BR112020008168A2

BR112020008168A2 - composições de peptídeos tau fosforilados e usos das mesmas

Info

Publication number: BR112020008168A2
Application number: BR112020008168-0A
Authority: BR
Inventors: Elizabeth Anne Ramsburg; Nicolas Piot; Saroj Raj Ghimire; Donata De Marco; Anish Chakkkumkal; Charlotte Sadaka; Jaap Goudsmit; Andreas Muhs; Maria Pihlgren Bosch; Marija Vukicevic Verhille; David Hickman
Original assignee: Janssen Pharmaceuticals, Inc.; Ac Immune Sa
Priority date: 2017-10-25
Filing date: 2018-10-24
Publication date: 2020-10-27
Also published as: MA50465A; JP2021501147A; CN111787942A; WO2019084118A2; CN117298259A; AU2018355325A1; KR20200077543A; MX2020004338A; CL2020001070A1; US11124552B2; IL302108A; CL2021000217A1; DOP2020000135A; CA3079423A1; TW202333768A; ECSP20026986A; US20210388044A1; CN111787942B; WO2019084118A3; SG11202003556UA

Abstract

  A presente invenção refere-se a lipossomas contendo peptídeos tau, preferencialmente peptídeos tau fosforilados, e conjugados contendo peptídeos tau, preferencialmente peptídeos tau fosforilados, conjugados com um veículo imunogênico. Também são descritas composições farmacêuticas e usos dos lipossomas e / ou conjugados para o tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio neurodegenerativo, tal como a doença de Alzheimer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÕES DE PEPTÍDEOS TAU FOSFORILADOS E USOS DAS MESMAS".

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se ao campo da medicina. A invenção, em particular, refere-se a lipossomas ou conjugados de peptídeos tau e a seu uso para prevenir ou tratar tauopatia, tal como a doença de Alzheimer.

ANTECEDENTES

[0002] A doença de Alzheimer (AD) é uma doença neurodegenerativa debilitante progressiva que afeta cerca de 44 milhões de pessoas em todo o mundo (Alzheimers.net). As terapias de AD atualmente disponíveis na clínica visam retardar a progressão dos sintomas clínicos, mas não visam os processos patogênicos subjacentes à doença. Infelizmente, essas terapias são minimamente eficazes e, portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver e testar medidas preventivas e terapêuticas adicionais.

[0003] As patologias marcantes da doença de Alzheimer são um acúmulo de placas extracelulares compreendendo proteína beta amiloide agregada e "emaranhados" intracelulares ou agregações de proteína tau hiperfosforilada. Os eventos moleculares que levam ao acúmulo dessas proteínas são pouco caracterizados. Para amiloide, supõe-se que a clivagem aberrante da proteína precursora de amiloide leve a um acúmulo do fragmento propenso à agregação compreendendo os aminoácidos 1-42. Para a tau, supõe-se que a desregulação de quinases, fosfatases ou ambas leve à fosforilação aberrante de tau. Uma vez que a tau se torna hiperfosforilada, ela perde a capacidade de se ligar e estabilizar efetivamente os microtúbulos, acumulando-se então no citoplasma do neurônio afetado. A tau não ligada e hiperfosforilada parece formar os primeiros oligômeros e depois os agregados de ordem superior, cuja presença presumivelmente afeta negativamente a função do neurônio em que eles se formam, talvez através da interrupção do transporte axonal normal.

[0004] Em países desenvolvidos, os indivíduos diagnosticados com a doença de Alzheimer ou outras tauopatias de demência são comumente tratados com inibidores da colinesterase (por exemplo, Aricept®) ou memantinas (por exemplo, Namenda™). Esses fármacos, embora razoavelmente bem tolerados, têm eficácia muito modesta. Por exemplo, o Aricept® atrasa a piora dos sintomas por 6 a 12 meses em aproximadamente 50% dos indivíduos tratados. O restante do tratamento não é farmacológico e se concentra em tornar os pacientes mais capazes de gerenciar as tarefas do dia-a-dia, à medida que sua capacidade cognitiva diminui.

[0005] Vários estudos publicados (Asuni AA e outros, J. Neurosci. 22 de agosto de 2007; 27 (34): 9115-29., Theunis C e outros, PLoS One. 2013; 8 (8): e72301., Kontsekova E e outros, Alzheimers Res Ther. 1 de agosto de 2014; 6 (4): 44) demonstram que vacinas ativas contendo peptídeos tau podem induzir respostas imunes anti-tau em camundongos ou ratos; e podem reduzir o acúmulo de agregados patológicos de tau no cérebro de roedores; e podem reduzir a taxa de progressão do declínio cognitivo em modelos animais da doença de Alzheimer. Uma vacina ativa contra proteínas tau patológicas demonstrou ser imunogênica em pacientes humanos com doença de Alzheimer (Novak P e outros, Lancet Neurology 2017, 16: 123 a 134). O documento WO2010/115843 descreve o fosfopeptídeo antigênico simulando um fosfo-epítopo patológico importante da proteína tau e composições relacionadas para o uso terapêutico e diagnóstico no tratamento de tauopatias, incluindo a doença de Alzheimer. No entanto, atualmente ainda não existem vacinas eficazes aprovadas no mercado para prevenir o aparecimento de doenças mediadas por tau. Também não existem fármacos eficazes no mercado para interceptar ou retardar o curso da doença, uma vez iniciada. Existe, portanto, uma necessidade premente de identificar novas medidas preventivas (por exemplo, vacinas) que possam prevenir essas doenças.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] Em um aspecto geral, a invenção refere-se a um lipossoma, compreendendo:

[0007] a. um peptídeo tau, preferencialmente o peptídeo tau é um fosfopeptídeo tau; e

[0008] b. um epítopo de célula T auxiliar,

[0009] em que o peptídeo tau é apresentado na superfície do lipossoma.

[0010] Em uma modalidade, o lipossoma compreende ainda pelo menos um adjuvante compreendendo um ligante de receptor do tipo toll. De preferência, o lipossoma compreende ainda pelo menos um dentre um ligante de receptor do tipo toll 4 e um ligante de receptor do tipo toll

9.

