CN117327785B - 一种用于sbds基因突变检测的引物组、方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于SBDS基因突变检测的引物组、方法及应用。所述引物组的核酸序列包括SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.2和/或SEQ ID NO.3‑SEQ ID NO.4所示的序列。本发明仅通过一次PCR就能够特异性的扩增SBDS基因相关序列，不受其假基因SBDSP1基因的影响，大幅提高了检测准确率，降低了检测的复杂程度和成本。
Description
技术领域
本发明属于生物技术、基因检测领域，涉及一种用于SBDS基因突变检测的引物组、方法及应用。
背景技术
舒瓦克曼综合征，Shwachman-Diamond综合征（SDS，OMIM260400），也称Shwachman-Bodian-Diamond综合征（SBDS），是一种罕见的常染色体隐性遗传病。SDS主要临床表现为骨髓衰竭和胰腺外分泌功能障碍，多数患者伴身材矮小，骨骼畸形，肝功能不全，重症感染以及白血病易感。SDS患者患骨髓增生异常综合征（MDS）和急性髓细胞白血病（AML）的风险很高，由于此病临床表现多样，极易漏诊及误诊，需要基因检测协助确诊。
c.183-184TA>CT和c.258+2T>c突变突变的高发通常是由假基因拷贝（SBDSP）的基因转换（gene conversion）事件引起的，该假基因拷贝与SBDS具有97%的核苷酸同源性，正是SBDSP的存在造成了SBDS基因突变检测的困难性，目前使用的捕获探针高通量测序技术由于读长限制，无论DNA水平还是RNA水平都不能有效区分SBDS和SBDSP的片段，无法实现准确的拼接，从而降低了SBDS基因突变的检出率，因此急需一种能对SBDS基因在DNA和mRNA水平上进行准确测序的方法。
综上所述，亟需提供一种用于SBDS基因突变检测的引物组及方法，实现对SBDS基因在DNA和mRNA水平上进行准确测序，提高SBDS基因突变检测的准确性。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明通过分析SBDS与其假基因SBDSP1在DNA及RNA水平上序列上的差异，设计出特异性的引物，使用Sanger测序法能够对SBDS基因及其mRNA进行准确测序，大大提高了SBDS基因突变检测的准确性。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种用于SBDS基因突变检测的引物组，所述引物组的核酸序列包括SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2和/或SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示的序列。
本发明通过分析SBDS与其假基因SBDSP1在DNA及RNA水平上序列上的差异，设计出特异性的引物，仅通过一次PCR就能够特异性的扩增SBDS基因相关序列，不受其假基因SBDSP1基因的影响，大幅提高了检测准确率，降低了检测的复杂程度和成本。
SEQ ID NO.1：5’-ACCACCAAGTTCTTTATTATTAGAAGTGACAC-3’。
SEQ ID NO.2：5’-GGGTTGGGGGGTAAGAAAAAGAAAACTG-3’。
SEQ ID NO.3：5’-GTGGTACGGATGAAGCGTGACG-3’。
SEQ ID NO.4：5’-CCTTCATTGACTGGAAGGATGAGCC-3’。
SEQ ID NO.1的引物针对NC_000007.14 ：66994086-C和66994086-C设计，区别于SBDSP1基因相似序列对应位置T；SEQ ID NO.2针对NC_000007.14：66994486-66994501序列设计，使用这两条引物可以以人全基因组DNA为模板，通过一次PCR特异性的对SBDS基因第二外显子区域进行扩增，可准确分辨出SBDS基因上2个最常见的突变c.183-184TA>CT和c.258+2T>c而不受SBDSP1基因序列的干扰。
SEQ ID NO.3针对NM_016038.4 c.66T和c.70G设计；SEQ ID NO.4针对NM_016038.4 c.524G和c.540C设计，为提高结合特异性，使用扩增阻碍突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)，在两条引物在3’端第三位碱基处人为引入错配。使用这两条引物，配合无3’-5’外切酶活性的Taq酶，可以以cDNA为模板，通过一次PCR，特异性的对SBDS mRNA的第二、三、四外显子区域进行扩增，可检测出c.183-184TA>CT造成的无义突变和c.258+2T>c造成的c.251-258 GTAAGCAG缺失。
优选地，所述SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示序列的引物扩增的区域包括SBDS基因第二外显子区域；所述SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示的序列的引物扩增的区域包括SBDS mRNA的第二、三和四外显子区域。
第二方面，本发明提供了第一方面所述的用于SBDS基因突变检测的引物组在制备用于检测SBDS基因突变的产品中的应用。
第三方面，本发明提供了一种用于SBDS基因突变检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一方面所述的用于SBDS基因突变检测的引物组。
第四方面，本发明提供了第一方面所述的用于SBDS基因突变检测的引物组或第三方面所述的试剂盒在检测SBDS基因突变中的应用。
