CN117298259A - 磷酸化Tau肽的组合物及其用途 - Google Patents

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D·德马科
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A·穆斯
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M·武基切维奇·维尔希勒
D·希克曼
N·皮奥特
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Abstract

描述了含有tau肽(优选地为磷酸化tau肽)的脂质体和含有缀合于免疫原性载体的tau肽(优选地为磷酸化tau肽)的缀合物。还描述了用于治疗或预防神经变性疾病或障碍比如阿尔茨海默病的所述脂质体和/或缀合物的药用组合物和用途。

Description

磷酸化Tau肽的组合物及其用途
发明领域
本发明处于医学领域。本发明特别涉及tau肽的脂质体或缀合物及其用于预防或治疗tau病比如阿尔茨海默病的用途。
背景
阿尔茨海默病(AD)为一种进行性衰弱性神经变性疾病，估计影响到全世界4400万人(Alzheimers.net)。目前临床上可用的AD疗法旨在减缓临床症状的进展，但不针对疾病潜在的致病过程。不幸的是，这些疗法仅具有最小功效，并因此迫切需要开发和测试另外的预防和治疗措施。
阿尔茨海默病的标志性病理学为包含聚集的淀粉样β蛋白的细胞外斑块和细胞内“缠结”的积聚或过度磷酸化tau蛋白的聚集。导致这些蛋白积聚的分子事件表征不佳。对于淀粉样蛋白，假设淀粉样蛋白前体蛋白的异常裂解导致包含氨基酸1-42的易于聚集的片段的积聚。对于tau，假设激酶、磷酸酶或两者的失调导致tau异常磷酸化。一旦tau变为过度磷酸化，它就失去了有效结合和稳定微管的能力，而是积聚在受影响神经元的细胞质中。未结合的和过度磷酸化的tau似乎首先形成寡聚体，并然后形成更高程度的聚集体，假定其存在可能经对正常轴突运输的干扰，对它们形成于其中的神经元的功能产生负面影响。
在发达国家，诊断患有阿尔茨海默病或其他痴呆性tau病的个体通常接受胆碱酯酶抑制剂(例如)或美金刚胺(例如NamendaTM)治疗。这些药物尽管耐受性相当良好，但功效却非常一般。例如，在约50％经治疗的个体中，/>将症状的恶化延迟了6-12个月。其余的治疗为非药理性的，并且集中于使患者随着其认知能力的下降而更有能力处理日常任务。
几项已发表的研究(Asuni AA et al,.J Neurosci.2007 Aug 22；27(34):9115-29.,Theunis C et al.,PLoS One.2013；8(8):e72301.,Kontsekova E et al.,Alzheimers Res Ther.2014 Aug 1；6(4):44)表明，含有tau肽的活性疫苗可在小鼠或大鼠中诱导抗tau免疫反应；减少啮齿动物脑中病理性tau聚集体的积聚；和降低阿尔茨海默病动物模型中认知下降的进展速度。针对病理性tau蛋白的活性疫苗在患有阿尔茨海默病的人类患者中显示出免疫原性(Novak P et al.,Lancet Neurology 2017,16:123-134)。WO2010/115843描述了模拟蛋白tau的主要病理性磷酸化表位的抗原性磷酸肽以及用于治疗包括阿尔茨海默病在内的tau病的治疗和诊断用途的相关组合物。然而，目前市场上仍没有批准的有效疫苗来预防tau介导的疾病的发作。市场上没有有效的药物来在一旦开始时就阻止或减缓疾病的进程。因此，迫切需要确定可预防这些疾病的新的预防措施(例如疫苗)。
发明概述
在一个总体方面，本发明涉及脂质体，其包含：
a.tau肽，优选地tau肽为tau磷酸肽；和
b.辅助性T细胞表位，
其中tau肽存在于脂质体的表面上。
在一个实施方案中，脂质体进一步包含至少一种佐剂，其包含toll样受体配体。优选地，脂质体进一步包括toll样受体4配体和toll样受体9配体中的至少一种。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及脂质体，其包含：
a.tau肽，优选地tau肽为tau磷酸肽；
b.辅助性T细胞表位；和
c.以下中的至少一种：
i.toll样受体9配体，优选地为脂质化CpG寡核苷酸；和
ii.toll样受体4配体，优选地为toll样受体4激动剂，
其中tau肽存在于脂质体的表面上。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及脂质体，其包含：
a.tau磷酸肽；
b.辅助性T细胞表位；
c.脂质化CpG寡核苷酸；和
d.含有toll样受体4配体的佐剂；
其中tau磷酸肽存在于脂质体的表面上。
在另一个总体方面，本发明涉及包含tau肽(优选地为tau磷酸肽)和与之缀合的免疫原性载体的缀合物，其中tau肽经接头与载体缀合。接头可包括聚乙二醇(PEG)、3-(溴乙酰氨基)丙酸琥珀酰亚胺酯(SBAP)和间-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)中的一种或多种。可用于本发明的免疫原性载体的实例包括(但不限于)钥孔血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素(TT)、CRM197和来自脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)的外膜蛋白混合物(OMP)或其衍生物。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及缀合物，其具有式(I)结构：
或式(II)结构：
其中
x为0-10的整数，优选地为2-6，最优选地为3；和
n为2-11的整数，优选地为3-11。
本发明的其他方面涉及包含本发明的脂质体或缀合物和药学上可接受的载体的药用组合物、制备药用组合物的方法、以及药用组合物在需要它的受试者中诱导针对tau的免疫反应或者治疗或预防神经变性疾病或障碍的用途。
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于在患有神经变性障碍的受试者中诱导免疫反应或者用于在需要它的受试者中治疗或预防神经变性疾病或障碍的方法。所述方法包括给予受试者包含本发明的脂质体和药学上可接受的载体的药用组合物或者包含本发明的缀合物和药学上可接受的载体的药用组合物。优选地，所述方法包括给予受试者用于引发免疫的本发明药用组合物和用于加强免疫的本发明药用组合物。
在阅读以下对本发明的详细描述和权利要求后将更好地意识到本发明的其他方面、特征和优点。
附图详述
当连同附图一起阅读时，将更好地理解本申请的前述概述以及以下优选实施方案的详细描述。然而，应当理解，本申请不限于附图所示的确切实施方案。
图1说明本发明实施方案的新疫苗：本发明实施方案的tau脂质体(上图)和本发明实施方案的tau缀合物(下图)；
图2说明包含本发明实施方案的脂质体(第二代脂质体)的疫苗活化辅助性T细胞，所述脂质体含有包封的辅助性T细胞表位(例如破伤风多肽(tet))；
图3说明包含本发明实施方案的缀合物的疫苗活化辅助性T细胞，所述缀合物含有非自身或免疫原性载体蛋白；
图4显示本发明实施方案的tau疫苗在恒河猴中诱导持续的高效价抗磷酸化tau抗体：与没有辅助性T-细胞表位的对照脂质体疫苗相比较，对于包含本发明实施方案的脂质体(脂质体Z)的疫苗或包含本发明实施方案的缀合物(缀合物A)的疫苗而言，随着时间推移的如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量的每组终点效价的几何平均值更高；
图5显示与健康人类脑切片(右图)相比较，来自用本发明实施方案的脂质体(脂质体Z)免疫的恒河猴的血清与人类AD脑切片中的病理性tau结构结合(左图)；
图6显示与健康人类脑切片(下排)相比较，来自用以含有可溶性CpG和氢氧化铝(alum hydroxide)的组合物配制的本发明实施方案的缀合物(缀合物A)免疫的恒河猴的血清与人类AD脑切片中的病理性tau结构结合(上排)。
图7显示通过本发明实施方案的脂质体疫苗脂质体X、Y和Z诱导的恒河猴中抗磷酸化tau抗体的效价，脂质体X、Y和Z中的每一种含有包封的T细胞表位T50和一种或多种佐剂；效价通过ELISA测量，并在单个猴子中随着时间的推移以终点滴度呈现。具体而言：
图7A显示使用单独的TLR4配体MPLA(3D-(6-酰基))作为佐剂，通过脂质体X诱导的抗磷酸化tau抗体的效价；
图7B显示使用单独的TLR9配体(脂质化CpG寡核苷酸)作为佐剂，通过脂质体Y诱导的抗磷酸化tau抗体的效价；
图7C显示使用TLR4配体MPLA(3D-(6-酰基))和TLR9配体(脂质化CpG寡核苷酸)的组合作为佐剂，通过脂质体Z诱导的抗磷酸化tau抗体的效价，其也表明两种佐剂的组合在个体猴子中诱导的抗体效价变化性较小；
图7D显示上述免疫组和含有TLR4配体MPLA但没有T细胞表位的对照脂质体疫苗的抗体效价的几何平均值，并显示本发明实施方案的疫苗比对照脂质体疫苗产生更高的抗磷酸化tau抗体的抗体效价：效价通过ELISA进行测量，并以随着时间推移每组的终点效价的几何平均值+/-95％置信区间表示；
图8显示使用本发明实施方案的脂质体疫苗(例如脂质体X、Y或Z)或缀合物疫苗(缀合物A)进行的免疫诱导对从阿尔茨海默病患者死后脑分离的富含成对螺旋丝(ePHF)特异性的抗体IgG效价：抗体效价通过Meso Scale Discovery(MSD)技术进行测量，并表示为个体猴子在第50天的数值以及第一次免疫之后的几何平均值+/-95％CI；
图9显示用含有包封的T50以及TLR4配体(3D-(6-酰基))和TLR9配体(脂质化CpG寡核苷酸)的组合作为佐剂的本发明实施方案的脂质体疫苗(脂质体Z)进行的免疫诱导主要结合SEQ ID NO:2的磷酸化tau肽的N-末端的抗体(图9A)，而用本发明实施方案的缀合物疫苗(缀合物A)免疫的猴子产生的IgG抗体则主要与磷酸化肽(左)和非磷酸化肽(右)两者肽的C-末端部分结合(图9B)；
图10A和B显示用含有包封的T细胞表位T50和TLR4配体(3D-(6-酰基))作为佐剂的本发明实施方案的脂质体疫苗(脂质体S)接种，比对照脂质体疫苗(含有TLR4配体3D-(6-酰基)/>但没有T细胞表位T50，脂质体R)以及含有表面T细胞表位T57(二棕榈酰化T50)和TLR4配体(3D-(6-酰基)/>脂质体T)的本发明实施方案的脂质体疫苗，在小鼠中诱导明显更高的抗体效价：第一次免疫之后第21天(图10A)和第35天(图10B)的抗体效价通过ELISA进行测量，并表示为个体数值和每组的几何平均值±95％CI；(**:p<0.01,***:p<0.001)；
图11显示将T细胞肽T48或T52包封于脂质体(分别为脂质体M或N)中在小鼠中诱导对所包封的肽特异性的T细胞反应：T细胞反应通过IFN-γ(图11A)和IL-4(图11B)ELISPOT进行评估；
图12显示含有包封的T细胞表位的脂质体疫苗(脂质体L)和含有锚定的T细胞表位的脂质体疫苗(脂质体O)各自比没有T细胞表位的对照脂质体疫苗诱导更高的tau磷酸肽特异性抗体效价；脂质体L、脂质体O和对照脂质体中的每一种均进一步含有MPLA作为佐剂；
图13显示Tau缀合物(KLH-TAUVAC-p7.1或KLH-TAUVAC-p22.1)在野生型小鼠中诱导TfH细胞和稳健的针对tau肽的Ab效价，具体而言：
图13A说明成年雌性Balb/C小鼠组(每组n＝14)用100ug佐剂化KLH-tau缀合物疫苗(KLH-TAUVAC-p7.1或KLH-TAUVAC-p22)、活性安慰剂疫苗(KLH加alum或Ribi)或非活性安慰剂(PBS)，根据所示时间表免疫总共4次：在初次免疫之后7天，将每个免疫组的4只动物处死，并收集注射部位引流的淋巴结；
图13B显示引流淋巴结中免疫组(每组n＝4只小鼠，个别进行分析)的TfH的几何平均百分比：所有接受活性疫苗或安慰剂的组均具有可测量的TfH；此外，接受疫苗KLH-TAUVAC-p7.1、KLH-TAUVAC-p22.1或活性安慰剂KLH加alum的动物的TfH明显多于给予非活性安慰剂的动物(就多重比较而言使用ANOVA检验然后进行Dunnett校正，对于KLH-TAUVAC-p7.1而言p＝0.0044；对于KLH-TAUVAC-p22.1而言p＝0.0482；对于KLH而言p＝0.0063)；
图13C-H显示对于具有95％置信区间的组平均值(n＝5-10)，在免疫之后的4个时间点(第14、28、56和84天)自基线(第0天)的血清效价的变化：星号表示KLH-TAUVAC诱导的抗体反应明显高于由活性安慰剂诱导的反应的时间点(p≤0.05，就多重比较而言使用ANOVA检验然后进行Tukey校正测量)，更具体而言：
图13C显示与磷酸化tau肽p7.1的结合效价；
图13D显示与磷酸化tau肽p22.1的结合效价；
图13E显示与非磷酸化tau肽p7.1的结合效价；
图13F显示与非磷酸化tau肽p22.1的结合效价；和
图13G和H各自显示与载体蛋白KLH的结合效价。
图14显示来自用Tau缀合物免疫的小鼠的血清也结合来自其他tau病的病理性tau结构：来自初次免疫之后84天每个接种组的合并血清(n＝6)用于对来自具有MAPT突变(MAPT P301S，额叶皮层)的额颞叶痴呆病例、具有皮克氏病(额叶皮层)的病例、进行性核上性麻痹(PSP，尾状核)和原发性年龄相关性tau病(PART，海马体)的脑组织进行染色；来自接受活性疫苗的动物的血清突出显示每种tau病典型的tau相关结构，而来自用活性安慰剂(KLH-alum或KLH-Ribi)或非活性安慰剂(PBS)免疫的动物的血清则未对任何那些结构染色；显示相应区域的用AT8进行的免疫染色作为参考；比例尺＝50um；
图15显示在加速tau病模型中，疫苗诱导的抗体降低聚集的tau，具体而言：
图15A：3月龄的P301L转基因小鼠(每组n＝15)接受以来自用KLH-TAUVAC-p7.1加RIBI或用活性安慰剂KLH加RIBI免疫的小鼠的纯化IgG预温育的人类ePHF的立体定位注射；注射之后两个月，处死所有小鼠，并在总和肌氨酰不溶性级分中测定小鼠中聚集的tau的量。
图15B和15C：从每只动物的注射半球中收集的总级分(B)和肌氨酰不溶性级分(C)：图表显示通过MSD测量的tau的量；在总级分和不溶性级分两者中，接受用来自KLH-TAUVAC-p7.1免疫的小鼠的IgG预温育的ePHF的小鼠脑，比接受用对照抗体预温育的ePHF的小鼠具有明显更少的聚集tau。(p<0.0001，就多重比较而言使用ANOVA检验然后进行Holm-Bonferroni校正)；和
图16显示本发明实施方案的Tau缀合物(缀合物B)在非人类灵长类动物中诱导高效价的针对磷酸化Tau和ePHF的抗体：恒河猴用alum和CpG佐剂化KLH-TAUVAC-p7.1(n＝6)或用KLH(n＝2)在第1、29、85和169天进行免疫；每14天收集一次血液，具体而言：
图16A：来自用KLH-TAUVAC-p7.1免疫的动物的血清对免疫化肽p7.1的反应性使用ELISA进行测试；
图16B：初次免疫后50天从所有动物收集的血清使用MSD具有可测量的针对人类ePHF的抗体水平，6只动物中有3只显示出对该抗原的高反应性；
图16C：将初次免疫后50天从动物收集的血清施用于来自健康个体或AD患者的人类脑切片，来自KLH-TAUVAC-p7.1组的免疫后血清将病理性tau结构(即AD脑组织中的神经原纤维缠结、神经纤维网线和神经炎性斑)染色，而来自KLH免疫小鼠的血清则未显示任何反应性，并且在对照组织上未观察到染色；
图16D：当以tau免疫耗竭测定进行测试时，接受KLH-TAUVAC-p7.1的动物具有能够结合和消耗tau种子的抗体(在第50天p＝0.03，就多重比较而言使用ANOVA检验然后进行Dunnett校正)，而用KLH免疫未触发这种抗体；
图16E：免疫前后的血清也作为连续稀释的个体样品在中和测定中进行测试，自基线的变化(CFB)作为分别在接种之前第-14天(基线)和接种后第50、106和190天的读出的FRET计数之间的差异计算。然后如下计算特定接种后天数(天i)的反应：反应＝％FRET_天i-％FRET_基线；以动物为随机效应，使用作为类别变量处理的变量疫苗组、天数和血清水平及所有其相互作用应用对上述反应的一般线性混合模型；
图17显示用本发明实施方案的缀合物疫苗(缀合物A)以及氢氧化铝(alum)和寡聚CpG(CpG)佐剂的组合免疫的小鼠导致对疫苗肽的较高效价的抗体反应：将成年雌性C57BL/6小鼠(每组n＝5-6)用2ug或0.2ug的缀合物A疫苗进行肌内免疫，并且缀合物疫苗既可单独，也可与alum、CpG或组合的alum和CpG一起给予；所有小鼠在研究的第0天均接受初次免疫，然后在第28天接受一次加强免疫；alum佐剂的剂量为每只小鼠每次注射500ug，和CpG佐剂的剂量为每次注射20ug/小鼠；该图表显示使用从用疫苗肽T3.5作为包被抗原免疫的小鼠收集的血清的结合ELISA的结果，将免疫之前(第0天)和免疫之后的两个时间点(第28天和42天)的每组T3.5特定平均终点效价绘图，并且误差线代表标准误差；表格显示结果的统计分析，其中使用非参数Kruskal-Wallis检验比较抗体效价，并使用Wilcoxon SignedRank检验作为Kruskal Wallis检验的事后比较评价成对组比较；具体而言：