[0011] Em uma modalidade preferencial, a invenção refere-se a um lipossoma, compreendendo:

[0012] a. um peptídeo tau, preferencialmente o peptídeo tau é um fosfopeptídeo tau;

[0013] b. um epítopo de célula T auxiliar; e

[0014] c. pelo menos um dentre

[0015] i. um ligante de receptor do tipo toll 9, preferencialmente um oligonucleotídeo CpG lipidado; e

[0016] ii. um ligante de receptor do tipo toll 4, preferencialmente um agonista do receptor do tipo toll 4,

[0017] em que o peptídeo tau é apresentado na superfície do lipossoma.

[0018] Em uma outra modalidade preferencial, a invenção refere-se a um lipossoma, compreendendo:

[0019] a. um fosfopeptídeo tau;

[0020] b. um epítopo de célula T auxiliar;

[0021] c. um oligonucleotídeo CpG lipidado; e

[0022] d. um adjuvante contendo um ligante de receptor do tipo toll 4; em que o fosfopeptídeo tau é apresentado na superfície do lipossoma.

[0023] Em outro aspecto geral, a invenção refere-se a um conjugado compreendendo um peptídeo tau, preferencialmente um fosfopeptídeo tau, e um veículo imunogênico conjugado ao mesmo, em que o peptídeo tau é conjugado ao veículo via um ligante. O ligante pode compreender um ou mais dentre polietileno glicol (PEG), sucinimidil 3- (bromoacetamido) propionato (SBAP) e m-maleimidobenzoil-N- hidroxisucinimida éster (MBS). Exemplos do veículo imunogênico útil para a invenção incluem, entre outros, hemocianina de lapa californiana (KLH), toxoide tetânico (TT), CRM197 e uma mistura de proteínas da membrana externa de N. meningitidis (OMP), ou um derivado dos mesmos.

[0024] Em uma modalidade preferencial, a invenção refere-se a um conjugado tendo a estrutura de fórmula (I): Peptídeo tau Carreador ou a estrutura da fórmula (II):

Peptídeo tau Carreador em que x é um número inteiro de 0 a 10, preferencialmente 2 a 6, mais preferencialmente 3; e n é um número inteiro de 2 a 11, de preferência 3 a 11.

[0025] Outros aspectos da invenção referem-se a uma composição farmacêutica que compreende um lipossoma ou um conjugado da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável, métodos de preparação da composição farmacêutica, e o uso da composição farmacêutica na indução de uma resposta imune contra tau, ou tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio neurodegenerativo em um indivíduo em necessidade de tratamento.

[0026] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método para induzir uma resposta imune em um indivíduo que sofre de um distúrbio neurodegenerativo, ou para tratar ou prevenir uma doença ou distúrbio neurodegenerativo em um indivíduo em necessidade de tratamento. O método compreende administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica compreendendo um lipossoma da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável, ou uma composição farmacêutica compreendendo um conjugado da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. De preferência, o método compreende administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica da invenção para iniciar a imunização, e uma composição farmacêutica da invenção para aumentar a imunização.

[0027] Outros aspectos, características e vantagens da presente invenção serão apreciados melhor com a leitura da seguinte descrição detalhada da invenção e reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0028] O sumário anterior, bem como a seguinte descrição detalhada das modalidades preferenciais do presente pedido, será compreendido melhor quando lido em conjunto com os desenhos em anexo. Dever-se-ia entender, no entanto, que o pedido não está limitado às modalidades precisas mostradas nos desenhos.

[0029] A Figura 1 ilustra novas vacinas de acordo com modalidades da invenção: um lipossoma de tau de acordo com uma modalidade da invenção (em cima) e um conjugado de tau de acordo com uma modalidade da invenção (em baixo).

[0030] A Figura 2 ilustra que uma vacina compreendendo um lipossoma de acordo com uma modalidade da invenção (lipossoma de segunda geração) que contém um epítopo de célula T auxiliar encapsulado (por exemplo, polipeptídeo de tétano (tet)) ativa células T auxiliares.

[0031] A Figura 3 ilustra que uma vacina compreendendo um conjugado de acordo com uma modalidade da invenção que contém proteína carreadora não auto ou imunogênica ativa as células T auxiliares.

[0032] A Figura 4 mostra que as vacinas de tau de acordo com modalidades da invenção induzem anticorpos de tau anti-fosforilados de alta titulação sustentados no macaco Rhesus: a média geométrica das titulações de desfecho por grupo, conforme medido pelo ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA), ao longo do tempo, é maior para uma vacina compreendendo um lipossoma (lipossoma Z) de acordo com uma modalidade da invenção ou uma vacina compreendendo um conjugado (Conjugado A) de acordo com uma modalidade da invenção, em comparação com uma vacina lipossômica de controle sem o epítopo de células T auxiliares.

[0033] A Figura 5 mostra que o soro de macacos Rhesus imunizados com um lipossoma (lipossoma Z) de acordo com uma modalidade da invenção se liga a estruturas de tau patológica nas seções do cérebro humano AD (painel esquerdo) em comparação com as seções saudáveis do cérebro humano (painel direito).

[0034] A Figura 6 mostra que o soro de macacos Rhesus imunizados com um conjugado (Conjugado A) de acordo com uma modalidade da invenção formulada em uma composição contendo CpG solúvel e hidróxido de alume se liga a estruturas de tau patológica em seções do cérebro AD humanas (fileira superior), em comparação com seções saudáveis do cérebro humano (linha inferior).

[0035] A Figura 7 mostra as titulações de anticorpos de tau anti- fosforilada em macacos Rhesus induzidos por vacinas lipossômicas de acordo com modalidades da invenção, Lipossomas X, Y e Z, cada um dos quais contém o epítopo de célula T encapsulado T50 e um ou mais adjuvantes; as titulações foram medidas por ELISA e apresentadas em titulações de desfecho ao longo do tempo em macacos individuais. Em particular:

[0036] A Figura 7A mostra as titulações de anticorpos de tau anti- fosforilada induzidos pelo lipossoma X com um ligante TLR4, MPLA (3D- (6-acil) PHAD®) isoladamente como o adjuvante.

