CN117343886A - 一种双基因缺失的血清5型副猪嗜血杆菌弱毒疫苗株、构建方法及其应用 - Google Patents

一种双基因缺失的血清5型副猪嗜血杆菌弱毒疫苗株、构建方法及其应用 Download PDF

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郎利敏
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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种双基因缺失的血清5型副猪嗜血杆菌弱毒疫苗株、构建方法及其应用。本发明主要是利用现代基因工程原理和分子生物学手段对HPS潜在的毒力因子cpxA基因和cpxR基因进行缺失，构建HN1570双基因缺失菌株HPS5△cpxAR，该双基因缺失菌株于2023年6月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：45596。该双基因缺失菌株与亲本株相比，毒力大大降低，免疫原性不变，其作为抗原制备的弱毒活疫苗对血清5型的感染具有100%的保护率，对其他血清型型及不能分型的副猪嗜血杆菌的感染均具有较好的交叉保护力。而在制备疫苗时无需灭活及灭活检验，制备方法简单，生产效率更高，为进一步研制新型高效可提供高交叉保护效力的基因工程活疫苗打下基础。

Description

一种双基因缺失的血清5型副猪嗜血杆菌弱毒疫苗株、构建方 法及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种双基因缺失的血清5型副猪嗜血杆菌弱毒疫苗株、构建方法及其应用。
背景技术
副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)为猪上呼吸道的常在菌，是引起猪格拉泽氏病的病原，其在某些应激环境条件下侵入仔猪体内，导致宿主出现如胸膜炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎为病症的传染病菌。
随着自然环境不断变化，许多革兰阴性菌演变出既可摄取足够营养成分，又能灵敏感知并适应外界环境的变化的膜应激系统。Cpx双组份系统是细菌重要的膜应激系统之一，能被各种应激条件诱导，反过来调控细菌的各种表型。
cpx系统包括cpxA传感器组氨酸激酶和cpxR响应调节器。当cpxA受到不同环境信号(如pH变化、低铁条件)的刺激后被激活，磷酸基从cpxA转移到cpxR，然后磷酸化的cpxR与DNA结合，启动基因表达调控。cpxA是组氨酸蛋白激酶，负责感受外界环境刺激并通过自磷酸化将信号传递给反应调节蛋白cpxR，磷酸化的cpxR通过调控靶基因的转录和表达影响细菌的生理活性从而应对外界刺激使得细菌适应外界环境并存活下来。外界刺激结束后cpxA通过降解磷酸化的cpxR，从而终止调控反应。cpx双组份系统通过反应调节蛋白cpxR的磷酸化水平使得细菌对外界环境特定信号的反应处于一个适度的状态。随着近些年来对cpx双组份系统和细菌耐药性的研究，发现cpx双组份系统和多种其他种类的抗生素耐药性相关。cpx双组份系统作为细菌细胞膜应激应答系统，其对耐药性的影响往往是通过细胞膜成分的改变实现的。除此之外研究发现cpx影响细菌生物被膜形成能力。
cpx系统作为细胞膜应激应答系统对许多病原菌的感染过程具有调控作用。cpx系统对多种病原菌的毒力具有调控作用，并且部分细菌是通过影响细菌分泌系统或者菌毛等毒力因子的表达从而影响细菌的感染过程，由于cpx双组份系统的作用范围十分广泛，因此对细菌毒力的影响机制就十分复杂，从最初cpx影响细菌表面结构从而影响细菌毒力到近期cpx双组份系统调控其他调控因子的表达从而影响细菌毒力，以及cpx双组份系统与其他调控系统之间的相互作用，都表明了cpx双组份系统的调控作用非常广泛且复杂。
随着养殖模式的转变和免疫抑制病的出现，由副猪嗜血杆菌引起的革拉泽氏病成为养猪场常见的、多发的并且危害严重的猪呼吸系统疾病之一。因临床抗生素的滥用，导致细菌的耐药性越来越强，以至治疗成本也越来越高。cpx双组份系统作为一个细胞膜应激应答的信号转导系统，对多种病原菌的生存和致病性具有重要作用。由于血清5型在临床上分离比例最高，毒力较强危害性最大，因此本发明构建副猪嗜血杆菌血清5型的cpxAR双组分基因缺失株，为研制副猪嗜血杆菌cpxAR双基因缺失的新型高效且具有交叉保护力的弱毒疫苗及该病的综合防控提供科学依据。
