CN102533973A - 检测x连锁鱼鳞病的基因芯片及使用方法、试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测X连锁鱼鳞病的基因芯片及使用方法、试剂盒，所述基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的探针，所述寡核苷酸探针为SEQ ID NO.1-50所示的核苷酸序列；所述使用方法包括如下步骤：(a)制备样品DNA片段；(b)荧光标记上述DNA片段；(c)洗脱上述标记产物；(d)将标记产物与所述基因芯片杂交；(e)扫描检测基因芯片的杂交信号，获得结果；本发明还涉及包含前述基因芯片的试剂盒。本发明的基因芯片操作步骤简单，检测特异性高，稳定性好，从样本抽提到得到扫描结果可在一个工作日内完成，成本低，适用于临床患者基因突变检测、产前诊断和正常人杂合子携带者检测。

Description

检测X连锁鱼鳞病的基因芯片及使用方法、试剂盒

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的基因芯片及使用方法、试剂盒，具体涉及一种检测X连锁鱼鳞病的基因芯片及使用方法、试剂盒。

背景技术

鱼鳞病是一组以皮肤干燥大片状鳞屑为特征的遗传角化障碍性皮肤病，X连锁隐性遗传鱼鳞病(X-linked recessive ichthyosis，XLRI)是其中重要的一型，主要是男性发病，女性为致病基因携带者，一般不发病。临床上以四肢和躯干部位大块状，多角形，深褐色鳞屑为主要表现，四肢伸侧尤甚。X连锁隐性遗传鱼鳞病男性发病率约1/6000-1/2000，没有显著的种族和地理差异。除皮肤表现外，文献报道XLRI可伴有其他症状和系统异常。角膜混浊和隐睾是其特征性的伴发症状。

1978年，Shapiro等首先发现X-连锁隐性遗传鱼鳞病的发生与类固醇硫酸酯酶(STS)缺乏有关。STS(sterol sulphate sulphohydrolase)基因的缺失导致皮肤角质层的类同醇硫酸酯酶缺乏，其底物胆同醇硫酸盐水解减少，皮肤中的胆固醇硫酸盐含量增加，高比例的胆固醇硫酸盐改变角质层细胞膜间的物理特性，增加了细胞膜的稳定性和细胞间的凝聚程度，导致角质层细胞持久性黏着，从而导致皮肤正常脱屑过程延迟，形成鳞屑。

目前诊断XLRI较直接的生化检测就是测定血清、白细胞以及皮肤成纤维细胞中的类固醇硫酸酯酶(STS)活性。基因诊断包括PCR扩增整个基因片段检测缺失和点突变，Southern印迹，荧光原位杂交(FISH，检出率为85％)等，可以确定家族中的男性患者，也可以用于产前诊断。然而尚无一种快速、低成本、大通量和自动化检测X连锁鱼鳞病基因突变的方法。

比较基因组杂交(CGH)芯片分析技术是一种突破性技术，能够支持研究人员通过微阵列准确研究与疾病有关的染色体的变化。比较基因组杂交(CGH)芯片分析的原理是在一张芯片上用两份标记不同荧光素的样品(检测样品和对照样品)同时进行杂交，从而快速而又直观地检测实验样品和对照样品之间基因组DNA的拷贝数量的差异。CGH应用于疾病遗传学的研究，可以提供一个全基因组的扫描图，提示样本DNA在整个染色体组的哪个特定位置存在扩增或缺失，那些发生扩增的区域，极有可能存在致病基因，而缺失区域即可能包含一些抑制基因。因此，需要一种新的技术方案来克服现有技术的上述不足和缺点。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测X连锁鱼鳞病的基因芯片及使用方法、试剂盒。本发明的基因芯片操作步骤简单，检测特异性高，稳定性好，时间短，成本低。本发明还提供了前述检测X连锁鱼鳞病的基因芯片的使用方法和试剂盒。

本发明的目的是通过以下技术方案实现：

第一方面，本发明提供了一种检测X连锁鱼鳞病的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针为SEQ ID NO.1～50所示的核苷酸序列。

优选地，所述固相载体选自载玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚本乙烯。

第二方面，本发明还涉及前述检测X连锁鱼鳞病的基因芯片的使用方法，包括以下步骤：

(a)制备样品DNA片段；

(b)荧光标记上述DNA片段；

(c)洗脱上述标记产物；

(d)将标记产物与所述基因芯片杂交；

(e)扫描检测基因芯片的杂交信号，获得结果。

第三方面，本发明还涉及一种用于检测X连锁鱼鳞病的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的基因芯片。