[0037] A Figura 7B mostra as titulações de anticorpos de tau anti- fosforilada induzidos pelo lipossoma Y com um ligante TLR9 (oligonucleotídeo CpG lipidado) isoladamente como o adjuvante.

[0038] A Figura 7C mostra as titulações de anticorpos de tau anti- fosforilada induzidos pelo lipossoma Z com uma combinação de um ligante TLR4, MPLA (3D- (6-acil) PHAD®) e um ligante TLR9 (oligonucleotídeo CpG lipidado) como os adjuvantes, que também mostra que a combinação de dois adjuvantes induz menos variabilidade nas titulações de anticorpos entre macacos individuais.

[0039] A Figura 7D apresenta a média geométrica das titulações de anticorpos dos grupos de imunização mencionados acima e uma vacina lipossômica de controle com um ligante TLR4, MPLA, mas sem epítopo de célula T, e mostra que as vacinas de acordo com modalidades da invenção resultam em titulações de anticorpos mais altas de anticorpos de tau anti-fosforilada do que em uma vacina lipossômica de controle: as titulações foram medidas por ELISA e são apresentadas em média geométrica +/- 95% de intervalo de confiança das titulações de desfecho por grupo ao longo do tempo.

[0040] A Figura 8 mostra que a imunização usando uma vacina lipossômica (por exemplo, lipossoma X, Y ou Z) ou uma vacina conjugada (Conjugado A) de acordo com uma modalidade da invenção induz titulações de anticorpos IgG específicas para filamentos helicoidais pareados enriquecidos (ePHF) isolados do cérebro após a morte de pacientes com doença de Alzheimer: as titulações de anticorpos foram medidas pela tecnologia Meso Scale Discovery (MSD) e são apresentadas como valores para macacos individuais no dia 50 e a média geométrica +/- 95% CI após a primeira imunização.

[0041] A Figura 9 mostra que a imunização com uma vacina lipossômica de acordo com uma modalidade da invenção (Lipossoma Z) contendo T50 encapsulado e uma combinação de um ligante TLR4 (3D- (6-acil) PHAD®) e um ligante TLR9 (oligonucleotídeo CpG lipidado) como os adjuvantes induz anticorpos que se ligam principalmente ao N- terminal do peptídeo tau fosforilado da SEQ ID NO: 2 (Figura 9A), enquanto macacos imunizados com uma vacina conjugada de acordo com uma modalidade da invenção (Conjugado A) geram anticorpos IgG que se ligam principalmente à parte C-terminal do peptídeo, tanto para peptídeos fosforilados (à esquerda) quanto para peptídeos não fosforilados (à direita) (Figura 9B).

[0042] As Figuras 10 A e B mostram que a vacinação com uma vacina lipossômica de acordo com uma modalidade da invenção contendo epítopo de célula T encapsulado T50 e ligante TLR4 (3D- (6- acil) PHAD®) como adjuvante (lipossoma S) induz titulações de anticorpo significativamente mais altas do que a vacina lipossômica de controle (com um ligante TLR4, 3D- (6-acil) PHAD®, mas sem o epítopo de células T T50, lipossoma R) e também a vacina lipossômica de acordo com uma modalidade da invenção que contém epítopo de células T de superfície T57 (T50 dipalmitoilado) e ligante TLR4 (3D- (6- acil) PHAD®, lipossoma T) em camundongos: as titulações de anticorpos no dia 21 (Figura 10A) e 35 (Figura 10B) após a primeira imunização foram medidas por ELISA e apresentadas como valores individuais e a média geométrica por grupo ± 95% CI; (**: p < 0,01, ***: p < 0,001).

[0043] A Figura 11 mostra que o encapsulamento dos peptídeos de células T T48 ou T52 no lipossoma (lipossoma M ou N, respectivamente) induz uma resposta de células T específica para o peptídeo encapsulado em camundongos: a resposta de células T foi avaliada por IFN- (Figura 11A) e IL-4 (Figura 11B) ELISPOT.

[0044] A Figura 12 mostra que a vacina lipossômica contendo um epítopo de células T encapsulado (lipossoma L) e a vacina lipossômica contendo um epítopo de células T ancorado (lipossoma O) cada uma induziu titulações de anticorpos específicos para fosfopeptídeos tau mais altas do que a vacina lipossômica de controle sem epítopo de células T; cada um do lipossoma L, lipossoma O e lipossoma de controle contém ainda MPLA como adjuvante.

[0045] A Figura 13 mostra que o conjugado de Tau (KLH-TAUVAC- p7.1 ou KLH-TAUVAC-p22.1) induz células TfH e titulações Ab robustas contra o peptídeo tau em camundongos de ocorrência natural, em particular:

[0046] A Figura 13A ilustra que os grupos de camundongos Balb /

C fêmeas adultos (n = 14 por grupo) foram imunizados um total de quatro vezes com 100 ug de vacina conjugada KLH-tau adjuvantada (KLH-TAUVAC-p7.1 ou KLH-TAUVAC -p22.1), uma vacina de placebo ativa (KLH mais alúmen ou Ribi), ou um placebo inativo (PBS) de acordo com o esquema mostrado: quatro animais de cada grupo de imunização foram sacrificados sete dias após a imunização primária, e os gânglios linfáticos drenando o sítio da injeção foram coletados.

[0047] A Figura 13B mostra a porcentagem média geométrica de TfHs por grupo de imunização (n = 4 camundongos por grupo analisado individualmente) nos nós de drenagem: todos os grupos que receberam vacinas ativas ou placebos tinham TfHs mensuráveis; além disso, os animais que receberam a vacina KLH-TAUVAC-p7.1, KLH-TAUVAC- p22.1 ou placebo ativo KLH mais alúmen tiveram significativamente mais TfHs do que os animais que receberam placebo inativo (p = 0,0044 para KLH-TAUVAC-p7.1; p = 0,0482 para KLH-TAUVAC-p22.1; p = 0,0063 para KLH, usando um teste ANOVA seguido de um ajuste de Dunnett para múltiplas comparações).

