CN117368377A - 一种检测利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯和羟苯丙酯的方法 - Google Patents

一种检测利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯和羟苯丙酯的方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种检测利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯和羟苯丙酯的方法，涉及药物分析及检测技术领域，方法包括制备利多卡因丁卡因乳膏的供试品溶液，以及分别配制羟苯甲酯和羟苯丙酯的对照品溶液；对供试品溶液和对照品溶液进行HPLC检测并记录色谱图，根据出峰结果对利多卡因丁卡因乳膏样品溶液中的羟苯甲酯和羟苯丙酯进行定性和定量分析。本申请提供的检测方法能排除利多卡因丁卡因乳膏中其他辅料、利多卡因、丁卡因及其已知杂质对羟苯甲酯和羟苯丙酯测定的影响，能更准确的定量利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯和羟苯丙酯的含量，从而更有利于控制药品的质量。

Description

一种检测利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯和羟苯丙酯的方法
技术领域
本申请涉及药物分析及检测技术领域，尤其是涉及一种检测利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯和羟苯丙酯的方法。
背景技术
利多卡因丁卡因乳膏是以7％利多卡因和7％丁卡因为主要成分的复方制剂，主要用于成人未受损皮肤，以提供浅表性皮肤治疗的局部麻醉作用。
利多卡因丁卡因乳膏中通常含有对氨基苯甲酸、利多卡因、2,6-二甲基苯胺、羟苯甲酯、对氨基苯甲酸乙酯、丁卡因、丁卡因氮氧化物、羟苯丙酯、对丁氨基苯甲酸、对丁氨基苯甲酸甲酯、对丁氨基苯甲酸乙酯以及其他辅料。羟苯甲酯和羟苯丙酯主要起防腐和抑菌功效，但两者对皮肤均具有一定的刺激性，需要严格控制其用量。
现有技术中公开有采用毛细血管气相色谱内标法进行测定的方法，但是该方法的样品前处理是先以盐酸酸化，再用乙醚提取。然而，利多卡因丁卡因乳膏中的盐酸丁卡因含有酯键，结构极其不稳定，易受到酸、碱、光照、氧化、高温等影响，引起变质，所以不利于利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯和羟苯丙酯的测定。
鉴于此，为了解决检测利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯和羟苯丙酯时，酸、碱等试剂对各组分的影响，特提出本申请。
发明内容
为解决不便于检测利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯和羟苯丙酯含量的问题，本申请提供一种检测利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯和羟苯丙酯的方法，该方法能排除利多卡因丁卡因乳膏中其他辅料、利多卡因、丁卡因及其已知杂质对羟苯甲酯和羟苯丙酯测定的影响，能更准确的定量利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯和羟苯丙酯的含量，从而更有利于控制药品的质量。
第一方面，本申请提供一种检测利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯和羟苯丙酯的方法，方法包括：
制备利多卡因丁卡因乳膏的供试品溶液，以及分别配制羟苯甲酯和羟苯丙酯的对照品溶液；对供试品溶液和对照品溶液进行HPLC检测并记录色谱图，根据出峰结果对供试品溶液中的羟苯甲酯和羟苯丙酯进行定性和定量分析；
HPLC色谱检测条件包括：
检测波长：255-265nm；
色谱柱：C18柱；
流动相：流动相A为磷酸盐缓冲液，流动相B为甲醇；
HPLC的洗脱程序为：
0min，流动相A所占的体积比为65-75％，流动相B所占的体积比为25-35％；
0-15min，流动相A所占的体积比变为45-55％，流动相B所占的体积比变为45-55％；15-25min，流动相A所占的体积比变为5-15％，流动相B所占的体积比变为85-95％。
进一步地，上述HPLC色谱检测条件还包括：流速为1-2ml/min，柱温为25-35℃，检测温度为3-8℃，进样体积为15-25μL。
