CN117379366A - 一种能量传递神经修复水凝胶、制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种能量传递神经修复水凝胶、制备方法及用途，能量传递神经修复水凝胶包括如下重量组分：壳聚糖1.5‑50份；β‑甘油磷酸钠40‑70份；海藻酸钠0.5‑5份；Ca‑PolyP 0.5‑10份。本发明将可降解的无机多聚磷酸盐(Ca‑PolyP)与温敏壳聚糖水凝胶结合，利用温敏壳聚糖水凝胶缓释可降解，可注射等特点，将无机多聚磷酸盐局部移植到损伤中心，实现了对脊髓损伤后内环境的调控。

Description

一种能量传递神经修复水凝胶、制备方法及用途
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种能量传递神经修复水凝胶、制备方法及用途。
背景技术
脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种具有高致残率、高死亡率的严重创伤性疾病，一直是医学界的一大难题。日益高发的脊髓损伤不仅严重危害患者的生命健康和生存质量，同时伴发的沉重经济负担对家庭、社会造成极大影响。目前脊髓损伤的治疗主要有三种主要方法：(1)手术减压；(2)抗炎药物；(3)康复治疗。手术治疗尽管能够早期对损伤脊髓进行有效减压，但仅能恢复脊柱解剖学上的完整性和稳定性，对神经恢复本身没有明显作用；药物治疗方面，由于近年来甲基强的松龙的多项临床研究证实该药物神经修复效果有限，并且会大大增加脊髓损伤后并发症的发生率，最新指南不推荐作为一线用药，因此临床上脊髓损伤患者面临着无药可用的局面；康复治疗仅对非完全性脊髓损伤患者有较好的治疗效果，由于脊髓损伤患者病情不稳定且多合并多发伤，限制了康复治疗的早期应用。
迄今为止，SCI被认为极难治疗。主要问题在于脊髓损伤后导致免疫细胞浸润，小胶质细胞活化，髓磷脂碎片对受损的神经中枢产生抑制作用。如何诱导剩余的神经网络和轴突再生激活和重组是脊髓损伤治疗的关键。因此，行之有效的脊髓损伤治疗方案是整个社会亟待寻求的目标。
发明内容
鉴于现有技术中的上述缺陷或不足，期望提供一种能量传递神经修复水凝胶、制备方法及用途，将可降解的无机多聚磷酸盐(Ca-PolyP)与温敏壳聚糖水凝胶结合，利用温敏壳聚糖水凝胶缓释可降解，可注射等特点，将无机多聚磷酸盐局部移植到损伤中心，实现了对脊髓损伤后内环境的调控。
本发明提供的一种能量传递神经修复水凝胶，其特征在于，包括如下重量组分：壳聚糖1.5-50份；β-甘油磷酸钠40-70份；海藻酸钠0.5-5份；Ca-PolyP 0.5-10份。
优选地，所述能量传递神经修复水凝胶包括如下重量组分：壳聚糖10-14份；β-甘油磷酸钠55-65份；海藻酸钠2-4份；Ca-PolyP 1-5份。
优选地，所述Ca-PolyP中PolyP的链长为40-130。
优选地，所述Ca-PolyP为(Ca1/2PO3)40或(Ca1/2PO3)100。
优选地，所述Ca-PolyP由CaCl2和(NaPO3)40-130制备而成；
所述Ca-PolyP的制备方法如下：将CaCl2溶解于pH=10的去离子水中，加入(NaPO3)40-130，将形成的微粒过滤收集，使用无水乙醇洗涤，置于60-80℃的烤箱中干燥，即得；其中(NaPO3)40-130摩尔浓度等于CaCl2摩尔浓度的2倍。
优选地，所述Ca-PolyP由CaCl2和(NaPO3)40-130制备而成；
所述Ca-PolyP的制备方法如下：将CaCl2·2H2O溶解于去离子水中，加入(NaPO3)40-130，将形过滤收集，使用无水乙醇洗涤，置于60-80℃的烤箱中干燥，即得；其中(NaPO3)40-130摩尔浓度等于CaCl2摩尔浓度的2倍。
另，本发明还提供了一种能量传递神经修复水凝胶的制备方法，所述制备方法为将所述能量传递神经修复水凝胶的各组分按照配方比例混合即可。
优选地，所述制备方法包括如下步骤：
称取壳聚糖溶于稀盐酸中，以配制壳聚糖溶液；
称取β-甘油磷酸钠溶于蒸馏水中，以配制β-甘油磷酸钠溶液；
称取海藻酸钠，溶于所述β-甘油磷酸钠溶液中，以配制海藻酸钠-β-甘油磷酸钠溶液；
将所述海藻酸钠-β-甘油磷酸钠溶液缓慢滴加到所述壳聚糖溶液中，以得到壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠混合溶液；
称取Ca-PolyP粉末溶于所述壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠溶液，即得。
另，本发明还提供了一种能量传递神经修复水凝胶在制备用于治疗神经系统疾病的药物中的用途，所述神经系统疾病包括神经退行性疾病、脊髓损伤和创伤性脑损伤。