发明内容
针对目前副猪嗜血杆菌各地流行血清型不一，存在多种灭活疫苗缺乏具有交叉保护力的血清5型副猪嗜血杆菌弱毒活疫苗，而细菌耐药性增强的问题，本发明提供一株副猪嗜血杆菌血清5型的cpxAR双组分基因缺失株，并研制出新型高效、具有交叉保护力的副猪嗜血杆菌cpxAR双基因缺失弱毒疫苗。
本发明解决其技术问题所采用的方案是：一株双基因缺失的副猪嗜血杆菌，所述副猪嗜血杆菌为副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)血清5型临床分离菌株HN1570的cpxA和cpxR基因缺失的双基因缺失株HPS5△cpxAR，保藏编号为CGMCC NO：45596，保藏日期为2023年6月16日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明还提供一种双基因缺失的副猪嗜血杆菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、引物的设计与合成：参考GenBank报道的副猪嗜血杆菌血清5型SH0165株全基因组No.CP001321序列，设计含有酶切位点及DNA摄取信号序列USS的引物cpxARuF/cpxARuR、cpxARdF/cpxARdR，用于扩增cpxAR上下游同源臂；参考质粒pSHK3-Kan序列设计引物KanF/KanR扩增Kan基因；其中所用引物序列如下：
cpxARuF：CGGAATTCACCGCTTGTAAGTGGTATTTCTTAGCAAT
cpxARuR：TATTTTTATCTTGTGCAATGAGCTCTATTTCCCTATTCCAT
cpxARdF：TAATCAGAATTGGTTAATTGTATCAATATATTGTCAATATC
cpxARdR：CGGGATCCACAAGCGGTAGCCGCAAACATACTTTGAC
KanF：CATTGCACAAGATAAAAATATAT
KanR：TTATTCCACCCACAACGGCAA；
步骤二、基因的克隆与重组自杀性质粒的构建：以副猪嗜血杆菌血清5型临床分离株HN1570株基因组为模板，分别用引物对cpxARuF/cpxARuR和cpxARdF/cpxARdR扩增出cpxAR基因上游和下游片段；用引物KanF/KanR从pSHK3质粒中扩增卡那霉素基因；利用重叠延伸PCR扩增原理用引物cpxARuF/cpxARdR将cpxAR基因上游片段、下游片段和卡那霉素基因通过重叠延伸PCR连接，形成重叠片段UKD；用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切UKD片段，连接到pK18mobsacB，构建得到自杀性质粒pKUKD；
步骤三、双基因缺失株的构建：参考自然转化法，大量提取重组质粒pKUKD并测定浓度；挑取转化子，提取基因组，分别用引物cpxARuuF/cpxARddR、cpxARF/cpxARR、KanF/KanR扩增UKD序列、cpxAR基因和Kan基因，电泳检测目的片段的大小及有无来鉴定是否成功构建cpxAR缺失株，并测序验证。
上述的双基因缺失的副猪嗜血杆菌的构建方法，步骤二中以副猪嗜血杆菌HN1570株基因组为模板，用引物对cpxARuF/cpxARuR和cpxARdF/cpxARdR扩增出cpxAR基因上游683bp和下游658bp的片段；用引物KanF/KanR从pSHK3质粒中扩增909bp卡那霉素基因。
上述的双基因缺失的副猪嗜血杆菌的构建方法，步骤三中自然转化法提取重组质粒pKUKD，具体步骤为：挑取HN1570单菌落于5mL TSB中，37℃培养至OD600值为0.8，取20μL菌液加入8mmol/L cAMP20μL，混匀，反应10min，加入2μg重组质粒pKUKD，混匀，反应10min后加入到TSA上，涂布均匀，37℃孵育5h。TSB洗下细菌，转移到含Kan的TSA固体培养基上中，37℃培养24～48h。
本发明还提供一种双基因缺失的副猪嗜血杆菌在制备副猪嗜血杆菌弱毒活疫苗方面的应用。
上述的应用，副猪嗜血杆菌弱毒活疫苗中副猪嗜血杆菌HPS5△cpxAR的含量为1×1010CFU/mL。
上述的应用，所述副猪嗜血杆菌弱毒活疫苗的制备方法为：将所述副猪嗜血杆菌依次经过增殖、浓缩后得到的副猪嗜血杆菌抗原液，向抗原液中加入免疫佐剂即得疫苗。
