CN117320548A - 经口疫苗组合物 - Google Patents
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Abstract
[课题]提供简便地制造具有免疫原性的经口给药用蛹的方法及由此制造的经口给药用蛹。[解决手段]一种经口用蛹的制造方法,其包括下述工序:使导入了编码抗原蛋白的DNA的重组杆状病毒感染杆状病毒感染性昆虫的幼虫或蛹,对由该感染后的幼虫化蛹而成的蛹或该感染后的蛹进行冷冻干燥。
Description
技术领域
本发明涉及经口给药用蛹、经口疫苗组合物、及它们的制造方法。
背景技术
杆状病毒是以昆虫为主要宿主、并且感染该宿主的核型多角体病毒(Nucleopolyhedrovirus:NPV),在增殖过程中,被感染的细胞的核内会形成被称为多角体(Polyhedrin)的晶体结构的蛋白质。因此,作为使用杆状病毒-桑蚕系统生产目标蛋白的方法之一,有下述方法:将编码目标蛋白的基因导入杆状病毒中,将该重组杆状病毒接种于桑蚕的幼虫或蛹,在桑蚕中生产目标蛋白(非专利文献1)。如此地使用杆状病毒-桑蚕系统制造疫苗时,在能够大量生产目标蛋白方面是有用的。
但是,在生产疫苗时,通常需要对桑蚕所生产的抗原蛋白进行提取和/或纯化等工序。
因此,期望开发出使用杆状病毒-桑蚕系统的更简便地生产疫苗的方法。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Maeda et al.,“Production of humanα-interferon in silkwormusing a baculovirus vector.”Nature,315,592-594(1985)
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于,提供简便地制造具有免疫原性的经口给药用蛹的方法、及由此制造的经口给药用蛹。另外,本发明的目的在于,提供包含上述经口给药用蛹的经口疫苗组合物及其制造方法。
用于解决问题的方案
本发明人们使导入有编码抗原蛋白的DNA的重组杆状病毒感染桑蚕的蛹,之后进行冷冻干燥,由此惊讶地发现可以维持免疫原性,至此完成了本发明。
即,本发明例如涉及以下各发明。
(1)一种杆状病毒感染性昆虫的蛹,其进行了导入有编码抗原蛋白的DNA的重组杆状病毒的感染处理及冷冻干燥处理。
(2)一种杆状病毒感染性细胞,其进行了导入有编码抗原蛋白的DNA的重组杆状病毒的感染处理及冷冻干燥处理。
(3)一种经口疫苗组合物,其含有(1)所述的蛹和/或(2)所述的细胞。
(4)根据(3)所述的经口疫苗组合物,其还包含含有佐剂的溶液。
(5)根据(3)或(4)所述的经口疫苗组合物,其中,相对于组合物的总重量,包含至少20重量%的蛹。
(6)一种功能性食品,其包含(1)所述的蛹和/或(2)所述的细胞。
(7)一种经口用蛹的制造方法,其包括下述工序:使导入了编码抗原蛋白的DNA的重组杆状病毒感染杆状病毒感染性昆虫的幼虫或蛹,对由该感染后的幼虫化蛹而成的蛹、或该感染后的蛹进行冷冻干燥。
(8)一种经口用细胞的制造方法,其包括下述工序:使导入了编码抗原蛋白的DNA的重组杆状病毒感染杆状病毒感染性细胞,对该感染后的细胞进行冷冻干燥。
(9)一种经口疫苗的制造方法,其包括下述工序:使导入了编码抗原蛋白的DNA的重组杆状病毒感染杆状病毒感染性昆虫的幼虫或蛹,对由该感染后的幼虫化蛹而成的蛹、或该感染后的蛹进行冷冻干燥。
(10)一种经口疫苗的制造方法,其包括下述工序:使导入了编码抗原蛋白的DNA的重组杆状病毒感染杆状病毒感染性细胞,对该感染后的细胞进行冷冻干燥。
(11)根据(7)或(9)所述的方法,其中,昆虫为桑蚕。
(12)根据(8)或(10)所述的方法,其中,细胞为源自黄领麻纹灯蛾(Spilosomaimparilis)、柞蚕、桑蚕、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)或粉纹夜蛾(Trichoplusiani)的细胞。
(13)一种在对象中诱导针对抗原蛋白的免疫的方法,其通过向对象给予(1)所述的蛹、(2)所述的细胞、(3)~(5)中任一项所述的经口疫苗组合物、或(6)所述的食品,从而在对象中诱导针对抗原蛋白的免疫。
发明的效果
根据本发明,提供简便地制造具有免疫原性的经口给药用蛹及含有其的经口疫苗组合物的方法。另外,所制造的经口给药用蛹可以直接用于给药,因此不再需要例如抗原蛋白的提取·纯化等、以及利用药剂的处理等。
附图说明
