CN117385055A - 一种基于超螺旋质粒扩增的羊奶掺假检测试剂盒以及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于羊奶检测技术领域，涉及一种基于超螺旋质粒扩增的羊奶掺假检测试剂盒以及检测方法，羊奶掺假检测试剂盒，包括质粒、一对PCR扩增引物、磁珠、UDG酶和dUTP，质粒为超螺旋质粒；一对PCR扩增引物包括引物F和引物R。本发明在羊奶原奶中引入质粒，然后通过PCR扩增结果的不同从而判断羊奶有无掺假，在无需知道确切掺假物的情况下实现对羊奶掺假的快速、准确检测，为乳品掺假检测提供技术支持。
Description
技术领域
本发明属于羊奶检测技术领域，涉及一种基于超螺旋质粒扩增的羊奶掺假检测试剂盒以及检测方法。
背景技术
羊奶是乳品中的一种，具有较高的营养价值，羊奶的成分组成特点使其有着较低的过敏特性且易被人体吸收，因此广受消费者青睐。然而，由于山羊泌乳期的短暂，其产量有限，价格较高。不法商家出于牟利目的，对羊奶产品进行掺假，以降低原料成本，提高利润，对公众健康造成极大威胁。因此，高效准确的羊奶掺假检测技术对评估羊奶质量、保障食品安全有着至关重要的作用。
目前行业内对羊奶的掺假检测通常基于脂质、蛋白质、氨基酸等物质，比如液相色谱-质谱联用法、荧光光谱等，这些方法已被证明可以检测乳品掺假，并已成功应用于乳品检测领域。例如：CN112986331A基于差示扫描量热法鉴别羊奶粉中牛奶粉掺假比例的方法，以及CN112578053A一种羊乳配方奶粉掺假的判别方法。然而此类检测通常需要昂贵复杂的仪器设备，且耗时较长，难以满足现场检测的需求，可重复性较差，检测的目标物质稳定性差，在高温、高压等食品加工处理过程中很容易发生变化，这些因素都不利于检测的准确性，给检测带来了很多限制。
近年来，基于DNA分子的掺假检测受到了国内外研究人员的关注，这类方法具有特异性强、稳定性高、灵敏度高、检测限低、重现性好的优点。然而目前报道的方法多依赖于动物体细胞DNA，例如：专利申请CN102367472A一种牛奶或乳粉中植物源掺加物的一重/双重PCR检测方法，试剂包括Taq酶、dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)、10×缓冲液、MgCl2、灭菌水、引物和模板DNA，按照如下步骤进行检测：对被测样品的DNA模板进行提取、PCR扩增及对扩增产物进行分析，从而判定是否有植物源掺加物，但是需要复杂的预处理过程；此外，现有方法只能针对性的单一地识别出羊奶被某一种掺假物稀释或替代的情况，却很难采用一种方法同时检测出多种掺假物或未知掺假物的掺假，无法适应对目前层出不穷的掺假手段的检测。
发明内容
为了解决现有羊奶掺假检测存在检测过程复杂，很难检测出多种掺假物或未知掺假物的掺假的技术问题，本发明提供一种基于超螺旋质粒扩增的羊奶掺假检测试剂盒以及检测方法。
本发明建立在羊奶原奶中引入的质粒对稀释敏感的检测体系，通过扩增结果的不同从而判断羊奶有无掺假，在无需知道确切掺假物的情况下，实现对羊奶掺假的快速、准确检测。本发明具体采用的技术方案是：
一种基于超螺旋质粒扩增的羊奶掺假检测试剂盒，包括质粒、一对PCR扩增引物、磁珠、UDG酶和dUTP；质粒为超螺旋质粒。
进一步限定，所述超螺旋质粒为pUC-18，pUC-19或pBR322。
进一步限定，所述一对PCR扩增引物的序列是根据扩增产物长度来确定的。
进一步限定，扩增产物长度为140bp、254bp、277bp、317bp、478bp或504bp。
进一步限定，所述一对PCR扩增引物的序列包括引物F和引物R；
所述扩增产物长度为140bp时，
所述引物F的序列为：5’-TTTACTTTCACCAGCGTTTCT-3’(SEQ ID NO.1)；