进一步地，上述HPLC的洗脱程序为：
0min，流动相A所占的体积比为70％，流动相B所占的体积比为30％；
0-15min，流动相A所占的体积比变为50％，流动相B所占的体积比变为50％；
15-25min，流动相A所占的体积比变为10％，流动相B所占的体积比变为90％。
进一步地，上述羟苯甲酯的定量限为0.8-1.2ng、检测限为0.2-0.4ng；
羟苯丙酯的定量限为0.6-1ng、检测限为0.1-0.4ng。
进一步地，上述在HPLC色谱图中，羟苯甲酯的保留时间为8.5min，羟苯丙酯的保留时间为14.5min。
进一步地，上述磷酸盐缓冲液的pH为2-3，磷酸盐缓冲液中的磷酸盐为磷酸二氢钾或磷酸二氢钠。
进一步地，上述供试品溶液的制备步骤包括：
取利多卡因丁卡因乳膏加入乙醇中稀释，制得浓度为0.5-0.9mg/mL的供试品溶液。
进一步地，上述对照品溶液的制备步骤包括：
分别取羟苯甲酯和羟苯丙酯的对照品，用乙醇稀释后，制得浓度为4-6μg/ml的羟苯甲酯对照品溶液、浓度为0.8-1.2μg/ml的羟苯丙酯对照品溶液。
第二方面，本申请提供一种用于利多卡因丁卡因乳膏质控的HPLC指纹图谱，HPLC指纹图谱具有11个特征峰，11个特征峰及保留时间如下：1号峰2.50-2.70min、2号峰4.06-4.10min、3号峰4.80-4.85min、4号峰8.46-8.48min、5号峰9.00-9.05min、6号峰9.90-10.01min、7号峰11.50-11.55min、8号峰14.58-14.59、9号峰15.50-15.55min、10号峰19.00-19.02min、11号峰20.60-20.64min。
进一步地，上述4号峰为羟苯甲酯，8号峰为羟苯丙酯。
综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：
1.本申请提供的利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯和羟苯丙酯检测方法，排除了复方制剂中其他辅料、利多卡因、丁卡因及其已知杂质对羟苯甲酯和羟苯丙酯测定的影响。能够更准确的定量利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯和羟苯丙酯的含量，从而更有利于控制药品的质量。另外，该检测方法不仅可以用于利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯和羟苯丙酯的检测，还可以用于羟苯甲酯和羟苯丙酯原料的检测。
附图说明
图1是本申请实施例中羟苯甲酯和羟苯丙酯检测混合溶液分离定位色谱图；
图2是本申请实施例中羟苯甲酯的线性关系图；
图3是本申请实施例中羟苯丙酯的线性关系图。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。予以特别说明的是：以下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行；以下实施例中所用原料除特殊说明外均可来源于普通市售。
本申请实施例公开一种检测利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯和羟苯丙酯的方法，利多卡因丁卡因乳膏是以7％利多卡因和7％丁卡因为主要成分和药用辅料制成的复方制剂。利多卡因是一种酰胺类局部麻醉药、丁卡因是一种酯类局部麻醉药，局部麻醉药(localanaesthetics)是一种能在用药局部可逆性的阻断感觉神经冲动发生与传递的药品，据临床研究发现，局部麻醉药的复方制剂较其单方，更有助于达到临床局部麻醉的效果，而利多卡因丁卡因乳膏就是复方制剂中的代表药品。
利多卡因丁卡因乳膏通常由对氨基苯甲酸、利多卡因、2,6-二甲基苯胺、羟苯甲酯、对氨基苯甲酸乙酯、丁卡因、丁卡因氮氧化物、羟苯丙酯、对丁氨基苯甲酸、对丁氨基苯甲酸甲酯、对丁氨基苯甲酸乙酯以及其他辅料复配制得。羟苯甲酯和羟苯丙酯是主要的抑菌剂和防腐剂，这两种组分的适用性较广，主要作用于有机合成、食品、化妆品、医药的杀菌防腐剂，也用作于饲料防腐剂。适量的羟苯甲酯和羟苯丙酯能起到抑菌的效果，但过量的羟苯甲酯和羟苯丙酯则会对人体产生危害。具体表现为：羟苯甲酯和羟苯丙酯对皮肤没有明显伤害，但仍具有一定的皮肤致敏性和刺激性，对于皮肤较为敏感的患者使用的话，就容易导致皮肤出现皮炎、皮肤发痒、发红等症状。