[0048] As Figuras 13C-H mostram alteração nas titulações séricas a partir da linha de base (dia 0) em quatro momentos após a imunização (dias 14, 28, 56 e 84) para as médias de grupo (n = 5-10) com intervalo de confiança de 95%: o asterisco indica os momentos nos quais a resposta de anticorpos induzida por KLH-TAUVAC é significativamente maior que a induzida por placebos ativos (p  0,05, medido usando o teste ANOVA seguido pelo ajuste de Tukey para múltiplas comparações), mais especificamente:

[0049] A Figura 13C mostra titulações de ligação ao peptídeo tau fosforilado p7.1.

[0050] A Figura 13D mostra titulações de ligação ao peptídeo tau fosforilado p22.1.

[0051] A Figura 13E mostra titulações de ligação ao peptídeo tau não fosforilado 7.1.

[0052] A Figura 13F mostra titulações de ligação ao peptídeo tau não fosforilado 22.1.

[0053] As Figuras 13G e H mostram titulações de ligação à proteína carreadora KLH.

[0054] A Figura 14 mostra que soros de camundongos imunizados com conjugado Tau também ligavam estruturas de tau patológica de outras tauopatias: soros combinados (n = 6) de cada grupo de vacinação 84 dias após a imunização primária foram usados para colorir o tecido cerebral a partir de um caso de demência temporal frontal com mutação MAPT (MAPT P301S, córtex frontal), um caso com doença de Pick (córtex frontal), paralisia supranuclear progressiva (PSP, núcleo caudado) e tauopatia primária relacionada à idade (PART, hipocampo); os soros de animais que receberam as vacinas ativas destacaram as estruturas relacionadas à tau típicas de cada tauopatia, enquanto os soros de animais imunizados com um placebo ativo (KLH-alúmen ou KLH-Ribi) ou o inativo (PBS) não coloriram nenhum deles estruturas; como referência é mostrada uma imunocoloração com AT8 da área correspondente; barra de escala = 50 um.

[0055] A Figura 15 mostra que os anticorpos induzidos por vacina reduzem a tau agregada em um modelo de tauopatia acelerada, em particular:

[0056] A Figura 15A mostra que camundongos transgênicos P301L com três meses de idade (n = 15 por grupo) receberam uma injeção estereotáxica de ePHF humano pré-incubado com IgG purificada a partir de camundongos imunizados com KLH-TAUVAC-p7.1 mais RIBI ou com o placebo ativo KLH mais RIBI; dois meses após a injeção, todos os camundongos foram sacrificados e a quantidade de tau agregada nos camundongos foi determinada em frações totais e insolúveis em sarkosil.

[0057] As Figuras 15B e 15C mostram as frações totais (B) e frações insolúveis em sarkosil (C) coletadas a partir do hemisfério injetado de cada animal: os gráficos mostram a quantidade de tau medida por MSD; tanto na fração total quanto na fração insolúvel, os cérebros de camundongos que receberam ePHF pré-incubados com IgG de camundongos imunizados com KLH-TAUVAC-p7.1 apresentaram tau significativamente menos agregada do que os camundongos que receberam ePHF pré-incubados com anticorpos de controle. (p < 0,0001, usando um teste ANOVA seguido de ajuste de Holm-Bonferroni para múltiplas comparações.

[0058] A Figura 16 mostra que o conjugado de Tau (Conjugado B) de acordo com uma modalidade da invenção induz altas titulações de anticorpos contra Tau fosforilada e ePHF em primatas não humanos: macacos Rhesus foram imunizados com alúmen e KLH-TAUVAC-p7 com adjuvante CpG.1 (n = 6) ou com KLH (n = 2) nos dias 1, 29, 85 e 169; o sangue foi coletado a cada 14 dias, em especial:

[0059] A Figura 16A mostra que os soros de animais imunizados com KLH-TAUVAC-p7.1 foram testados quanto à reatividade no peptídeo imunizante p7.1 usando ELISA.

[0060] A Figura 16B mostra que os soros coletados de todos os animais 50 dias após a imunização primária apresentaram níveis mensuráveis de anticorpos contra o ePHF humano usando MSD, com 3 de 6 animais mostrando alta reatividade nesse antígeno.

[0061] A Figura 16C mostra que os soros coletados de animais 50 dias após a imunização primária foram aplicados em seções do cérebro humano de indivíduos saudáveis ou de pacientes com AD, soros pós- imunização de estruturas de tau patológica coradas pelo grupo KLH- TAUVAC-p7.1, ou seja, emaranhados neurofibrilares, fios de neurópilos e placas neuríticas no tecido cerebral de AD, enquanto os soros de camundongos imunizados com KLH não apresentaram reatividade, e nenhuma coloração foi observada no tecido de controle.

[0062] A Figura 16D mostra que, quando testados no ensaio de imunodepleção de tau, os animais que receberam KLH-TAUVAC-p7.1 tinham anticorpos capazes de se ligar e depletar a semente de tau (p = 0,03 no dia 50 usando um teste ANOVA seguido pelo ajuste de Dunnett para múltiplas comparações), enquanto a imunização com KLH não desencadeou tais anticorpos.

[0063] A Figura 16E mostra que os soros pré- e pós-imunização também foram testados no ensaio de neutralização como amostras individuais diluídas em série; as alterações a partir da linha de base (CFB) foram calculadas como a diferença entre as contagens de FRET para leituras no dia -14 antes da vacinação (linha de base) e após a vacinação nos dias 50, 106 e 190, respectivamente. A resposta em um dia pós-vacinação específico (diai) foi calculada da seguinte forma: Resposta = % FRET_diai - % FRET_linha de base; um modelo linear geral misto nas respostas mencionadas acima, com efeito aleatório animal, foi aplicado com grupos de vacinas, dias níveis séricos variáveis tratados como variáveis categóricas e todas as suas interações.