所述引物R的序列为：5’-CAATAACCCTGATAAATGCTTC-3’(SEQ ID NO.2)；
所述扩增产物长度为254bp时，
所述引物F的序列为：5’-GGGGATAACGCAGGAAAGAA-3’(SEQ ID NO.3)；
所述引物R的序列为：5’-GAAGGGAGAAAGGCGGACAG-3’(SEQ ID NO.4)；
所述扩增产物长度为277bp时，
所述引物F的序列为：5’-GAGGCGGTTTGCGTATTGGG-3’(SEQ ID NO.5)；
所述引物R的序列为：5’-GTCGGGTTTCGCCACCTCTG-3’(SEQ ID NO.6)；
所述扩增产物长度为317bp时，
所述引物F的序列为：5’-GGGGATAACGCAGGAAAGAA-3’(SEQ ID NO.7)；
所述引物R的序列为：5’-CGAACGACCTACACCGAACT-3’(SEQ ID NO.8)；
所述扩增产物长度为478bp时，
所述引物F的序列为：5’-GGGGATAACGCAGGAAAGAA-3’(SEQ ID NO.9)；
所述引物R的序列为：5’-TAGCACCGCCTACATACCTC-3’(SEQ ID NO.10)；
所述扩增产物长度为504bp时，
所述引物F的序列为：5’-CGGTAATACGGTTATCCACAG-3’(SEQ ID NO.11)；
所述引物R的序列为：5’-TAGCACCGCCTACATACCTC-3’(SEQ ID NO.12)。
利用基于超螺旋质粒扩增的羊奶掺假检测试剂盒的羊奶掺假检测方法，包括以下步骤：
1)将质粒加入羊奶原奶中，得到待测样品；
2)待测样品并加入磁珠，对待测样品中的质粒进行纯化富集；
3)PCR扩增
向步骤2)富集的待测样品中依次加入一对PCR扩增引物，UDG酶及dUTP，对待测样品中富集的质粒进行扩增，得到待测样品的扩增条带；
4)取羊奶原奶参照步骤3)的方法进行扩增，得到羊奶原奶的扩增条带；
5)将待测样品的扩增条带和羊奶原奶的扩增条带进行对比，判断出待测羊奶是否掺假。
进一步限定，所述步骤5)中，待测样品的扩增条带消失，则待测样品有掺假；反之，则扩增条带出现，则待测样品无掺假。
进一步限定，所述步骤3)中，PCR扩增时还需加入2×SuperStar HiFi PCR Mix和无菌无酶水。
本发明的有益效果是：
1、本发明利用质粒对稀释敏感的扩增体系，无需进行DNA提取，避免了检测前复杂的DNA提取前处理过程；通过一种扩增试剂盒和扩增体系实现羊奶不同掺假物的掺假检测，检测更加简单，提高了检测效率。
2、本发明采用的质粒，具有超螺旋结构，使得扩增结果对稀释敏感度强，该方法通过检测羊奶是否被稀释来判断掺假，无需检测掺假物的种类和含量，适用范围广，为乳品掺假检测提供一种新的技术支持。
3、本发明中，质粒的超螺旋结构特点能够在羊奶中保持较高的稳定性，保证检测结果稳定性较好。
4、本发明利用磁珠对待测羊奶中的质粒进行富集，降低羊奶成分对扩增的背景干扰，放大检测信号，提高检测的准确性；此外，在扩增体系中加入UDG酶和dUTP，提高质粒对稀释的敏感度，使掺假检测的准确性和灵敏度得到提升。
附图说明
图1为本发明六对PCR引物对羊奶中质粒进行扩增的梯度实验结果；
图2为对以水、牛奶、豆浆、米汤作为掺假物的羊奶的掺假检测结果；
图3为不加磁珠富集和加磁珠时本发明六对PCR引物对羊奶中质粒进行扩增的梯度实验结果；
图4为不加UDG酶和dUTP以及加UDG酶和dUTP时对以水、牛奶、豆浆、米汤作为掺假物的羊奶的掺假检测结果。
具体实施方式
本发明的检测原理是：该方法在羊奶原奶中引入质粒。由于质粒的超螺旋结构，对质粒的PCR扩增需要包括合适的模板浓度在内的严格的条件。因此，当羊奶中质粒的浓度因稀释而降低时，质粒将难以被成功扩增；将UDG酶和dUTP加入到扩增体系中，dUTP不是DNA扩增的天然底物，并且会与天然底物dTTP竞争，因此dUTP的引入导致质粒对扩增所需的模板浓度要求更加严格，使质粒对羊奶的稀释更加敏感。该检测方法具有较少的局限性，能够应对多种掺假形式。