图17A：小鼠用2ug缀合物A疫苗进行免疫；和
图17B：小鼠用0.2ug缀合物A疫苗进行免疫；和
图18显示具有不同的Tau肽与T细胞表位比率的本发明实施方案的tau疫苗在恒河猴中诱导持续高效价的抗磷酸化tau抗体。
发明详述
背景和整个说明书中引用或描述了各种出版物、文章和专利，这些参考文献中的每一个均通过参考以其全部结合至本文中。本说明书中已包括的对文件、法令、材料、装置、物品等的讨论是为了提供本发明的背景。对于所公开或要求保护的任何发明，这种讨论并非承认任何或所有这些事宜构成现有技术的一部分。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。否则，本文使用的某些术语具有说明书中阐述的含义。
必须注意的是，如本文和所附权利要求中使用的单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指涉，除非上下文另外明确指出。
除非另外说明，否则任何数值，比如本文所述的浓度或浓度范围，在所有情况下应理解为由术语“约”修饰。因此，数值一般地包括所述值的±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL-1.1mg/mL。同样地，1％-10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)-11％(w/v)。本文使用的数字范围的使用明确地包括所有可能的子范围、该范围内的所有单个数值，包括这种范围内的整数和该值的分数，除非上下文另外明确指明。
除非另外指明，否则一系列要素之前的术语“至少”应理解为是指该系列中的每个要素。本领域技术人员将认识到或者能够使用不超过常规实验来确定本文所述的本发明特定实施方案的许多等同物。这种等同物旨在被本发明所涵盖。
本文使用的术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“含有(contains)”或“含有(containing)”或其任何其他变型将理解为意指包括所述整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组，并且旨在为非排他性的或开放式的。例如，包含一系列要素的组合物、混合物、过程、方法、物品或装置不一定仅限于那些要素，而是可包括未明确列出或这种组合物、混合物、过程、方法、物品或装置固有的其他要素。进一步地，除非明确说明相反的意思，否则“或”是指包含性的或而不是排他性的或。例如，条件A或B由以下任何一个满足：A为真(或存在)且B为假(或不存在)、A为假(或不存在)且B为真(或存在)，和A和B两者均为真(或存在)。
还应当理解，当指涉优选发明的组件的尺寸或特征时，本文使用的术语“大约”、“大约”、“通常”、“基本上”以及类似术语表示所描述的尺寸/特征不是严格的界限或参数，并且不排除其在功能上相同或相似的微小变化，如本领域普通技术人员将理解的那样。至少，包括数字参数的这种指涉将包括使用本领域接受的数学和工业原理(例如四舍五入、测量或其他系统误差、制造公差等)不会改变最低有效数字的变化。
本文使用的术语“tau”或“tau蛋白”，也称为微管相关蛋白tau、MAPT、神经原纤维缠结蛋白、成对螺旋丝-tau、PHF-tau、MAPTL、MTBT1，是指具有多种同工型的丰富的中枢和周围神经系统蛋白。在人类中枢神经系统(CNS)中，由于可变剪接，存在6种主要的tau同工型，长度大小在352-441个氨基酸的范围内(Hanger et al.,Trends Mol Med.15:112-9,2009)。tau的实例包括(但不限于)CNS中的tau同工型，比如具有四个重复和两个插入的441个氨基酸的最长tau同工型(4R2N)和具有三个重复且没有插入的352个氨基酸长的最短(胎儿)同工型(3R0N)。tau的实例还包括在周围神经中表达的“大tau”同工型，其含有300个另外的残基(外显子4a)。Friedhoff et al.,Biochimica et Biophysica Acta 1502(2000)122-132。tau的实例包括人类大tau(其为由长为6762个核苷酸的mRNA转录物(NM_016835.4)编码的758个氨基酸长的蛋白)或其同工型。以GenBank登录号NP_058519.3代表举例说明的人类大tau的氨基酸序列。本文使用的术语“tau”包括来自除人类以外的物种比如食蟹猴(Macaca Fascicularis)(猕猴(cynomolgous monkey))或黑猩猩(Pantroglodytes)(黑猩猩(chimpanzee))的tau的同源物。本文使用的术语“tau”包括包含突变(例如全长野生型tau的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体)的蛋白。术语“tau”还涵盖tau氨基酸序列的翻译后修饰。翻译后修饰包括(但不限于)磷酸化。
本文使用的术语“肽”或“多肽”是指由氨基酸残基组成的聚合物、相关的天然存在的结构变体和经肽键连接的其合成的非天然存在的类似物。该术语是指任何大小、结构或功能的肽。一般地，肽长至少3个氨基酸。肽可为天然存在的、重组的或合成的或其任何组合。合成肽可例如使用自动化多肽合成仪合成。tau肽的实例包括长度为约5-约30个氨基酸，优选地长度为约10-约25个氨基酸，更优选地长度为约16-约21个氨基酸的tau蛋白的任何肽。在本公开中，肽使用标准的3个或1个字母的氨基酸缩写从N到C末端列出，其中磷酸化残基用“p”指示。可用于本发明的tau肽的实例包括(但不限于)包含SEQ ID NO:1-12中任何一个的氨基酸序列的tau肽，或与SEQ ID NO:1-12中任何一个的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列的tau肽。
本文使用的术语“磷酸肽”或“磷酸化表位”是指在一个或多个氨基酸残基处被磷酸化的肽。tau磷酸肽的实例包括包含一个或多个磷酸化氨基酸残基的任何tau肽。可用于本发明的tau磷酸肽的实例包括(但不限于)包含SEQ ID NO:1-3或5-12中任何一个的氨基酸序列的tau磷酸肽，或与SEQ ID NO:1-3或5-12中任何一个的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列的tau磷酸肽。
本发明的tau肽可通过固相肽合成或通过重组表达系统来合成。自动肽合成仪可从许多供应商比如Applied Biosystems(Foster City,Calif.)处商购。重组表达系统可包括细菌(比如大肠杆菌(E.coli))、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。用于重组表达的程序由Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(C.S.H.P.Press,NY 2ded.,1989)描述。
Tau为人类的“自身”蛋白。这意味着原则上带有tau特异性受体的所有淋巴细胞在发育期间均应已被删除(中枢耐受性)或由于周围耐受性机制呈现无反应。该问题已经证实为开发针对自身或“改变的自身”蛋白(例如肿瘤抗原)的疫苗的明显障碍。
产生针对抗原(自身或感染性)的高品质抗体，不仅需要产生抗体的B淋巴细胞的作用，而且还需要CD4+ T“辅助性”淋巴细胞的作用。CD4+ T细胞为B淋巴细胞提供关键的存活和成熟信号，而CD4+ T细胞缺陷型动物则受到深刻的免疫抑制。CD4+ T细胞也受到耐受性机制的影响，产生强烈的抗自身(例如抗tau)抗体反应的另一障碍为tau反应性CD4+ T细胞也很可能在人类/动物库中罕见至不存在。
尽管不希望受到理论的束缚，但据信但决不限制本发明的范围，该问题通过本发明的疫苗组合物得以解决。
在一个实施方案中，产生包含tau肽的脂质体(一个实例如图1所示；上图)，该脂质体还包含能够结合大多数或全部HLA DR(人类白细胞抗原-抗原D相关)分子的T细胞表位。然后，T细胞表位能够活化CD4+ T细胞，并向tau特异性B细胞提供必要的成熟和存活信号(图2)。在另一个实施方案中，产生tau肽与载体蛋白的缀合物(一个实例如图1所示；下图)，其产生强烈的辅助性T细胞反应(图3)。在该实施方案中，使用“非连接识别”，其中载体特异性T细胞向自身反应性B细胞提供存活和成熟信号。因此，tau特异性B细胞接收关键信号以触发亲和力成熟、免疫球蛋白类别转换并建立长期记忆池。tau脂质体和tau缀合物可用于在同源或异源免疫方案中产生针对tau抗原的高品质抗体，其中脂质体或缀合物用于引发和/或加强。
脂质体
在一个总体方面，本发明涉及脂质体，其包含：
a.tau肽，优选地tau肽为tau磷酸肽；和
b.辅助性T细胞表位，
其中tau肽存在于脂质体的表面上。
本发明实施方案的脂质体本文也称为“改良的脂质体”，“改良的脂质体疫苗”或“本发明实施方案的脂质体疫苗”或“Tau脂质体”或“第二代脂质体”的“最佳化脂质体疫苗”。
本文使用的术语“脂质体”通常是指由具有高脂质含量的材料例如磷脂、胆固醇制成的脂质囊泡。这些囊泡的脂质通常以脂质双层的形式组织。脂质双层通常包封一定体积，该体积散布在脂质双层的多个洋葱状壳之间，形成多层脂质囊泡(MLV)，或者包含在无定形的中央腔内。具有无定形中央腔的脂质囊泡为单层脂质囊泡，即在腔的周围具有单一周围双层的脂质囊泡。大单层囊泡(LUV)的直径通常为100nm至几微米，比如100-200nm或更大，而小单层脂质囊泡(SUV)的直径通常小于100nm，比如20-100nm，一般地为15-30mm。
根据特定的实施方案，脂质体包含一种或多种tau肽。根据特定的实施方案，脂质体中的tau肽可以相同或不同。
鉴于本公开，本领域技术人员已知的任何合适的tau肽均可用于本发明。根据特定的实施方案，一种或多种tau肽包含SEQ ID NO:1-12之一的氨基酸序列。在其他实施方案中，一种或多种tau肽包含与SEQ ID NO:1-12之一的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列，其中没有一个氨基酸残基被磷酸化，或者一个或多个氨基酸残基被磷酸化。
根据特定的实施方案，一种或多种tau肽为tau磷酸肽。根据特定的实施方案，一种或多种tau磷酸肽包含SEQ ID NO:1-3或5-12之一的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1-3或5-12之一的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列，其中一个或多个所示氨基酸残基被磷酸化。优选地，tau磷酸肽包含SEQ ID NO:1-3之一的氨基酸序列。tau肽可具有酰胺化的C-末端。
根据本申请的实施方案，tau肽存在于脂质体的表面上。鉴于本公开，可使用本领域已知的方法使tau肽、优选tau磷酸肽存在于脂质体的表面上。参见例如美国专利号8647631和9687447中的相关公开，其内容通过参考结合至本文中。根据特定的实施方案，一种或多种tau肽(包括磷酸肽)进一步包含一种或多种修饰，比如棕榈酰化或十二烷基修饰，以允许tau肽存在于脂质体的表面上。可向tau肽添加另外的氨基酸残基，比如Lys、Cys或有时为Ser或Thr，以促进修饰。据报道，脂质锚的位置诱导肽序列的不同构象(Hickman etal.,J.Biol.Chem.vol.286,NO.16,pp.13966-13976,2011年4月22日)。尽管不希望受到理论的束缚，但据信在两个末端均添加疏水部分可增加tau肽的病理性β-折叠构象。因此，一种或多种tau肽在两个末端进一步包含疏水部分。修饰的tau肽可具有酰胺化的C-末端。优选地，存在于脂质体表面上的tau肽由SEQ ID NO:27至SEQ ID NO:38之一的氨基酸序列组成。
本文使用的术语“辅助性T细胞表位”是指包含能够被辅助性T细胞识别的表位的多肽。辅助性T细胞表位的实例包括(但不限于)破伤风类毒素(例如P2和P30表位，也分别称为T2和T30)、乙型肝炎表面抗原、霍乱毒素B、类毒素、白喉类毒素、麻疹病毒F蛋白、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)主要外膜蛋白、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)环子孢子T、恶性疟原虫(P.falciparum)CS抗原、曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)磷酸丙糖异构酶、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、破伤风梭状芽胞杆菌(Clostridiumtetani)、粗体鸡皮衣(Pertusaria trachythallina)、大肠杆菌TraT和流感病毒血凝素(HA)。
鉴于本公开，本领域技术人员已知的任何合适的辅助性T细胞表位均可用于本发明。根据特定的实施方案，辅助性T细胞表位包含选自SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:26的至少一个氨基酸序列。优选地，辅助性T细胞表位包含经接头(比如包含一个或多个氨基酸例如Val(V)、Ala(A)、Arg(R)、Gly(G)、Ser(S)、Lys(K)的肽接头)融合在一起的SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:26的两个或更多个氨基酸序列。接头的长度可以变化，优选地为1-5个氨基酸。优选地，辅助性T细胞表位包含经选自VVR、GS、RR、RK的一个或多个接头融合在一起的SEQID NO:23至SEQ ID NO:26的三个或更多个氨基酸序列。辅助性T细胞表位可具有酰胺化的其C-末端。
根据本申请的实施方案，可将辅助性T细胞表位掺入脂质体表面，例如由共价结合的疏水部分锚定，其中所述疏水部分为烷基、脂肪酸、甘油三酯、甘油二酯、类固醇、鞘脂、糖脂或磷脂，特别是烷基或脂肪酸，特别是具有至少3个碳原子，特别是至少4个碳原子，特别是至少6个碳原子，特别是至少8个碳原子，特别是至少12个碳原子，特别是至少16个碳原子的碳骨架的烷基或脂肪酸。在本发明的一个实施方案中，疏水部分为棕榈酸。或者，可将辅助性T细胞表位包封于脂质体中。根据特定的实施方案，辅助性T细胞表位包封于脂质体中。
鉴于本公开，可使用本领域已知的方法，针对其在脂质体中期望的位置修饰辅助性T细胞表位。根据特定的实施方案，可用于本发明的辅助性T细胞表位包含SEQ ID NO:39至SEQ ID NO:44之一的氨基酸序列。优选地，辅助性T细胞表位由选自SEQ ID NO:13至SEQID NO:17的氨基酸序列组成。
根据特定的实施方案，脂质体包含tau肽和辅助性T细胞表位，其重量比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1或6:1。
在一个实施方案中，脂质体进一步包含含有toll样受体配体的至少一种佐剂。因此，在另一个总体方面，本发明涉及脂质体，其包含：
a.tau肽，优选地为tau磷酸肽；
b.辅助性T细胞表位；和
c.以下的至少一种：
i.Toll样受体9配体，和
ii.Toll样受体4配体。
本文使用的术语“toll样受体”或“TLR”是指在先天性免疫反应中起关键作用的一类模式识别受体(PRR)蛋白。TLR从微生物病原体(比如细菌、真菌、寄生虫和病毒)中识别可区分其与宿主分子的病原体相关分子模式(PAMP)。TLR为跨膜蛋白，一般地作为二聚体起作用，并由参与先天性免疫反应的细胞(包括抗原呈递树突状细胞和吞噬性巨噬细胞)表达。有至少10个人类TLR家族成员TLR1-TLR10以及至少12个鼠类TLR家族成员TLR1-TLR9和TLR11-TLR13，并且它们的区别在于它们识别的抗原类型。例如，TLR4识别脂多糖(LPS)(许多革兰氏阴性细菌中存在的一种成分)以及病毒蛋白、多糖和内源性蛋白(比如低密度脂蛋白、β-防御素和热休克蛋白)；和TLR9为一种核苷酸感知TLR，其被在原核基因组中丰富但在脊椎动物基因组中稀少的未甲基化的胞嘧啶-磷酸酯-鸟嘌呤(CpG)单链或双链二核苷酸活化。TLR的活化导致一系列信号传导事件，导致产生I型干扰素(IFN)、炎性细胞因子和趋化因子以及诱导免疫反应。最终，这种炎症也会激活适应性免疫系统，然后导致清除入侵的病原体和感染的细胞。
本文使用的术语“配体”是指与生物分子(例如受体)形成复合物以用于生物学目的的分子。根据特定的实施方案，toll样受体配体为toll样受体激动剂。