上述的应用，所述免疫佐剂为畜禽用水包油包水佐剂Summit S550。
上述的应用，所述副猪嗜血杆菌弱毒活疫苗的制备方法为：
(1)增殖：将副猪嗜血杆菌双基因缺失株HPS5△cpxAR菌株分别繁殖培养，获得8株副猪嗜血杆菌菌液，并分别进行活菌计数；
(2)浓缩：使用超滤装置浓缩副猪嗜血杆菌双基因缺失株HPS5△cpxAR菌液，根据活菌计数，用无菌生理盐水调整浓缩终浓度为1.0×1010CFU/mL；
(3)制备疫苗：将增殖、浓缩后获得的副猪嗜血杆菌双基因缺失株HPS5△cpxAR抗原液，加入终体积30％的畜禽用水包油包水佐剂，混匀制得副猪嗜血杆菌弱毒活疫苗。
本发明的有益效果：本发明以从临床分离株中筛选出5型副猪嗜血杆菌菌株HN1570株基因组为模板，构建出血清5型cpxAR双基因缺失株HPS5△cpxAR，该双基因缺失菌株对保育仔猪致病力极弱，不能够引起保育猪发病。
通过试验发现用HPS5△cpxAR株副猪嗜血杆菌作为菌株抗原制备的弱毒活疫苗对5型的感染具有100％的保护率，对其它血清型及不能分型的副猪嗜血杆菌的感染均具有较好的交叉保护力，说明副猪嗜血杆菌HPS5△cpxAR株菌株有良好的免疫原性；而且本发明疫苗制备工艺简单，无毒副作用，安全性好，免疫期长、免疫效果好，能够用于工业生产。
附图说明
图1为cpxAR基因上游片段、下游片段、卡那霉素基因、重叠延伸cpxAR上游片段+Kan+cpxAR下游片段扩增结果；图中M1为DL5000 Marker，从上到下依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp；M2为DL2000 Marker，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp；泳道1为上游片段；泳道2为下游片段；泳道3为Kan；泳道4为UKD。
图2为HPS5△cpxAR缺失株的鉴定结果；图中M1为DL5000Marker，从上到下依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp；M2为DL2000 Marker，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp；泳道1为引物cpxARuuF/cpxARddR鉴定HPS5△cpxAR；泳道2为引物cpxARuuF/cpxARddR鉴定HN1570；泳道3为引物cpxARuuF/cpxARddR鉴定ddH2O对照；泳道4为引物cpxARF/cpxARR鉴定HPS5△cpxAR；泳道5为引物cpxARF/cpxARR鉴定HN1570；泳道6为引物cpxARF/cpxARR鉴定ddH2O对照；泳道7为引物KanF/KanR鉴定HPS5△cpxAR；泳道8为引物KanF/KanR鉴定HN1570；泳道9为引物KanF/KanR鉴定ddH2O对照。
图3为本发明副猪嗜血杆菌HN1570和HPS5△cpxAR的菌落形态。
图4为本发明副猪嗜血杆菌HN1570和HPS5△cpxAR的光学显微镜下1000倍菌体形态。
图5为本发明副猪嗜血杆菌HN1570和HPS5△cpxAR的扫描电镜下100000倍菌体形态。
图6为本发明副猪嗜血杆菌HN1570和HPS5△cpxAR生长曲线结果。
具体实施方式
为了更清楚的说明本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明进一步阐述。
实施例1：副猪嗜血杆菌血清5型cpxAR双基因缺失株HPS5△cpxAR的构建
1、引物的设计与合成
参考GenBank报道的副猪嗜血杆菌血清5型SH0165株全基因组(No.CP001321)序列，设计含有酶切位点及ACCGCTTGTA(DNA摄取信号序列，USS)的引物cpxARuF/ARuR、cpxARdF/cpxARdR，用于扩增cpxAR上下游同源臂；cpxARF/cpxARR用于扩增cpxAR基因，去掉酶切位点和USS序列的cpxARuuF/cpxARddR用于鉴定cpxAR亲本株与缺失株，参考质粒pSHK3-Kan序列设计KanF/KanR用于扩增Kan基因。构建及鉴定副猪嗜血杆菌cpxAR基因缺失株的引物见表1。
表1用于构建和鉴定cpxAR缺失株的引物
2、副猪嗜血杆菌血清5型cpxAR双基因缺失株HPS5△cpxAR的构建与鉴定