优选地，所述试剂盒还包括标记物，所述标记物为Cy3-dUTP。

优选地，该试剂盒还包括标记物，所述标记物为Cy5-dUTP。

本发明具有如下的有益效果：本发明的基因芯片操作步骤简单，检测特异性高，稳定性好，该芯片多次试验重复性高；时间短，从样本抽提到得到扫描结果可在一天内完成。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解为：这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见New York Cold Spring HarborLaboratory出版社1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

本实施例的基因芯片由固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针为SEQ ID NO.1～50所示的核苷酸序列，所述固相载体为玻片。本实施例基因芯片的固相载也可选用硝酸纤维素膜、硅片、尼龙膜或聚本乙烯。本实施例的寡核苷酸探针由安捷伦公司生产，同时本实施例的基因芯片也由安捷伦公司按照常规方法生产。

本实施例基因芯片的使用方法，步骤如下：

(1)样品DNA片段的制备

取患者、正常人血液，采用常规方法抽提全基因组DNA(gDNA)。

将水浴锅温度调到37℃和65℃，溶化10×Buffer C(见下表)，短暂涡旋震荡后离心数秒。

对每个反应来说，将gDNA加入到适当的无核酸酶的PCR管中，并加入无核酸酶的水使反应体积达到10.1μL。

在冰上准备酶切混合母液，按顺序加入以下试剂：

其中，10×Buffer C由Rsa I提供；Acetylated BSA由Alu I提供；Promega Alu I的货号为Promega p/n R6281；Promega Rsa I的货号为Promega p/n R6371。

将2.9μL酶切反应液加入到gDNA反应管中，使之体积达到13μL。上下颠倒使之混匀。进行PCR反应，反应程序为：37℃运行2小时，65℃运行20分钟。

反应后将反应管转移到冰上，取2μL酶切好的gDNA，配置0.8％琼脂糖胶，用SYBR Gold染色，跑电泳检测酶切是否完全。大部分酶切产物长度应在200bp-500bp。

(2)DNA的荧光标记

在每个反应管中加入2.5μL随机引物(Agilent Genomic DNA Labeling Kit，Agilent p/n 5188-5309)，使之体积达到13.5μL，轻轻上下颠倒进行混匀。进行PCR反应，反应程序为：95℃变性3分钟。将反应管转移至冰上5min。

准备标记混合母液，按顺序加入以下试剂：

#Agilent Genomic DNA Labeling Kit，Agilent p/n 5188-5309。

将11.5μL标记反应液加入到gDNA反应管中，使之体积达到25μL。轻轻上下颠倒使之混匀。进行PCR反应，反应程序为：37℃运行2小时，65℃运行10分钟。将反应管转移到冰上。其中Cy3-dUTP标记正常人gDNA，Cy5-dUTP标记患者gDNA。

(3)标记gDNA的洗脱

加入430μL的1×TE(pH 8.0)到每个反应管中。将一个Microcon YM-30过滤柱(Millipore p/n 42410)放入一个1.5mL离心管中，并且将标记好的gDNA加到滤膜上。室温下8000g离心10min。弃滤液。加入480μL的1×TE(pH 8.0)到每个过滤柱中。室温下8000g离心10min。弃滤液。

倒置过滤柱，放入一个新的1.5mL离心管中。室温下8000g离心1min收集纯化样本。检查并记录每管洗出液的体积。如果体积超出10μL，将洗出液重新加到滤膜上，室温下8000g离心1min。弃滤液。

重复上述两步直到样本体积均小于等于10μL。加入1×TE(pH 8.0)使最终体积达到10μL。从每个样本中取1.5μL检测产量和比活，使用NanoDrop ND-1000 UV-VIS分光光度计(由Thermo Fisher Scientific Inc提供)测量。

将等量的分别用Cy5和Cy3标记的两种样本在一个新的1.5mL耐高温的离心管中混合，达到最终体积158μL。

(4)样品的预处理

向装有10×Blocking Agent冻干粉的小瓶中加入1350μL无核酶的水。在使用或保存之前，室温放置60min，涡旋振荡混匀。

将水浴锅调至95℃和37℃。

在一个无核酶的离心管中按顺序加入以下试剂：

试剂	体积(μL)/每次杂交反应
		Cy5和Cy3标记的gDNA混合液	16
Cot-1DNA(1.0mg/mL)1	2
		Agilent 10×Blocking Agent2	4.5
Agilent 2×Hybridization Buffer3	22.5
		最终杂交样本体积	45