图1示出使用摄食了蛹的小鼠的血清分别通过ELISA法确认表达PCV2a的蛹及表达PPV VP2的蛹的免疫原性而得到的结果。图1的上图示出PBS包被的结果,图1的下图示出碳酸氢盐缓冲液(Bicarbonate buffer)包被的结果。“无稀释”表示以原液状态使用一抗的结果,“1/50稀释”表示将一抗稀释50倍而使用的结果。
图2为示出针对PCV2 ORF2抗原的抗原特异性IgG抗体或IgA抗体产生应答的图。左上:血清(原液)及肠道清洗液(原液)的IgG抗体产生应答(OD450 nm);左下:血清(50倍稀释)及肠道清洗液(50倍稀释)的IgG抗体产生应答(OD450 nm);右上:血清(原液)及肠道清洗液(原液)的IgA抗体产生应答(OD450 nm);右下:血清(50倍稀释)及肠道清洗液(50倍稀释)的IgA抗体产生应答(OD450 nm)。值示出N=3的平均值。将非给药组的血清及肠道清洗液记作原始(Naive)。
图3为示出针对PPV VP2抗原的抗原特异性IgG抗体或IgA抗体产生应答的图。左上:血清(原液)及肠道清洗液(原液)的IgG抗体产生应答(OD450 nm);左下:血清(50倍稀释)及肠道清洗液(50倍稀释)的IgG抗体产生应答(OD450 nm),针对PPV VP2抗原的抗原特异性产生应答;右上:血清(原液)及肠道清洗液(原液)的IgA抗体产生应答(OD450 nm);右下:血清(50倍稀释)及肠道清洗液(50倍稀释)的IgA抗体产生应答(OD450 nm)。值示出N=3的平均值。将非给药组的血清及肠道清洗液记作原始(Naive)。
图4为示出针对NV VP1抗原的抗原特异性抗体产生应答的图。左:血清(50倍稀释)及肠道清洗液(50倍稀释)的IgG抗体产生应答(OD450 nm);右:血清(50倍稀释)及肠道清洗液(50倍稀释)的IgA抗体产生应答(OD450 nm)。值示出N=6的平均值。将非给药组的血清及肠道清洗液记作原始(Naive)。将每周给药两次蛹的组记作每周2次给药组,将每周给药五次蛹的组记作每周5次给药组。
具体实施方式
1.概要
使用桑蚕异种蛋白表达系统生产针对感染症的疫苗抗原时,通过制作插入了成为对象的病原微生物(病毒等)来源的疫苗抗原基因的重组杆状病毒、并将其接种于桑蚕幼虫或蛹,从而使病毒在桑蚕个体内增殖,产生疫苗抗原。通常通过注射而给药的疫苗的情况下,需要对疫苗抗原蛋白进行一些纯化。并且,在进行纯化时,需要将亲和纯化、离子交换纯化、硫酸铵沉淀等多种色谱法组合。但是,如果能够将表达疫苗抗原的桑蚕蛹本身作为疫苗抗原来进行给药,则能够降低纯化的成本,可以期待削减注射给药相关的劳动量。
本发明中,通过对表达疫苗抗原的蛹或表达疫苗抗原的细胞进行冷冻干燥处理,成功地获得了高度确保了抗原性的蛹及细胞。并且,使小鼠摄食这些蛹或细胞,实际验证了抗体产生应答是否增强。其结果是,对于两种猪病毒抗原及一种人病毒抗原,确认到抗体产生应答的显著增强,获知甚至能够达成血中及肠道内的抗体诱导。
本发明基于上述见解。
本发明提供经口用蛹的制造方法,其包括下述工序:使导入了编码抗原蛋白的DNA的重组杆状病毒感染杆状病毒感染性昆虫的幼虫或蛹,对由该感染后的幼虫化蛹而成的蛹、或该感染后的蛹进行冷冻干燥。另外,本发明提供经口用细胞的制造方法,其包括下述工序:使导入了编码抗原蛋白的DNA的重组杆状病毒感染杆状病毒感染性细胞,对该感染后的细胞进行冷冻干燥。
冷冻干燥处理后的这些蛹及细胞均可以作为经口疫苗来使用。
2.导入了编码抗原蛋白的DNA的重组杆状病毒
本说明书中,抗原蛋白是指显示抗原性、即免疫原性的蛋白质。
作为抗原,没有特别限制,可以任意选择使用可使用的公知的各种抗原。可列举例如病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原及寄生虫抗原等。作为具体例,可列举猪圆环病毒抗原(PCV)等圆环病毒抗原、猪细小病毒抗原(PPV)等细小病毒抗原、诺如病毒抗原、流感病毒抗原、SARS-CoV2等冠状病毒抗原、疱疹病毒抗原、虹彩病毒抗原、弹状病毒抗原、双核糖核酸病毒抗原、三日热疟疾传播抑制疫苗候选抗原(Pvs25、Pvs28)等疟疾抗原、金黄色葡萄球菌抗原、气单孢菌抗原、结核杆菌抗原、猪胸膜肺炎放线杆菌抗原、猪肺炎支原体抗原、支气管炎鲍特氏菌抗原、多杀性巴斯德氏菌抗原、猪鼻支原体抗原、副猪嗜血杆菌抗原、大肠杆菌抗原、猪霍乱沙门菌抗原、链球菌抗原、流感病毒抗原、AIDS病毒抗原、猪流行性腹泻病毒抗原、传染性胃肠炎病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、日本脑炎病毒抗原、伪狂犬病毒抗原、锥虫抗原、多杀性巴斯德氏菌毒素、球虫抗原及泰勒虫抗原等。作为抗原蛋白的更具体的例子,可列举猪圆环病毒2型(PCV2;porcine circovirus type 2)的分离株PCV2a(GenBank accession#AF055392)的ORF2(1-233(序列号1))及猪细小病毒(PPV)的VP2(T3d17)等。