以副猪嗜血杆菌血清5型临床分离株HN1570株基因组为模板，引物分别用引物对cpxARuF/cpxARuR和cpxARdF/cpxARdR扩增出cpxAR基因上游683bp和下游658bp的片段。引物KanF/KanR从pSHK3质粒中扩增909bp卡那霉素基因。利用重叠延伸PCR扩增原理使用引物cpxARuF/cpxARdR将这三个片段通过重叠延伸PCR连接，形成重叠片段UKD(如图1)。用BamHI和EcoRI酶切UKD片段，连接到pK18mobsacB，鉴定重组自杀性质粒pKUKD，酶切片段大小正确，测序100％正确，证明重组自杀性质粒构建成功。
参考文献(Jiang C S,Cheng Y F,Cao H,et al.Effect of cAMP ReceptorProtein Gene on Growth Characteristics and Stress Resistance of Haemophilusparasuis Serovar 5[J].Frontiers in Cellular and Infection Microbiology,2020.00019.)报道的自然转化法，大量提取重组质粒pKUKD，测定浓度。挑取HN1570单菌落于5mL TSB中，37℃培养至OD600值为0.8，取20μL菌液加入8mmol/L cAMP 20μL，混匀，反应10min，加入2μg重组质粒pKUKD，混匀，反应10min后加入到TSA上，涂布均匀，37℃孵育5h。TSB洗下细菌，转移到含Kan的TSA固体培养基上中，37℃培养24～48h。挑取转化子，提取基因组，用引物cpxARuuF/cpxARddR、cpxARF/cpxARR、KanF/KanR扩增UKD序列、cpxAR基因和Kan基因，电泳检测目的片段的大小及有无来鉴定是否成功构建cpxAR缺失株，并测序验证。
通过自然转化法将成功构建的重组自杀性质粒pKUKD转入HN1570中，通过PCR鉴定是否构建成功HN1570的cpxAR缺失株，引物cpxARuuF/cpxARddR鉴定缺失株片段2250bp，亲本株3513bp，引物cpxARF/cpxARR鉴定缺失株不能扩增到2172bp的cpxAR基因片段，亲本株能扩增到，引物KanF/KanR鉴定缺失株扩增到909bp卡那霉素基因，亲本株不能扩增到。PCR鉴定结果如图2，阳性扩增片段测序比对，结果100％同源。结果表明HN1570的cpxAR基因缺失株构建成功。
实施例2：副猪嗜血杆菌血清5型cpxAR双基因缺失株的生长特性试验
将亲本株HN1570及缺失株HPS5△cpxAR同时划TSA培养基，37℃培养，观察到均为无色透明小菌落，HPS5△cpxAR菌落与HN1570菌落相似(如图3)。革兰氏染色镜检及扫描电镜观察，均为革兰阴性短小杆菌，HPS5△cpxAR的菌体形态与HN1570相似(如图4，5)。
对HN1570和HPS5△cpxAR菌株的生长曲线进行了测定，结果两种菌株的生长特性没有显著差异(如图6)。表明cpxAR基因对HN1570的生长没有明显的影响。
实施例3：副猪嗜血杆菌血清5型cpxAR双基因缺失株的毒力试验
选取250g左右清洁级雌性豚鼠45只，随机分成9组(HN1570、HPS5△cpxAR菌株各4组，空白对照1组)，每组5只。将HN1570和HPS5△cpxAR单菌落接种TSB，过夜培养，活菌计数，调整至1.0×1010CFU/mL，10倍稀释成4个滴度，每个滴度腹腔注射5只豚鼠，每只豚鼠1mL，对照组注射生理盐水，同时原液10倍稀释，进行活菌计数。观察豚鼠发病和死亡情况，连续观察14d，死亡豚鼠取脏器组织抹片观察，接种TSA培养基。
观察发现：豚鼠感染试验发病死亡情况如表2。
表2致病性试验结果
结果显示，HN1570的1.0×107剂量组有2只发病，1.0×108、1.0×109、1.0×1010剂量组5只均发病，感染2h后出现了明显的发病症状，如精神沉郁，被毛粗乱，震颤，卷缩，挤堆等症状，感染6h后出现了死亡，1.0×107剂量组未死亡，1.0×108剂量组共死亡3只，1.0×109、1.0×1010剂量组5只均死亡，3天后未死亡豚鼠耐过症状消失恢复正常。HPS5△cpxAR的1.0×107、1.0×108、1.0×109剂量组均未发病，1.0×1010剂量组2只发病，未发生死亡，HPS5△cpxAR组发病症状明显轻于HN1570组，对照组未出现如何症状。组织抹片肝、肺、心血、脾、肾、脑均观察到短杆状细菌，接种TSA固体培养基，肝、肺、心血、脾、肾、脑分离到与接种菌株一致的细菌。