本文使用的术语“激动剂”是指与一种或多种TLR结合并诱导受体介导的反应的分子。例如，激动剂可诱导、刺激、增加、激活、促进、增强或上调受体的活性。这种活性称为“激动活性”。例如，TLR4或TLR9激动剂可激活或增加通过结合受体的细胞信号传导。激动剂包括(但不限于)核酸、小分子、蛋白、碳水化合物、脂质或者与受体结合或相互作用的任何其他分子。激动剂可模拟天然受体配体的活性。激动剂在序列、构象、电荷或其他特征方面可与这些天然受体配体同源，使得它们可被受体识别。这种识别可导致细胞内的生理和/或生化变化，使得细胞以与天然受体配体存在相同的方式对激动剂的存在做出反应。根据特定的实施方案，toll样受体激动剂为toll样受体4激动剂和toll样受体9激动剂中的至少一种。
本文使用的术语“toll样受体4激动剂”是指起TLR4激动剂作用的任何化合物。鉴于本公开，本领域技术人员已知的任何合适的toll样受体4激动剂均可用于本发明。可用于本发明的toll样受体4配体的实例包括TLR4激动剂，包括(但不限于)单磷酰脂质A(MPLA)。本文使用的术语“单磷酰脂质A”或“MPLA”是指脂质A的修饰形式，脂质A为革兰氏阴性细菌脂多糖(LPS)内毒素的生物活性部分。MPLA的毒性低于LPS同时保持免疫刺激活性。作为疫苗佐剂，MPLA刺激对疫苗抗原的细胞和体液反应两者。MPLA的实例包括(但不限于)3-O-脱酰基-4'-单磷酰脂质A、单磷酰基六-酰基脂质A 3-脱酰基、单磷酰基3-脱酰基脂质A及其结构相关的变体。可用于本发明的MPLA可使用本领域已知的方法或从商业来源获得，比如来自Avanti Polar Lipids(Alabaster,Alabama,USA)的3D-(6-酰基)或者来自各种商业来源的MPLTM。根据特定的实施方案，toll样受体4激动剂为MPLA。本文使用的术语“toll样受体9激动剂”是指起TLR9激动剂作用的任何化合物。鉴于本公开，本领域技术人员已知的任何合适的toll样受体9激动剂均可用于本发明。可用于本发明的toll样受体9配体的实例包括TLR9激动剂，包括(但不限于)CpG寡核苷酸。
本文使用的术语“CpG寡核苷酸”、“CpG寡脱氧核苷酸”或“CpG ODN”是指包含至少一个CpG基序的寡核苷酸。本文使用的“寡核苷酸”、“寡脱氧核苷酸”或“ODN”是指由多个连接的核苷酸单元形成的多核苷酸。这种寡核苷酸可从现有的核酸来源获得或者可通过合成方法产生。本文使用的术语“CpG基序”是指核苷酸序列，其含有通过磷酸酯键或磷酸二酯骨架或其他核苷酸间键连接的未甲基化的胞嘧啶-磷酸酯-鸟嘌呤(CpG)二核苷酸(即胞嘧啶(C)然后是鸟嘌呤(G))。
根据特定的实施方案，将CpG寡核苷酸脂质化，即缀合(共价连接)于脂质部分。
本文使用的“脂质部分”是指含有亲脂结构的部分。脂质部分，比如烷基、脂肪酸、甘油三酯、甘油二酯、类固醇、鞘脂、糖脂或磷脂，特别是固醇(比如胆固醇)或脂肪酸，当连接于高度亲水性的分子(比如核酸)时，可显著增强血浆蛋白结合，从而提高亲水分子的循环半衰期。另外，已经显示与某些血浆蛋白(比如脂蛋白)的结合增加表达相应脂蛋白受体(例如LDL受体、HDL受体或清道夫受体SR-B1)的特定组织中的摄取。特别是，缀合于磷酸肽和/或CpG寡核苷酸的脂质部分允许所述肽和/或寡核苷酸能够经疏水部分锚定到脂质体的膜中。
根据特定的实施方案，鉴于本公开，CpG寡核苷酸可包含任何合适的核苷酸间键。
本文使用的术语“核苷酸间键”是指通过其糖连接两个核苷酸的化学键，其由相邻核苷之间的磷原子和荷电或中性基团组成。核苷酸间键的实例包括磷酸二酯(po)、硫代磷酸酯(ps)、二硫代磷酸酯(ps2)、甲基膦酸酯(mp)和甲基硫代磷酸酯(rp)。硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和甲基硫代磷酸酯稳定核苷酸间键，而磷酸二酯为天然存在的核苷酸间键。寡核苷酸硫代磷酸酯一般地合成为Rp和Sp硫代磷酸酯键的无规外消旋混合物。
鉴于本公开，本领域技术人员已知的任何合适的CpG寡核苷酸均可用于本发明。这种CpG寡核苷酸的实例包括(但不限于)CpG2006(也称为CpG 7909)、CpG 1018、CpG2395、CpG2216或CpG2336。
鉴于本公开，可使用本领域已知的方法将CpG寡核苷酸脂质化。在一些实施方案中，CpG寡核苷酸的3’末端通过磷酸酯键(任选地经PEG接头)共价连接于胆固醇分子。其他亲脂部分也可共价连接于CpG寡核苷酸的3’末端。例如，CpG寡核苷酸可共价连接于与脂质体的磷脂长度相同的脂质锚：一个棕榈酸链(使用Pal-OH或类似物，被活化用于偶联)或两个棕榈酸(例如使用1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(琥珀酰基)或类似物，被活化用于偶联)，任选地经PEG接头。参见例如美国专利第7741297号中的相关公开，其内容通过参考结合至本文中。PEG的长度可例如从1-5个PEG单元变化。
其他接头也可用于将使CpG寡核苷酸共价连接于亲脂部分(比如胆固醇分子)，其实例包括(但不限于)具有3-12个碳的烷基间隔基。需要与寡核苷酸化学相容的短接头如氨基二醇。在一些实施方案中，没有接头用于共价键合。参见例如Ries et al.,“Convenientsynthesis and application of versatile nucleic acid lipid membrane anchors inthe assembly and fusion ofliposomes,Org.Biomol.Chem.,2015,13,9673，其相关公开通过参考结合至本文中。
根据特定的实施方案，可用于本发明的脂质化CpG寡核苷酸包含选自SEQ ID NO:18至SEQ ID NO:22的核苷酸序列，其中核苷酸序列包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键，并且核苷酸序列经接头共价连接于至少一个胆固醇。可使用任何合适的接头将CpG寡核苷酸共价连接于胆固醇分子。优选地，连头包含聚乙二醇(PEG)。
根据特定的实施方案，脂质体包含：
a.tau磷酸肽；
b.辅助性T细胞表位；
c.脂质化CpG寡核苷酸；和
d.toll样受体4配体；
其中tau磷酸肽存在于脂质体的表面上，和辅助性T细胞表位包封于脂质体中。
根据特定的实施方案，脂质体包含：
a.tau肽，其具有选自SEQ ID NO:27至SEQ ID NO:38的氨基酸序列；
b.辅助性T细胞表位，其具有选自SEQ ID NO:39至SEQ ID NO:44的氨基酸序列，优选地辅助性T细胞表位由选自SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成；
c.脂质化CpG寡核苷酸，其具有选自SEQ ID NO:18至SEQ ID NO:22的核苷酸序列，其中CpG寡核苷酸包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键，并且CpG寡核苷酸经接头共价连接于至少一个胆固醇；和
d.单磷酰脂质A(MPLA)。
根据特定的实施方案，脂质体进一步包含一种或多种选自以下的脂质：1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰-3’-rac-甘油(DMPG)和胆固醇。
根据特定的实施方案，脂质体进一步包含缓冲剂。鉴于本公开，本领域技术人员已知的任何合适的缓冲剂均可用于本发明。在一实施方案中，脂质体包含磷酸盐缓冲盐水。根据特定的实施方案，缓冲剂包含组氨酸和蔗糖。
根据特定的实施方案，脂质体包含摩尔比为9:1:7:0.07:0.04的DMPC、DMPG、胆固醇、tau磷酸肽和辅助性T细胞表位。
鉴于本公开，本发明的脂质体可使用本领域已知的方法制备。
本申请示例性的脂质体如图1所示。更具体地讲，tau四棕榈酰化磷酸肽(pTau肽T3，SEQ ID NO:28)经tau肽每个末端处的两个棕榈酸存在于脂质体的表面上。包含脂质化CpG(佐剂CpG7909-Chol)的TLR-9配体经共价连接的胆固醇掺入到脂质体膜中。TLR-4配体(佐剂3D-(6-酰基))也掺入到膜中。将辅助性T细胞表位(PAN-DR结合剂T50)包封在内。
缀合物
在一个总体方面，本发明涉及包含tau肽和与之缀合的免疫原性载体的缀合物。
根据特定方面，缀合物具有以下结构：
或式(II)结构：
其中
x为0-10的整数；和
n为2-15的整数，优选地为3-11。
根据特定的实施方案，x为1-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4或2-3的整数。根据特定的实施方案，x为3。
根据特定的实施方案，n为2-15、3-11、3-9、3-8或3-7。
根据特定的实施方案，缀合物包含一种或多种tau肽。根据特定的实施方案，缀合物的tau肽可以相同或不同。
根据特定的实施方案，鉴于本公开，任何合适的tau肽均可用于本发明。根据特定的实施方案，一种或多种tau肽包含SEQ ID NO:1-12之一的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1-12之一的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列，其中没有一个、一个或多个氨基酸残基被磷酸化。
根据特定的实施方案，一种或多种tau肽为tau磷酸肽。根据特定的实施方案，一种或多种tau磷酸肽包含SEQ ID NO:1-3或5-12之一的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1-3或5-12之一的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列，其中一个或多个所示氨基酸残基被磷酸化。
根据特定的实施方案，tau磷酸肽由SEQ ID NO:1-3之一的氨基酸序列组成。
本文使用的术语“免疫原性载体”是指可与tau肽偶联的免疫原性物质。与tau肽偶联的免疫原性部分可诱导免疫反应并引起可特异性结合tau肽的抗体的产生。免疫原性部分为有效部分，其包括被识别为外来物并由此引起宿主免疫反应的蛋白、多肽、糖蛋白、复合多糖、颗粒、核酸、多核苷酸等。鉴于本公开，本领域技术人员已知的任何合适的免疫原性载体可用于本发明。根据特定的实施方案，免疫原性载体为钥孔血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素、CRM197(白喉毒素的非毒性形式)、脑膜炎奈瑟菌的外膜蛋白混合物(OMP)或其衍生物。根据特定的实施方案，免疫原性载体为KLH或CRM197。
根据特定的实施方案，tau肽经接头与载体缀合。本文使用的术语“接头”是指将免疫原性载体连接于tau肽的化学部分。鉴于本公开，本领域技术人员已知的任何合适的接头均可用于本发明。接头可为例如单共价键、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基部分、聚乙二醇(PEG)接头、肽接头、基于糖的接头或可裂解接头比如二硫键或蛋白酶切割位点或氨基酸或其组合。接头的实例可包括聚乙二醇(PEG)、3-(溴乙酰氨基)丙酸琥珀酰亚胺酯(SBAP)、间-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)中的一种或多种，或者一种或多种氨基酸比如Cys、Lys或有时为Ser或Thr，或其组合。
根据特定的实施方案，接头包含(C2H4O)x-半胱氨酸-乙酰氨基丙酰胺或间马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯-半胱氨酸-(C2H4O)x，其中x为0-10的整数，比如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
根据特定的实施方案，载体经接头共价连接于tau肽的N-末端。
根据其他特定的实施方案，载体经接头共价连接于tau肽的C-末端。
根据特定的实施方案，缀合物具有以下结构：
其中n为2-15的整数，优选地为3-11，更优选地为3-7。
鉴于本公开，可通过本领域已知的方法制备本发明的缀合物。例如，以上缀合物可通过使3-(溴乙酰氨基)丙酸琥珀酰亚胺酯(SBAP)
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与CRM197的氨基反应形成酰胺键而形成。该CRM197前体可随后与在其N-末端或在其C-末端与带有游离亲核硫醇基的PEG-半胱氨酸接头缀合的tau肽(例如SEQ ID NO:2的磷酸化tau肽)反应，以形成tau磷酸肽缀合物。
本申请实施方案的示例性缀合物如图1所示。更具体地讲，多个tau磷酸肽(pTau肽T3.76)共价连接于载体蛋白CRM197。
药用组合物
在一个总体方面，本发明涉及药用组合物，其包含治疗有效量的本发明的脂质体或缀合物以及药学上可接受的赋形剂和/或载体。药学上可接受的赋形剂和/或载体为本领域众所周知的(参见Remington’s Pharmaceutical Science(15th ed.),Mack PublishingCompany,Easton,Pa.,1980)。药用组合物的优选制剂取决于打算的给予模式和治疗应用。组合物可包含药学上可接受的非毒性载体或稀释剂，其被定义为通常用于配制用于动物或人类给予的药用物组合物的媒介物。选择稀释剂以不影响组合的生物活性。这种稀释剂的实例为蒸馏水、生理性磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和汉克溶液。另外，药用组合物或制剂还可包含其他载体、佐剂或非毒性、非治疗性、非免疫原性的稳定剂等。应当理解，载体、赋形剂或稀释剂的特性将取决于特定应用的给予途径。
药用组合物可含有相同免疫原性tau肽的混合物。或者，药用组合物可含有本发明的不同免疫原性tau肽的混合物。
与针对神经元疾病的疫苗相关的另一个问题是，可能需要特别高的抗体效价才能确保功效。这是因为疫苗的靶抗原位于脑中。脑通过称为血脑屏障(BBB)的特化细胞结构与循环分开。BBB限制物质从循环进入脑。这防止毒素、微生物等进入中枢神经系统。BBB还具有防止免疫介质(比如抗体)有效进入脑周围的间质和脑脊髓液的潜在较不期望的效果。
体循环中存在的约0.1％抗体穿过BBB并进入脑。这意味着由靶向CNS抗原的疫苗诱导的全身效价必须为脑中有效的最小有效效价的至少1000倍。
因此，根据特定的实施方案，本发明的药用组合物进一步包含一种或多种合适的佐剂。因此，存在于脂质体或缀合物中的本发明的tau肽可与合适的佐剂组合给予以在受试者中获得期望的免疫反应。合适的佐剂可在本发明脂质体或缀合物的给予之前、之后或同时给予。优选的佐剂增强对免疫原的内在反应而不会引起影响反应的定性形式的免疫原的构象变化。佐剂的实例为铝盐(alum)，比如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝。这种佐剂可与或不与其他特异性免疫刺激剂一起使用，比如MPLA类(3去-O-酰化单磷酰脂质A(MPLTM)、单磷酰基六-酰基脂质A 3-脱酰基合成的(3D-(6-酰基))、PHADTM、/>)脂质A)、聚合或单体氨基酸，比如聚谷氨酸或聚赖氨酸。这种佐剂可与或不与其他特异性免疫刺激剂一起使用，比如胞壁酰肽(例如N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)、N-乙酰葡糖胺基-N-乙酰胞壁酰-L-Al-D-isoglu-L-Ala-二棕榈酰氧基丙酰胺(DTP-DPP)TheramideTM)或其他细菌细胞壁成分。水包油乳液包括MF59(参见WO 90/14837)，其含有5％角鲨烯、0.5％Tween 80和0.5％Span 85(任选地含有各种量的MTP-PE)，使用微流化器配制为亚微米颗粒；SAF，其含有10％角鲨烯、0.4％Tween 80、5％普朗尼克嵌段的聚合物L121和thr-MDP，微流化为亚微米乳液或涡旋产生较大粒度的乳液；及RibiTM佐剂系统(RAS)(Ribi ImmunoChem,Hamilton,Mont.)0.2％Tween 80和一种或多种选自以下的细菌细胞壁成分：单磷酰脂质A(MPLTM)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选地为MPLTM+CWS(DetoxTM)。其他佐剂包括完全弗氏佐剂(CFA)和细胞因子，比如白细胞介素(IL-1、IL-2和IL-12)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和肿瘤坏死因子(TNF)。
本文使用的术语“组合”在给予受试者两种或更多种疗法的上下文中是指使用多于一种疗法。术语“组合”的使用不限制其中给予受试者疗法的顺序。例如，第一疗法(例如本文所述的组合物)可在给予受试者第二疗法之前(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同时或之后(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)给予。
本发明的药用组合物可根据本领域众所周知的方法来配制。鉴于本公开，组合物中每种组分的最佳比率可通过本领域技术人员众所周知的技术来确定。
使用方法