基于此，检测利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯和羟苯丙酯的含量，对管控药品质量有重要指导意义。由于利多卡因丁卡因乳膏中含有较多极其不稳定的组分，对酸、碱、光照、温度、湿度等条件较为敏感，所以传统的羟苯甲酯和羟苯丙酯的检测方法，例如食品、化妆品以及饲料中检测羟苯甲酯和羟苯丙酯的方法，不适用于利多卡因丁卡因乳膏。本申请提供一种利用HPLC精准检测利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯和羟苯丙酯的方法，能够有效排除不稳定的辅料和杂质对检测的影响，为药品质量管控提供有力指导。
实施例
实施例1
方法学验证结果
方法学验证内容及标准如下表1所示：
表1.方法学验证内容及标准
一、专属性
1、分别取利多卡因丁卡因乳膏供试品、丁卡因原料、对氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸乙酯、对丁氨基苯甲酸、对丁氨基苯甲酸甲酯、对丁氨基苯甲酸乙酯、丁卡因氮氧化物、利多卡因原料、2,6-二甲基苯胺、羟苯甲酯、羟苯丙酯以及其他辅料各适量，用乙醇溶解、稀释，制成供试品溶液(0.7mg/ml)、丁卡因溶液(0.7mg/ml)、利多卡因溶液(0.7mg/ml)，对氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸乙酯、对丁氨基苯甲酸、对丁氨基苯甲酸甲酯、对丁氨基苯甲酸乙酯、丁卡因氮氧化物(均为14μg/ml混合溶液)，2,6-二甲基苯胺(14μg/ml)，羟苯甲酯(5μg/ml)、羟苯丙酯(1μg/ml)，混合辅料(10μg/ml)的溶液，羟苯甲酯、羟苯丙酯的溶液为对照品溶液。
2、将上述溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品、丁卡因原料、利多卡因原料、潜在杂质及其他辅料出峰结果见表2；羟苯甲酯和羟苯丙酯的检查定位混合溶液色谱图结果见图1。
表2.抑菌剂与主成分、潜在杂质、其他辅料的分离结果统计
结果显示：出峰顺序为：对氨基苯甲酸、利多卡因、2,6-二甲基苯胺、羟苯甲酯、对氨基苯甲酸乙酯、丁卡因，丁卡因氮氧化物、羟苯丙酯、对丁氨基苯甲酸、对丁氨基苯甲酸甲酯、对丁氨基苯甲酸乙酯。
所有辅料除抑菌剂(羟苯甲酯和羟苯丙酯)外，其他辅料均不出峰；羟苯甲酯、羟苯丙酯、利多卡因、丁卡因及已知杂质均出峰，与羟苯甲酯、羟苯丙酯分离完全，含所有杂质及主成分的混合溶液中，羟苯甲酯与相邻峰(14μg/ml的对氨基苯甲酸，乳膏样品中始终未检出该杂质)的分离度为1.40，羟苯甲酯与相邻峰(14μg/ml的对丁氨基苯甲酸，乳膏样品中可能存在)的分离度为2.86。
综上结果表明确定的抑菌剂(羟苯甲酯和羟苯丙酯)检查方法专属性好，所有主成分、潜在杂质、其他辅料均不影响抑菌剂检查。
二、检测限和定量限
(1)羟苯甲酯
精密称取羟苯甲酯对照品适量，用流动相配成浓度为5μg/ml的溶液，将该溶液用乙醇逐级稀释进样，考察羟苯甲酯的检测限及定量限，结果见表3。
表3.羟苯甲酯检测限和定量限
结论：定量限按峰高为基线噪音的10倍计算，此时进样浓度约为0.0503μg/ml，进样量为20μl，故羟苯甲酯的定量限约为1ng；检测限按峰高为基线噪音的3倍计算，此时进样浓度为0.1509μg/ml，进样量为20μl，羟苯甲酯的最低检测限约为0.3ng。
取定量限浓度溶液，重复测定6次，考察其主峰保留时间及峰面积的平行性，结果见表4。
表4.定量限溶液连续进样6次结果
样品号 1 2 3 4 5 6 RSD
保留时间 8.201 8.208 8.219 8.231 8.189 8.196 0.19
峰面积 8531 8497 8540 8452 8555 8264 1.29
结果显示：重复检测羟苯甲酯定量限溶液，其主峰保留时间的RSD为0.19％，峰面积的RSD为1.29％，符合规定。
(2)羟苯丙酯
精密称取羟苯丙酯对照品适量，用流动相配成浓度为1μg/ml的溶液，将该溶液用乙醇逐级稀释进样，考察羟苯丙酯的检测限及定量限。结果见表5。
表5.羟苯丙酯检测限和定量限
结论：定量限按峰高为基线噪音的10倍计算，此时进样浓度约为0.0408μg/ml，进样量为20μl，故羟苯丙酯的定量限约为0.8ng；检测限按峰高为基线噪音的3倍计算，此时进样浓度为0.01244μg/ml，进样量为20μl，羟苯丙酯的最低检测限约为0.25ng。
取定量限浓度溶液，重复测定6次，考察其主峰保留时间及峰面积的平行性，结果见表6。