抗原的尺寸没有特别限制,例如可以为5~1000kDa、10~500kDa、或30~200kDa。
免疫原性是指抗原诱导抗体产生、细胞免疫的性质。有无免疫原性例如可通过抗体给药后有无抗体产生来评价。抗体的表达可以通过本领域技术人员公知的方法、例如酶结合免疫吸附检查法(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀、流式细胞术及免疫组织染色来确认。
将编码抗原蛋白的DNA导入杆状病毒的方法可以通过本领域技术人员公知的方法来进行,例如,可以通过Maeda et al.,Nature 315,592-594(1985)、Y.Matsuura et al.,Virology,(1989)173,674-682等中记载的方法来进行。例如,克隆编码抗原蛋白的DNA(包括cDNA),整合到杆状病毒转移载体,得到重组杆状病毒转移载体。然后,使用该重组杆状病毒转移载体,通过同源重组法或通过转座子转移法得到重组杆状病毒DNA。将该重组杆状病毒DNA通过脂质体转染法等公知的方法导入到昆虫培养细胞,得到重组杆状病毒。
杆状病毒转移载体是将杆状病毒基因组DNA的包含多角体基因的DNA片段亚克隆到质粒中而得到的,可以利用公知的方法来制作,也可以使用市售的载体。作为市售的载体,可列举例如pAcYM1、pAcG2T、pAcGP67、及VL1392(均为Pharmingen公司的)、pDEST8(Invitrogen公司)。
本发明中,作为用于制作重组杆状病毒的杆状病毒的种类,可列举苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus:AcNPV)、桑蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus:BmNPV)、黄杉毒蛾核多角体病毒(Orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus:OpNPV)、桑树舞毒蛾核型多角体病毒(Lymantria disper multiple nucleopolyhedrovirus:LdNPV)等,优选桑蚕核型多角体病毒(BmNPV)。
3.对杆状病毒感染性昆虫的幼虫或蛹的感染
本发明中,使重组杆状病毒感染成为宿主的杆状病毒感染性昆虫的幼虫或蛹、或者杆状病毒感染性细胞(也将这些统称为“宿主”)。
作为成为宿主的昆虫,可列举鳞翅目昆虫,只要是适合于蛋白质的表达且能感染杆状病毒者则没有特别限定,可列举例如黄领麻纹灯蛾(Spilosoma imparilis)、柞蚕(Antheraea pernyi)、桑蚕(Bombyx mori)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)等。昆虫可以为蛹及幼虫中的任一形态。
另外,作为成为宿主的细胞,只要是适合于蛋白质的表达且为杆状病毒感染性细胞株则没有特别限定。作为具有杆状病毒感染性的特征之一,可列举细胞表面表达被称为GP64的糖蛋白。因此,只要具有这种性质,则细胞的种类没有限定,可列举昆虫细胞等培养细胞。
作为昆虫细胞,可列举以下细胞。
黄领麻纹灯蛾(Spilosoma imparilis)来源细胞:SpIm
柞蚕(Antheraea pernyi)来源细胞:Anpe
桑蚕(Bombyx mori)来源细胞:BmN、BmN4、Oyanagi-2、Bme21
草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)来源细胞:Sf9、Sf21
使重组杆状病毒感染成为宿主的昆虫或细胞的方法可以通过本领域技术人员公知的方法来进行。例如,将上述工序中得到的重组杆状病毒注射于蛹或幼虫。在使宿主细胞感染的情况下,也可以将包含重组杆状病毒的液体添加到细胞培养用培养基中。
使宿主昆虫或宿主细胞感染重组杆状病毒后饲养或培养5~8天,则幼虫化蛹而成为蛹。并且在宿主昆虫或宿主细胞中表达抗原蛋白。
在此,在使用以往的杆状病毒-桑蚕系统生产目标蛋白时,在感染了重组杆状病毒的桑蚕的蛹或幼虫的体内表达目标蛋白后,进行蛹的破碎或从幼虫中回收体液,进行各种纯化而将目标蛋白纯化。与此相对地,在本申请发明的方法中,不需要进行这种目标蛋白的提取·纯化处理,在对表达了抗原蛋白的蛹或细胞进行冷冻干燥处理后可以直接使用。