另，本发明还提供了一种Ca-PolyP在制备用于治疗神经系统疾病的药物中的用途，所述神经系统疾病包括神经退行性疾病、脊髓损伤和创伤性脑损伤。
相对于现有技术而言，本发明的有益效果是：
神经再生需要受损的轴突能够重新密封受损的末端，重建细胞骨架，合成和运输再生原料，组装轴突组件并形成生长锥。所有这些事件都需要三磷酸腺苷(ATP)形式的能量，其中大部分是由神经元中的线粒体提供的。由于神经元的极化结构和轴突延伸，它们面临着维持远端轴突和生长锥中线粒体分布和能量稳态的特殊挑战。
本发明的能量传递神经修复水凝胶，将可降解的无机多聚磷酸盐(Ca-PolyP)与温敏壳聚糖水凝胶结合，利用温敏壳聚糖水凝胶缓释可降解，可注射等特点，将无机多聚磷酸盐局部移植到损伤中心，实现对脊髓损伤后内环境的调控。适用于神经退行性疾病，脊髓损伤，创伤性脑损伤等神经系统疾病，通过提高神经元胞外ATP含量，提高神经元电活动，促进神经元存活和功能再生为脊髓损伤等神经系统疾病提供了新的修复手段及理论基础。
应当理解，发明内容部分中所描述的内容并非旨在限定本发明的实施例的关键或重要特征，亦非用于限制本发明的范围。本发明的其它特征将通过以下的描述变得容易理解。
附图说明
通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显。
图1为能量传递神经修复水凝胶的扫描电镜图。
图2为Zn-PolyP的组合物的扫描电镜图。
图3为Mn-PolyP的组合物的扫描电镜图。
图4为Mg-PolyP的组合物的扫描电镜图。
图5为Ni-PolyP的组合物的扫描电镜图。
图6为不同阳离子-PolyP对于神经元细胞系HT22细胞活性影响的柱状图。
图7为不同浓度Ca-PolyP对于神经元细胞系HT22细胞活性影响的柱状图。
图8为表面喷金后的冻干Ca-PolyP的扫描电镜图，图8中A图是扫描电镜放大200倍的图片，图8中B图是扫描电镜放大1000倍的图片，其中白色斑点是Ca-PolyP。
图9为Ca-PolyP对OGD/R诱导的HT22细胞毒性影响的柱状图。
图10为Ca-PolyP对OGD诱导的海马神经元细胞死亡影响的柱状图，图10中A图为caspase 3活性表示的，图10中B图为以相对于对照的PARP活性表示的。
图11为Ca-PolyP对OGD引起的HT22氧化应激影响的柱状图，图11中A图为MDA含量的柱状图，图11中B图为SOD1活性的柱状图；图11中C图为GSH含量的柱状图；图11中D图为GPx活性的柱状图。
图12为Ca-PolyP激发原代海马神经元自放电现象的示意图，其中，图12中A图表示单个电极接受到神经元的放电现象的示意图；图12中B图表示神经元的平均发放率的示意图。
图13为Ca-PolyP增强OGD损伤海马神经元的线粒体呼吸和糖代谢的示意图，图13中A途为线粒体呼吸；图13中B图为糖代谢。
图14为Ca-PolyP对脊髓损伤大鼠功能恢复的影响的示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
本发明的实施例提供了一种能量传递神经修复水凝胶，包括如下重量组分：壳聚糖1.5-50份；β-甘油磷酸钠40-70份；海藻酸钠0.5-5份；Ca-PolyP 0.5-10份。
在一优选实施例中，能量传递神经修复水凝胶包括如下重量组分：壳聚糖10-14份；β-甘油磷酸钠55-65份；海藻酸钠2-4份；Ca-PolyP 1-5份。
优选地，能量传递神经修复水凝胶包括如下重量组分：壳聚糖12份；β-甘油磷酸钠60份；海藻酸钠2-4份；Ca-PolyP 2份；
优选地，能量传递神经修复水凝胶包括如下重量组分：壳聚糖12份；β-甘油磷酸钠60份；海藻酸钠4份；Ca-PolyP 1-5份。
在一优选实施例中，Ca-PolyP中PolyP的链长为40-130。
在一优选实施例中，Ca-PolyP为(Ca1/2PO3)40或(Ca1/2PO3)100。
在一优选实施例中，Ca-PolyP由CaCl2和(NaPO3)40-130制备而成；
Ca-PolyP的制备方法如下：将CaCl2溶解于pH=10的去离子水中，加入(NaPO3)40-130，将形成的微粒过滤收集，使用无水乙醇洗涤，置于60-80℃的烤箱中干燥，即得；其中(NaPO3)40-130摩尔浓度等于CaCl2摩尔浓度的2倍。
在一优选实施例中，Ca-PolyP由CaCl2和(NaPO3)40-130制备而成；
Ca-PolyP的制备方法如下：将CaCl2·2H2O溶解于去离子水中，加入(NaPO3)40-130，将形过滤收集，使用无水乙醇洗涤，置于60-80℃的烤箱中干燥，即得；其中(NaPO3)40-130摩尔浓度等于CaCl2摩尔浓度的2倍。