表6.定量限溶液连续进样6次结果
样品号 1 2 3 4 5 6 RSD
保留时间 17.779 17.806 17.804 17.831 17.841 17.838 0.14
峰面积 2314 2318 2342 2322 2349 2341 0.63
结果显示：重复检测羟苯丙酯定量限溶液，其主峰保留时间的RSD为0.14％，峰面积的RSD为0.63％，符合规定。
三、线性和线性范围
精密称取羟苯甲酯对照品10.0±5mg、羟苯丙酯对照品10.0mg±5mg，置于不同的100ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取上述羟苯甲酯溶液5ml、羟苯丙酯溶液1ml，置于同一10ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，分别精密量取0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml，置10ml量瓶中，分别加稀释至刻度，摇匀，作为标准曲线系列溶液，取标准曲线系列溶液各20μl，注入色谱仪，按照羟苯甲酯及羟苯丙酯检查方法，依法检测，结果见表7，线性关系图见图2和图3。
表7.羟苯甲酯和羟苯丙酯测定准曲线
结果显示：羟苯甲酯浓度在2.10μg/ml～8.40μg/ml之间，浓度与峰面积的线性关系良好，以羟苯甲酯浓度为横坐标，其峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程y＝72077x+2484.3，R2＝0.9991；羟苯丙酯浓度在0.408μg/ml～1.632μg/ml之间，浓度与峰面积的线性关系良好，以羟苯丙酯浓度为横坐标，其峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程y＝65416x-205.43，R2＝0.999。
四、溶液稳定性
取利多卡因丁卡因乳膏供试品，制成羟苯甲酯及羟苯丙酯测定用供试品溶液，置室温条件下放置，每隔2小时进样20μl，考察主成份峰面积变化情况，结果见表8。
表8.供试品溶液稳定性结果—峰面积
结果显示：本品羟苯甲酯及羟苯丙酯检查供试品溶液在室温条件下放置24小时，羟苯甲酯及羟苯丙酯峰面积均未变化，显示样品稳定，无需临用新制。
五、回收率
精密称取羟苯甲酯、羟苯丙酯对照品适量，加乙醇溶解制成含羟苯甲酯0.5mg/ml及羟苯丙酯0.1mg/ml的混合溶液，作为高浓度样品贮备液；另取9个100ml容量瓶，编号1-9，在每个容量瓶中加不含“羟苯甲酯、羟苯丙酯”的复方丁卡因乳膏样品左右；在1-3号瓶中各加入0.8ml羟苯甲酯、羟苯丙酯高浓度样品贮备液，分别加乙醇破乳、定容至刻度，过滤；在4-6号瓶中各加入1.0ml羟苯甲酯、羟苯丙酯高浓度样品贮备液，分别加乙醇破乳、定容至刻度，过滤；在7-9号瓶中各加入1.2ml羟苯甲酯、羟苯丙酯高浓度样品贮备液，分别加乙醇破乳、定容至刻度，过滤。按外标法测定羟苯甲酯、羟苯丙酯的含量，并计算回收率，结果见表9。
表9.羟苯甲酯及羟苯丙酯检查回收率结果
结果表明：该方法准确度高，抑菌剂(羟苯甲酯和羟苯丙酯)加入量与测得量相当，其他物料对抑菌剂的检查无影响。
六、重复性
取利多卡因丁卡因乳膏供试品，平行配制成6份羟苯甲酯及羟苯丙酯检查的供试品溶液，按上述确定的羟苯甲酯及羟苯丙酯检查方法，检测样品中羟苯甲酯及羟苯丙酯的含量。结果见表10。
表10.羟苯甲酯及羟苯丙酯检查重复性结果
结果表明：本品羟苯甲酯及羟苯丙酯检查方法的重复性好。
七、中间精密度
由不同实验次数使用不同的仪器，在不同时间，按上述方法测定利多卡因丁卡因乳膏供试品中羟苯甲酯及羟苯丙酯，结果见表11。
表11.中间精密度试验结果
结果表明：由不同实验次数使用不同的仪器，在不同时间，检查样品中主成分的含量，其RSD％均小于2％，说明羟苯甲酯及羟苯丙酯检查方法中间精密度好。
实施例2
利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯及羟苯丙酯检查
取三批利多卡因丁卡因乳膏(批号：140801、140802、140803)，依上述测定方法检查羟苯甲酯及羟苯丙酯，结果见表12。
表12.利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯及羟苯丙酯检查结果
结论：采用本申请的检测方法，能够精确检测出羟苯甲酯以及羟苯丙酯在利多卡因丁卡因乳膏中的含量，且能够排除其它杂质以及辅料的影响，检测结果更准确，可参考性更高。