[0064] A Figura 17 mostra que os camundongos imunizados com uma vacina conjugada (Conjugado A) de acordo com uma modalidade da invenção e uma combinação com hidróxido de alúmen (alúmen) e adjuvante oligo CpG (CpG) resultam em respostas de anticorpos de titulação mais alta ao peptídeo de vacina: camundongos fêmea adulta C57BL / 6 (n = 5-6 por grupo) foram imunizados por via intramuscular com 2 ou 0,2 µg da vacina de Conjugado A, e a vacina conjugada foi administrada isoladamente, com alúmen, com CpG ou com alúmen e CpG combinados; todos os camundongos receberam uma imunização primária no dia 0 do estudo, seguida por uma única imunização de reforço no dia 28; as doses para o adjuvante alúmen foram de 500 ug por camundongo por injeção, e as doses para o adjuvante CpG foram de 20 ug / camundongo por injeção; os gráficos mostram os resultados da ligação ELISA usando soro coletado a partir de camundongos imunizados com o peptídeo da vacina T3.5 como antígeno de revestimento, com titulações médias específicas de desfecho de T3.5 por grupo plotadas, antes da imunização (dia 0) e em dois momentos após a imunização (dia 28 e 42), e com barras de erro representando o erro padrão; as tabelas mostram a análise estatística dos resultados, em que as titulações de anticorpos foram comparadas pelo teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, e as comparações de grupos aos pares foram avaliadas pelo teste de Wilcoxon Signed Rank como post-hoc ao teste de Kruskal Wallis; em particular:

[0065] A Figura 17A mostra que os camundongos foram imunizados com 2 ug da vacina de Conjugado A.

[0066] A Figura 17B mostra que os camundongos foram imunizados com 0,2 ug da vacina de Conjugado A.

[0067] A Figura 18 mostra que as vacinas de tau de acordo com modalidades da invenção com diferentes relações de peptídeo Tau para epítopo de célula T induzem anticorpos de tau anti-fosforilada de alta titulação sustentados em macacos Rhesus.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0068] Várias publicações, artigos e patentes são citadas ou descritas em segundo plano e em toda a especificação; cada uma dessas referências é aqui incorporada por referência em sua totalidade. A discussão de documentos, atos, materiais, dispositivos, artigos ou similares que foram incluídos na presente especificação é com o objetivo de fornecer contexto para a invenção. Essa discussão não é uma admissão de que algum ou todos esses assuntos façam parte da técnica anterior com relação a quaisquer invenções descritas ou reivindicadas.

[0069] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que é comumente entendido por um versado na técnica a que esta invenção se refere. Caso contrário, certos termos usados neste documento têm os significados estabelecidos na especificação.

[0070] Deve-se notar que, conforme usado aqui e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "um", "uma" e "o", "a" incluem referência plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[0071] A menos que indicado ao contrário, quaisquer valores numéricos, tal como uma concentração ou uma faixa de concentrações aqui descritas, devem ser entendidos como modificados em todas as ocorrências pelo termo "cerca de". Assim, um valor numérico normalmente inclui ± 10% do valor citado. Por exemplo, uma concentração de 1 mg / mL inclui 0,9 mg / mL a 1,1 mg / mL. Da mesma forma, uma faixa de concentração de 1% a 10% (peso / volume) inclui 0,9% (peso / volume) a 11% (peso / volume). Como usado aqui, o uso de uma faixa numérica inclui expressamente todas as subfaixas possíveis, todos os valores numéricos individuais dentro dessa faixa, incluindo números inteiros dentro dessas faixas e frações dos valores, a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[0072] A menos que indicado ao contrário, o termo "pelo menos" que precede uma série de elementos deve ser entendido como referente a cada elemento na série. Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar, usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção aqui descritas. Tais equivalentes pretendem ser abrangidos pela invenção.

[0073] Como aqui utilizado, os termos "compreende", "compreendendo", "inclui", "incluindo", "tem", "tendo", "contém" ou "contendo" ou qualquer outra variação dos mesmos, serão entendidos como implicando a inclusão de um número inteiro declarado ou grupo de números inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros e se destina a ser não exclusivo ou aberto. Por exemplo, uma composição, uma mistura, um processo, um método, um artigo, ou um aparelho que compreende uma lista de elementos não é necessariamente limitada apenas a esses elementos, mas pode incluir outros elementos não listados expressamente ou inerentes a tal composição, mistura, processo, método, artigo ou aparelho. Além disso, a menos que expressamente indicado ao contrário, "ou" refere-se a um ou inclusivo e não a um ou exclusivo. Por exemplo, uma condição A ou B é satisfeita por qualquer um dos seguintes itens: A é verdadeiro (ou presente) e B é falso (ou não está presente), A é falso (ou não está presente) e B é verdadeiro (ou presente), e ambos A e B são verdadeiros (ou presentes).

[0074] Também dever-se-ia entender que os termos "cerca de", "aproximadamente", "geralmente", "substancialmente" e termos semelhantes, usados aqui quando se referem a uma dimensão ou característica de um componente da invenção preferencial, indicam que a dimensão / característica descrita não é um limite ou parâmetro estrito e não exclui pequenas variações que sejam funcionalmente iguais ou semelhantes, como seria entendido por um versado na técnica. No mínimo, essas referências que incluem um parâmetro numérico incluiriam variações que, usando princípios matemáticos e industriais aceitos na técnica (por exemplo, arredondamento, medição ou outros erros sistemáticos, tolerâncias de fabricação, etc.), não variariam o dígito menos significativo.