另，本发明的实施例还提供了一种能量传递神经修复水凝胶的制备方法，该制备方法为将能量传递神经修复水凝胶的各组分按照配方比例混合即可。
在一优选实施例中，制备方法包括如下步骤：
称取壳聚糖溶于稀盐酸中，以配制壳聚糖溶液；
称取β-甘油磷酸钠溶于蒸馏水中，以配制β-甘油磷酸钠溶液；
称取海藻酸钠，溶于所述β-甘油磷酸钠溶液中，以配制海藻酸钠-β-甘油磷酸钠溶液；
将所述海藻酸钠-β-甘油磷酸钠溶液缓慢滴加到所述壳聚糖溶液中，以得到壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠混合溶液；
称取Ca-PolyP粉末溶于所述壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠溶液，即得。
另，本发明的实施例还提供了一种能量传递神经修复水凝胶在制备用于治疗神经系统疾病的药物中的用途，神经系统疾病包括神经退行性疾病、脊髓损伤和创伤性脑损伤。
另，本发明的实施例还提供了一种Ca-PolyP在制备用于治疗神经系统疾病的药物中的用途，神经系统疾病包括神经退行性疾病、脊髓损伤和创伤性脑损伤。
实施例1
一种能量传递神经修复水凝胶，其组成如下：
其中，Ca-PolyP的制备方法如下：取28g CaCl2·2H2O(C118444，阿拉丁)溶解于250毫升的去离子水中(pH=10)，加入10g Na-polyP (平均链长为40个磷酸盐单位)，将形成的微粒经过过滤收集，使用无水乙醇洗涤三次，置于60-80℃的烤箱中干燥，得到Ca-PolyP(CaPP)。其中Na-PolyP的摩尔浓度为CaCl2·2H2O摩尔浓度的2倍。
其中，能量传递神经修复水凝胶的制备方法如下：
(1)称取一定量的壳聚糖溶于0.1mol/L稀盐酸中(盐酸现用现配)，搅拌2h使壳聚糖能够充分溶解，制备得壳聚糖溶液，4℃冷藏。
(2)称取一定量β-甘油磷酸钠并溶解1mL蒸馏水中，制备得β-甘油磷酸钠溶液。
(3)称取一定量海藻酸钠，溶于β-甘油磷酸钠溶液得到海藻酸钠-β-甘油磷酸钠溶液。将混合溶液缓慢滴加到壳聚糖溶液中，4℃下缓慢搅拌30分钟得到壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠混合溶液。4℃冷藏。
(4)称取一定量Ca-PolyP粉末，4℃下溶于壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠溶液，即得，4℃冷藏备用，其中各组分浓度为：壳聚糖20mg/mL，β-甘油磷酸钠100mg/mL，海藻酸钠8mg/mL，CaPP 5mg/mL。其扫描电镜图如图1所示。
实施例2
一种能量传递神经修复水凝胶，其组成如下：
其中，Ca-PolyP的制备方法如下：取28g CaCl2·2H2O(C118444，阿拉丁)溶解于250毫升的去离子水中(pH=10)，加入10g Na-polyP (平均链长为40个磷酸盐单位)，将形成的微粒经过过滤收集，使用无水乙醇洗涤三次，置于60-80℃的烤箱中干燥，得到Ca-PolyP，其中Na-PolyP的摩尔浓度为CaCl2·2H2O摩尔浓度的2倍。
其中，能量传递神经修复水凝胶的制备方法如下：
(1)称取一定量的壳聚糖溶于0.1mol/L稀盐酸中(盐酸现用现配)，搅拌2h使壳聚糖能够充分溶解，制备得壳聚糖溶液，4℃冷藏。
(2)称取一定量β-甘油磷酸钠并溶解1mL蒸馏水中，制备得β-甘油磷酸钠溶液。
(3)称取一定量海藻酸钠，溶于β-甘油磷酸钠溶液得到海藻酸钠-β-甘油磷酸钠溶液。将混合溶液缓慢滴加到壳聚糖溶液中，4℃下缓慢搅拌30分钟得到壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠混合溶液，4℃冷藏。
(4)称取一定量Ca-PolyP粉末，4℃下溶于壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠溶液，即得，4℃冷藏备用。其中各组分浓度为：壳聚糖20mg/mL，β-甘油磷酸钠100mg/mL，海藻酸钠4mg/mL，CaPP 8mg/mL。
实施例3
一种能量传递神经修复水凝胶，其组成如下：
其中，Ca-PolyP的制备方法如下：取28g CaCl2·2H2O(C118444，阿拉丁)溶解于250毫升的去离子水中(pH=10)，加入10g Na-polyP (平均链长为40个磷酸盐单位)，将形成的微粒经过过滤收集，使用无水乙醇洗涤三次，置于60-80℃的烤箱中干燥，得到Ca-PolyP，其中Na-PolyP的摩尔浓度为CaCl2·2H2O摩尔浓度的2倍。
其中，所述能量传递神经修复水凝胶的制备方法如下：
(1)称取一定量的壳聚糖溶于0.1mol/L稀盐酸中(盐酸现用现配)，搅拌2 h使壳聚糖能够充分溶解，制备得壳聚糖溶液，4℃冷藏。