4.感染了重组杆状病毒的宿主的冷冻干燥
作为对感染了重组杆状病毒的宿主的蛹或细胞进行冷冻干燥的时机,优选在宿主内(例如桑蚕蛹的体内)中表达了充分量的抗原蛋白后。另外,在使幼虫感染杆状病毒的情况下,使其发育成蛹。因此,关于冷冻干燥的时机,在所感染的桑蚕为幼虫时,为化蛹后,在所感染的桑蚕为蛹时,可以在感染后的任意时期进行冷冻干燥。冷冻干燥可以在感染了重组杆状病毒的蛹未经切割或破碎、以蛹的形状直接进行,也可以将蛹切割或破碎后进行。
本说明书中,“直接”及“以蛹的形状直接”使用蛹的表述是指:实质上以蛹的形状直接使用或包含等,例如非故意地在制造过程中缺失了一部分的情况下,只要维持了蛹形状的90%以上、80%以上、70%以上、60%以上、或50%以上,则也可以判断为保持蛹的形状。
冷冻干燥是在冷冻状态下通过减压下(例如在真空状态下维持)而使其干燥的方法。冷冻干燥可以通过本领域技术人员公知的方法来进行,例如可以使用市售的冷冻干燥机进行。冷冻处理温度可以由本领域技术人员适当设定,例如为-90℃~-5℃、-80℃~-10℃、或-50℃~-10℃。另外,减压条件也可以由本领域技术人员适当调整,例如为2Pa~20Pa、3Pa~20Pa或10Pa~20Pa。冷冻干燥时间例如为8小时~36小时。
通过冷冻干燥,蛹、细胞的水分大部分被除去,成为干燥状态。冷冻干燥后的蛹中所含的水分例如相对于蛹或细胞的总重量可以为1重量%以下、0.5重量%以下、0.1重量%以下、0.01重量%以下或0.001重量%以下。从容易维持免疫原性的观点出发,蛹中所含的水分越接近0重量%越优选。
在此,在本发明中,在上述冷冻干燥后可以任选对蛹或细胞进行加压加热处理。作为进行加压加热的时机,优选蛹、细胞被充分干燥后。也可以对感染了重组杆状病毒的宿主连续进行冷冻干燥工序和加压加热处理工序,即在冷冻干燥后不夹设其它处理工序而进行加压加热处理。冷冻干燥后的时机可以根据干燥后的桑蚕蛹的状况等适当调整,例如可以在冷冻干燥后24小时以内、12小时以内、3小时以内或1小时以内进行。冷冻干燥后的蛹优选未经切割或破碎、以蛹的形状直接进行加压加热处理。
加压加热处理是指在加热的状态下进行加压的处理。加压加热处理可以通过本领域技术人员公知的方法进行,例如可以使用市售的加压加热处理装置(例如高压釜装置等)进行。加压条件可以由本领域技术人员适当设定,例如可以通过加压到0.1MPa~0.6MPa、或0.2MPa~0.5MPa来进行。另外,加热条件也可以由本领域技术人员适当调整,例如可以以100℃~150℃、或110℃~140℃来进行。进行加压加热的时间也没有特别限制,例如可以以3分钟~90分钟、5分钟~60分钟、或10分钟~30分钟来进行。
进行了加压加热处理的蛹及细胞维持了免疫原性。因此,本发明中不需要提取抗原蛋白,可以直接用于经口给药。
进而,本发明的一方式中,进行了冷冻干燥处理的蛹被干燥、呈海绵状,因此可以通过浸渍于液体而使液体容易地渗透到内部。因此,本实施方式所涉及的制造方法可以还包括下述工序:将进行了冷冻干燥处理的蛹、或根据需要进行了加压加热处理的蛹浸渍于液体。作为浸渍的液体,为了能够容易提高作为疫苗的效果,优选含有佐剂的溶液。通过将进行了冷冻干燥处理的蛹浸渍于含有佐剂的溶液,可以使含有佐剂的溶液容易地浸渗到内部。对培养细胞进行冷冻干燥则成为粉末状组合物,因此可以在使用细胞时将冷冻干燥后的细胞浸渍于含有佐剂的溶液中。
通过本发明而制造的蛹或细胞可以直接使用,也可以切割或破碎后使用,还可以如上所述地浸渗液体后使用。
作为直接使用的方式,可列举例如将蛹直接作为疫苗而经口给药的方式、及直接食用蛹而摄取的方式。
作为切割或破碎后使用的方式,可列举例如将切割或破碎后的蛹直接给药的方式、将破碎后的蛹与其它可经口给药的材料混合并进行给药的方式、及将破碎物混合到饲料中以食用方式摄取的方式。例如,为了考虑到蛹的免疫原性而调整给药量,可以切割成例如1/2、1/3、1/4等。破碎的程度只要表现出免疫原性则没有特别限定,例如可以制成粉状。切割例如可以利用食品用剪刀及实验动物用剪刀来进行,破碎例如可以利用混合机、手动研磨机及粉碎装置来进行。使用细胞时,可以与将蛹破碎时同样进行处理。
作为经口给药,可列举例如口腔内给药及舌下给药。本说明书中,给药也包括对象自己进行摄取的情况。将蛹以原本的形态给药时,优选口腔内给药,也可以使对象自己食用。
作为可经口给药的添加剂,可列举例如食品材料、饮料材料、赋形剂、增稠剂、稳定化剂、防腐剂、pH调节剂、甜味剂、着色剂、乳化剂、香料、后述的药品添加物等。也可以与食品材料或饮料材料混合而以功能性食品或饮料形式来给药。作为包含可经口给药的材料的液体,只要经口给药用蛹具有免疫原性、为适合于经口给药的液体则没有特别限制,例如可以为水或水溶液。