本发明的另一个总体方面涉及用于在患有神经变性疾病、障碍或病症的受试者中诱导针对tau蛋白的免疫反应的方法，其包括给予受试者本发明的实施方案的药用组合物。根据特定方面，诱导针对磷酸化tau蛋白、优选ePHF的免疫反应。
本发明的另一个总体方面涉及用于治疗或预防神经变性疾病、障碍或病症的方法，其包括给予受试者本发明的实施方案的药用组合物。
本文使用的术语“诱导”和“刺激”及其变体是指细胞活性的任何可测量的增加。免疫反应的诱导可包括例如免疫细胞群的活化、增殖或成熟，增加细胞因子的产生和/或增加免疫功能的另一指标。在某些实施方案中，免疫反应的诱导可包括增加B细胞的增殖、产生抗原特异性抗体、增加抗原特异性T细胞的增殖、改善树突状细胞的抗原呈递和/或增加某些细胞因子、趋化因子和共刺激标志物的表达。
在动物或人类有机体中给予后诱导或刺激抗tau免疫反应的能力可使用本领域标准的多种测定进行体外或体内评估。对于可用于评估免疫反应的发生和活化的技术的一般描述，参见例如Coligan et al.(1992和1994,Current Protocols in Immunology；ed.JWiley&Sons Inc,National Institute of Health)。细胞免疫的测量可通过本领域易于已知的方法来进行，例如通过测量由激活的效应细胞分泌的细胞因子谱，包括衍生自CD4+和CD8+ T细胞的那些(例如通过ELISPOT量化IL-4或IFNγ产生细胞)，通过确定免疫效应细胞的活化状态(例如通过经典的[3H]胸苷摄取进行T细胞增殖测定)，通过测定敏化受试者中的抗原特异性T淋巴细胞(例如细胞毒性测定中的肽特异性裂解等)。
刺激细胞和/或体液反应的能力可通过测试来自受试者的生物样品(例如血液、血浆、血清、PBMC、尿液、唾液、粪便、CSF或淋巴液)中针对以药用组合物给予的免疫原性tau肽的抗体的存在来确定(参见例如Harlow,1989,Antibodies,Cold Spring Harbor Press)。例如，响应于给予提供免疫原的组合物而产生的抗体的效价可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、斑点印迹、SDS-PAGE凝胶、ELISPOT或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)测定来测量。
本文使用的术语“受试者”是指动物。根据特定的实施方案，受试者为哺乳动物，包括非灵长类动物(例如骆驼、驴、斑马、牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠、兔、豚鼠或小鼠)或灵长类动物(例如猴子、黑猩猩或人类)。根据特定的实施方案，受试者为人类。
本文使用的术语“治疗有效量”是指在受试者中引起期望的生物学或医学反应的活性成分或组分的量。关于所述目的，可凭经验并以常规方式确定治疗有效量。例如，可任选地采用体外测定来帮助确定最佳剂量范围。本领域技术人员可基于若干因素的考虑来确定特定有效剂量的选择(例如经临床试验)，这些因素包括要治疗或预防的疾病、所涉及的症状、患者的体重、患者的免疫状态和技术人员已知的其他因素。制剂中采用的精确剂量还取决于给予途径和疾病的严重程度，并且应根据从业医生的判断和每位患者的状况来决定。可从由体外或动物模型测试系统得出的剂量反应曲线外推有效剂量。
本文使用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”均旨在指与神经变性疾病、障碍或病症相关的至少一种可测量的物理参数的改善或逆转，其在受试者不一定为可识别，但在受试者中可为可识别的。术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”还可指引起疾病、障碍或病症的消退、防止其进展或至少减缓其进展。在一个特定的实施方案中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指减轻与神经变性疾病、障碍或病症相关的一种或多种症状、预防其发展或发作或者减少其持续时间。在一个特定的实施方案中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指预防疾病、障碍或病症的复发。在一个特定的实施方案中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指患有疾病、障碍或病症的受试者的存活增加。在一个特定的实施方案中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指消除受试者的疾病、障碍或病症。
根据特定的实施方案，治疗有效量是指足以实现一种、两种、三种、四种或更多种以下作用的治疗量：(i)降低或改善待治疗的疾病、障碍或病症或者与之相关的症状的严重程度；(ii)减少待治疗的疾病、障碍或病症或者与之相关的症状的持续时间；(iii)预防待治疗的疾病、障碍或病症或者与之相关的症状的进展；(iv)引起待治疗的疾病、障碍或病症或者与之相关的症状的消退；(v)预防待治疗的疾病、障碍或病症或者与之相关的症状的发展或发作；(vi)预防待治疗的疾病、障碍或病症或者与之相关的症状的复发；(vii)减少患有待治疗的疾病、障碍或病症或者与之相关的症状的受试者的住院治疗；(viii)减少患有待治疗的疾病、障碍或病症或者与之相关的症状的受试者的住院治疗时间；(ix)增加患有待治疗的疾病、障碍或病症或者与之相关的症状的受试者的存活；(x)在受试者中抑制或减少待治疗的疾病、障碍或病症或者与之相关的症状；和/或(xi)增强或改善另一种疗法的预防或治疗效果。
鉴于本公开，本文使用的“神经变性疾病、障碍或病症”包括本领域技术人员已知的任何神经变性疾病、障碍或病症。神经变性疾病、障碍或病症的实例包括由神经原纤维损伤形成引起或与之相关的神经变性疾病或障碍，比如tau相关的疾病、障碍或病症，称为tau病。根据特定的实施方案，神经变性疾病、障碍或病症包括显示tau和淀粉样蛋白病理学共同存在的任何疾病或障碍，包括(但不限于)阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease)、帕金森病(Parkinson’s Disease)、克-雅氏病(Creutzfeldt-Jacob disease)、拳击手痴呆症、唐氏综合征(Down’s Syndrome)、Gerstmann--Scheinker病、包涵体肌炎、朊病毒蛋白大脑淀粉样血管病、创伤性脑损伤、肌萎缩侧索硬化症、关岛帕金森-痴呆综合征(parkinsonism-dementia complex of Guam)、伴发神经原纤维缠结的非关岛型运动神经元病(Non-Guamanian motor neuron disease with neurofibrillary tangles)、嗜银颗粒性痴呆、皮质基底节变性、路易体痴呆肌萎缩侧索硬化症(Dementia Lewy AmyotrophicLateral sclerosis)、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化症；额颞叶痴呆(frontotemporaldementia)，优选地为与17号染色体相关的额颞叶痴呆合并帕金森综合征(frontotemporaldementia with parkinsonism linked to chromosome 17)(FTDP-17)、额颞叶痴呆(frontotemporal lobar dementia)；Hallevorden-Spatz病、多系统萎缩、C型Niemann-Pick病(iemann-Pick disease type C)、皮克氏病(Pick’s disease)、进行性皮质下胶质增生、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、仅缠结性痴呆(Tangle only dementia)、脑炎后帕金森综合征(Postencephalitic Parkinsonism)、强直性肌营养不良、慢性创伤性脑病(CTE)、原发性年龄相关性tau病(PART)或路易体痴呆(Lewy body dementia)(LBD)。根据特定的实施方案，神经变性疾病、障碍或病症为阿尔茨海默病或另一种tau病。
本发明还提供一种用于促进tau聚集体从受试者的脑中清除的方法，所述方法包括在有效促进tau聚集体从受试者的脑中清除的条件下给予受试者本发明实施方案的药用组合物。根据特定的实施方案，tau聚集体为神经原纤维缠结或其病理性tau前体。
本发明还提供一种用于减缓受试者中tau-病理学相关行为表型的进展的方法，所述方法包括在有效减缓受试者中tau-病理学相关行为表型的进展的条件下给予受试者本发明实施方案的药用组合物。
在本发明的一个优选实施方案中，经给予本发明实施方案的药用组合物给予tau肽，在受试者中诱导针对tau肽和针对tau的病理形式的活性免疫反应，从而促进相关tau聚集体的清除，减缓tau-病理学相关行为的进展和/或治疗潜在的tau病。根据本发明的这个方面，免疫反应涉及针对tau肽的有益体液(抗体介导的)反应和针对T细胞表位或免疫原性载体的细胞(由抗原特异性T细胞或其分泌产物介导的)反应的发展。
本文使用的tau-病理学相关行为表型非限制性地包括认知缺损、早期人格改变和抑制解除、冷漠、意志缺乏、缄默、失用症、持续动作、刻板性运动/行为、口部过度活动(hyperorality)、混乱、无法计划或组织依序的任务、自私/无情、反社会特质、缺乏同理心、蹒跚的(halting)、伴随经常性错语但相对保留理解力的语法失能、理解功能受损和词汇搜索困难、缓慢进行性步态不稳、后退步态、僵硬、频繁跌倒、非左旋多巴反应性轴向刚度、核上性凝视麻痹、方波急跳、垂直扫视运动缓慢、假性延髓麻痹、肢体失用、肌张力障碍、皮质感觉丧失和震颤。
在实施本发明的方法时，优选的是在给予本发明的免疫原性肽或抗体之前选择患有患有患阿尔茨海默病或其他tau病或处于其风险下的受试者、脑具有tau聚集体的受试者或表现出缠结相关行为表型的受试者。适合于治疗的受试者包括处于疾病风险下但未表现出症状的个体，以及目前表现出症状的患者。就阿尔茨海默病而言，几乎任何人均处于患有阿尔茨海默病的风险下。因此，本方法可预防性地给予普通人群而无需对受试患者的风险进行任何评估。本方法对具有已知的阿尔茨海默病遗传风险的个体尤其有用。这种个体包括有亲戚经历过该疾病的那些个体，以及通过分析遗传或生化标志物而确定其风险的那些个体。
在无症状患者中，治疗可在任何年龄(例如10、20、30岁)开始。然而，通常直到患者达到40、50、60或70岁时才需要开始治疗。治疗一般地需要在一段时间内多个剂量。治疗可通过测定抗体或活化的T细胞或B细胞对治疗剂随着时间推移的反应进行监测。如果反应降低，则表明加强剂量。
在预防性应用中，将含有tau肽的药用组合物以足以消除或降低疾病的风险、减轻其严重程度或延迟其发作的量给予易患阿尔茨海默病或其他tau病或者以其他方式处于其风险下的患者，所述疾病包括疾病的生化、组织学和/或行为症状、其并发症以及在疾病发展期间出现的中间病理表型。在治疗应用中，将含有tau肽的药用组合物以足以治愈或至少部分地抑制疾病症状(生化、组织学和/或行为，包括其并发症和在疾病发展中的中间病理表型)的量给予怀疑患有或已经患有这种疾病的患者。
用于预防和/或治疗神经变性疾病、障碍或病症的本发明药用组合物的有效剂量取决于许多不同因素而变化，这些因素包括给予模式、靶位点、患者的生理状态、所给予的其他药物以及治疗是预防性还是治疗性。肽的量取决于是否还给予佐剂，在没有佐剂的情况下需要更高的剂量。注射时机可从每天一次到每年一次到十年一次明显变化。典型的方案由免疫然后以时间间隔(比如6周间隔)进行加强注射组成。另一种方案由免疫然后在1、2、6、9和12个月后进行加强注射组成。另一种方案需要每两个月注射一次持续终生。或者，如通过监测免疫反应所示，可不定期进行加强注射。
本领域的技术人员易于意识到，可基于给予之后测得的免疫反应来调整引发和加强给予的方案。例如，加强组合物通常在给予引发组合物之后数周或数月给予，例如给予引发组合物之后约2-3周或4周、或8周、或16周、或20周、或24周、或26周、或28周、或30周、或32周、或36周或1-2年。
肽可通过胃肠外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、皮内、鼻内或肌内方式给予，以进行预防性和/或治疗性治疗。免疫原性剂的最典型给予途径为皮下或肌内注射。该后一种类型的注射最一般地在手臂或腿部肌肉中进行。
根据特定方面，可给予一种或多种加强免疫。然而，在各自的引发和加强组合物中的抗原(尽管采用了许多加强组合物)不必相同，但应共具抗原决定簇或彼此基本相似。
如果需要，组合物可存在于试剂盒、包装或分配器中，其可含有一种或多种含有活性成分的单位剂型。试剂盒例如可包括金属或塑料箔，比如泡罩包装。试剂盒、包装或分配器可随附给予说明。
根据特定的实施方案，试剂盒包含以下至少一种：包含本发明实施方案的脂质体的药用组合物和包含本发明实施方案的缀合物的药用组合物。
实施方案
本发明还提供以下非限制性实施方案。
实施方案1为脂质体，其包含：
a.tau肽；和
b.辅助性T细胞表位；
其中tau肽存在于脂质体的表面上。
实施方案2为实施方案1的脂质体，其中tau肽为tau磷酸肽。
实施方案3为实施方案1或2的脂质体，其进一步包含toll样受体配体。
实施方案4为实施方案3的脂质体，其中toll样受体配体包括toll样受体4配体和toll样受体9配体中的至少一种。
实施方案5为实施方案3或4的脂质体，其中toll样受体配体为toll样受体4配体。
实施方案6为实施方案5的脂质体，其中toll样受体4配体包括单磷酰脂质A(MPLA)。
实施方案7为实施方案3或4的脂质体，其中toll样受体配体为toll样受体9配体。
实施方案8为实施方案7的脂质体，其中toll样受体9配体包括脂质化CpG寡核苷酸。
实施方案9为实施方案1的脂质体，其包含：
a.tau肽；
b.辅助性T细胞表位；和
c.以下的至少一种：
i.toll样受体9配体，和
ii.toll样受体4配体。
实施方案10为实施方案9的脂质体，其中tau肽为tau磷酸肽。
实施方案11为实施方案9或10的脂质体，其中toll样受体9配体为脂质化CpG寡核苷酸。
实施方案12为实施方案9-11中任何一项的脂质体，其中脂质体包含toll样受体4配体和toll样受体9配体。
实施方案13为实施方案12的脂质体，其中toll样受体4配体包括单磷酰脂质)A(MPLA)。
实施方案14为脂质体，其包含：
a.tau磷酸肽；
b.辅助性T细胞表位；
c.脂质化CpG寡核苷酸；和
d.含有toll样受体4配体的佐剂；
其中tau磷酸肽存在于脂质体的表面上。
实施方案15为实施方案14的脂质体，其中toll样受体4配体包含单磷酰脂质A(MPLA)。
实施方案16为实施方案1-15中任何一项的脂质体，其中辅助性T细胞表位包封于脂质体中。
实施方案16a为实施方案1-15中任何一项的脂质体，其中辅助性T细胞表位掺入脂质体的膜中。
实施方案16b为实施方案1-15中任何一项的脂质体，其中辅助性T细胞表位存在于脂质体的表面上。
实施方案17为脂质体组合物，其包含：
a.tau磷酸肽；
b.辅助性T细胞表位；
c.脂质化CpG寡核苷酸；和
d.单磷酰脂质A(MPLA)；
其中tau磷酸肽存在于脂质体的表面上，和
T细胞表位包封于脂质体中。
实施方案17a为实施方案17的脂质体，其中MPLA为3-O-脱酰基-4'-单磷酰脂质A，优选地为MPLTM。
实施方案17b为实施方案17的脂质体，其中MPLA为单磷酰基六-酰基脂质A 3-脱酰基，优选地为3D-(6-酰基)
实施方案17c为实施方案17的脂质体，其中MPLA为单磷酰基3-脱酰基脂质A，优选地为
实施方案18为实施方案1-17c中任何一项的脂质体，其进一步包含一种或多种选自以下的脂质：1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰-3’-rac-甘油(DMPG)和胆固醇。
实施方案19为实施方案1-18中任何一项的脂质体，其中tau肽具有选自SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:12或与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。
实施方案19-1为实施方案19的脂质体，其中tau肽为磷酸肽，其包含选自SEQ IDNO:1-3和5-12的氨基酸序列。
实施方案19-2为实施方案19-1的脂质体，其中tau磷酸肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
实施方案19-3为实施方案19-1的脂质体，其中tau磷酸肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
实施方案19-4为实施方案19-1的脂质体，其中tau磷酸肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
实施方案19a为实施方案19、19-1、19-2、19-3和19-4中任何一项的脂质体，其中氨基酸序列进一步包含一种或多种修饰以允许tau肽存在于脂质体的表面上。