(2)称取一定量β-甘油磷酸钠并溶解1mL蒸馏水中，制备得β-甘油磷酸钠溶液。
(3)称取一定量海藻酸钠，溶于β-甘油磷酸钠溶液得到海藻酸钠-β-甘油磷酸钠溶液。将混合溶液缓慢滴加到壳聚糖溶液中，4℃下缓慢搅拌30分钟得到壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠混合溶液，4℃冷藏。
(4)称取一定量Ca-PolyP粉末，4℃下溶于壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠溶液，即得，4℃冷藏备用，其中各组分浓度为：壳聚糖20mg/mL，β-甘油磷酸钠100mg/mL，海藻酸钠8mg/mL，CaPP 8mg/mL。
实施例4
一种能量传递神经修复水凝胶，其组成如下：
其中，Ca-PolyP的制备方法如下：取28g CaCl2·2H2O(C118444，阿拉丁)溶解于250毫升的去离子水中(pH=10)，加入10g Na-polyP (平均链长为100个磷酸盐单位)，将形成的微粒经过过滤收集，使用无水乙醇洗涤三次，置于60-80℃的烤箱中干燥，得到Ca-PolyP。其中Na-PolyP的摩尔浓度为CaCl2·2H2O摩尔浓度的2倍。
其中，能量传递神经修复水凝胶的制备方法如下：
(1)称取一定量的壳聚糖溶于0.1mol/L稀盐酸中(盐酸现用现配)，搅拌2h使壳聚糖能够充分溶解，制备得壳聚糖溶液，4℃冷藏。
(2)称取一定量β-甘油磷酸钠并溶解1 m L蒸馏水中，制备得β-甘油磷酸钠溶液。
(3)称取一定量海藻酸钠，溶于β-甘油磷酸钠溶液得到海藻酸钠-β-甘油磷酸钠溶液。将混合溶液缓慢滴加到壳聚糖溶液中，4℃下缓慢搅拌30分钟得到壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠混合溶液，4℃冷藏。
(4)称取一定量Ca-PolyP粉末，4℃下溶于壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠溶液，即得，4℃冷藏备用。其中各组分浓度为：壳聚糖20mg/mL，β-甘油磷酸钠100mg/mL，海藻酸钠8mg/mL，CaPP 5mg/mL。
实施例5
含Zn-PolyP的组合物，其组成如下：
其中，Zn-PolyP的制备方法如下：取26g ZnCl2 (Z112534，阿拉丁)溶解于250毫升的去离子水中(pH=10)，加入10g Na-polyP (平均链长为40个磷酸盐单位)，将形成的微粒经过过滤收集，使用无水乙醇洗涤三次，置于60-80℃的烤箱中干燥，得到Zn-PolyP(ZnPP)，其中NaPolyP的摩尔浓度为ZnCl2摩尔浓度的2倍。
其中，所述含Zn-PolyP的组合物的制备方法如下：
(1)称取一定量的壳聚糖溶于0.1mol/L稀盐酸中(盐酸现用现配)，搅拌2h使壳聚糖能够充分溶解，制备得壳聚糖溶液，4℃冷藏。
(2)称取一定量β-甘油磷酸钠并溶解1mL蒸馏水中，制备得β-甘油磷酸钠溶液。
(3)称取一定量海藻酸钠，溶于β-甘油磷酸钠溶液得到海藻酸钠-β-甘油磷酸钠溶液。将混合溶液缓慢滴加到壳聚糖溶液中，4℃下缓慢搅拌30分钟得到壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠混合溶液，4℃冷藏。
(4)称取一定量Zn-PolyP粉末，4℃下溶于壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠溶液，得到Zn-PolyP，4℃冷藏备用。其中各组分浓度为：壳聚糖20mg/mL，β-甘油磷酸钠100mg/mL，海藻酸钠8mg/mL，ZnPP 5mg/mL。其扫描电镜图如图2所示。
实施例6
含Mn-PolyP的组合物，其组成如下：
其中，Mn-PolyP的制备方法如下：取39.4gMnCl2·4H2O(M112543，阿拉丁)溶解于250毫升的去离子水中(pH=10)，加入10g Na-polyP (平均链长为40个磷酸盐单位)，将形成的微粒经过过滤收集，使用无水乙醇洗涤三次，置于60-80℃的烤箱中干燥，得到Mn-PolyP(MnPP)，其中NaPolyP的摩尔浓度为MnCl2摩尔浓度的2倍。
其中，含Mn-PolyP的组合物的制备方法如下：
(1)称取一定量的壳聚糖溶于0.1mol/L稀盐酸中(盐酸现用现配)，搅拌2h使壳聚糖能够充分溶解，制备得壳聚糖溶液，4℃冷藏。
(2)称取一定量β-甘油磷酸钠并溶解1mL蒸馏水中，制备得β-甘油磷酸钠溶液。
(3)称取一定量海藻酸钠，溶于β-甘油磷酸钠溶液得到海藻酸钠-β-甘油磷酸钠溶液。将混合溶液缓慢滴加到壳聚糖溶液中，4℃下缓慢搅拌30分钟得到壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠混合溶液，4℃冷藏。