[0075] Conforme usado neste documento, o termo "tau" ou "proteína tau", também conhecido como proteína tau associada a microtúbulos, MAPT, proteína de emaranhado neurofibrilar, filamento helicoidal pareado-tau, PHF-tau, MAPTL, MTBT1, refere-se a uma proteína abundante do sistema nervoso central e periférico tendo múltiplas isoformas. No sistema nervoso central humano (SNC), existem seis principais isoformas de tau com tamanho variando de 352 a 441 aminoácidos de comprimento devido a splicing alternativo (Hanger e outros, Trends Mol Med. 15: 112-9, 2009). Exemplos de tau incluem, mas não estão limitados a, isoformas de tau no SNC, tal como a isoforma tau com 441 aminoácidos mais longa (4R2N) que tem quatro repetições e duas inserções e a isoforma mais curta (fetal) com 352 aminoácidos de comprimento (3R0N) que tem três repetições e nenhuma inserção. Exemplos de tau também incluem a isoforma "big tau" expressa em nervos periféricos que contêm 300 resíduos adicionais (exon 4a). Friedhoff e outros, Biochimica et Biophysica Acta 1502 (2000) 122 a 132. Exemplos de tau incluem uma big tau humana que é uma proteína de 758 aminoácidos codificada por um transcrito de mRNA de 6762 nucleotídeos de comprimento (NM_016835.4), ou isoformas dos mesmos. A sequência de aminoácidos da big tau humana exemplificada está representada no número de acesso ao GenBank NP_058519.3. Como usado aqui, o termo "tau" inclui homólogos de tau de outras espécies que não humanas, tal como Macaca Fascicularis (macaco cinomolgoso) ou Pan trogloditas (chimpanzé). Como usado aqui, o termo "tau" inclui proteínas compreendendo mutações, por exemplo, mutações pontuais, fragmentos, inserções, deleções e variantes de splice de tau de ocorrência natural de comprimento total. O termo "tau" também abrange modificações pós-traducionais da sequência de aminoácidos tau. As modificações pós-traducionais incluem, mas não estão limitadas à fosforilação.

[0076] Como usado aqui, o termo "peptídeo" ou "polipeptídeo" refere-se a um polímero composto de resíduos de aminoácidos, variantes estruturais de ocorrência natural relacionadas e seus análogos sintéticos de ocorrência não natural, ligados através de ligações peptídicas. O termo refere-se a um peptídeo de qualquer tamanho, estrutura ou função. Tipicamente, um peptídeo tem pelo menos três aminoácidos. Um peptídeo pode ser de ocorrência natural, recombinante ou sintético, ou qualquer combinação dos mesmos. Os peptídeos sintéticos podem ser sintetizados, por exemplo, usando um sintetizador de polipeptídeo automatizado. Exemplos de peptídeos tau incluem qualquer peptídeo de proteína tau de cerca de 5 a cerca de 30 aminoácidos de comprimento, preferencialmente de cerca de 10 a cerca de 25 aminoácidos de comprimento, mais preferencialmente de cerca de 16 a cerca de 21 aminoácidos de comprimento. Na presente descrição, os peptídeos são listados do N-terminal ao C-terminal usando a abreviação padrão de aminoácidos de três letras ou uma letra, em que os fosforesíduos são indicados com "p". Exemplos de peptídeos tau úteis na invenção incluem, mas não estão limitados a, peptídeos tau compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-12, ou peptídeos tau com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica à sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-12.

[0077] Como usado aqui, o termo "fosfopeptídeo" ou "fosfo-epítopo" refere-se a um peptídeo que é fosforilado em um ou mais resíduos de aminoácidos. Exemplos de fosfopeptídeos tau incluem qualquer peptídeo tau compreendendo um ou mais resíduos de aminoácidos fosforilados. Exemplos de fosfopeptídeos tau úteis na invenção incluem, mas não estão limitados a, fosfopeptídeos tau compreendendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-3 ou 5- 12, ou fosfopeptídeos tau com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica à sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-3 ou 5-12.

[0078] Os peptídeos tau da presente invenção podem ser sintetizados por síntese peptídica em fase sólida ou por sistemas de expressão recombinante. Sintetizadores automáticos de peptídeos estão comercialmente disponíveis a partir de vários fornecedores, tal como Applied Biosystems (Foster City, Califórnia). Os sistemas de expressão recombinante podem incluir bactérias, tal como E. coli, levedura, células de insetos ou células de mamíferos. Os procedimentos para expressão recombinante são descritos por Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY 2ª ed., 1989).

[0079] Tau é uma "auto" proteína humana. Isto significa que, em princípio, todos os linfócitos portadores de um receptor específico para tau deveriam ter sido deletados durante o desenvolvimento (tolerância central) ou tornados não responsivos por um mecanismo de tolerância periférica. Esse problema provou ser um obstáculo significativo para o desenvolvimento de vacinas contra auto proteínas ou auto proteínas "alteradas" (por exemplo, antígenos tumorais).

[0080] A geração de anticorpos de alta qualidade contra um antígeno (auto ou infeccioso) requer a ação não apenas dos linfócitos B, que produzem o anticorpo, mas também dos linfócitos CD4+ T "auxiliares". As células T CD4+ fornecem sinais críticos de sobrevivência e maturação para os linfócitos B, e os animais deficientes de células T CD4+ são profundamente imunossuprimidos. As células T CD4+ também estão sujeitas a mecanismos de tolerância, e um obstáculo adicional para gerar fortes respostas de anti-auto anticorpos (por exemplo, anti- tau) é que as células T CD4+ reativas à tau também provavelmente são raras ou inexistentes no repertório humano / animal.

[0081] Embora não deseje estar vinculado à teoria, acredita-se, mas de forma alguma limitando o escopo da presente invenção, que esse problema seja contornado pelas composições de vacina da presente invenção.

[0082] Em uma modalidade, um lipossoma compreendendo um peptídeo tau (um exemplo é mostrado na Figura 1; parte superior) é produzido que também compreende um epítopo de célula T que é capaz de ligar a maioria ou todas as moléculas HLA DR (antígeno leucocitário humano - antígeno D relacionado). O epítopo de célula T é então capaz de ativar as células T CD4+ e fornece sinais essenciais de maturação e sobrevivência às células B específicas de tau (Figura 2). Em outra modalidade, um conjugado de um peptídeo tau com uma proteína carreadora é produzido (um exemplo é mostrado na Figura 1; parte inferior), que gera uma forte resposta das células T auxiliares (Figura 3). Nesta modalidade, é utilizado "reconhecimento não vinculado", no qual células T de veículo específico fornecem sinais de sobrevivência e maturação para células B autorreativas. Por conseguinte, as células B específicas de tau recebem sinais cruciais para desencadear a maturação por afinidade, a mudança de classe de imunoglobulina, e para estabelecer um agrupamento de memória de longo prazo. Os lipossomas de tau e conjugados de tau podem ser usados para gerar anticorpos de alta qualidade contra o antígeno de tau em esquemas de imunização homólogos ou heterólogos, com lipossoma ou conjugado usado no início e / ou no reforço. Lipossomas

[0083] Em um aspecto geral, a invenção refere-se a um lipossoma, compreendendo:

[0084] a. um peptídeo tau, preferencialmente o peptídeo tau é um fosfopeptídeo tau; e

[0085] b. um epítopo de célula T auxiliar,

[0086] em que o peptídeo tau é apresentado na superfície do lipossoma.