实施方案19b为实施方案19a的脂质体，其中所述一种或多种修饰包括棕榈酰化和十二烷基修饰中的至少一种。
实施方案19c为实施方案19a或19b的脂质体，其中tau肽在其N-末端被所述一种或多种修饰进行修饰。
实施方案19d为实施方案19a-19c中任何一项的脂质体，其中tau肽在其C-末端被所述一种或多种修饰进行修饰。
实施方案19e为实施方案19d的脂质体，其中tau肽在其N-末端和C-末端两者均被棕榈酰化。
实施方案19f为实施方案19a-19e中任何一项的脂质体，其中tau肽进一步包含一个或多个另外的氨基酸以促进所述一种或多种修饰。
实施方案19g为实施方案19f的脂质体，其中所述一个或多个另外的氨基酸选自Lys、Cys、Ser和Thr。
实施方案19h为实施方案19-19g中任何一项的脂质体，其中tau肽在其C-末端被酰胺化。
实施方案19i为实施方案19-19h中任何一项的脂质体，其中tau肽由选自SEQ IDNO:27至SEQ ID NO:38的氨基酸序列组成。
实施方案19j为实施方案19-19i中任何一项的脂质体，其中tau肽由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成。
实施方案19k为实施方案19-19i中任何一项的脂质体，其中tau肽由SEQ ID NO:28的氨基酸序列组成。
实施方案19l为实施方案19-19i中任何一项的脂质体，其中tau肽由SEQ ID NO:29的氨基酸序列组成。
实施方案20为实施方案1-19l中任何一项的脂质体，其中辅助性T细胞表位包含至少一个选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:26。
实施方案20a为实施方案20的脂质体，其中辅助性T细胞表位包含至少两个选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:26。
实施方案20b为实施方案20的脂质体，其中辅助性T细胞表位包含至少三个选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:26。
实施方案20c为实施方案20的脂质体，其中辅助性T细胞表位包含四个以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:26。
实施方案20d为实施方案20a-20c中任何一项的脂质体，其中选自SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:26的两个或更多个氨基酸序列通过接头共价连接。
实施方案20e为实施方案20d的脂质体，其中接头包含一个或多个选自Val(V)、Ala(A)、Arg(R)、Gly(G)、Ser(S)、Lys(K)的氨基酸。
实施方案20f为实施方案20e的脂质体，其中接头包含选自VVR、GS、RR和RK的氨基酸序列。
实施方案20g为实施方案20-20f中任何一项的脂质体，其中辅助性T细胞表位在其C-末端被酰胺化。
实施方案20h为实施方案20-20g中任何一项的脂质体，其中辅助性T细胞表位被修饰以插入到脂质体的膜中，存在于脂质体的表面上或包封于脂质体中，这取决于辅助性T细胞表位的预期位置。
实施方案20i为实施方案20-20h中任何一项的脂质体，其中辅助性T细胞表位由选自SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成。
实施方案20j为实施方案1-20i中任何一项的脂质体，其中脂质体以重量比为6:1包含tau肽和辅助性T细胞表位。
实施方案20k为实施方案1-20i中任何一项的脂质体，其中脂质体以重量比为5:1包含tau肽和辅助性T细胞表位。
实施方案20l为实施方案1-20i中任何一项的脂质体，其中脂质体以重量比为4:1包含tau肽和辅助性T细胞表位。
实施方案20m为实施方案1-20i中任何一项的脂质体，其中脂质体以重量比为3:1包含tau肽和辅助性T细胞表位。
实施方案20n为实施方案1-20i中任何一项的脂质体，其中脂质体以重量比为2:1包含tau肽和辅助性T细胞表位。
实施方案20o为实施方案1-20i中任何一项的脂质体，其中脂质体以重量比为1:1包含tau肽和辅助性T细胞表位。
实施方案21为实施方案1-20o中任何一项的脂质体，其中脂质化CpG寡核苷酸包含选自SEQ ID NO:18至SEQ ID NO:22的核苷酸序列。
实施方案21a为实施方案21的脂质体，其中CpG寡核苷酸具有一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。
实施方案21b为实施方案21a的脂质体，其中CpG寡核苷酸具有全部均为硫代磷酸酯的核苷酸间键。
实施方案21c为实施方案21-21b中任何一项的脂质体，其中脂质化CpG寡核苷酸包含经接头共价连接于至少一个亲脂基团的CpG寡核苷酸。
实施方案21d为实施方案21c的脂质体，其中接头包含(C2H4O)n，其中n为0-10的整数。
实施方案21e为实施方案21c的脂质体，其中接头包含具有3-12个碳的烷基间隔基。
实施方案21f为实施方案21-21e中任何一项的脂质体，其中至少一个亲脂基团为胆固醇。
实施方案21g为实施方案21-21f中任何一项的脂质体，其中脂质化CpG寡核苷酸包含经包含(C2H4O)n的接头共价连接于胆固醇分子的SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的核苷酸序列，其中n为3-5的整数。
实施方案22为脂质体，其包含：
a.tau肽，其具有选自SEQ ID NO:27至SEQ ID NO:38的氨基酸序列；
b.辅助性T细胞表位，其具有选自SEQ ID NO:39至SEQ ID NO:44的氨基酸序列，优选地，辅助性T细胞表位由选自SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成；
c.脂质化CpG寡核苷酸，其具有选自SEQ ID NO:18至SEQ ID NO:22的核苷酸序列，其中CpG寡核苷酸包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键，并且CpG寡核苷酸经接头共价连接于至少一个胆固醇；和
d.单磷酰脂质A(MPLA)。
实施方案22a为实施方案22的脂质体，其包含：
a.tau磷酸肽，其由SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的氨基酸序列组成；
b.辅助性T细胞表位，其由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成；
c.脂质化CpG寡核苷酸，其由经包含(C2H4O)n的接头共价连接于胆固醇的SEQ IDNO:18或SEQ ID NO:19的核苷酸序列组成，其中n为3-7的整数；和
d.单磷酰脂质A(MPLA)。
实施方案22b为实施方案22或22a的脂质体，其中MPLA为3-O-脱酰基-4'-单磷酰脂质A，优选地为MPLTM。
实施方案22c为实施方案22或22a的脂质体，其中MPLA优选地为3D-(6-酰基)
实施方案22d为实施方案22或22a的脂质体，其中MPLA优选地为
实施方案23为实施方案22-22d中任何一项的脂质体，其中辅助性T细胞表位包封于脂质体中。
实施方案24为药用组合物，其包含实施方案1-23中任何一项的脂质体和药学上可接受的载体。
实施方案25为包含tau磷酸肽和经接头与之缀合的免疫原性载体的缀合物，其具有以下结构：
其中x为0-10的整数；和
n为2-15的整数。
实施方案25a为包含tau磷酸肽和经接头与之缀合的免疫原性载体的缀合物，其具有以下式(II)的结构：
其中
x为0-10的整数；和
n为2-15的整数。
实施方案26为实施方案25或25a的缀合物，其中x为2-6的整数。
实施方案27为实施方案25或25a的缀合物，其中x为3。
实施方案28为实施方案25-25a中任何一项的缀合物，其中n为3-7。
实施方案29为实施方案25-28中任何一项的缀合物，其中载体为选自以下的免疫原性载体：钥孔血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素、CRM197和来自脑膜炎奈瑟菌的外膜蛋白混合物(OMP)或其衍生物。
实施方案30为实施方案25-29中任何一项的缀合物，其中tau磷酸肽由选自SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成。
实施方案30a为实施方案30的缀合物，其中tau磷酸肽由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。
实施方案31为实施方案25-30中任何一项的缀合物，其中载体为CRM197。
实施方案32为实施方案25的缀合物，其具有以下结构：
其中n为3-7。
实施方案32a为实施方案25的缀合物，其中
KLH-[间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯-半胱氨酸-(C2H4O)x-Tau肽]n
其中
Tau肽由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3组成；
x为0-10的整数；和
n为2-15的整数。
实施方案33为药用组合物，其包含实施方案25-32a中任何一项的缀合物和药学上可接受的载体。
实施方案33a为权利要求33的药用组合物，其进一步包含佐剂。
实施方案33b为权利要求33a的药用组合物，其中佐剂包括TLR-4配体和TLR-9配体中的至少一种。
实施方案34为用于在患有神经变性障碍的受试者中诱导免疫反应的方法，其包括给予受试者实施方案24和33-33b的药用组合物中的至少一种。
实施方案35为实施方案34的方法，其包括给予受试者实施方案24和33-33b的药用组合物中的至少一种用于引发免疫，以及给予受试者实施方案24和33-33b的药用组合物中的至少一种用于加强免疫。
实施方案36为用于在需要它的受试者中治疗或预防神经变性神疾病或障碍的方法，其包括给予受试者实施方案24或33的药用组合物中的至少一种。
实施方案37为实施方案36的方法，其包括给予受试者实施方案24和33-33b的药用组合物中的至少一种用于引发免疫，以及给予受试者实施方案24和33-33b的药用组合物中的至少一种用于加强免疫。
实施方案38为实施方案34-37中任何一项的方法，其中神经变性疾病或障碍由神经原纤维损伤的形成引起或与之相关。
实施方案39为实施方案34-38中任何一项的方法，其中神经变性疾病或障碍为阿尔茨海默病、帕金森病、克-雅氏病、拳击手痴呆症、唐氏综合征、Gerstmann--Scheinker病、包涵体肌炎、朊病毒蛋白大脑淀粉样血管病、创伤性脑损伤、肌萎缩侧索硬化症、关岛帕金森-痴呆综合征、伴发神经原纤维缠结的非关岛型运动神经元病、嗜银颗粒性痴呆、皮质基底节变性、路易体痴呆肌萎缩侧索硬化症、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化症；额颞叶痴呆(frontotemporal dementia)，优选地为与17号染色体相关的额颞叶痴呆合并帕金森综合征(FTDP-17)、额颞叶痴呆(frontotemporal lobar dementia)；Hallevorden-Spatz病、多系统萎缩、C型Niemann-Pick病、皮克氏病、进行性皮质下胶质增生、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、仅缠结性痴呆、脑炎后帕金森综合征、强直性肌营养不良、慢性创伤性脑病(CTE)、原发性年龄相关性tau病(PART)或路易体痴呆(LBD)。
实施方案40为实施方案34-39中任何一项的方法，其中神经变性疾病或障碍为阿尔茨海默病、帕金森病、唐氏综合征、进行性核上性麻痹(PSP)、与17号染色体相关的额颞叶痴呆合并帕金森综合征(FTDP-17)、皮克氏病、皮质基底节变性、路易体痴呆肌萎缩侧索硬化症、强直性肌营养不良、慢性创伤性脑病(CTE)、大脑血管病、原发性年龄相关性tau病(PART)或路易体痴呆(LBD)。
实施方案40b为实施方案34-39中任何一项的方法，其中神经变性疾病或障碍为阿尔茨海默病、进行性核上性麻痹(PSP)、与17号染色体相关的额颞叶痴呆合并帕金森综合征(FTDP-17)或皮克氏病和PART(原发性年龄相关性tau病)。
实施方案40c为实施方案34-39中任何一项的方法，其中神经变性疾病或障碍为阿尔茨海默病、帕金森病、唐氏综合征、与17号染色体相关的额颞叶痴呆合并帕金森综合征(FTDP-17)、皮质基底节变性、路易体痴呆肌萎缩侧索硬化症、强直性肌营养不良、慢性创伤性脑病(CTE)、大脑血管病、原发性年龄相关性tau病(PART)或路易体痴呆(LBD)。
实施方案41为一种试剂盒，其包含实施方案24的药用组合物和实施方案33、33a或33b的药用组合物中的至少一种。
实施方案42为由选自SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成的辅助性T细胞表位。
实施方案43为包含实施方案42的辅助性T细胞表位的药用组合物。
实施方案44为在需要它的受试者中增强针对抗原的免疫反应的方法，其包括给予受试者抗原以及实施方案43的药用组合物。
实施例
本发明的以下实施例将进一步说明本发明的性质。应当理解，以下实施例不限制本发明，并且本发明的范围由所附权利要求确定。
除非另外指明，否则以下实施例中使用的实验方法均为普通方法。除非另外指明，否则以下实施方案中使用的试剂均购自普通试剂供应商。
实施例1：脂质体疫苗的制备
对照脂质体疫苗的制备(乙醇注射技术)
对照脂质体疫苗通过乙醇(EtOH)注射技术然后挤出来产生。首先，将DMPC(LipoidGmbH,Ludwigshafen,Germany)、DMPG(Lipoid GmbH,Ludwigshafen,Germany)、胆固醇(Dishman,Netherlands)和MPLA(Avanti Polar Lipids,AL,USA)以摩尔比为9:1:7:0.05，在60℃下溶解于EtOH和叔丁醇(t-BuOH)的20:1(V/V)混合物中。将脂质/乙醇溶液在60℃下以磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4稀释，以保持10％EtOH浓度并导致形成多层脂质体囊泡(MLV)。然后，使MLV进行使用Emulsiflex-C5(Avestin,Canada)，通过连续3个孔径为0.08um的聚碳酸酯过滤器(Whatman)进行的5次依序挤出通过。在添加tau肽之前，将所得脂质体以PBS pH 7.4稀释并加热至60℃以获得脂质体溶液。
将乙酸四棕榈酰化的SEQ ID NO:2的磷酸化tau肽(Bachem AG,Switzerland)(本文称为活性药用成分(API))以1mg/mL的浓度溶于含有2.0％辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma-Aldrich,USA)的PBS pH 11.4中，并将肽溶液在60℃下注入到脂质体溶液中，然后在60℃下搅拌30分钟。通过超滤浓缩至目标最终体积，并在渗滤期间用PBS pH 7.4进行10次缓冲液交换。然后，使具有存在于脂质体表面上的API的所得脂质体经由通过连续两个0.2um聚碳酸酯注射器式过滤器进行无菌过滤，并将最终产物储存于5℃下。
脂质体X、Y、Z和Z+疫苗的制备
脂质体X和Y疫苗通过薄脂质膜技术然后均质化和挤出来产生。
具有最终API浓度为1200ug/ml和最终T50浓度为1200ug/ml的脂质体Z+疫苗通过乙醇注射技术然后挤出来产生，和具有最终API浓度为400ug/ml和最终T50浓度为100ug/ml的脂质体Z疫苗通过薄脂质膜技术然后均质化和挤出来产生。
具有最终API浓度为400ug/ml和最终T50浓度为400ug/ml的脂质体Z++疫苗通过薄脂质膜技术然后均质化和挤出来产生。
具有最终API浓度为1200ug/ml和最终T50浓度为300ug/ml的脂质体Z+++疫苗通过乙醇注射技术然后挤出来产生。
脂质体X、Y、Z和Z++疫苗通过薄脂质膜技术的制备
脂质体X、Y、Z和Z++疫苗通过薄脂质膜技术然后均质化和挤出来产生。首先，将DMPC(Lipoid GmbH,Ludwigshafen,Germany)、DMPG(Lipoid GmbH,Ludwigshafen,Germany)、胆固醇(Dishman,Netherlands)和单磷酰基六-酰基脂质A 3-脱酰基合成的(3D-(6-酰基))(Avanti Polar Lipids,AL,USA)以摩尔比为9:1:7:0.05，在60℃下溶解于EtOH中，但脂质体Y除外，其不含3D-(6-酰基)/>在真空旋转蒸发仪上蒸发乙醇以获得薄脂质膜。