综合毒力试验结果，确定将副猪嗜血杆菌株HPS5△cpxAR株表现为毒力极弱的菌株，HPS5△cpxAR的毒力极显著低于HN1570。
实施例4：副猪嗜血杆菌血清5型cpxAR双基因缺失株弱毒活疫苗的制备、安全性和效力试验
一、疫苗的制备
1、菌种及菌种繁殖
一级种子繁殖
将副猪嗜血杆菌血清5型HN1570和cpxAR双基因缺失株HPS5△cpxAR株冻干菌种分别接种于含新生牛血清(终浓度5％)和NAD(终浓度0.01％)的TSA平板上，37℃培养18～24h，挑取符合要求的典型菌落，分别传代接种含胎牛血清(终浓度5％)和NAD(终浓度0.01％)的TSA平板，37℃培养24h，检验合格后，作为一级种子。
二级种子繁殖
将各株一级种子分别接种于含新生牛血清(终浓度5％)和NAD(终浓度0.01％)的TSB液体培养基中，37℃，摇床振荡培养18～24h，进行纯粹检验合格后，作为二级种子。
2、抗原菌液制备
将HN1570和HPS5△cpxAR株菌株的二级种子按1％分别接种于含新生牛血清(终浓度5％)和NAD(终浓度0.01％)的TSB液体培养基中，分别于37℃。摇床振荡培养18～24h后收获菌液。
3、活菌计数
按现行《中国兽药典》附录方法，使用适宜于本菌生长的含5％新生牛血清和0.01％NAD的TSA培养基进行活菌计数。使用摇瓶培养，活菌计数浓度，菌株培养活菌含量均在1.0×109CFU/mL以上。
4、菌液灭活
副猪嗜血杆菌HN1570菌株的培养液添加体积总量的0.2％甲醛溶液，在37℃灭活48h。取HN1570菌株的灭活菌液0.2mL接种适宜于TSA平板(含5％新生牛血清和0.01％NAD)，置37℃培养48h，无细菌生长为合格。HPS5△cpxAR无需灭活。
5、抗原浓缩
将检验合格的HPS5△cpxAR株菌液分别通过超滤系统装置浓缩菌液。根据浓缩前活菌计数结果，使用无菌生理盐水将菌体抗原浓度调整至1.0×1010CFU/mL。
6、佐剂准备
将畜禽用水包油包水佐剂Summit-S550分装成瓶，经121℃高压灭菌30分钟，室温存放备用。
7、疫苗制备
按浓缩的抗原液添加30％的畜禽用水包油包水佐剂Summit-S550，搅拌充分混匀，分装得到畜禽用水包油包水佐剂的副猪嗜血杆菌病弱毒活疫苗。最终疫苗中含灭活前菌株活菌总数为1.0×109CFU/mL。
二、疫苗的效力试验
选取体重在250g左右的清洁级雌性豚鼠240只，设立HN1570灭活疫苗组、HPS5△cpxAR活疫苗组和对照组各16组，每组5只。疫苗组每组分别注射疫苗1mL，疫苗组3周后二免注射同等剂量的疫苗，对照组注射生理盐水。二免后8天，疫苗免疫组、对照组分别用109CFU的副猪嗜血杆菌1～15型标准株和未能分型毒株菌液采取腹腔内攻毒。观察各组豚鼠的临床表现，发病和死亡情况，共观察2周，对死亡猪肺脏等器官进行细菌分离培养。
观察发现：HN1570灭活疫苗组与HPS5△cpxAR活疫苗组对不同血清型标准株均有较好的保护力，两组疫苗间没有明显的差异，对照组的豚鼠出现不同程度的发病和不同比例的死亡，疫苗免疫攻毒结果分别见表3。
表3对不同血清型菌株攻毒试验结果
由上述免疫攻毒试验结果可以看出，本HPS5△cpxAR弱毒活疫苗1mL免疫剂量两次免疫对副猪嗜血杆菌1～15型标准株和未能分型毒株攻击菌有不同程度保护，说明本发明菌株制备的弱毒活疫苗对所有的副猪嗜血杆菌感染具有较好的交叉保护效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不限制本发明，凡在本发明的精神和原则范围内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一株双基因缺失的副猪嗜血杆菌，其特征在于：所述副猪嗜血杆菌为副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）血清5型临床分离菌株HN1570的cpxA和 cpxR基因缺失的双基因缺失株HPS5△cpxAR，保藏编号为CGMCC NO：45596，保藏日期为2023年6月16日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种如权利要求1所述的双基因缺失的副猪嗜血杆菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、引物的设计与合成：参考GenBank报道的副猪嗜血杆菌血清5型SH0165株全基因组No.CP001321序列，设计含有酶切位点及DNA摄取信号序列USS的引物cpxARuF/cpxARuR、cpxARdF/cpxARdR，用于扩增cpxAR上下游同源臂；参考质粒pSHK3-Kan序列设计引物KanF/KanR扩增Kan基因；其中所用引物序列如下：