[0087] Os lipossomas de acordo com as modalidades da invenção também são aqui chamados de "lipossomas melhorados", "vacinas lipossômicas melhoradas" ou "vacinas lipossômicas de acordo com modalidades da invenção" ou "lipossomas de Tau" ou "vacinas lipossômicas otimizadas" de "Lipossomas de 2ª geração".

[0088] Como usado aqui, o termo "lipossoma" refere-se geralmente a uma vesícula lipídica que é feita de materiais com alto teor de lipídios, por exemplo, fosfolipídios, colesterol. Os lipídios dessas vesículas são geralmente organizados na forma de bicamadas lipídicas. As bicamadas lipídicas geralmente encapsulam um volume que é intercalado entre vários invólucros tipo cebola de bicamadas lipídicas, formando vesículas lipídicas multilamelares (MLVs) ou contidas dentro de uma cavidade central amorfa. As vesículas lipídicas com uma cavidade central amorfa são vesículas lipídicas unilamelares, isto é, aquelas com uma única bicamada periférica em torno da cavidade. As grandes vesículas unilamelares (LUVs) geralmente têm um diâmetro de 100 nm a poucos micrometros, tal como 100 a 200 nm ou mais, enquanto as pequenas vesículas lipídicas unilamelares (SUV) geralmente têm um diâmetro inferior a 100 nm, tal como 20 a 100 nm, tipicamente 15 a 30 mm.

[0089] De acordo com modalidades particulares, o lipossoma compreende um ou mais peptídeos tau. De acordo com modalidades particulares, os peptídeos tau no lipossoma podem ser iguais ou diferentes.

[0090] Qualquer peptídeo tau adequado conhecido pelos versados na técnica pode ser usado na invenção em vista da presente descrição. De acordo com modalidades particulares, um ou mais dos peptídeos tau compreendem a sequência de aminoácidos de uma das SEQ ID NOs: 1-12. Em outras modalidades, um ou mais dos peptídeos tau compreendem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica à sequência de aminoácidos de uma das SEQ ID NOs: 1-12, em que nenhum dos resíduos de aminoácidos é fosforilado ou um ou mais resíduos de aminoácidos são fosforilados.

[0091] De acordo com modalidades particulares, um ou mais dos peptídeos tau é um fosfopeptídeo tau. De acordo com modalidades particulares, os um ou mais fosfopeptídeos tau compreendem a sequência de aminoácidos de uma das SEQ ID NOs: 1-3 ou 5-12, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico à sequência de aminoácidos de uma das SEQ ID NOs: 1-3 ou 5-12, em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos indicados são fosforilados. De preferência, o fosfopeptídeo tau compreende a sequência de aminoácidos de uma das SEQ ID Nos: 1-3. O peptídeo tau pode ter o C-terminal amidado.

[0092] De acordo com as modalidades do pedido, um peptídeo tau é apresentado na superfície do lipossoma. Um peptídeo tau, preferencialmente um fosfopeptídeo tau, pode ser apresentado na superfície do lipossoma usando métodos conhecidos na técnica, tendo em vista a presente descrição. Ver, por exemplo, a descrição relevante nas patentes U.S. Nos. 8.647.631 e 9.687.447, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência. De acordo com modalidades particulares, os um ou mais peptídeos tau, incluindo fosfopeptídeos, compreendem ainda uma ou mais modificações, tais como palmitoilação ou modificação de dodecil para permitir que os peptídeos tau sejam apresentados na superfície do lipossoma. Resíduos de aminoácidos adicionais, tal como Lys, Cys, ou às vezes Ser ou Thr, podem ser adicionados ao peptídeo tau para facilitar a modificação. Foi relatado que a posição das âncoras lipídicas induz diferentes conformações da sequência peptídica (Hickman e outros, J. Biol. Chem. Vol. 286, NO. 16, pág. 13966 a 13976, 22 de abril de 2011). Embora não deseje estar limitado pela teoria, acredita-se que a adição de porções hidrofóbicas em ambos os terminais pode aumentar a conformação patológica em folha beta do peptídeo tau. Assim, os um ou mais peptídeos tau compreendem ainda porções hidrofóbicas em ambos os terminais. O peptídeo tau modificado pode ter o C-terminal amidado. De preferência, um peptídeo tau apresentado na superfície do lipossoma consiste na sequência de aminoácidos de uma das SEQ ID NO: 27 a SEQ ID NO:

38.

[0093] Como aqui utilizado, o termo "epítopo de célula T auxiliar" refere-se a um polipeptídeo compreendendo um epítopo que é capaz de reconhecimento por uma célula T auxiliar. Exemplos de epítopos de células T auxiliares incluem, entre outros, toxoide tetânico (por exemplo, epítopos P2 e P30, também denominados, respectivamente, T2 e T30), antígeno de superfície da hepatite B, toxina cólera B, toxoide, toxoide diftérico, proteína F do vírus do sarampo, proteína principal da membrana externa de Chlamydia trachomatis, Plasmodium falciparum circumsporozita T, antígeno falciparum CS, fosfato isomerase de Schistosoma mansoni triose, Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Pertusaria trachythallina, Escherichutin coli TraT, e hemaglutinina do vírus Influenza (HA).