(4)称取一定量Mn-PolyP粉末，4℃下溶于壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠溶液，得到Mn-PolyP，4℃冷藏备用。其中各组分浓度为：壳聚糖20mg/mL，β-甘油磷酸钠100mg/mL，海藻酸钠8mg/mL，MnPlP 5mg/mL。其扫描电镜图如图3所示。
实施例7
含Mg-PolyP的组合物，其组成如下：
其中，Mg-PolyP的制备方法如下：取41.2gMgCl2·6H2O(M116335，阿拉丁)溶解于250毫升的去离子水中(pH=10)，加入10g Na-polyP (平均链长为40个磷酸盐单位)，将形成的微粒经过过滤收集，使用无水乙醇洗涤三次，置于60-80℃的烤箱中干燥，得到Mg-PolyP(MgPP)，其中NaPolyP的摩尔浓度为MgCl2摩尔浓度的2倍。
其中，含Mg-PolyP的组合物的制备方法如下：
(1)称取一定量的壳聚糖溶于0.1mol/L稀盐酸中(盐酸现用现配)，搅拌2h使壳聚糖能够充分溶解，制备得壳聚糖溶液，4℃冷藏。
(2)称取一定量β-甘油磷酸钠并溶解1mL蒸馏水中，制备得β-甘油磷酸钠溶液。
(3)称取一定量海藻酸钠，溶于β-甘油磷酸钠溶液得到海藻酸钠-β-甘油磷酸钠溶液。将混合溶液缓慢滴加到壳聚糖溶液中，4℃下缓慢搅拌30分钟得到壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠混合溶液，4℃冷藏。
(4)称取一定量Mg-PolyP粉末，4℃下溶于壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠溶液，得到Mg-PolyP，4℃冷藏备用。其中各组分浓度为：壳聚糖20mg/mL，β-甘油磷酸钠100mg/mL，海藻酸钠8mg/mL，MgPP 5mg/mL。其扫描电镜图如图4所示。
实施例8
含Ni-PolyP的组合物，其组成如下：
其中，Ni-PolyP的制备方法如下：取47.6gNiCl2·6H2O(654507，Sigma-Aldrich)溶解于250毫升的去离子水中(pH=10)，加入10g Na-polyP (平均链长为40个磷酸盐单位)，将形成的微粒经过过滤收集，使用无水乙醇洗涤三次，置于60-80℃的烤箱中干燥，得到Ni-PolyP(NiPP)，其中NaPolyP的摩尔浓度为NiCl2摩尔浓度的2倍。
其中，含Ni-PolyP的组合物的制备方法如下：
(1)称取一定量的壳聚糖溶于0.1mol/L稀盐酸中(盐酸现用现配)，搅拌2h使壳聚糖能够充分溶解，制备得壳聚糖溶液，4℃冷藏。
(2)称取一定量β-甘油磷酸钠并溶解1mL蒸馏水中，制备得β-甘油磷酸钠溶液。
(3)称取一定量海藻酸钠，溶于β-甘油磷酸钠溶液得到海藻酸钠-β-甘油磷酸钠溶液。将混合溶液缓慢滴加到壳聚糖溶液中，4℃下缓慢搅拌30分钟得到壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠混合溶液，4℃冷藏。
(4)称取一定量Ni-PolyP粉末，4℃下溶于壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠溶液，得到Ni-PolyP，4℃冷藏备用。其中各组分浓度为：壳聚糖20mg/mL，β-甘油磷酸钠100mg/mL，海藻酸钠8mg/mL，NiPP 5mg/mL。其扫描电镜图如图5所示。
实施例9
不同阳离子-PolyP(即实施例1，5-8制备的Ca-PolyP、Zn-PolyP、Mn-PolyP、Mg-PolyP、Ni-PolyP)对于神经元细胞系HT22细胞活性影响：
在96孔板中于正常条件下培养约3×103 HT22细胞24小时。然后在浓度为0.25ug/ml不同阳离子-PolyP的情况下继续培养24小时。用细胞计数试剂盒8(CCK-8)(HY-K0301；MEDCHEMEXPRESS LLC，China)评估细胞活力，并根据制造商的说明书进行所有实验。用酶标仪(Synergy H1 Hybrid Reader，BioTek，USA)在450nm处测量吸光度。光密度值显示为对照值的百分比。结果如图6所示。
实施例10
不同浓度Ca-PolyP(即实施例1制备的Ca-PolyP)对于神经元细胞系HT22细胞活性的影响：
在96孔板中于正常条件下培养约3×103 HT22细胞24小时。然后在不同浓度Ca-PolyP的情况下继续培养24小时。用细胞计数试剂盒8(CCK-8)(HY-K0301；MEDCHEMEXPRESSLLC，China)评估细胞活力，并根据制造商的说明书进行所有实验。用酶标仪(Synergy H1Hybrid Reader，BioTek，USA)在450nm处测量吸光度。光密度值显示为对照值的百分比。结果如图7所示。