cpxARuF：CGGAATTCACCGCTTGTAAGTGGTATTTCTTAGCAAT
cpxARuR：TATTTTTATCTTGTGCAATGAGCTCTATTTCCCTATTCCAT
cpxARdF：TAATCAGAATTGGTTAATTGTATCAATATATTGTCAATATC
cpxARdR：CGGGATCCACAAGCGGTAGCCGCAAACATACTTTGAC
KanF：CATTGCACAAGATAAAAATATAT
KanR：TTATTCCACCCACAACGGCAA
步骤二、基因的克隆与重组自杀性质粒的构建：以副猪嗜血杆菌血清5型临床分离株HN1570株基因组为模板，分别用引物对cpxARuF/cpxARuR和cpxARdF/cpxARdR扩增出cpxAR基因上游和下游片段；用引物KanF/KanR从pSHK3质粒中扩增卡那霉素基因；利用重叠延伸PCR扩增原理用引物cpxARuF/cpxARdR将cpxAR基因上游片段、下游片段和卡那霉素基因通过重叠延伸PCR连接，形成重叠片段UKD；用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切UKD片段，连接到pK18mobsacB，构建得到自杀性质粒pKUKD；
步骤三、双基因缺失株的构建：参考自然转化法，大量提取重组质粒pKUKD并测定浓度；挑取转化子，提取基因组，分别用引物cpxARuuF/cpxARddR、cpxARF/cpxARR、KanF/KanR扩增UKD序列、cpxAR基因和Kan基因，电泳检测目的片段的大小及有无来鉴定是否成功构建cpxAR缺失株，并测序验证。
3.根据权利要求2所述的双基因缺失的副猪嗜血杆菌的构建方法，其特征在于：步骤二中以副猪嗜血杆菌HN1570株基因组为模板，用引物对cpxARuF/cpxARuR和cpxARdF/cpxARdR扩增出cpxAR基因上游683bp和下游658bp的片段；用引物KanF/KanR从pSHK3质粒中扩增909bp卡那霉素基因。
4.根据权利要求2所述的双基因缺失的副猪嗜血杆菌的构建方法，其特征在于：步骤三中自然转化法提取重组质粒pKUKD，具体步骤为：挑取HN1570单菌落于5mL TSB中，37℃培养至OD600值为0.8，取20µL菌液加入8mmol/L cAMP 20µL，混匀，反应10min，加入2µg重组质粒pKUKD，混匀，反应10min后加入到TSA上，涂布均匀，37℃孵育5h。TSB洗下细菌，转移到含Kan的TSA固体培养基上中，37℃培养24～48h。
5.一种双基因缺失的副猪嗜血杆菌在制备副猪嗜血杆菌弱毒活疫苗方面的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：副猪嗜血杆菌弱毒活疫苗中副猪嗜血杆菌HPS5△cpxAR的含量为1×1010 CFU/mL。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述副猪嗜血杆菌弱毒活疫苗的制备方法为：将所述副猪嗜血杆菌依次经过增殖、浓缩后得到的副猪嗜血杆菌抗原液，向抗原液中加入免疫佐剂即得疫苗。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述免疫佐剂为畜禽用水包油包水佐剂Summit S550。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述副猪嗜血杆菌弱毒活疫苗的制备方法为：
（1）增殖：将副猪嗜血杆菌双基因缺失株HPS5△cpxAR菌株分别繁殖培养，获得8株副猪嗜血杆菌菌液，并分别进行活菌计数；
（2）浓缩：使用超滤装置浓缩副猪嗜血杆菌双基因缺失株HPS5△cpxAR菌液，根据活菌计数，用无菌生理盐水调整浓缩终浓度为1.0×1010 CFU/mL；
（3）制备疫苗：将增殖、浓缩后获得的副猪嗜血杆菌双基因缺失株HPS5△cpxAR抗原液，加入终体积30%的畜禽用水包油包水佐剂，混匀制得副猪嗜血杆菌弱毒活疫苗。
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