5.经口疫苗组合物
如上得到的蛹或细胞包含外源抗原蛋白且具有免疫原性,因此可以作为经口疫苗组合物来使用。
经口疫苗组合物除了可以为蛹原本的形状以外,也可以为例如液状剂(糖浆剂、果冻剂等)、粉末剂、颗粒剂、片剂、散剂或胶囊等任意剂形。在将细胞作为经口疫苗组合物使用时,也可以为粉末剂、颗粒剂、片剂、散剂或胶囊等任意剂形。
以上的剂形通常可利用该领域中进行的方法与药品添加物一起制剂化。作为药品添加物,可列举例如佐剂、经口给药用载体、稀释剂、赋形剂、崩解剂、结合剂、润滑剂、流动化剂、涂覆剂、溶解剂、溶解助剂、增稠剂、分散剂、稳定化剂、防腐剂、pH调节剂、渗透压调节剂、浸润剂、甜味剂、及香料等。从提高作为疫苗的效果的观点出发,药品添加物优选含有佐剂。
作为佐剂,可列举例如弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、百日咳菌佐剂、Ribi佐剂、脂质A、脂质体、氢氧化铝、二氧化硅等。
本发明中可以进一步包括将具有免疫原性的蛹或细胞与药物添加物或包含它们的液体混合的工序。本发明的经口疫苗组合物中,包含在蛹或细胞中表达而得的抗原蛋白。在此可以设为:相对于疫苗组合物的总重量,包含例如20重量%以上、30重量%以上、40重量%以上、50重量%以上、60重量%以上、70重量%以上、80重量%以上、或90重量%以上的具有免疫原性的蛹或细胞的成分(例如冷冻干燥后的蛹的粉末)。
作为用作药物添加物的液体,只要经口疫苗组合物具有免疫原性、药学上适合于经口给药的液体则没有特别限制,可列举例如水、生理盐水或磷酸缓冲液(PBS)等水溶液等。
具有免疫原性的蛹可以直接使用,可以切割后使用,也可以破碎后使用。在使用细胞的情况下,也可以进行破碎。
本发明中,以蛹的形状直接使用蛹时,与包含药物添加物的液体混合的工序可以包括将冷冻干燥后的蛹浸渍于液体的工序。例如,通过将蛹浸渍于含有佐剂的溶液,可以使含有佐剂的溶液容易地渗透到内部。可以将内部浸渗有液体的蛹进一步切割或破碎后制成经口疫苗组合物。培养细胞的情况下,也可以基于蛹的破碎物那样来使用。
使用经切割或破碎的蛹的情况下,与包含药物添加物的液体混合的工序可以包括使经切割或破碎的蛹分散于液体的工序。
给药经口给药用蛹(疫苗)的对象没有特别限定,可列举例如哺乳类动物、禽类、爬行类、两栖类及鱼类等。哺乳类动物包括人以及小鼠、大鼠、猪、猴、牛、马、绵羊、兔、狗、猫及山羊等非人哺乳类动物。
本发明的经口给药用疫苗即使以蛹的形状直接经口给药也发挥免疫原性,但是也可以切割或破碎后给药,也可以如上所述地浸渗液体后使用。
作为以蛹的形状直接给药的方式,可列举例如:将经口给药用蛹直接作为疫苗而经口给药的方式;及,直接以食用方式摄取经口给药用蛹的方式。
作为切割或破碎后给药的方式(包括细胞的破碎物),可列举例如:将经切割或破碎的蛹或细胞直接经口给药的方式;将经切割或破碎的蛹或细胞与其它可经口给药的材料混合后给药的方式;及,将破碎物混合在饲料中,以食用方式摄取的方式。例如,为了考虑蛹的免疫原性而调整给药量,例如可以切割成1/2、1/3、1/4等。关于破碎的程度,只要显示免疫原性则没有特别限定,例如可以制成粉状。
给药量可以考虑给药对象、及蛹或细胞中表达的抗原蛋白量等适当设定。例如,可以每次给药1/10~2个蛹的量(0.08g~1.6g),也可以每次给药1/2~3/2个蛹的量(0.2g~1.2g)。表达的抗原蛋白量根据抗原蛋白的种类而不同,在使用PCV2及PPV等时,相对于蛹的重量约800mg为0.2mg~10mg,相对于每个蛹为0.025重量%~1.25重量%。根据上述,1个经口给药用蛹中包含通常的注射型疫苗的每次给药量的10倍以上的抗原病毒蛋白。
给药的次数及时间可以考虑给药对象、及蛹或细胞中表达的抗原蛋白量等适当设定。例如可以每天给药1次~5次,可以每天给药1次~3次,可以每天给药1次。另外,例如可以每周给药1天~7天,可以每周给药1天~5天,可以每周给药1天~4天。另外,可以将这些给药重复进行例如2~10周,可以重复进行1~7周,可以重复进行2~5周,可以重复进行2~4周。
需要说明的是,在给药疫苗时,可以在给药前(摄食前)断食1~3小时左右。
具体而言,例如可以按照以下方式给药。
给药对象为小鼠的情况下:
给药量:将1/4~1个蛹的量(0.2g~1.6g)每天给药(摄食)1次
时间:每周给药4~5次,重复进行3~4周
另外,此后可以通过例如每1~4周、优选每1~2周同样地给药而进行追加免疫。