将脂质膜用含有0.15mg/mL T50肽(Peptides&Elephants,Germany)的PBS pH7.4、5％DMSO(均来自Sigma-Aldrich)再水合。将样品轻轻搅拌15分钟，并进一步剧烈涡旋以溶解薄脂质膜。将所得多层囊泡进行10次冻融循环(液体N2和37℃的水浴)和进行均质化然后通过孔径为0.08um的聚碳酸酯膜(Whatman,UK)依序挤出。均质化和挤出两个步骤均在EmulsiFlex-C5(Avestin,Canada)中进行。将含有包封的T50肽的挤出脂质体通过超滤进行浓缩，并通过渗滤将缓冲液与PBS pH 7.4进行交换。在添加tau肽和佐剂之前，将所得脂质体以PBS pH 7.4稀释并加热至60℃以获得脂质体溶液。
CpG2006-胆固醇(CpG2006-Chol)(Microsynth,Switzerland)为一种DNA寡核苷酸，具有的所有核苷酸间键均为硫代磷酸酯，在5’末端用胆固醇分子经PEG间隔基通过磷酸酯键进行修饰。将CpG2006-胆固醇(CpG2006-Chol)(Microsynth,Switzerland)以1mg/mL溶于PBS pH 7.4中，并注入到脂质体溶液中(除了脂质体X以外，其不含CpG2006-Chol)，然后温育15分钟，之后插入API。
将API(Bachem AG,Switzerland)以1mg/mL的浓度溶于含有2.0％辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma-Aldrich,USA)的PBS pH 11.4中，并将肽溶液在60℃下注入到脂质体溶液中，然后在60℃下搅拌30分钟。通过超滤进行浓缩以获得目标值(对于脂质体X、Y、Z为400ug/ml API和100ug/ml T50；和对于脂质体Z++为400ug/ml API和400ug/ml的T50)，并在渗滤期间用PBS pH 7.4进行10次缓冲液交换。然后，使具有存在于脂质体表面上的API的所得脂质体经由通过0.2um聚碳酸酯注射器式过滤器进行无菌过滤，并将最终产物储存于5℃下。
脂质体O通过乙醇注射技术的制备
脂质体O疫苗通过乙醇(EtOH)注射技术然后挤出来产生。首先，将DMPC(LipoidGmbH,Ludwigshafen,Germany)、DMPG(Lipoid GmbH,Ludwigshafen,Germany)、胆固醇(Dishman,Netherlands)和MPLA(Avanti Polar Lipids,AL,USA)以摩尔比为9:1:7:0.05，在60℃下溶解于EtOH和叔丁醇(t-BuOH)的20:1(V/V)混合物中。将脂质/乙醇溶液在60℃下以磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4稀释，以保持10％EtOH浓度并导致形成多层脂质体囊泡(MLV)。然后，使MLV进行使用Emulsiflex-C5(Avestin,Canada)，通过连续3个孔径为0.08um的聚碳酸酯过滤器(Whatman)进行的5次依序挤出通过。在添加tau肽之前，将所得脂质体以PBS pH 7.4稀释并加热至60℃以获得脂质体溶液。
将T46肽(Pepscan,the Netherlands)以1mg/mL溶于PBS pH 7.4中，并注入到脂质体溶液中，然后温育15分钟，之后插入API。
将API(Bachem,Switzerland)以1mg/mL的浓度溶于含有2％辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma-Aldrich,USA)的PBS pH 11.4中，并将肽溶液在60℃下注入到脂质体溶液中，然后在60℃下搅拌30分钟。通过超滤进行浓缩以获得目标值(400ug/ml API和100ug/mlT46)，并在渗滤期间用PBS pH 7.4进行10次缓冲液交换。然后，使具有存在于脂质体表面上的API的所得脂质体经由通过0.2um聚碳酸酯注射器式过滤器进行无菌过滤，并将最终产物储存于5℃下。
脂质体Z+和脂质体Z+++疫苗通过乙醇注射的制备
脂质体Z+和脂质体Z+++疫苗使用基于乙醇注射的方法来产生。首先，将DMPC(Lipoid GmbH,Ludwigshafen,Germany)、DMPG(Lipoid GmbH,Ludwigshafen,Germany)、胆固醇(Dishman,Netherlands)和3D-(6-酰基)(Avanti Polar Lipids,AL,USA)以摩尔比为约9:1:7:0.04，在60℃下溶解于EtOH中。将T50肽(Bachem AG,Switzerland)溶于10mM His/270mM蔗糖(pH 5.8-6.0)中。然后，将脂质乙醇溶液注入到含有T50肽的溶液中，并轻轻搅拌15分钟，导致形成多层囊泡(MLV)。使MLV进行均质化(对于脂质体Z+为6次，和对于脂质体Z+++没有均质化)，然后通过孔径为0.08um的聚碳酸酯膜(Whatman,UK)依序挤出(对于脂质体Z+为通过5次，对于脂质体Z+++为3-5次)。对于脂质体Z+均质化和挤出两个步骤均在EmulsiFlex-C5(Avestin,Canada)中进行。脂质体Z+++的挤出使用LIPEX过滤挤出机进行。挤出脂质体通过超滤进行浓缩，并通过渗滤将缓冲液与20mM His/145mM NaCL pH 7.4进行交换。在添加API和佐剂之前，将含有包封的T50肽的所得脂质体以20mM His/145mMNaCLpH 7.4稀释并加热至60℃以获得脂质体溶液。
将CpG2006-Chol(对于脂质体Z+为Microsynth,Switzerland；对于脂质体Z+++为Avecia,USA)以1mg/mL溶于20mM His/145mM NaCL pH 7.4中，并注入到脂质体溶液中，然后温育15分钟，之后插入API。
将API(Bachem AG,Switzerland)以1mg/mL的浓度溶于含有1％辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma-Aldrich,USA)的碳酸盐缓冲液(pH 10.2)中，并将肽溶液在60℃下注入到脂质体Z+溶液中，然后在60℃下搅拌30分钟。将肽溶液使用T-Line Mixing在60℃下混合到脂质体Z+溶液中，然后在60℃下搅拌30分钟。通过超滤进行浓缩以获得目标值(对于脂质体Z+为1200ug/ml API和1200ug/ml T50；和对于脂质体Z+++为1200ug/ml API和300ug/ml T50)，并在渗滤期间用10mM His/270mM蔗糖pH 6.5进行10次缓冲液交换。然后，使具有存在于脂质体表面上的API的所得Z+脂质体和具有存在于脂质体表面上的API的所得Z+++脂质体经由通过0.2um聚碳酸酯注射器式/囊式过滤器进行无菌过滤，并将最终产物储存于5℃下。
脂质体L、M和N疫苗的制备
脂质体L、M和N疫苗通过薄脂质膜技术然后均质化和挤出来产生。首先，将DMPC(Lipoid GmbH,Ludwigshafen,Germany)、DMPG(Lipoid GmbH,Ludwigshafen,Germany)、胆固醇(Dishman,Netherlands)和MPLA(Avanti Polar Lipids,AL,USA)以摩尔比为9:1:7:0.05，在60℃下溶解于EtOH中。在真空旋转蒸发仪上蒸发乙醇以获得薄脂质膜。
将脂质膜用含有以下的PBS pH 7.4、5％DMSO(均来自Sigma-Aldrich)再水合：
·0.15mg/mL T48肽(Peptides&Elephants,Germany)-对于脂质体M；或
·0.13mg/mL T50肽(Peptides&Elephants,Germany)-对于脂质体L；或
·0.15mg/mL T52肽(Peptides&Elephants,Germany)-对于脂质体N。
将样品轻轻搅拌15分钟，并进一步剧烈涡旋以溶解薄脂质膜。将所得多层囊泡进行10次冻融循环(液体N2和37℃的水浴)和进行均质化然后通过孔径为0.08um的聚碳酸酯膜(Whatman,UK)依序挤出。均质化和挤出两个步骤均在EmulsiFlex-C5(Avestin,Canada)中进行。挤出脂质体通过超滤进行浓缩，并通过渗滤将缓冲液与PBS pH 7.4进行交换。在添加tau肽之前，将含有包封的T48、T50或T52肽的所得脂质体以PBS pH 7.4稀释并加热至60℃以获得脂质体溶液。
将API(Bachem AG,Switzerland)以1mg/mL的浓度溶于含有2％辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma-Aldrich,USA)的PBS pH 11.4中，并将肽溶液在60℃下注入到脂质体溶液中，然后在60℃下搅拌30分钟。通过超滤进行浓缩以获得目标值(400ug/ml API和100ug/mlT48、T50或T52)，并在渗滤期间用PBS pH 7.4进行10次缓冲液交换。然后，使具有存在于脂质体表面上的API的所得脂质体经由通过0.2um聚碳酸酯注射器式过滤器进行无菌过滤，并将最终产物储存于5℃下。
脂质体R、S和T疫苗的制备
脂质体R、S和T疫苗使用基于乙醇注射的方法然后挤出来产生。首先，将DMPC(Lipoid GmbH,Ludwigshafen,Germany)、DMPG(Lipoid GmbH,Ludwigshafen,Germany)、胆固醇(Dishman,Netherlands)和3D-(6-酰基)(Avanti Polar Lipids,AL,USA)以摩尔比为9:1:7:0.04，在60℃下溶于EtOH中。对于脂质体R和T，将以上脂质乙醇溶液混合到补充有270mM蔗糖的10mM组氨酸pH 5.8中以达到10％溶剂(EtOH)，并然后在60℃下温育30分钟。对于脂质体S，将T50肽(Bachem AG,Switzerland)溶于10mM His/270mM蔗糖(pH5.8-6.0)中。将与脂质体R、S和T相关的脂质-缓冲液混合物轻轻搅拌15分钟，导致形成多层囊泡(MLV)。将所得多层囊泡进行在EmulsiFlex-C5高压系统(Avestin,Canada)中进行的通过孔径为0.08um(5X)的聚碳酸酯膜(Whatman,UK)的挤出。
将挤出脂质体通过超滤进行浓缩，并通过渗滤将缓冲液与20mM His/145mM NaCLpH 7.4进行交换。在添加API和对于脂质体T添加T57之前，将含有包封的T50的所得脂质体(脂质体S)和所得脂质体R和T以20mM His/145mM NaCLpH 7.4进一步稀释并加热至60℃以获得脂质体溶液。
对于脂质体T，将T57溶于去离子蒸馏水中的1％辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma-Aldrich,USA)中至1mg/mL，并插入脂质体中，然后在60℃下温育15分钟，之后插入API。
将API(Bachem AG,Switzerland)以1mg/mL的浓度溶于含有1％辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma-Aldrich,USA)的碳酸盐缓冲液(pH 10.2)中，并将肽溶液在60℃下混合到脂质体溶液中，然后在60℃下搅拌30分钟。通过超滤进行浓缩以获得以下目标值：
-对于脂质体R为1200ug/ml API；
-对于脂质体S为1200ug/ml API和300ug/ml T50；和
-对于脂质体T为1200ug/ml API和300ug/ml T57。
在渗滤期间用10mM His/270mM蔗糖pH 6.5进行10次缓冲液交换。然后，使具有存在于脂质体表面上的API的所得脂质体经由通过0.2um聚碳酸酯注射器式过滤器进行无菌过滤，并将最终产物储存于5℃下。
实施例2：缀合物疫苗的制备
肽和佐剂
通过优化长度来精制两个多磷酸化肽表位的序列(分别具有三个和两个磷酸化氨基酸的TAUVAC-p7.1和TAUVAC-p22.1)，使得其可更好地结合B细胞的表面免疫球蛋白，和使得该序列不含预测以高亲和力结合人类HLA I类A、B和C分子的表位。后者标准对于避免诱导可能潜在地导致明显的神经元损伤的针对tau的细胞毒性CD8+ T细胞反应为重要的。使用免疫表位数据库和分析资源(Immune Epitope Database and Analysis Resources)的T细胞表位预测工具，肽TAUVAC-p7.1没有显示能够以高亲和力与人类HLA I类A、B、C和HLAII类DQ和DR分子结合的预测表位，而预测肽TAUVAC-p22.1含有以中等/高亲和力与HLA II类DQ和DR分子结合的表位(数据未显示)。
本研究中使用的磷酸化tau肽(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3)为在合成期间添加磷酸化残基而合成产生的(Pepscan,NL)。包含具有经接头共价连接于KLH载体的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的磷酸化tau肽的缀合物本文分别称为缀合物B或缀合物C。包含具有经接头共价连接于CRM载体的SEQ ID NO:2的氨基酸序列的磷酸化tau肽的缀合物本文称为缀合物A。
为了制造缀合物B和C，疫苗肽经间-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)接头和在肽的N-末端的额外半胱氨酸缀合于载体蛋白KLH。使用Sephadex G25柱去除未结合的肽，之后浓缩缀合物。混合缀合物，之后按照制造商的说明，注入到有效的多组分佐剂(Sigma Adjuvant System,Sigma-Aldrich)或单组分贮存佐剂(氢氧化铝，Invivogen)中。
疫苗肽经聚乙二醇(PEG)-半胱氨酸-乙酰氨基丙酰胺接头缀合于载体蛋白CRM197。具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的磷酸化tau肽为在合成期间添加磷酸化残基和PEG3间隔基而合成产生的(Polypeptide Laboratories SAS)。通过使载体蛋白CRM197经3-(溴乙酰氨基)丙酸琥珀酰亚胺酯(SBAP)接头缀合于肽的N-末端的半胱氨酸来制造缀合物A。SBAP经NHS酯反应化学连接于CRM197蛋白伯胺(-NH2)。使用超滤和渗滤(UF/DF)去除过量的SBAP接头。将CRM197-SBAP中间体缀合于磷酸化tau肽，并且一旦反应完成，通过添加过量的L-胱氨酸猝灭反应来终止缀合反应。使用Capto Q ImpRes(GE Healthcare)色谱柱和使用盐等度法洗脱纯化粗品CRM197-肽缀合产物。然后将纯化的CRM197-肽产物使用UF/DF配制于20mM Tris,250mM蔗糖,pH 8.1中至浓度为0.5mg/mL。通过添加10％PS80储备缓冲液以达到0.01％PS80最终浓度来产生CRM197-tau肽原料药(DS)。过滤之前将溶液充分混合。
实施例3：疫苗诱导对Tau磷酸肽特异性的IgG抗体
所有动物实验均已批准，并根据有关动物实验的当地法规进行。恒河猴(猕猴)得自中国昆明科灵生物科技有限公司(Kunming Biomed International Ltd,China)、中国云南英茂生物技术有限公司(Yunnan Yinmore Bio-Tech Co.LTD,China)和中国云南灵长类实验动物有限公司(Yunnan Laboratory Primates Inc.,China)。免疫开始时动物为2-5岁龄，并且其最小体重为2.5kg。在治疗开始之前和之后每周进行详细的临床检查。此外，每天两次观察猕猴，并记录临床体征。
将成年恒河猴(每组n＝3只雄性和3只雌性)在第1、29和85天用以下皮下免疫：与alum和CpG寡核苷酸CpG 2006共同注射的每剂1800μg乙酸四棕榈酰化的SEQ ID NO:2的磷酸化tau肽的对照脂质体疫苗(含有四棕榈酰化的SEQ ID NO:2的磷酸化tau肽和MPLA的脂质体)或本申请实施方案的脂质体疫苗例如脂质体Z(含有四棕榈酰化的SEQ ID NO:2的磷酸化tau肽、3D-(6-酰基)脂质化CpG寡核苷酸CpG 2006和T细胞肽T50的脂质体)，或每剂15μg本发明实施方案的缀合物疫苗(例如缀合物A，连接于CRM197的SEQ ID NO:2的磷酸化tau肽)。在免疫之前和第8、22、36、50、64、78、92、106、120、134和148天进行抽血并分离血清。
使用SEQ ID NO:2的磷酸化tau肽作为包被抗原，通过ELISA测定特异性IgG抗体效价。将来自个体免疫猴子的血清以测定缓冲液(PBS,0.05％Tween20,1％BSA)连续稀释，并施用于已用相关肽包被的96孔板中。温育两小时之后，取出样品并将板以PBST(PBS,0.05％Tween20)清洗。先后使用HRP缀合的抗猴IgG(KPL)和ABTS底物(Roche)检测抗体。所有样品均以八次两倍稀释运行，每块板上均包含阳性和阴性对照样品。数据表示为每组终点效价(诱导阳性反应的最后血清稀释度)的几何平均值。
如图4所示，与对照脂质体疫苗相比较，脂质体Z疫苗和缀合物A两者均诱导更高的磷酸肽特异性IgG效价。