第五方面，本发明提供了一种用于SBDS基因突变检测的基因扩增方法，所述方法包括：
以待测样本的DNA或cDNA为模板，利用第一方面所述的用于SBDS基因突变检测的引物组进行PCR扩增，得到扩增片段。
优选地，所述SBDS基因突变的位点包括GRCh38。
优选地，所述基因突变的形式包括c.183-184TA>CT和/或c.258+2T>c。
优选地，所述引物组的浓度为100 nM-1000 nM。
上述100 nM-1000 nM中的具体点值包括100 nM、200 nM、300 nM、400 nM、500 nM、600 nM、700 nM、800 nM、900 nM、950 nM、980 nM、1000 nM等。
优选地，所述引物组的浓度为400-600 nM。
上述400 nM-600 nM中的具体点值包括400 nM、410 nM、420 nM、430 nM、500 nM、550 nM、560 nM、570 nM、580 nM、590 nM、600 nM等。
优选地，所述PCR扩增使用的DNA聚合酶包括不含有3’-5’外切酶活性的Taq DNA聚合酶。
优选地，所述Taq DNA聚合酶包括：Thermo AmpliTaq Gold™ 360。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种特异性高的SBDS基因突变的检测方法及其引物，可以从DNA和RNA水平对SBDS基因突变进行检测，并且能够避免其假基因SBDSP1的干扰，无需复杂的巢式PCR提供特异性，仅通过一次PCR即可实现SBDS基因的特异性扩增，检测准确率高，方法简单，成本低。
附图说明
图1为健康人和携带c.183-184TA>CT突变患者的SBDS基因DNA测序结果图；
图2为健康人和携带c.258+2T>c突变患者的SBDS基因DNA测序结果图；
图3为健康人和携带c.183-184TA>CT突变患者的SBDS基因cDNA测序结果图；
图4为健康人和携带c.258+2T>c突变患者的SBDS基因cDNA测序结果图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
SBDS DNA测序。
1.1使用QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen 51306）分别提取健康人、携带c.183-184TA>CT和c.183-184TA>CT突变患者的外周血标本DNA，提取的DNA OD260/280为1.9。
1.2 配置10×引物mix
SBDS-F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTACCACCAAGTTCTTTATTATTA GAAGTGACAC-3’；
其中5’端18碱基为通用引物M13F，第19到50碱基为SEQ ID NO.1所示序列；
SBDS-R：5’-CAGGAAACAGCTATGACCGGTTGGGGGGTAAGAAAAA GAA AACT G-3’；
其中5’端18碱基为通用引物M13R，第19到45碱基为SEQ ID NO.2所示序列。
2管干粉引物彻底离心后，分别加水溶解为10 μM工作液，1：1混合成10×引物mix。
1.3 使用NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix（NEB M0543）配制表1PCR体系。
表1
1.4 扩增程序如表2。
表2
1.5 产物检测测序：产物进行琼脂糖电泳检测，PCR产物483 bp，使用M13F和M14R两条通用测序引物进行双向测序。
结果如图1和图2所示。图1上部分为健康人测序峰图，其c.184-185位测序结果为单独的TA峰，而SBDSP基因对应序列此位置序列为CT，测序信号峰下无其他碱基的信号峰，说明未扩增出SBDSP基因，测序结果未受到干扰；图1下部分为患者测序峰图，其c.184位置同时有T、A两个测序峰，c.185位置有T、A两个测序峰，且高度相近，说明患者携带一个c.183-184TA的野生型拷贝和一个c.183-184CT的突变型拷贝，且c.183-184CT拷贝并非来源于SBDSP基因序列的扩增而是本身SBDS基因上的突变。图2上部分为健康人测序峰图，其c.258+2位测序结果为T，而SBDSP基因对应序列此位置序列为C测序信号峰下无其他碱基的信号峰，说明未扩增出SBDSP基因，测序结果未受到干扰；图2下部分为患者测序峰图，其c.258+2位置同时有T、C两个测序峰，且高度相近，说明患者携带一个c.258+2C的野生型拷贝和一个c.258+2T的突变型拷贝，且为自身SBDS基因上突变。以上结果表明本发明设计的引物能够准确从DNA水平检测出SBDS基因c.183-184TA>CT和c.258+2T>C突变类型，不受其假基因SBDSP1基因的影响，检测准确率高。
实施例2
SBDS mRNA 测序。
2.1 使用QIAamp RNA Blood Minikit提取分别提取健康人、携带c.183-184TA>CT和c.183-184TA>CT突变患者的mRNA，提取的RNA OD260/280为2.0。
2.2 使用SuperScript II 反转录酶（Thermo 18064071）和Oligo dT反转录成cDNA。
2.3 配置10×引物mix
SBDS-cDNA-F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGtGTGGTACGGATGAAG CGTGACG-3’，
其中5’端18碱基为通用引物M13F，第19到40碱基为SEQ ID NO.3所示的序列；
SBDS-cDNA-R：5’-CAGGAAACAGCTATGACCCCTTCATTGACTGGAA GGATGAG CC-3’；