本发明的蛹及细胞也可以与其它疫苗联合使用或组合使用。其它疫苗可以是对与本发明蛹或细胞相同的抗原蛋白具有免疫原性的疫苗,也可以是对不同的抗原蛋白具有免疫原性的疫苗。在为对与蛹或细胞相同的抗原蛋白具有免疫原性的疫苗时,例如可以为了进行上述其它疫苗的追加免疫等而给药本发明的蛹。
6.食品
本发明的食品包含蛹或细胞,因此具有免疫原性。
作为包含经口给药用蛹的食品,没有特别限制,可列举例如动物性食品及植物性食品。另外,食品可以为动物用的饲料的形式。
作为在食品中包含经口给药用蛹的方式,只要显示免疫原性则没有特别限制,具有免疫原性的蛹可以以其原来的形态使用,也可以以经切割的形态使用,还可以以经破碎的形态使用。
摄取食品的对象没有特别限定,与前述同样,可列举例如哺乳类动物、禽类、爬行类、两栖类及鱼类等。哺乳类动物包括人以及小鼠、大鼠、猪、猴、牛、马、绵羊、兔、狗、猫及山羊等非人哺乳类动物。
7.诱导免疫的方法
通过向对象给药上述的经口给药用的桑蚕的蛹、包含其的经口疫苗组合物或食品,可以在对象中诱导免疫。
关于给药等,如前所述。
关于在对象中诱导了免疫、以及免疫的程度,例如可以通过测定对象中的抗体产生或滴度等本领域技术人员熟知的方法来确认。
实施例
以下通过实施例更具体地说明本发明,但是本发明的技术范围不受这些例示限定。
[实施例1]家畜病毒用疫苗抗原经口给药用蛹的制造
将编码猪圆环病毒2型(PCV2;porcine circovirus type 2)的分离株PCV2a(GenBank登录号LC381288)的ORF2(1-233)或猪细小病毒(PPV)的VP2(T3 d17)的DNA按照常规方法(Purification and characterization of immunogenic recombinant virus-like particles of porcine circovirus type 2expressed in silkwormpupae.Journal of General Virology,2018,volume 99,Issue 7,917-926.)导入到桑蚕杆状病毒中,将得到的重组杆状病毒注射到桑蚕的蛹中而进行感染。
注射起8天后,将桑蚕的蛹用冷冻干燥机在-40℃下处理720分钟。
[实施例2]摄食试验
使用7周龄雌性BALB/c小鼠(n=3),进行实施例1中制作的经口给药用蛹的摄食试验。
在摄食前断食断水2小时。将每1只隔离,使其自由地摄食经口给药用蛹。在摄食蛹时,不供给水。
按照下表的日程使小鼠摄食蛹。暂停摄食时,除了蛹以外无饮食限制。在此期间,每1只小鼠摄食了14个蛹。
[表1]
蛹 | |
第1天 | 摄食 |
第2天 | 摄食 |
第3天 | 摄食 |
第4天 | 摄食 |
第5天 | 摄食 |
第6天 | 暂停摄食 |
第7天 | 暂停摄食 |
第8天 | 摄食 |
第9天 | 摄食 |
第10天 | 摄食 |
第11天 | 摄食 |
第12天 | 摄食 |
第13天 | 暂停摄食 |
第14天 | 暂停摄食 |
第15天 | 摄食 |
第16天 | 摄食 |
第17天 | 摄食 |
第18天 | 摄食 |
第19天 | 暂停摄食 |
第20天 | 暂停摄食 |
第21天 | 暂停摄食 |
第22天 | 采样 |
第22天在麻醉下采血后,得到血清及肠道清洗液。
[实施例3]特异性抗体产生应答的确认
使用实施例2中得到的血清及肠道清洗液,分别通过ELISA法确认表达PCV2a的蛹及表达PPV VP2的蛹的免疫原性。
将非给药组的小鼠的血清设为原始(Naive)。
ELISA法的包被抗原如下述那样来准备。需要说明的是,稀释用PBS来实施。
PCV2a ORF2(1-233):将0.44mg/mL稀释成56.8μL/4943.2μL(5μg/mL),以50μL/孔进行包被,在4℃下静置一晚。
PPV VP2:将0.34mg/mL稀释成73.5μL/4926.5μL(5μg/mL),以50μL/孔包被,在4℃下静置一晚。
另外,如以下所述那样使用各种抗体及底物等。
一抗:各种免疫血清及肠道清洗液原液(无稀释)或50倍稀释(均为50μL/孔)
二抗:1/10000稀释抗小鼠IgG或IgA-HRP在0.5%BSA中,以50μL/孔使用,在37℃下静置1小时。
封闭:1%BSA在PBS中,以200μL/孔使用,37℃下静置2小时。
清洗:基于0.5%BSA的1/50稀释或原液(undiluted solution),以50μL/孔使用,在37℃下静置2小时。
底物:使用1step Turbo TMB-ELISA(Thermo Scientific公司、100μL/孔),在室温下静置10分钟。
终止液:用2M H 2SO 4(100μL/孔)进行处理。