实施例4：疫苗在人类脑中诱导对病理性Tau结构特异性的抗体所有脑组织均得自Netherlands Brain Bank(NBB)，并在签署关于脑解剖和使用样品及其临床信息用于研究目的的知情同意书后，从捐赠者处收集。使用来自非痴呆对照(健康)、阿尔茨海默病(AD)、具有tau病理学的额颞叶痴呆(FTD-tau)、皮克氏病、原发性年龄相关性tau病(PART)和进行性核上性麻痹(PSP)的石蜡切片。脑区域包括顶叶皮层、额中回、海马或尾状核。
特别地，将来自对照人类受试者(健康)和患有阿尔茨海默病的人类受试者(ADBraak V/VI)的顶叶皮层的福尔马林固定石蜡包埋切片用以常规抗体稀释剂(Immunologic)按1:100稀释的免疫后猕猴血清进行染色。然后清洗切片，并用山羊抗猴-HRP(Abcam)染色。染色最终使用3,3’-二氨基联苯胺(DAB；Dako)可视化，DAB在存在辣根过氧化物酶(HRP)的情况下沉积棕色的特异性染色。将玻片用苏木精复染，脱水并用Quick D封固剂(Klinipath)封固。用Leica DC500显微镜拍摄图片。
图5中的结果表明，来自用脂质体Z(含有四棕榈酰化的SEQ ID NO:2的磷酸化tau肽、3D-(6-酰基)脂质化CpG寡核苷酸CpG 2006和T细胞肽T50的脂质体)免疫的恒河猴的免疫后血清染色人类脑切片中的病理性tau结构。在用改良脂质体进行初次免疫之后第106天，从恒河猴收集血清。该恒河猴在血清收集之前的第0、1和3个月接受免疫。左图(AD Braak V/VI)显示来自Braak V期捐赠者的顶叶皮层的染色。箭头指示tau缠结的染色。右图(健康)显示来自Braak 0期捐赠者的顶叶皮层的染色。将血清以1:100的稀释度施用于切片，然后以1:100施用山羊抗猴抗体，并使用DAB显影剂使染色可视化。
图6中的结果表明，来自用缀合物A(含有SEQ ID NO:2的磷酸化tau肽加可溶性CpG和氢氧化铝)免疫的恒河猴的血清与人类AD脑切片中的病理性tau结构结合。在用CRM缀合物疫苗初次免疫之后第106天收集血清。这些恒河猴在血清收集之前的第0、1和3个月接受免疫。上图(AD)显示来自Braak V期捐赠者的顶叶皮层(包括tau缠结)的染色。下图(CTRL)显示来自Braak 0期捐赠者的顶叶皮层的染色。将血清以1:100的稀释度施用于切片，然后以1:100施用山羊抗猴抗体，并使用DAB显影剂使染色可视化。
实施例5：具有一种或两种佐剂的脂质体疫苗
在改良脂质体疫苗中添加两种佐剂提高tau磷酸肽特异性IgG抗体效价的水平，以及个体之间抗体反应的一致性。
将成年恒河猴(每组n＝3只雄性和3只雌性)在第1、29、85和169天用以下皮下免疫：每剂1800μg乙酸四棕榈酰化的SEQ ID NO:2的磷酸化tau肽的对照脂质体疫苗、或含有单独的3D-(6-酰基)佐剂(脂质体X，图7A)、单独的脂质化CpG 2006寡核苷酸佐剂(脂质体Y，图7B)、或者3D-(6-酰基)/>和脂质化CpG 2006寡核苷酸佐剂两者(脂质体Z，图7C)的带有包封的T50 T细胞表位的改良脂质体疫苗。在免疫之前和第8、22、36、50、64、78、92、106、120、134、148、162、176和190天进行抽血并分离血清。使用SEQ ID NO:2的磷酸化tau肽作为包被抗原和抗猴IgG二抗，通过ELISA测定血清中的特异性IgG抗体效价。所得抗体水平表示为随着时间的推移每只个体猴子的终点效价(诱导阳性反应的最后血清稀释度)。每个免疫组以一个图代表(图7A-C)。每组终点效价的几何平均值±95％置信区间如图7D所示。总之，图7A-D显示，在含有包封的T50的脂质体疫苗中包含两种佐剂改善对tau磷酸肽的抗体反应的水平和一致性，从而导致个体猴子之间抗体反应的可变性较小。更具体地讲，如图7D所示，含有SEQ ID NO:2的磷酸化tau肽、T50T细胞表位(脂质体X、Y和Z)及1或2种佐剂的改良脂质体疫苗比没有T细胞表位的对照脂质体疫苗诱导更高的针对tau磷酸肽的效价。当注射了每种改良脂质体疫苗时，所有猴子均为响应者，而使用对照脂质体疫苗的6只动物中有4只为响应者。
实施例6：疫苗诱导对富含成对螺旋丝(ePHF)特异性的抗体
将恒河猴各组(每组n＝3只雄性和3只雌性)通过在第1和29天用以下接种进行皮下免疫：(i)改良脂质体疫苗，其含有T50 T细胞表位和单独的3D-(6-酰基)佐剂(脂质体X)，(ii)改良脂质体疫苗，其含有T50 T细胞表位和单独的脂质化CpG 2006佐剂(脂质体Y)，(iii)改良脂质体疫苗，其含有T50 T细胞表位和两种佐剂(3D-(6-酰基)/>和脂质化CpG2006，脂质体Z)，或(iv)与alum和CpG寡核苷酸CpG 2006共同注射的缀合物疫苗(连接于CRM197的SEQ ID NO:2的磷酸化tau肽)(缀合物A)。
使用Greenberg和Davies(Greenberg和Davies,1991,Proc Natl Acad Sci U SA,87(15):5827-31)的改良方法，富含成对螺旋丝(ePHF)的制备物从组织学证实的AD受试者的死后脑组织通过不溶性tau的肌氨酰提取而获得。使用Mesoscale Discovery(MSD)平台评估对富含成对螺旋丝(ePHF)特异性的抗体效价。将MSD链霉亲和素板用生物素化的抗tau捕获抗体(HT7-生物素，ThermoScientific)包被，之后与从阿尔茨海默病患者分离的ePHF一起温育，同时使用与猴子IgG抗体交叉反应的SulfoTag标记的抗人类IgG抗体进一步检测对ePHF特异性的IgG抗体。更具体地讲，将ePHF添加到预先用1％BSA饱和并用生物素化HT-7(Thermo Scientific)包被的MSD Gold小斑点链霉亲和素96孔板(MSD)中。温育1小时之后，将板用PBST清洗，并添加血清的连续稀释液且温育2小时。使用SulfoTag标记的抗人类IgG抗体检测结合的抗体，然后是以1％PFA的固定步骤，之后添加读取缓冲液T(ReadBuffer T)。使用Sector Imager(MSD)分析板。结果以每只单个猴子的任意单位/毫升(AU/mL)以及每组的几何平均值表示。以第一次免疫之后第50天对ePHF特异性的抗体效价来表示。
图8显示所有疫苗均诱导高效价的ePHF特异性IgG抗体。
用其他脂质体(比如脂质体Z+)经肌内给予来给予恒河猴，也获得了具有高效价的ePHF特异性IgG抗体的类似结果。
实施例7：在恒河猴中由脂质体疫苗和缀合物疫苗诱导的Tau磷酸肽特异性抗体的广度将恒河猴各组(每组n＝3只雄性和3只雌性)在第1和29天用以下进行皮下免疫：(i)改良脂质体疫苗，其含有包封的T50和两种佐剂：TLR4配体(3D-(6-酰基))和脂质化CpG 2006寡核苷酸(脂质体Z)，和(ii)与alum和CpG寡核苷酸CpG 2006共同注射的缀合物疫苗(连接于CRM的SEQ ID NO:2的磷酸化tau肽)(缀合物A)。在第二次免疫之后3周(第50天)，使用N-末端生物素化的8聚体肽(移动一个氨基酸和涵盖SEQ ID NO:2的磷酸化tau肽的序列以及SEQ ID NO:4的序列(VYKSPVVSGDTSPRHL，具有与SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列的非磷酸化tau肽))和相应的生物素化的全长肽的文库，通过表位作图ELISA测定抗体的表位识别特性。
图9显示用脂质体Z免疫的猴子产生的IgG抗体主要与SEQ ID NO:2的磷酸化肽的N-末端部分结合(图9A)，而用缀合物疫苗(连接于CRM的SEQ ID NO:2的磷酸化tau肽)免疫的猴子产生的IgG抗体主要与SEQ ID NO:2的tau肽的C-末端部分结合(图9B)。
实施例8：由含有包封的T细胞表位的脂质体疫苗诱导的对Tau磷酸肽特异性的IgG抗体的增加效价将3组C57BL/6J小鼠(每组n＝10)在第0和14天用以下进行皮下免疫：i)脂质体疫苗，其含有TLR4激动剂(3D-(6-酰基))(脂质体R)，ii)脂质体疫苗，其含有包封的T细胞表位T50和TLR4配体(3D-(6-酰基)/>)作为佐剂(脂质体S)，或iii)脂质体疫苗，其在脂质体表面含有锚定的T细胞表位T57(即二棕榈酰化的T50)和TLR4配体(3D-(6-酰基)/>)作为佐剂(脂质体T)。在第一次注射之后21和35天，通过ELISA测量小鼠血浆中对SEQ ID NO:2的磷酸化tau肽特异性的IgG抗体的水平；结果表示为个体小鼠的值以及以每mL任意单位(AU)表示的每组的几何平均值±95％CI。如图10A所示，在第一次免疫之后21天，用含有包封的T50的脂质体疫苗(脂质体S)接种诱导显著高于对照脂质体疫苗(脂质体R)和含有锚定的T细胞表位的脂质体疫苗(脂质体T)的抗体效价(Kruskal-Wallis检验：分别为p＝0.0089和p＝0002)，而且在第一次免疫之后35天诱导也高于对照脂质体疫苗的抗体效价和诱导显著高于含有锚定的T细胞表位的脂质体疫苗的抗体效价(Kruskal-Wallis检验：分别为p＝0.7591和p＝0053)(图10B)。
实施例9：脂质体疫苗诱导对掺入的T细胞表位特异性的T细胞反应将3组C57BL/6J小鼠(每组n＝5)在第0、14和28天用以下进行皮下免疫：(i)改良脂质体疫苗，其含有包封的T细胞肽T48(含有以GS接头隔开的T细胞表位PADRE、T2、T30和T17)和TLR4激动剂作为佐剂(MPLA)(脂质体M)，(ii)改良脂质体疫苗，其含有包封的T52(含有以RK接头隔开的T细胞表位PADRE、T2和T30)和TLR4激动剂(MPLA)作为佐剂(脂质体N)，或(iii)PBS。在第一次免疫之后42天从小鼠收获脾脏，以通过IL-4和IFN-γELISPOT分析T细胞反应。将单细胞悬浮液以10ug/mL与培养基、T48或T52肽一起温育48小时。将板与生物素化的抗小鼠IL-4或IFN-γ单克隆抗体以及与链霉亲和素碱性磷酸酶(AP)一起温育。通过添加AP底物使斑点显影。图11显示用与脂质体中包封的肽相同的肽再刺激小鼠脾细胞诱导IL-4(图11B)和IFN-γ斑点形成细胞(图11A)，而注射PBS的小鼠脾细胞则没有。这证实了向疫苗中添加T细胞表位诱导特异性T细胞的活化，允许它们进一步为tau特异性B细胞的抗体产生提供帮助。
实施例10：含有包封的T细胞表位和锚定的T细胞表位的脂质体疫苗将恒河猴各组(每组n＝6)在第1、29、85和169天用以下进行皮下免疫：(i)脂质体疫苗，其含有包封的T细胞表位T50和TLR4配体(MPLA)作为佐剂(脂质体L)，(ii)脂质体疫苗，其含有锚定的T细胞表位T46和TLR4配体(MPLA)作为佐剂(脂质体O)，和(iii)对照脂质体疫苗，其含有TLR4配体(MPLA)作为佐剂且没有T细胞表位。在免疫之前(第-14天)和第8、22、36、50、64、78、92、106、120、134、148、162、176和190天进行抽血并分离血清。使用SEQ ID NO:2的磷酸化tau肽作为包被抗原和抗猴IgG二抗，通过ELISA测定特异性IgG抗体效价。所得抗体水平计算为终点效价(诱导阳性反应的最后血清稀释度)，并且数据表示为每组的几何平均值。如图12所示，含有包封的T细胞表位的脂质体疫苗(脂质体L)和含有锚定的T细胞表位的脂质体疫苗(脂质体O)各自比没有T-细胞表位的对照脂质体疫苗诱导更高的tau磷酸肽特异性抗体效价。
实施例11：由缀合物疫苗在小鼠中诱导的抗体反应
将雌性BALB/c小鼠(每组14只小鼠)按照图13A所述的时间表和使用以有效的多组分佐剂(Sigma AdjuvantSigma-Aldrich,从这里开始称为Ribi)或单组分贮存佐剂(/>佐剂2％或氢氧化铝凝胶,InvivoGen,从这里开始称为alum)佐剂化的疫苗候选物，用缀合物B或缀合物C(含有共价连接于KLH的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3)免疫。与小鼠蛋白相比较，SEQ ID NO:1的氨基酸序列仅含有一个氨基酸差异，而在人类与小鼠之间，SEQ ID NO:3的序列为100％保守的。因此，所选的表位可合理地认为是小鼠的“自身”蛋白，并且小鼠应为用于研究免疫耐受性可能对免疫原性施加的限制的相关模型。
作为疫苗免疫原性的第一次测量，流式细胞术用于测量疫苗注射部位引流的颈部淋巴结中T滤泡辅助性细胞(TfH)的诱导(每组4只小鼠)。TfH为CD4+ T细胞的一个特化群体，其特征为CXCR5、PD-1和ICOS等分子的表达。TfH在暴露于疫苗或其他免疫刺激之后会扩增，并支持生发中心中B细胞的亲和力成熟(Crotty,2011,Annual Reviews ofImmunology.Vol 29:p621-663)。诱导的TfH的数量与疫苗在人类(Bentebibel et al.,2013,Sci Transl Med.,5(176):176ra32；Spensieri et al.,2013,Proc Natl Acad SciU S A.,110(35):14330-5)和小动物中的保护功效成正相关。如图13B所示，两种疫苗以及KLH加佐剂的对照免疫在接种的小鼠中诱导可测量的TfH。此外，当在第一次免疫之后7天收获引流颈部淋巴结时，所有接受活性疫苗(缀合物B和缀合物C组)或活性安慰剂(KLH)加alum的动物的TfH明显多于给予非活性安慰剂的动物(PBS组)(就多重比较而言使用ANOVA检验然后进行Dunnett校正，对于KLH-TAUVAC-p7.1，P＝0.0044；对于KLH-TAUVAC-p22.1，P＝0.0482；对于KLH，P＝0.0063)。
第0天和在免疫之后的4个另外时间点(第14、28、56和84天，参见图13C、D、G和H)进行ELISA以确定与tau磷酸肽和与KLH结合的抗体的血清效价。如图13C所示，用缀合物B免疫诱导针对相应疫苗肽具有反应性的结合抗体。对于用缀合物B和Ribi佐剂免疫的动物，在所有测量的时间点，针对疫苗肽的结合效价明显高于由活性安慰剂诱导的结合效价(将缀合物B加Ribi与KLH加Ribi相比较)(P<0.001，就多重比较而言使用ANOVA检验然后进行Tukey校正)。对于alum佐剂化组，差异仅在第56和84天才显著(分别为P＝0.001和0.012)。
尽管测定差异(不同的包被肽)妨碍在两种疫苗之间进行直接统计比较，但对缀合物C的tau特异性抗体反应(图13D)在总体幅度上低于对缀合物B的反应。尽管如此，在免疫之后第28和84天，用缀合物C加Ribi接种的小鼠中针对缀合物C的抗体效价显著高于接受活性安慰剂KLH Ribi的小鼠(分别为P＝0.001和0.008)；alum佐剂化组的效价没有显著不同于活性安慰剂的那些。
尽管载体蛋白在某种程度上保护磷酸肽免于体内降解，但是肽抗原的体内磷酸酶消化很可能会使一些非磷酸化的肽暴露于免疫系统。为了确定该暴露是否导致能够结合缀合物B和缀合物C中的非磷酸化肽的抗体产生，使用非磷酸化肽作为包被抗原进行ELISA。如图13E-F所示，对非磷酸化tau肽的反应低，与活性安慰剂对相同的非磷酸化肽的反应相当。此外，在用缀合物B和Ribi免疫的动物中，在所有测量的时间点，针对磷酸化肽的结合效价显著高于针对非磷酸化肽的结合效价(使用ANOVA检验，在第14天P＝0.009；在第28、56和84天P<0.0001)。对于alum佐剂化组，差异仅在第56和84天才显著(分别为P＝0.0002和0.001)。对于用缀合物C免疫的动物，仅当使用Ribi佐剂时，对磷酸化肽的反应才更高(在第28天P<0.0001；在第56和84天P＝0.0001)。
实施例12：由缀合物疫苗诱导的抗体与经改变tau的生理相关的形式结合为了进一步确定疫苗诱导的抗体是否可与经改变tau的生理相关的形式结合，我们使用了来自接种小鼠的免疫后血清以对从阿尔茨海默病患者(5例AD)、从患有其他tau病的患者(3例PART、FTD、PICK和PSP)或从年龄匹配的健康对照(5个对照病例，CTRL)中收集的死后人类脑切片进行染色。正如预期的那样，来自对照动物(PBS和活性安慰剂组)的血清并未结合脑切片，而AT8(一种与从鼠类克隆获得的pTau[pSer202，pThr 205]结合的单克隆抗体)在相应区域的相邻组织切片中显示出强烈的tau病理学的免疫反应性(图14)。来自用活性疫苗缀合物B和缀合物C免疫的动物的血清不仅在AD切片(数据未显示)中，而且还在来自其他tau病的那些切片中结合病理性tau结构(图14)。在AD病例中，缀合物B诱导的抗体与(前)缠结、神经纤维网线和神经炎性斑反应。这些免疫后血清还能与PART脑组织中的神经原纤维缠结和神经纤维网线、FTD-tau(MAPT P301S)组织中的神经元包涵体和神经纤维网线、某些皮克氏病病例中的包涵体和星形胶质细胞以及最后PSP典型的神经元包涵体、神经纤维网线和星形胶质细胞进行免疫反应。缀合物C诱导的多克隆血清也与每种tau病特征性的病理性tau结构反应。在AD病例中，染色主要集中于神经原纤维缠结上，而较少程度地集中于神经炎性斑和神经纤维网线上。相应区域的较低放大倍数显示出相似的结果(数据未知)。
实施例13：疫苗诱导的抗体在小鼠中为有功能的以tau病的注射模型测试缀合物B疫苗的保护功效(Peeraer et al.,2015,Neurobiol Dis.,73:83-95)。在该模型中，经基因突变(P301L)易患tau病的小鼠按照图15A所示的时间线接受脑内注射从人类AD脑分离的富集PHF。在转基因诱导的tau病发作之前进行的注射加速这些动物中tau病的发展。相反，当将ePHF“种子”与能够抑制tau接种活性的抗体(如AT8)预混合时，就减少tau病的诱导(未公开的数据，未显示)。