本发明设计一种基于超螺旋质粒扩增的羊奶掺假检测试剂盒，包括质粒、一对PCR扩增引物、磁珠、UDG酶和dUTP。
本发明中，质粒为超螺旋质粒，具体的，超螺旋质粒为pUC-18，pUC-19或pBR322。
本发明中，一对PCR引物是可以与质粒中一部分序列互补配对从而产生一段双链DNA的引物F和引物R。
在一些实施方式中，可根据期待的扩增产物双链DNA长度范围，选取不同序列的引物F和引物R。也就是说，引物的序列是根据扩增产物长度来确定的。
本发明中，以质粒(pUC-19)序列，设计一对PCR引物(引物F、引物R)，引物的扩增产物长度为140bp，引物记为P-140，引物序列长度为20-22bp。
pUC-19(全长2686bp)完整序列如下(SEQ ID NO.13)。
5’-TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC-3’。
其中，TTTACTTTCACCAGCGTTTCT是引物F的序列、GAAGCATTTATCAGGGTTATTG是引物R反向互补序列。
扩增产物长度为140bp，采用的为P-140引物如下。
引物F，长度21～22nt，序列为：
5’-TTTACTTTCACCAGCGTTTCT-3’；(SEQ ID NO.1)
引物R，长度22nt，序列为：
5’-CAATAACCCTGATAAATGCTTC-3’(SEQ ID NO.2)。
本发明中，除使用P-140引物(即扩增产物长度为140bp)以外，还可使用P-254引物、P-277引物、P-317引物、P-478引物或P-504引物(引物信息见表1)。
表1本发明涉及的引物的序列信息
| 名称 | 引物F序列(5’→3’) | 引物R序列(5’→3’) | 产物长度 |
| P-140 | TTTACTTTCACCAGCGTTTCT | CAATAACCCTGATAAATGCTTC | 140nt |
| P-254 | GGGGATAACGCAGGAAAGAA | GAAGGGAGAAAGGCGGACAG | 254nt |
| P-277 | GAGGCGGTTTGCGTATTGGG | GTCGGGTTTCGCCACCTCTG | 277nt |
| P-317 | GGGGATAACGCAGGAAAGAA | CGAACGACCTACACCGAACT | 317nt |
| P-478 | GGGGATAACGCAGGAAAGAA | TAGCACCGCCTACATACCTC | 478nt |
| P-504 | CGGTAATACGGTTATCCACAG | TAGCACCGCCTACATACCTC | 504nt |
下面以实施对本发明的检测方法进行说明。
需要说明的是，全部实例中，质粒pUC-19来自北京索莱宝生物科技有限公司；磁珠法动物组织基因组DNA提取试剂盒来自天根生化科技(北京)有限公司；UDG酶来自上海哈灵生物科技有限公司；dUTP Mix来自美国Thermo Scientific公司；2×SuperStar HiFi PCRMix来自北京康润诚业生物科技有限公司。
实施例1
利用基于超螺旋质粒扩增的羊奶掺假检测试剂盒检测羊奶是否掺假，具体的，羊奶掺假检测方法包括以下步骤。
1)将质粒加入待测羊奶中，得到待测样品；
2)取待测样品并加入磁珠，对待测样品中的质粒进行纯化富集；
3)PCR扩增
向步骤2)富集的待测样品中依次加入一对PCR扩增引物、UDG酶及dUTP，对待测样品中富集的质粒进行扩增。