实施例11
表面喷金后的冻干Ca-PolyP(即实施例1制备的Ca-PolyP)的扫描电镜图：
采用S-4800型扫描电子显微镜(日立公司)对表面喷金后的冻干凝胶样品进行观察，表征凝胶截面的微观形貌。结果如图8所示。
实施例12
Ca-PolyP(即实施例1制备的Ca-PolyP)对OGD/R诱导的HT22细胞毒性：
在96孔板中于正常条件下培养约3×103 HT22细胞24小时。用氧-葡萄糖剥夺(OGD)处理细胞8小时，然后在有或没有Ca-PolyP的情况下恢复正常培养条件24小时。用细胞计数试剂盒8(CCK-8)(HY-K0301；MEDCHEMEXPRESS LLC，China)评估细胞活力，并根据制造商的说明书进行所有实验。用酶标仪(Synergy H1 Hybrid Reader，BioTek，USA)在450nm处测量吸光度。光密度值显示为对照值的百分比。结果如图9所示。
结果说明Ca-PolyP可以降低OGD/R诱导的HT22细胞毒性。
实施例13
Ca-PolyP(即实施例1制备的Ca-PolyP)对OGD诱导的海马神经元细胞死亡：
用裂解缓冲液以每100μl 107个细胞的浓度收获细胞，在冰上孵育20分钟，并在4℃下以16000×g离心15分钟。在37℃下，在5µl上清中用Ac-DEVD-pNA(2 mM)(＃CASP3C;Sigma-Aldrich)在反应缓冲液中检测caspase 3活性2h，用酶标仪(Synergy H1 HybridReader，BioTek，USA)在405nm处读取吸光度。结果如图10中A图所示。
收集细胞，并在裂解缓冲液中在冰上孵育30分钟。将它们转移到组蛋白包被的板的孔中后，将细胞裂解液与PARP底物混合物(含有测定缓冲液，活化的DNA和NAD +)(4684-096-K; Gaithersburg，MD，USA)在室温下孵育30分钟。使用抗PAR抗体，山羊抗小鼠IgG抗体-辣根过氧化物酶(HRP)偶联物和比色底物来产生信号，用酶标仪在450nm处检测。结果表示为相对于对照的PARP活性。结果如图10中B图所示。
结果说明Ca-PolyP可以减轻OGD诱导的海马神经元细胞死亡。
实施例14
Ca-PolyP(即实施例1制备的Ca-PolyP)对OGD引起的HT22氧化应激的影响：
HT22细胞在六孔板中以4×104个细胞/孔的密度孵育。在有或没有Ca-PolyP的情况下用OGD / R处理后，收集细胞，在PBS中匀浆，并以1000×g离心在4℃下放置10分钟。根据制造商的说明(A001-3, A003-4, A006-2; Jiancheng, Bioengineering Institute,Nanjing, China; #CGP1; Sigma-Aldrich)收集上清液，用酶标仪测量MDA和GSH含量以及SOD1和GPx的活性。脂质过氧化是通过MDA与硫代巴比妥酸，乙酸和十二烷基硫酸钠在95℃下反应80分钟以形成硫代巴比妥酸反应性物质(TBARS)来确定的，该物质在530nm处检测。结果如图11中A图所示。
在37℃下将另一份等分试样(20μl)与200μlWST-1(高度水溶性四唑盐)和20μl酶工作溶液反应20分钟，使用酶标仪在450nm处测量SOD1活性。结果如图11中B图所示。
将上清液的等分试样(100μl)与含有5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)和25μlNADPH溶液(0.12mg/ml)的工作混合物100μl在室温下反应6分钟，并在405nm处用分光光度法检测到还原的GSH。结果如图11中C图所示。
通过与试剂盒中的GPx检测工作溶液反应来测定上清液中的GPx活性(0.25mMNADPH，2.1mM)还原GSH，0.5单位/ml谷胱甘肽还原酶和300μM叔丁基过氧化氢(其中NADPH吸光度降低表示GPx活性)，在反应开始后15s后在340nm处检测，并在25℃下每10s监测1分钟。进行了BCA分析(Beyotime Biotechnology，China)以将结果标准化为蛋白质含量。数据显示为相对于对照的CPX活性。结果如图11中D图所示。
结果显示，Ca-PolyP可以降低OGD引起的HT22氧化应激。
实施例15
Ca-PolyP(即实施例1制备的Ca-PolyP)激发原代海马神经元自放电现象：