按照图15A中的方案，我们评价了立体定位注射与从用缀合物B、Ribi或活性对照KLH Ribi免疫的动物血清中纯化的IgG预混合的富集人类PHF之后tau病的发展。注射之后两个月，收获这些小鼠的脑，并使用标准生化分析测定在总和肌氨酰不溶性级分中的聚集tau的量。获得的数据表明，当小鼠注射已与来自用缀合物B接种的小鼠的IgG预混合的ePHF时，与接受对照注射的动物相比较，总级分(图15B)和肌氨酰不溶性级分(图15C)两者中聚集的磷酸化tau明显更少(p<0.0001 KLH Ribi相对于KLH-TAUVAC-p7.1 Ribi，就多重比较而言使用ANOVA检验然后进行Holm-Bonferroni校正)。肌氨酰不溶性tau与tau病的病理性特征相关已被广泛接受，该结果表明，通过接种KLH-TAUVAC-p7.1诱导的抗体在体内为保护性的。
实施例14：疫苗诱导的抗体在非人类灵长类动物中为有功能的将恒河猴用alum和CpG寡核苷酸佐剂化的缀合物B(n＝6)或用KLH(n＝2)在第1、29、85和169天免疫。每14天收集血液和将来自用缀合物B免疫的动物的血清使用ELISA测试对免疫肽的反应性(图16A)，并使用MSD测试对人类ePHF的反应性(图16B)。用缀合物B免疫导致针对疫苗磷酸肽的持续且一致的抗体反应。此外，所有动物均具有可测量的针对人类ePHF的抗体水平，6只动物中有3只对该抗原显示出高反应性。将初次免疫后50天从动物收集的血清施用于来自健康个体或AD患者的人类脑切片(图16C)。来自缀合物B组的免疫后血清染色病理性tau结构(即AD脑组织中的神经原纤维缠结、神经纤维网线和神经炎性斑)，而来自KLH免疫小鼠的血清则未显示任何反应性。在对照组织上未观察到染色。当以tau免疫耗竭测定进行测试时，接受缀合物B的动物具有能够结合和消耗tau种子的抗体(在第50天p＝0.03，就多重比较而言使用ANOVA检验然后进行Dunnett校正)，而用KLH免疫未触发这种抗体(图16D)。免疫前后的血清也作为连续稀释的个体样品在中和测定中进行测试(图16E)。自基线的变化(CFB)作为分别在接种之前第-14天(基线)和接种后第50、106和190天的读出的FRET计数之间的差异计算。然后如下计算特定接种后天数(天i)的反应：反应＝％FRET_天i-％FRET_基线；
以动物为随机效应，使用作为类别变量处理的变量疫苗组、天数和血清水平及所有其相互作用应用对上述反应的一般线性混合模型。考虑到研究的探索性，无需考虑多重检验校正。假设检验以5％的显著性水平进行。
实施例15：用与alum和CpG寡核苷酸佐剂组合的缀合物疫苗免疫的小鼠导致对疫苗肽更高效价的抗体反应
将成年雌性C57BL/6小鼠(每组n＝5-6)用2ug(图17A)或0.2ug(图17B)的缀合物A疫苗肌内免疫。将缀合物疫苗单独(无佐剂)、与氢氧化铝、CpG寡核苷酸或组合的alum和CpG寡核苷酸一起给予。所有小鼠在研究的第0天均接受初次免疫，然后在第28天接受一次加强免疫。alum佐剂的剂量为每只小鼠每次注射500ug，和CpG寡核苷酸佐剂的剂量为每次注射20ug/小鼠。图17中的图表显示使用从免疫之前(第0天)和用疫苗肽T3.5作为包被抗原免疫之后的两个时间点(第28和42天)的小鼠收集的血清的结合ELISA结果。将每组T3.5特异性平均终点效价绘图，并且误差线代表标准误差。表格显示结果的统计分析，其中使用非参数Kruskal-Wallis检验比较抗体效价，并使用Wilcoxon Signed Rank检验作为KruskalWallis检验的事后比较评价成对组比较。
图17所示的结果说明，在两种剂量下非佐剂化疫苗均无法诱导强烈的免疫反应。使用alum或CpG寡核苷酸或两者的组合提高抗体反应的幅度(p≤0.0152)。此外，对于用2ug疫苗免疫的动物，佐剂组合在第28天给出的抗体效价显著高于单一佐剂(p＝0.0028)。在第42天，对于用0.2ug疫苗免疫的动物，alum-CpG寡核苷酸组合也比单独的CpG寡核苷酸表现更好(p＝0.0497)。这些数据支持alum和CpG寡核苷酸佐剂组合的使用。
实施例16：具有不同比率Tau肽:T细胞表位的脂质体疫苗诱导高和持续水平的tau磷酸肽特异性IgG抗体效价将成年恒河猴(每组n＝6)在第1、29、85和169天用具有包封的T50 T细胞表位的改良脂质体疫苗中每剂1800μg乙酸四棕榈酰化的SEQ ID NO:2的磷酸化tau肽进行皮下免疫，所述疫苗含有3D-(6-酰基)和脂质化CpG 2006寡核苷酸佐剂两者以及i)400ug/mL SEQ ID NO:2的磷酸化tau肽和100ug/mL T50(脂质体Z)，ii)1200ug/mL SEQ ID NO:2的磷酸化tau肽和1200ug/mL T50(脂质体Z+)，iii)400ug/mL SEQ ID NO:2的磷酸化tau肽和400ug/mL T50(脂质体Z++),iv)1200ug/mL SEQ ID NO:2的磷酸化tau肽和300ug/mL T50(脂质体Z+++)。在免疫之前和第8、22、36、50、64、78、92、106、120、134、148、162、176和190天进行抽血并分离血清。使用SEQ ID NO:2的磷酸化tau肽作为包被抗原和抗猴IgG二抗，通过ELISA测定血清中的特异性IgG抗体效价。所得抗体水平计算为随着时间的推移每只个体猴子的终点效价(诱导阳性反应的最后血清稀释度)。每组终点效价的几何平均值±95％置信区间如图18所示，表明所有4种测试的脂质体疫苗均可诱导针对tau磷酸肽的高和持续效价。
序列表
SEQ ID NO:1-磷酸化tau肽(7.1)
GDRSGYS[pS]PG[pS]PG[pT]PGSRSRT
SEQ ID NO:2-磷酸化tau肽(T3.5)
VYK[pS]PVVSGDT[pS]PRHL
SEQ ID NO:3-磷酸化tau肽(22.1)
SSTGSIDMVD[pS]PQLA[pT]LA
SEQ ID NO:4-tau肽
VYKSPVVSGDTSPRHL
SEQ ID NO:5-磷酸化tau肽
RENAKAKTDHGAEIVYK[pS]PVVSGDT[pS]PRHL
SEQ ID NO:6-磷酸化tau肽
RQEFEVMEDHAGT[pY]GL
SEQ ID NO:7-磷酸化tau肽
PGSRSR[pT]P[pS]LPTPPTR
SEQ ID NO:8-磷酸化tau肽
GYSSPG[pS]PG[pT]PGSRSR
SEQ ID NO:9-磷酸化tau肽
GDT[pS]PRHL[pS]NVSSTGSID
SEQ ID NO:10-磷酸化tau肽
PG[pS]PG[pT]PGSRSR[pT]P[pS]LP
SEQ ID NO:11-磷酸化tau肽
HL[pS]NVSSTGSID
SEQ ID NO:12-磷酸化tau肽
VSGDT[pS]PRHL
SEQ ID NO:13-T50 T细胞表位
AKFVAAWTLKAAAVVRQYIKANSKFIGITELVVRFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-NH2
SEQ ID NO:14-T46 T细胞表位
AKFVAAWTLKAAAGSQYIKANSKFIGITELGSFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEK(Pal)K(Pal)-NH2
SEQ ID NO:15-T48辅助性T细胞表位
AKFVAAWTLKAAAGSQYIKANSKFIGITELGSFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSLINSTKIYSYFPSVISKVNQ-NH2
SEQ ID NO:16-T51辅助性T细胞表位
AKFVAAWTLKAAARRQYIKANSKFIGITELRRFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-NH2
SEQ ID NO:17-T52辅助性T细胞表位
AKFVAAWTLKAAARKQYIKANSKFIGITELRKFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-NH2
SEQ ID NO:18-CpG 2006(也称为CpG 7909)
5’-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3’
其中小写字母表示硫代磷酸酯(ps)核苷酸间键
SEQ ID NO:19-CpG 1018
5’-tgactgtgaacgttcgagatga-3’
其中小写字母表示硫代磷酸酯核苷酸间键
SEQ ID NO:20-CpG2395
5’-tcgtcgttttcggcgcgcgccg-3’
其中小写字母表示硫代磷酸酯核苷酸间键
SEQ ID NO:21-CpG2216
5’-ggGGGACGATCGTCgggggg-3’
其中小写字母表示硫代磷酸酯核苷酸间键和大写字母表示磷酸二酯(po)键
SEQ ID NO:22-CpG2336
5’-gggGACGACGTCGTGgggggg-3’,
其中小写字母表示硫代磷酸酯核苷酸间键和大写字母表示磷酸二酯键
SEQ ID NO:23-Pan DR表位(PADRE)肽
AKFVAAWTLKAAA
SEQ ID NO:24-P2
QYIKANSKFIGITEL
SEQ ID NO:25-P30
FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
SEQ ID NO:26-TT586–605
LINSTKIYSYFPSVISKVNQ
SEQ ID NO:27-棕榈酰化的磷酸化tau肽(棕榈酰化7.1)
K(pal)K(pal)GDRSGYS[pS]PG[pS]PG[pT]PGSRSRTK(pal)K(pal)
SEQ ID NO:28-棕榈酰化的磷酸化tau肽(T3,棕榈酰化T3.5)
K(pal)K(pal)VYK[pS]PVVSGDT[pS]PRHLK(pal)K(pal)
SEQ ID NO:29-棕榈酰化的磷酸化tau肽(棕榈酰化22.1)
K(pal)K(pal)SSTGSIDMVD[pS]PQLA[pT]LAK(pal)K(pal)
SEQ ID NO:30-棕榈酰化的tau肽
K(pal)K(pal)VYKSPVVSGDTSPRHLK(pal)K(pal)
SEQ ID NO:31-棕榈酰化的磷酸化tau肽
K(pal)K(pal)RENAKAKTDHGAEIVYK[pS]PVVSGDT[pS]PRHLK(pal)K(pal)
SEQ ID NO:32-棕榈酰化的磷酸化tau肽
K(pal)K(pal)RQEFEVMEDHAGT[pY]GLK(pal)K(pal)
SEQ ID NO:33-棕榈酰化的磷酸化tau肽
K(pal)K(pal)PGSRSR[pT]P[pS]LPTPPTRK(pal)K(pal)
SEQ ID NO:34-棕榈酰化的磷酸化tau肽
K(pal)K(pal)GYSSPG[pS]PG[pT]PGSRSRK(pal)K(pal)
SEQ ID NO:35-棕榈酰化的磷酸化tau肽
K(pal)K(pal)GDT[pS]PRHL[pS]NVSSTGSIDK(pal)K(pal)
SEQ ID NO:36-棕榈酰化的磷酸化tau肽
K(pal)K(pal)PG[pS]PG[pT]PGSRSR[pT]P[pS]LPK(pal)K(pal)
SEQ ID NO:37-棕榈酰化的磷酸化tau肽
K(pal)K(pal)HL[pS]NVSSTGSIDK(pal)K(pal)
SEQ ID NO:38-棕榈酰化的磷酸化tau肽
K(pal)K(pal)VSGDT[pS]PRHLK(pal)K(pal)
SEQ ID NO:39-没有C-末端酰胺的T50
AKFVAAWTLKAAAVVRQYIKANSKFIGITELVVRFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
SEQ ID NO:40-在C-末端没有-Lys(Pal)-Lys(Pal)-NH2的T46
AKFVAAWTLKAAAGSQYIKANSKFIGITELGSFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
SEQ ID NO:41-没有C-末端酰胺的T48
AKFVAAWTLKAAAGSQYIKANSKFIGITELGSFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSLINSTKIY
SYFPSVISKVNQ
SEQ ID NO:42-没有C-末端酰胺的T51
AKFVAAWTLKAAARRQYIKANSKFIGITELRRFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
SEQ ID NO:43-没有C-末端酰胺的T52
AKFVAAWTLKAAARKQYIKANSKFIGITELRKFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
SEQ ID NO:44-T57
AKFVAAWTLKAAAVVRQYIKANSKFIGITELVVRFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-K(Pal)K(Pal)-NH2。
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Claims (15)

1.一种缀合物，其包含tau磷酸肽和经接头与之缀合的免疫原性载体，所述缀合物具有以下结构：
(i)式(I)：
或
(ii)式(II)：
其中
x为0-10的整数，优选地为2-6，最优选地为3；和
n为3-15的整数，优选地为3-12。
2.权利要求1的缀合物，其中所述免疫原性载体选自钥孔血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素、CRM197和来自脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)的外膜蛋白混合物(OMP)或其衍生物。
3.权利要求1的缀合物，其中所述tau肽具有选自SEQ ID NO:1至3和SEQ ID NO:5至12的氨基酸序列。
4.权利要求3的缀合物，其中所述缀合物具有式(I)的结构，并且所述免疫原性载体为CRM197。
5.权利要求4的缀合物，其具有以下结构：
其中n为3-7的整数，并且VYKS(p)PVVSGDTS(p)PRHL-CONH2包含SEQ ID NO:2的磷酸tau肽。
6.一种药用组合物，其包含权利要求1-5中任何一项的缀合物和药学上可接受的载体。
7.权利要求6的药物组合物，还包含佐剂。
8.权利要求7的药物组合物，其中所述佐剂包含铝盐和CpG至少之一。
9.权利要求8的药物组合物，其中所述佐剂包含铝盐和CpG。
10.权利要求6的药用组合物在制备用于在患有神经变性障碍的受试者中诱导免疫反应的药物中的用途。
11.权利要求6的药用组合物在制备用于在需要它的受试者中治疗或预防神经变性疾病或障碍的药物中的用途。
12.权利要求11的用途，其中所述神经变性疾病或障碍由神经原纤维损伤的形成引起或与之相关。
13.权利要求12的用途，其中所述神经变性疾病或障碍为阿尔茨海默病、帕金森病、克-雅氏病、拳击手痴呆症、唐氏综合征、Gerstmann--Scheinker病、包涵体肌炎、朊病毒蛋白大脑淀粉样血管病、创伤性脑损伤、肌萎缩侧索硬化症、关岛帕金森-痴呆综合征、伴发神经原纤维缠结的非关岛型运动神经元病、嗜银颗粒性痴呆、皮质基底节变性、路易体痴呆肌萎缩侧索硬化症、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化症、与17号染色体相关的额颞叶痴呆合并帕金森综合征(FTDP-17)、Hallevorden-Spatz病、多系统萎缩、C型Niemann-Pick病、皮克氏病、进行性皮质下胶质增生、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、仅缠结性痴呆、脑炎后帕金森综合征、强直性肌营养不良、慢性创伤性脑病(CTE)、原发性年龄相关性tau病(PART)或路易体痴呆(LBD)。
14.权利要求12的用途，其中所述神经变性疾病或障碍为阿尔茨海默病、帕金森病、唐氏综合征、与17号染色体相关的额颞叶痴呆合并帕金森综合征(FTDP-17)、皮质基底节变性、路易体痴呆肌萎缩侧索硬化症、强直性肌营养不良、慢性创伤性脑病(CTE)、大脑血管病、原发性年龄相关性tau病(PART)或路易体痴呆(LBD)。
15.权利要求6的药用组合物在制备用于在需要它的受试者中治疗或预防神经变性疾病或障碍的药盒中的用途。
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