h，得到活化的高密度大肠杆菌菌株，并离心富悬液约5ml，富集菌株。

（3）使用大肠杆菌转化试剂盒，将质粒pET28α-SUMO-EXTs转化至上述大肠杆菌中，具体操作步骤参照试剂盒说明。

（4）将转化后的菌株，涂布抗性筛选培养基，于37℃恒温培养箱内倒置培养过夜，直至平板上长出较大菌落。

（5）挑取上述平板上的阳性转化子，转接至LB抗性试管中，于28℃、200rpm摇床内培养约24h，使用紫外分光光度计检测OD600数值为6以上。

（6）取上述发酵液，添加终浓度为25%的甘油，保藏于-80℃冰箱内备用，即得到含有伸展蛋白EXTs的大肠杆菌底盘细胞甘油保藏菌株，并命名为BL21(DE3)-EXTs。

实施例3：伸展蛋白的纯化。

本发明实施例3为获得伸展蛋白EXTs。具体实施步骤如下。

（1）将BL21(DE3)-EXTs接种至100ml的LB摇瓶培养基内，于37℃、200rpm摇床过夜培养约16 h，得到发酵种子液。

（2）取上述新鲜种子液，转接至含2L YPD液体培养基的5L摇瓶内，于37℃、200rpm摇床培养至OD600约为0.4-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导，于37℃、200rpm摇床继续培养4h，得到含有大量伸展蛋白EXTs表达的发酵产物。

（3）上述发酵产物经过离心等工艺，富集发酵菌株，菌株重悬后经均质破碎，收集上清液，得到含有EXTs蛋白的组分。

（4）使用AKTA蛋白纯化仪，利用Ni柱纯化含有融合标签SUMO的伸展蛋白EXTs，并使用SDS-PAGE电泳验证蛋白大小。

（5）使用SUMO蛋白酶过夜酶切SUMO-EXTs，过分子筛后得到取出标签的EXT蛋白。

实施例4：伸展蛋白的表达优化。

本发明实施例4为获得伸展蛋白EXTs的最优表达条件。具体实施步骤如下。

（1）将BL21(DE3)-EXTs接种至100ml的LB摇瓶培养基内，于37℃、200rpm摇床过夜培养约16h，得到发酵种子液。

（2）取上述新鲜种子液，1%接种量转接至含200mL YPD液体培养基的500mL摇瓶内，于37℃、200rpm摇床内培养至OD600约为0.6，共做9个平行。

（3）上述9个摇瓶，每3瓶为一组，每组的3个摇瓶内，分别加入终浓度为0.05mM、0.1mM、0.2mM的IPTG诱导，3组摇瓶分别于18℃、23℃及37℃、200rpm摇床继续培养4h，得到含有大量伸展蛋白EXTs表达的发酵产物。

（4）上述发酵产物经过离心等工艺，富集发酵菌株，菌株重悬后经均质破碎，收集上清液，得到含有EXTs蛋白的组分。

（5）使用AKTA蛋白纯化仪，利用Ni柱纯化含有融合标签SUMO的伸展蛋白EXTs，并使用SDS-PAGE电泳验证蛋白大小，使用BCA法测试不同诱导条件下的蛋白表达量。