其中5’端18碱基为通用引物M13R，第19到43碱基为SEQ ID NO.4所示的序列。
2管干粉引物彻底离心后，分别加水溶解为10 μM工作液，1：1混合成10×引物mix。
2.4 使用AmpliTaq Gold™ 360 预混液（Thermo 4398901）配置扩增体系，如表3所示。
表3
2.5 扩增程序如表4。
表4
2.6 产物检测测序：产物进行琼脂糖电泳检测，PCR产物536 bp，使用M13F和M14R两条通用测序引物进行双向测序。
结果如图3和图4所示，图3、图4上半部分测序结果为健康人测序峰图，c.251-258测序结果为GTAAGCAG，c.183-184TA为TA，测序结果为单峰，无SBDSP1基因非编码RNA序列的影响。图3、图4下半部分为患者cDNA测序峰图，c.258+2T>c导致mRNA的第二外显子剪接发生错误，造成c.251-258GTAAGCAG缺失，形成与c.259-266ATTTTGAC的套峰，说明患者部分SBDS基因的mRNA存在c.251-258GTAAGCAG缺失造成移码；c.183-184位置出现TA和CT的套峰，说明患者部分SBDS基因的mRNA序列c.183-184位置序列未CT，c.184T使c.184-186AAA(p.62K)变为TAA（X）造成无义突变。以上结果表明本发明设计的引物能够准确从RNA水平检测出SBDS基因c.183-184TA>CT和c.258+2T>c突变类型，不受其假基因SBDSP1基因的影响，检测准确率高。
实施例3
口腔拭子DNA测序。
3.1使用tiangen口腔拭子基因组DNA提取试剂盒（tiangen DP322）提取受试者DNA，取受试者拭子棉签5个，提取DNA溶液80 μL，浓度为56.1 ng/μL，OD260/280为2.0
3.2检测方法同实施例1
结果健康受试者c.183-184位测序结果为单独的TA峰，c.258+2位测序结果为T，测序信号峰下无其他碱基的信号峰，说明未扩增出SBDSP基因，检测结果不受假基因SBDSP1基因的影响。
综上所述，本发明通过分析SBDS与其假基因SBDSP1在DNA及RNA水平上序列上的差异，设计出特异性的引物，仅通过一次PCR就能够特异性的扩增SBDS基因相关序列，不受其假基因SBDSP1基因的影响，大幅提高了检测准确率，降低了检测的复杂程度和成本。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (3)
1.一种用于SBDS基因突变检测的引物组，其特征在于，所述引物组的核酸序列为SEQID NO.1-SEQ ID NO.2和/或SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示的序列。
2.权利要求1所述的用于SBDS基因突变检测的引物组在制备用于检测SBDS基因突变的产品中的应用。
3.一种用于SBDS基因突变检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的用于SBDS基因突变检测的引物组。
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| CN104031978A (zh) * | 2013-03-06 | 2014-09-10 | 北京宏微特斯生物科技有限公司 | 一种基于arms荧光定量pcr检测基因突变的试剂盒和方法 |
| CN110719957A (zh) * | 2017-04-06 | 2020-01-21 | 王磬 | 用于核酸靶向富集的方法和试剂盒 |
| CN113584159A (zh) * | 2021-09-01 | 2021-11-02 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 | 用于sbds基因突变检测的引物组及基因扩增方法 |
-
2023
- 2023-12-01 CN CN202311629293.5A patent/CN117327785B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104031978A (zh) * | 2013-03-06 | 2014-09-10 | 北京宏微特斯生物科技有限公司 | 一种基于arms荧光定量pcr检测基因突变的试剂盒和方法 |
| CN110719957A (zh) * | 2017-04-06 | 2020-01-21 | 王磬 | 用于核酸靶向富集的方法和试剂盒 |
| CN113584159A (zh) * | 2021-09-01 | 2021-11-02 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 | 用于sbds基因突变检测的引物组及基因扩增方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Shwachman-Diamond综合征患儿的肝脏病理和基因分析;姜涛;欧阳文献;谭艳芳;李双杰;;临床儿科杂志(第07期);第540-542页 * |
| Structural variation and missense mutation in SBDS associated with Shwachman-Diamond syndrome;Carvalho, CMB等;《BMC Medical Genetics》;第15卷;第1-10页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117327785A (zh) | 2024-01-02 |
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