扩增体系包括如下成分：2μL经过磁珠纯化后的羊奶样品作为模板，2μL正向引物(浓度为5μM)，2μL反向引物(浓度为5μM)，2μL dNTP/dUTP mix，0.5μL UDG酶，11.5μL 2×SuperStar HiFi PCR mix。
扩增PCR条件为：37℃，20min活化UDG酶；95℃，30s预变性；30个循环的95℃，10s变性；60℃，30s退火；72℃ 15s延伸；最后72℃，4min为终末延伸。
4)取羊奶原奶参照步骤3)的方法进行扩增，得到羊奶原奶的扩增条带；
5)将待测样品的扩增条带和羊奶原奶的扩增条带进行对比，判断出待测羊奶是否掺假。
具体的，待测样品的扩增条带消失，则待测样片的羊奶有掺假；反之，待测样品的扩增条带出现，则羊奶无掺假。
本实施例中，分别用不同扩增产物长度对应的六对不同的引物(引物信息见表1)，应用本发明的方法对羊奶原奶中的质粒进行梯度实验，pUC-19的Log10拷贝数分别为8、7、6、5，没有加入质粒的羊奶的扩增结果在N泳道作为对照。结果如图1所示，其中：N是未加入质粒羊奶的扩增结果，以此为对照；L为50bp DNALadder。
参见图1，这六对引物产物的扩增结果表明，一旦被稀释，质粒的扩增条带将消失，体现了质粒扩增对稀释敏感的特点，六对引物均可参与建立此检测体系，实现检测目的。
实施例2
本实施例羊奶掺假检测方法包括以下步骤。
1)将质粒加入羊奶原奶中混匀，得到未掺假的羊奶。
2)分别用水、牛奶、豆浆、米汤作为掺假物，每种掺假物与上述羊奶原奶以不同比例混合，分别得到掺假物含量为0％、30％、50％、70％、90％的羊奶样品。
本步骤中，用掺假物对羊奶进行掺假，分别得到掺假物含量为0％、30％、50％、70％、90％的五个羊奶样品，四种掺假物共计20组羊奶样品。
3)取上述待测羊奶样品，在每个样品中加入磁珠对质粒进行纯化富集。
4)对富集后的质粒进行扩增，扩增时，加入PCR扩增引物、UDG酶和dUTP，还要加入2×SuperStar HiFi PCR Mix、无菌无酶水，进行PCR扩增。
本步骤中，扩增产物长度为140bp。
引物F，长度21nt，序列为：5’-TTTACTTTCACCAGCGTTTCT-3’。
引物R，长度22nt，序列为：5’-CAATAACCCTGATAAATGCTTC-3’。
5)分析扩增结果，即可得到对羊奶是否掺假的检测结论。
本实例中采用琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，结果如图2所示，L为50bp DNALadder，四组羊奶分别被水、牛奶、豆浆、米汤稀释掺假，每组中五个样品的掺假物含量分别为0％、30％、50％、70％、90％。
参见图2的实验结果，只有当掺假物含量为0％，即未掺假时，目标产物大小处会出现条带，一旦有掺假发生，扩增条带将消失；此检测方法可以实现对羊奶的掺假检测。可见，该方法仅通过检测羊奶是否被稀释判断羊奶是否掺假，而无需对掺假物的种类进行检测，适用范围广，检测速度快。
对比例1
与实施例1中的步骤基本相同，不同之处在于：在步骤2)时不加入磁珠。
按照实例1方法对扩增产物进行分析。结果如图3所示，其中，pUC-19的Log10拷贝数分别为8、7、6、5，没有加入质粒的羊奶的扩增结果在N泳道作为对照，L为50bp DNA Ladder，结果参见图3。
参见图3，结果显示对比例1中所有条带均消失，羊奶成分对扩增具有背景干扰，抑制了pUC-19的扩增，对比例1不具有质粒扩增对稀释敏感的特点，无法对羊奶掺假进行检测。与实施例1对比，表明本发明中磁珠可以对质粒进行纯化富集，从而降低羊奶成分对扩增的背景干扰，放大检测信号，提高检测的准确性和抗干扰性。
对比例2
与实例2中步骤基本相同，不同之处在于：在步骤4)时不加入UDG酶和dUTP。
按照实例2方法对扩增产物进行分析。结果如图4所示，L为50bp DNA Ladder，四组羊奶分别被水、牛奶、豆浆、米汤稀释掺假，每组中五个羊奶样品的掺假物含量分别为0％、30％、50％、70％、90％。