将Wistar大鼠原代神经元以100000个/孔密度接种于Classic MEA 96孔板(Axionbiosystems，USA)。在培养第三天，通过氧-葡萄糖剥夺(OGD)处理细胞8小时，然后在有或没有Ca-PolyP的情况下恢复正常培养条件。用Maestro多孔微电极阵列系统(Maestro Pro，Axion biosystems，USA)连续记录放电14天。收集数据。结果如图12中A-B图所示。
其中，图12中A图中Number of spike 表示单个电极接受到神经元的放电现象。数值越高表示单位时间内神经源放电越强，表明神经元电活动越强。
图12中B图中Mean Firing Rate等于Number of spike/Time，动作电位是神经元功能的决定性特征。高值表示神经元频繁激发动作电位。较低的值表示神经元可能具有受损的电生理功能。
结果显示，Ca-PolyP可以激发原代海马神经元自放电现象。
实施例16
Ca-PolyP(即实施例1制备的Ca-PolyP)增强OGD损伤海马神经元的线粒体呼吸和糖代谢：
氧气消耗率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)通过依次添加Seahorse XF Cell Mito压力测试试剂盒和XF糖酵解压力测试试剂盒(＃103015-100，103020-100; SeahorseBioscience，USA)中的特定化合物来测量，使用Seahorse XF e 24细胞外通量分析仪。
将细胞在XF e 24微孔板中以2×104个细胞/孔的密度孵育。在测定之前，将细胞用测定培养基(102353-100；Seahorse Bioscience)彻底洗涤，并在无CO2的培养箱中于37℃温育约1小时。然后将微孔板装入XF e24分析仪。在OCR测量中依次注入了三种化合物：寡霉素(1.0μM)，三氟甲氧基苯腙羰基氰化物(FCCP; 1.0μM)，鱼藤酮和抗霉素A(0.5μM)的混合物，以获得线粒体基础呼吸，ATP连接的耗氧率，最大呼吸和备用呼吸能力。在指定的时间点依次注射葡萄糖(10 mM)，寡霉素(1.0μM)和2-脱氧葡萄糖(2-DG，50 mM)后测量ECAR，作为基础ECAR，最大ECAR和储备容量。分析后，将微孔板保存并用DAPI染色，以使用Operetta高内涵成像系统(PerkinElmer，USA)对每个孔中的细胞数进行归一化。结果如图13中A-B图所示。
实施例17
本申请的能量传递神经修复水凝胶(即实施例1制备的能量传递神经修复水凝胶，其中包含Ca-PolyP对脊髓损伤大鼠功能恢复的影响：
选用6-8周龄Wistar雌性大鼠，异氟烷麻醉后，对大鼠实现胸10(T10)椎板切除术，暴露脊髓。随后使用弹簧剪对T9-T10横断2mm，将CaPP温敏水凝胶通过注射器注射到损伤部位。逐层缝合筋膜肌肉和皮肤。每天对动物护理2次，术后适量使用抗生素。
术后1，3，7，14，28天对大鼠进行BBB评分。评分越高表明恢复越好。评分表如下BBB评分(Basso, Beattie & Bresnahan locomotor rating scale, BBB scale)，(大鼠脊髓损伤)评分标准：
0分：无可见后肢运动。
1分：一或两个关节轻微运动，通常为髋和/或膝关节。
2分：一个关节大幅活动或一个关节大幅活动且有另一关节轻微活动。
3分：两个关节大幅活动。
4分：后肢全部三个关节可轻微活动。
5分：两个关节轻微活动，第三个关节可大幅活动。
6分：两个关节大幅活动，第三个关节可轻微活动。
7分：后肢全部三个关节可大幅活动。
8分：非承重情况下可以爪掌面着地。
9分：足底仅位于负重位，或偶尔/频繁/持续以足背负重步行，无足底负重步行。负重：足底负重位时或仅在后躯干抬高时，HL伸肌收缩。
10分：偶见爪掌面承重移动；无前后肢协调动作。
11分：可较多的见到掌面承重移动，但无前后肢协调动作。
12分：可较多的见到掌面承重移动，偶见前后肢协调动作。
13分：常见掌面承重移动，可常见前后肢协调动作。
14分：有持续性掌面承重移动和前后肢协调动作；或出现常见的掌面移动，持续型前后肢协调动作，偶有爪背侧移动
15分：持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中无或欧有抓地；初接触时主动爪位置与身体平行
16分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常见爪抓地；初接触时主动爪位置与身体平行，负重转移后旋转。
17分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常见爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。
18分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可持续性爪抓地；初接触时主动爪位置均与身体平行，负重转移后旋转。