测定各孔在450nm下的吸光度(OD450值),将结果示于图1~图3。PCV2的结果是,在血清及肠道清洗液中确认到高的IgG抗体产生应答。另外,也评价了IgA应答,结果是在血清中也确认到抗体产生,但是在肠道清洗液中确认到更高的产生,不仅在原液情况下确认到应答,与预想相反在50倍稀释下也确认到充分的抗体产生反应(图2)。另一方面,PPV的情况下,血清中确认到IgG及IgA的抗体产生应答,但肠道清洗液则未确认到抗体产生应答(图3)。认为这些差异起因于病毒性状的差异。
[实施例4]人病毒用疫苗抗原经口给药用蛹的制造
将编码诺如病毒(Norovirus,NV)的基因型GII.4(GenBank登录号BAG70500.1)的VP1的DNA通过常规方法导入桑蚕杆状病毒,将得到的重组杆状病毒注射到桑蚕的蛹中而进行感染。
注射起8天后,将桑蚕的蛹用冷冻干燥机在-40℃下处理720分钟。
[实施例5]摄食试验
使用7周龄雌性BALB/c小鼠(n=6),进行实施例1中制作的经口给药用蛹的摄食试验。
在摄食前断水断食2小时。对每1只进行隔离,使其自由摄食经口给药用蛹。摄食蛹时,不供给水。
按照以下的表2及表3的日程使小鼠摄食蛹。暂停摄食时,除了蛹以外无饮食限制。在此期间,每1只小鼠摄食了14或6个蛹。
[表2]
每周摄食五次
蛹 | |
第1天 | 摄食 |
第2天 | 摄食 |
第3天 | 摄食 |
第4天 | 摄食 |
第5天 | 暂停摄食 |
第6天 | 暂停摄食 |
第7天 | 摄食 |
第8天 | 摄食 |
第9天 | 摄食 |
第10天 | 摄食 |
第11天 | 摄食 |
第12天 | 暂停摄食 |
第13天 | 暂停摄食 |
第14天 | 摄食 |
第15天 | 摄食 |
第16天 | 摄食 |
第17天 | 摄食 |
第18天 | 摄食 |
第19天 | 暂停摄食 |
第20天 | 暂停摄食 |
第21天 | 采样 |
[表3]
每周摄食两次
蛹 | |
第1天 | 摄食 |
第2天 | 暂停摄食 |
第3天 | 暂停摄食 |
第4天 | 摄食 |
第5天 | 暂停摄食 |
第6天 | 暂停摄食 |
第7天 | 暂停摄食 |
第8天 | 摄食 |
第9天 | 暂停摄食 |
第10天 | 暂停摄食 |
第11天 | 摄食 |
第12天 | 暂停摄食 |
第13天 | 暂停摄食 |
第14天 | 暂停摄食 |
第15天 | 摄食 |
第16天 | 暂停摄食 |
第17天 | 暂停摄食 |
第18天 | 摄食 |
第19天 | 暂停摄食 |
第20天 | 暂停摄食 |
第21天 | 采样 |
第21天在麻醉下采血后,得到血清及肠道清洗液。
[实施例6]特异性抗体产生应答的确认
使用实施例5中得到的血清及肠道清洗液,分别通过ELISA法确认表达NV VP1的蛹的免疫原性。
将非给药组的小鼠的血清设为原始(Naive)。
ELISA法的包被抗原如下述那样来准备。需要说明的是,稀释用PBS来实施。
NV VP2:将1.36mg/mL稀释成18.4μL/4981.6μL(5μg/mL),以50μL/孔进行包被,在4℃下静置一晚。
另外,如以下所述那样使用各种抗体及底物等。
一抗:各种免疫血清及肠道清洗液50倍稀释(均为50μL/孔)
二抗:1/10000稀释抗小鼠IgG或IgA-HRP在0.5%BSA中,以50μL/孔使用,在37℃下静置1小时。
封闭:1%BSA在PBS中,以200μL/孔使用,在37℃下静置2小时。
清洗:基于0.5%BSA的1/50稀释,以50μL/孔使用,在37℃下静置2小时。
底物:使用1step Turbo TMB-ELISA(Thermo Scientific公司、100μL/孔),在室温下静置10分钟。
终止液:以2M H 2SO 4(100μL/孔)进行处理。
测定各孔在450nm下的吸光度(OD450值),将结果示于图4。根据图4的结果,血清及肠道清洗液中确认了高的IgG抗体产生应答。另外,也评价了IgA应答,结果是在血清及肠道清洗液中均确认到抗体产生。与注射型的疫苗比较,在无佐剂的联合给药的状态下,确认到水平与注射型相比毫不逊色的抗体产生反应。分为给药次数为每周五次的组和每周两次的组来评价抗体产生应答,在每周五次的给药组中确认到增强的抗体产生应答。
序列表
<110> KAICO株式会社(KAICO Ltd.)
国立大学法人鹿儿岛大学(Kagoshima University)
国立大学法人九州大学(Kyushu University)
<120> 经口疫苗组合物
<130> G2855WO
<150> JP2021-066427
<151> 2021-04-09