其中，Cot-1DNA的货号为Invitrogen p/n 15279-011；

Agilent 10×Blocking Agent与Agilent 2×Hybridization Buffer的货号为Agilent p/n 5188-5220。

上下颠倒混合样品，随后短暂离心。将样品管转移到95℃水浴锅中水浴保温3min。立即将样品管转移到37℃水浴锅中水浴保温30min。将样品管拿出水浴锅，17900g离心1分钟，收集管底样品。

(5)芯片杂交

将一张干净的垫片放在杂交室(Agilent p/n G2534A)底部，使垫片标志朝上，并与杂交室底部的长方形区域对齐。确保垫片与杂交室底部同高。

缓慢地以画圈的方式将40μL杂交样品混合液加到垫片上的垫圈内区域。将芯片的活性面朝下放在垫片上，使得印有数字条形码的一面朝上，而印有“Agilent”标志的条形码一面朝下。确保两者相互对齐。将杂交室盖子盖在“垫片-杂交样品-芯片”三明治结构上，滑动夹具使之固定。手动加固杂交室上的夹具。垂直旋转组装好的杂交室以润湿芯片，观察气泡是否可以自由流动。如果发现静止的气泡，可以将杂交室放在桌面上通过轻轻敲打芯片或垫片使之移动。将组装好的杂交室固定在旋转器上，放入65℃的杂交炉中以20rpm的转速转动，杂交24小时。

(6)芯片洗脱和扫描

在室温下将染色缸1#装满Wash Buffer 1(Agilent Oligo aCGH Wash Buffer 1，Agilent p/n 5188-5221)。将一个芯片架放入染色缸2#。并往染色缸2#中放入一个磁力搅拌子。室温下往染色缸2#中装入足够多的Wash Buffer 1使之足以覆盖芯片架。将染色缸2#放在磁力搅拌器上。将在37℃烘箱中预热过的染色缸3#放在带有加热元件的磁力搅拌器上，装入3/4体积的预热过的Wash Buffer 2(Agilent Oligo aCGH Wash Buffer2，Agilent p/n 5188-5222)，再放入一个磁力搅拌子。打开加热元件，保持Wash Buffer2的温度于37℃；用温度计控制温度。将一个杂交室从杂交炉中拿出来并计时。记录杂交过程中是否形成气泡以及所有气泡是否旋转自由。拆卸杂交室。从有条形码的一端撬开三明治结构。通过将干净镊子伸入两张拨片之间，轻轻分开两张玻片。让垫片落入染色缸底部。将芯片移至染色缸2#(Wash Buffer 1)的芯片架上。同时避免让芯片暴露于空气中。

开启磁力搅拌器搅拌5min。调整转速以达到良好而不过分的搅拌。将芯片架转移至装有Wash Buffer 2、预热到37℃的染色缸3#，搅拌1min。在5-10s内缓慢将芯片架移出。尽可能减少芯片上的液滴。弃用过的Wash Buffer 1和Wash Buffer 2。立即扫描芯片以减少环境中氧化剂对于信号强度的影响。本实施例的基因芯片操作步骤简单，检测特异性高，稳定性好，该芯片多次试验重复性高；时间短，从样本抽提到获得扫描结果可在一天内完成。

Claims (6)

1.一种检测X连锁鱼鳞病的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，其特征在于，所述寡核苷酸探针为SEQ ID NO.1～50所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的检测X连锁鱼鳞病的的基因芯片，其特征在于，所述固相载体选自载玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚本乙烯。

3.一种使用权利要求1所述检测X连锁鱼鳞病的基因芯片的使用方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(a)制备样品DNA片段；

(b)荧光标记上述DNA片段；

(c)洗脱上述标记产物；

(d)将标记产物与所述基因芯片杂交；

(e)扫描检测基因芯片的杂交信号，获得结果。

4.一种用于检测X连锁鱼鳞病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的基因芯片。

5.根据权利要求4所述的用于检测X连锁鱼鳞病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标记物，所述标记物为Cy3-dUTP。

6.根据权利要求4所述的用于检测X连锁鱼鳞病的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括标记物，所述标记物为Cy5-dUTP。