以上均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯和羟苯丙酯的方法，其特征在于，所述方法包括：
制备利多卡因丁卡因乳膏的供试品溶液，以及分别配制羟苯甲酯和羟苯丙酯的对照品溶液；
对所述供试品溶液和所述对照品溶液进行HPLC检测并记录色谱图，根据出峰结果对所述供试品溶液中的羟苯甲酯和羟苯丙酯进行定性和定量分析；
所述HPLC色谱检测条件包括：
检测波长：255-265nm；
色谱柱：C18柱；
流动相：流动相A为磷酸盐缓冲液，流动相B为甲醇；
所述HPLC的洗脱程序为：
0min，所述流动相A所占的体积比为65-75％，所述流动相B所占的体积比为25-35％；
0-15min，所述流动相A所占的体积比变为45-55％，所述流动相B所占的体积比变为45-55％；
15-25min，所述流动相A所占的体积比变为5-15％，所述流动相B所占的体积比变为85-95％。
2.根据权利要求1所述的检测利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯和羟苯丙酯的方法，其特征在于，所述HPLC色谱检测条件还包括：流速为1-2ml/min，柱温为25-35℃，检测温度为3-8℃，进样体积为15-25μL。
3.根据权利要求1所述的检测利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯和羟苯丙酯的方法，其特征在于，所述HPLC的洗脱程序为：
0min，所述流动相A所占的体积比为70％，所述流动相B所占的体积比为30％；
0-15min，所述流动相A所占的体积比变为50％，所述流动相B所占的体积比变为50％；
15-25min，所述流动相A所占的体积比变为10％，所述流动相B所占的体积比变为90％。
4.根据权利要求1所述的检测利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯和羟苯丙酯的方法，其特征在于：所述羟苯甲酯的定量限为0.8-1.2ng、检测限为0.2-0.4ng；
所述羟苯丙酯的定量限为0.6-1ng、检测限为0.1-0.4ng。
5.根据权利要求1所述的检测利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯和羟苯丙酯的方法，其特征在于：在HPLC色谱图中，所述羟苯甲酯的保留时间为8.5min，所述羟苯丙酯的保留时间为14.5min。
6.根据权利要求1所述的检测利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯和羟苯丙酯的方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液的pH为2-3，所述磷酸盐缓冲液中的磷酸盐为磷酸二氢钾或磷酸二氢钠。
7.根据权利要求1所述的检测利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯和羟苯丙酯的方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备步骤包括：
取利多卡因丁卡因乳膏加入乙醇中稀释，制得浓度为0.5-0.9mg/mL的所述供试品溶液。
8.根据权利要求1所述的检测利多卡因丁卡因乳膏中羟苯甲酯和羟苯丙酯的方法，其特征在于，所述对照品溶液的制备步骤包括：
分别取羟苯甲酯和羟苯丙酯的对照品，用所述乙醇稀释后，制得浓度为4-6μg/ml的所述羟苯甲酯对照品溶液、浓度为0.8-1.2μg/ml的所述羟苯丙酯对照品溶液。
9.一种用于利多卡因丁卡因乳膏质控的HPLC指纹图谱，其特征在于，所述HPLC指纹图谱具有11个特征峰，所述11个特征峰及保留时间如下：1号峰2.50-2.70min、2号峰4.06-4.10min、3号峰4.80-4.85min、4号峰8.46-8.48min、5号峰9.00-9.05min、6号峰9.90-10.01min、7号峰11.50-11.55min、8号峰14.58-14.59、9号峰15.50-15.55min、10号峰19.00-19.02min、11号峰20.60-20.64min。
10.根据权利要求9所述的用于利多卡因丁卡因乳膏质控的HPLC指纹图谱，其特征在于：所述4号峰为所述羟苯甲酯，所述8号峰为所述羟苯丙酯。
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