19分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可持续性爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。尾巴有时或总是下垂。
20分：持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行，躯干不稳定，尾巴持续翘起。
21分：持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，活动过程中主动爪位置始终与身体平行，躯干持续稳定，尾巴持续翘起。
注：HL(hindlimb)：后肢。轻度：小于等于百分之五十的关节活动范围。大幅是指大于百分之五十的关节活动范围。2个关节通常指髋关节和膝关节。第3个关节通常为踝关节。
结果如图14所示。
本发明的能量传递神经修复水凝胶，将可降解的无机多聚磷酸盐(Ca-PolyP)与温敏壳聚糖水凝胶结合，利用温敏壳聚糖水凝胶缓释可降解，可注射等特点，将无机多聚磷酸盐局部移植到损伤中心，实现对脊髓损伤后内环境的调控。适用于神经退行性疾病，脊髓损伤，创伤性脑损伤等神经系统疾病，通过提高神经元胞外ATP含量，提高神经元电活动，促进神经元存活和功能再生为脊髓损伤等神经系统疾病提供了新的修复手段及理论基础。
在本说明书的描述中，术语“一个实施例”、“一些实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或实例。而且，描述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种能量传递神经修复水凝胶，其特征在于，包括如下重量组分：壳聚糖1.5-50份；β-甘油磷酸钠40-70份；海藻酸钠0.5-5份；Ca-PolyP 0.5-10份。
2.根据权利要求1所述的能量传递神经修复水凝胶，其特征在于，包括如下重量组分：壳聚糖10-14份；β-甘油磷酸钠55-65份；海藻酸钠2-4份；Ca-PolyP 1-5份。
3.根据权利要求1所述的能量传递神经修复水凝胶，其特征在于，所述Ca-PolyP中PolyP的链长为40-130。
4.根据权利要求1所述的能量传递神经修复水凝胶，其特征在于，所述Ca-PolyP为(Ca1/2PO3)40或(Ca1/2PO3)100。
5.根据权利要求1所述的能量传递神经修复水凝胶，其特征在于，所述Ca-PolyP由CaCl2和(NaPO3)40-130制备而成；
所述Ca-PolyP的制备方法如下：将CaCl2溶解于pH=10的去离子水中，加入(NaPO3)40-130，将形成的微粒过滤收集，使用无水乙醇洗涤，置于60-80℃的烤箱中干燥，即得；其中(NaPO3)40-130摩尔浓度等于CaCl2摩尔浓度的2倍。
6.根据权利要求1所述的能量传递神经修复水凝胶，其特征在于，所述Ca-PolyP由CaCl2和(NaPO3)40-130制备而成；
所述Ca-PolyP的制备方法如下：将CaCl2·2H2O溶解于去离子水中，加入(NaPO3)40-130，将形过滤收集，使用无水乙醇洗涤，置于60-80℃的烤箱中干燥，即得；其中(NaPO3)40-130摩尔浓度等于CaCl2摩尔浓度的2倍。
7.一种如权利要求1-6中任一项所述的能量传递神经修复水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法为将所述能量传递神经修复水凝胶的各组分按照配方比例混合即可。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
称取壳聚糖溶于稀盐酸中，以配制壳聚糖溶液；
称取β-甘油磷酸钠溶于蒸馏水中，以配制β-甘油磷酸钠溶液；
称取海藻酸钠，溶于所述β-甘油磷酸钠溶液中，以配制海藻酸钠-β-甘油磷酸钠溶液；
将所述海藻酸钠-β-甘油磷酸钠溶液缓慢滴加到所述壳聚糖溶液中，以得到壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠混合溶液；
称取Ca-PolyP粉末溶于所述壳聚糖-β-甘油磷酸钠-海藻酸钠溶液，即得。
9.一种如权利要求1-6中任一项所述的能量传递神经修复水凝胶在制备用于治疗神经系统疾病的药物中的用途，其特征在于，所述神经系统疾病包括神经退行性疾病、脊髓损伤和创伤性脑损伤。
10.一种Ca-PolyP在制备用于治疗神经系统疾病的药物中的用途，其特征在于，所述神经系统疾病包括神经退行性疾病、脊髓损伤和创伤性脑损伤。
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