参见图4，结果显示对比例2中，当以水、牛奶为掺假物，掺假物含量为30％、50％时，结果中也出现条带，当以豆浆、米汤为掺假物，羊奶含量为30％时，结果中也出现条带，对比例2不具有能够区分羊奶有无掺假的特点，无法对羊奶掺假进行检测；与实施例2进行对比，表明本发明中加入的UDG酶和dUTP，可以提高质粒对稀释的敏感度，使掺假检测的准确性和灵敏度得到提升。
Claims (8)
1.一种基于超螺旋质粒扩增的羊奶掺假检测试剂盒，其特征在于，包括质粒、一对PCR扩增引物、磁珠、UDG酶和dUTP；所述质粒为超螺旋质粒。
2.根据权利要求1所述的基于超螺旋质粒扩增的羊奶掺假检测试剂盒，其特征在于，所述超螺旋质粒为pUC-18，pUC-19或pBR322。
3.根据权利要求1所述的基于超螺旋质粒扩增的羊奶掺假检测试剂盒，其特征在于，所述一对PCR扩增引物的序列是根据扩增产物长度来确定的。
4.根据权利要求3所述的基于超螺旋质粒扩增的羊奶掺假检测试剂盒，其特征在于，扩增产物长度为140bp、254bp、277bp、317bp、478bp或504bp。
5.根据权利要求4所述的基于超螺旋质粒扩增的羊奶掺假检测试剂盒，其特征在于，所述一对PCR扩增引物的序列包括引物F和引物R；
所述扩增产物长度为140bp时，
所述引物F的序列为：5’-TTTACTTTCACCAGCGTTTCT-3’，
所述引物R的序列为：5’-CAATAACCCTGATAAATGCTTC-3’；
所述扩增产物长度为254bp时，
所述引物F的序列为：5’-GGGGATAACGCAGGAAAGAA-3’，
所述引物R的序列为：5’-GAAGGGAGAAAGGCGGACAG-3’；
所述扩增产物长度为277bp时，
所述引物F的序列为：5’-GAGGCGGTTTGCGTATTGGG-3’，
所述引物R的序列为：5’-GTCGGGTTTCGCCACCTCTG-3’；
所述扩增产物长度为317bp时，
所述引物F的序列为：5’-GGGGATAACGCAGGAAAGAA-3’，
所述引物R的序列为：5’-CGAACGACCTACACCGAACT-3’；
所述扩增产物长度为478bp时，
所述引物F的序列为：5’-GGGGATAACGCAGGAAAGAA-3’，
所述引物R的序列为：5’-TAGCACCGCCTACATACCTC-3’；
所述扩增产物长度为504bp时，
所述引物F的序列为：5’-CGGTAATACGGTTATCCACAG-3’，
所述引物R的序列为：5’-TAGCACCGCCTACATACCTC-3’。
6.利用权利要求1所述的基于超螺旋质粒扩增的羊奶掺假检测试剂盒的羊奶掺假检测方法，其特征在于，所述羊奶掺假检测方法包括以下步骤：
1)将质粒加入羊奶原奶中，得到待测样品；
2)待测样品并加入磁珠，对待测样品中的质粒进行纯化富集；
3)PCR扩增
向步骤2)富集的待测样品中依次加入一对PCR扩增引物，UDG酶及dUTP，对待测样品中富集的质粒进行扩增，得到待测样品的扩增条带；
4)取羊奶原奶参照步骤3)的方法进行扩增，得到羊奶原奶的扩增条带；
5)将待测样品的扩增条带和羊奶原奶的扩增条带进行对比，判断出待测羊奶是否掺假。
7.根据权利要求6所述的羊奶掺假检测方法，其特征在于，所述步骤5)中，待测样品的扩增条带消失，则待测样品有掺假；反之，则扩增条带出现，则待测样品无掺假。
8.根据权利要求6所述的羊奶掺假检测方法，其特征在于，所述步骤3)中，PCR扩增时还需加入2×SuperStar HiFi PCR Mix和无菌无酶水。
Priority Applications (1)
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