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 233
<212> PRT
<213> 猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2)
<400> 1
Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg
1 5 10 15
Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro
20 25 30
Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg
35 40 45
Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Arg Thr Thr Val Thr Thr
50 55 60
Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Lys Ile Asp Asp Phe Val
65 70 75 80
Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr
85 90 95
Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
100 105 110
Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn
115 120 125
Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
130 135 140
Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro
165 170 175
Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ser Gly Asn
180 185 190
Val Asp His Val Gly Leu Gly Ala Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp
195 200 205
Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe
210 215 220
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro
225 230
Claims (13)
1.一种杆状病毒感染性昆虫的蛹,其进行了导入有编码抗原蛋白的DNA的重组杆状病毒的感染处理及冷冻干燥处理。
2.一种杆状病毒感染性细胞,其进行了导入有编码抗原蛋白的DNA的重组杆状病毒的感染处理及冷冻干燥处理。
3.一种经口疫苗组合物,其包含权利要求1所述的蛹和/或权利要求2所述的细胞。
4.根据权利要求3所述的经口疫苗组合物,其还包含含有佐剂的溶液。
5.根据权利要求3或4所述的经口疫苗组合物,其中,相对于组合物的总重量,包含至少20重量%的蛹。
6.一种功能性食品,其包含权利要求1所述的蛹和/或权利要求2所述的细胞。
7.一种经口用蛹的制造方法,其包括下述工序:使导入了编码抗原蛋白的DNA的重组杆状病毒感染杆状病毒感染性昆虫的幼虫或蛹,对由该感染后的幼虫化蛹而成的蛹或该感染后的蛹进行冷冻干燥。
8.一种经口用细胞的制造方法,其包括下述工序:使导入了编码抗原蛋白的DNA的重组杆状病毒感染杆状病毒感染性细胞,对该感染后的细胞进行冷冻干燥。
9.一种经口疫苗的制造方法,其包括下述工序:使导入了编码抗原蛋白的DNA的重组杆状病毒感染杆状病毒感染性昆虫的幼虫或蛹,对由该感染后的幼虫化蛹而成的蛹或该感染后的蛹进行冷冻干燥。
10.一种经口疫苗的制造方法,其包括下述工序:使导入了编码抗原蛋白的DNA的重组杆状病毒感染杆状病毒感染性细胞,对该感染后的细胞进行冷冻干燥。
11.根据权利要求7或9所述的方法,其中,昆虫为桑蚕。
12.根据权利要求8或10所述的方法,其中,细胞为源自黄领麻纹灯蛾、柞蚕、桑蚕、草地贪夜蛾或粉纹夜蛾的细胞。
13.一种在对象中诱导针对抗原蛋白的免疫的方法,其通过向对象给予权利要求1所述的蛹、权利要求2所述的细胞、权利要求3~5中任一项所述的经口疫苗组合物、或权利要求6所述的食品,从而在对象中诱导针对抗原蛋白的免疫。
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