（6）检测响应的蛋白浓度，得到最佳的伸展蛋白EXTs诱导表达条件为23℃、终浓度0.2mM的IPTG。

实施例5：含有伸展蛋白的防脱生发精华液。

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制备方法。

（1）将活性咖啡因、甘油、去离子水加入到反应釜中，搅拌加热至70℃，保温20分钟，为A相，降温至40℃。

（2）将B相原料依次加入反应釜中，搅拌均匀。

（3）将苯氧乙醇、辛甘醇加入到丁二醇中，搅拌均匀，加入到反应釜中，混合搅拌均匀，即得含有伸展蛋白的防脱生发精华液。

实施例6：含有伸展蛋白的防脱洗发水。

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制备方法。

（1）将聚季铵盐-10、尼泊金甲酯、去离子水加入到反应釜中，搅拌加热至80℃，保温20分钟。

（2）将B相原料加入反应釜中，搅拌降温至45℃。

（3）将C相原料加入反应釜中，搅拌均匀。

（4）将香精加入到PPG-13-癸基十四醇聚醚-24中搅拌均匀为D相，将D相加入到反应釜中，搅拌均匀。

（5）用乳酸调节PH至4.5左右，即得含有伸展蛋白的防脱洗发水。

实施例7：小鼠脱发模型测试伸展蛋白的防脱性能。

实验配方。

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制备方法。

实验组：将甘油、伸展蛋白、鼠李糖依次加入去离子水中，搅拌均匀为A相，将苯氧乙醇、辛甘醇加入到丁二醇中，混合搅拌均匀为B相，将B相加入到A相中，搅拌均匀。

对照组：将甘油、鼠李糖依次加入去离子水中，搅拌均匀为A相，将苯氧乙醇、辛甘醇加入到丁二醇中，混合搅拌均匀为B相，将B相加入到A相中，搅拌均匀。

将7周龄的C57BL/6雌性小鼠在温度为25±3 ℃，湿度为65±5%的空调房里适应性饲养1周，对小鼠背部皮肤进行脱毛处理，具体处理方法为：在小鼠背部两侧各取1×3 cm²面积，先用剃毛器剔除毛发，再用脱毛膏进行脱毛处理。将小鼠分为三个小组，每组10只，A组涂抹实验组产品，B组涂抹对照组产品，C组涂抹市售米诺地尔酊（5%）作为阳性对照，涂抹剂量为0.2 mL，每天涂抹一次，连续涂抹18天。每日观察小鼠两侧毛发生长情况并进行拍照，第19天将小鼠处死进行HE染色，观察毛囊生长情况。

结果显示，第19天对照组小鼠毛发暗淡，没有光泽，出现了脱毛现象，实验组和阳性对照组小鼠毛发生长旺盛，有光泽。小鼠背部皮肤切片HE染色结果如图1所示，对照组小鼠毛囊数量明显变少，毛球根部上移，毛囊进入退行期；米诺地尔酊组毛囊数量没有变少，但部分毛囊上移至真皮层，毛囊有进入退行期趋势；实验组毛囊多分布在皮下组织，毛球中可见明显黑色素和毛发，多数毛囊处于生长期，且数量明显多于对照组。实验结果说明添加了伸展蛋白能够明显延缓小鼠脱毛速度，具有防脱效果，防脱效果优于米诺地尔。

图1 小鼠背部皮肤毛囊HE染色图。

实施例8：志愿者测试防脱效果。

招募有脱发困扰的志愿者20名进行防脱效果盲测，志愿者随机分为两组，一组10人，A组涂抹实施例7制备的实验组产品，B组涂抹实施例7制备的对照组产品，连续使用60天，在0天和60天拍照记录头发生长状况，观察脱发情况和头发生长情况。

实验结果显示，B组志愿者反馈脱发现象无变化，A组10名志愿者全部反馈脱发数量减少，其中有1名志愿者（男，35岁）反馈毛发新生效果明显，细软毛发变粗壮，如图2所示，说明伸展蛋白在人体上具有防脱发效果。

图2 志愿者测试生发示例图。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之内。

序列表。

SEQ ID NO: 1

EXTs

PPPLRPLPTADPAPLHRRSPPPPPPHRRLP。

SEQ ID NO: 2

EXTs

CCGCCTCCACTGCGGCCTCTCCCCACCGCGGATCCGGCGCCTCTCCACCGCCGGTCCCCTCCTCCTCCGCCACCTCACCGCCGCCTGCCA。

Claims (7)

1.一种伸展蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

2.根据权利要求1所述的伸展蛋白，其特征在于，其氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，或重复叠加的序列。

3.根据权利要求1所述的伸展蛋白，其特征在于，制备步骤如下：步骤一，菌株的构建与试表达；步骤二，菌株的发酵培养；步骤三，蛋白的分离纯化。

4.根据权利要求3所述的重组伸展蛋白制备方法，其特征在于，步骤二中的伸展蛋白表达的最适诱导温度为23℃，诱导剂IPTG的终浓度为0.2mM。

5.根据权利要求1所述的伸展蛋白，其特征在于，该伸展蛋白可以应用于毛发护理日化领域，包括但不限于生发液、洗发水、护发素、发膜、发胶、发蜡、毛发营养霜、焗油膏、染发剂、头皮按摩精华、头皮按摩霜、眉粉、睫毛膏。

6.根据权利要求1所述的伸展蛋白，其特征在于，该伸展蛋白可以用于各种制剂包括但不限于水剂、精华、乳液、膏霜、凝胶、固体、冻干粉、脂质体。

7.根据权利要求1所述的伸展蛋白可用于制备防脱及毛发生长相关的医药用品和化妆品，所述的毛发包括头发、眉毛、睫毛。