[0094] Qualquer epítopo de célula T auxiliar adequado conhecido pelos versados na técnica pode ser usado na invenção em vista da presente descrição. De acordo com modalidades particulares, o epítopo de célula T auxiliar compreende pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NO: 23 a SEQ ID NO: 26. De preferência, o epítopo de célula T auxiliar compreende duas ou mais das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 a SEQ ID NO: 26 fundidas através de um ligante, como um ligante peptídico compreendendo um ou mais aminoácidos, por exemplo, Val (V), Ala (A), Arg (R), Gly (G), Ser (S), Lys (K). O comprimento do ligante pode variar, preferencialmente de 1 a 5 aminoácidos. De preferência, o epítopo de célula T auxiliar compreende três ou mais das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 a SEQ ID NO: 26 fundidas através de um ou mais ligantes selecionados a partir do grupo que consiste de VVR, GS, RR, RK. O epítopo de célula T auxiliar pode ter seu C-terminal amidado.

[0095] De acordo com modalidades do pedido, os epítopos de células T auxiliares podem ser incorporados na superfície lipossômica, por exemplo, ancorado por uma fração hidrofóbica ligada covalentemente, em que a dita fração hidrofóbica é um grupo alquila, um ácido graxo, um triglicerídeo, diglicerídeo, esteroide, esfingolipídio, glicolípido ou fosfolipídio, particularmente um grupo alquila ou um ácido graxo, particularmente com uma espinha dorsal de carbono de pelo menos 3 átomos de carbono, particularmente de pelo menos 4 átomos de carbono, particularmente de pelo menos 6 átomos de carbono, particularmente de pelo menos 8 átomos de carbono, particularmente de pelo menos 12 átomos de carbono, particularmente de pelo menos 16 átomos de carbono. Em uma modalidade da invenção, a fração hidrofóbica é o ácido palmítico. Alternativamente, os epítopos de células T auxiliares podem ser encapsulados nos lipossomas. De acordo com modalidades particulares, o epítopo de célula T auxiliar é encapsulado no lipossoma.

[0096] O epítopo de célula T auxiliar pode ser modificado para a sua localização desejada nos lipossomas usando métodos conhecidos na técnica em vista da presente descrição. De acordo com modalidades particulares, o epítopo de célula T auxiliar útil para a invenção compreende uma sequência de aminoácidos de uma das SEQ ID NO: 39 a SEQ ID NO: 44. De preferência, o epítopo de célula T auxiliar consiste de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NO: 13 a SEQ ID NO: 17.

[0097] De acordo com modalidades particulares, o lipossoma compreende um peptídeo tau e um epítopo de célula T auxiliar na relação em peso de 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1 ou 6:1.

[0098] Em uma modalidade, o lipossoma compreende ainda pelo menos um adjuvante compreendendo um ligante de receptor do tipo toll. Assim, em outro aspecto geral, a invenção se refere a um lipossoma, compreendendo:

[0099] a. um peptídeo tau, preferencialmente um fosfopeptídeo tau;

[0100] b. um epítopo de célula T auxiliar; e

[0101] c. pelo menos um dentre

[0102] i. um ligante de receptor do tipo toll 9, e

[0103] ii. um ligante de receptor do tipo toll 4.

[0104] Como usado aqui, o termo "receptor do tipo toll" ou "TLR" refere-se a uma classe de proteínas de receptor de reconhecimento de padrões (PRR) que desempenham um papel fundamental na resposta imune inata. Os TLRs reconhecem padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) a partir de patógenos microbianos, tal como bactérias, fungos, parasitas e vírus, que podem ser distinguidos das moléculas hospedeiras. Os TLRs são proteínas que atravessam a membrana que normalmente funcionam como dímeros e são expressas por células envolvidas na resposta imune inata, incluindo células dendríticas apresentadoras de antígenos e macrófagos fagocitários. Existem pelo menos dez membros da família de TLR humanos, TLR1 a TLR10, e pelo menos doze membros da família de TLR murinos, TLR1 a TLR9 e TLR11 a TLR13, e diferem nos tipos de antígenos que reconhecem. Por exemplo, o TLR4 reconhece lipopolissacarídeos (LPS), um componente presente em muitas bactérias Gram-negativas, bem como proteínas virais, polissacarídeos, e proteínas endógenas tal como lipoproteína de baixa densidade, beta-defensinas e proteínas de choque térmico; e TLR9 é um TLR com detecção de nucleotídeo que é ativado por dinucleotídeos de cadeia simples ou dupla de citosina- fosfato-guanina (CpG) não metilados ou de cadeia dupla, que são abundantes em genomas procarióticos, mas raros em genomas de vertebrados. A ativação de TLRs leva a uma série de eventos de sinalização, resultando na produção de interferons do tipo I (IFNs), citocinas inflamatórias e quimiocinas, e na indução de respostas imunes. Eventualmente, essa inflamação também ativa o sistema imunológico adaptativo, o que resulta na eliminação dos patógenos invasores e das células infectadas.

[0105] Como usado aqui, o termo "ligante" refere-se a uma molécula que forma um complexo com uma biomolécula (por exemplo, um receptor) para servir a um propósito biológico. De acordo com modalidades particulares, o ligante de receptor do tipo toll é um agonista do receptor do tipo toll.

[0106] Como aqui utilizado, o termo "agonista" refere-se a uma molécula que se liga a um ou mais TLRs e induz uma resposta mediada por receptor. Por exemplo, um agonista pode induzir, estimular, aumentar, ativar, facilitar, aprimorar ou regular a atividade do receptor. Tais atividades são chamadas de "atividades agonísticas". Por exemplo, um agonista de TLR4 ou TLR9 pode ativar ou aumentar a sinalização celular através do receptor ligado. Os agonistas incluem, mas não estão limitados a ácidos nucleicos, pequenas moléculas, proteínas, carboidratos, lipídios ou quaisquer outras moléculas que se ligam ou interagem com os receptores. Os agonistas podem similar a atividade de um ligante de receptor natural. Os agonistas podem ser homólogos desses ligantes de receptores naturais em relação à sequência, conformação, carga ou outras características, de modo que possam ser reconhecidos pelos receptores. Esse reconhecimento pode resultar em alterações fisiológicas e / ou bioquímicas dentro da célula, de modo que a célula reaja à presença do agonista da mesma maneira que se o ligante de receptor natural estivesse presente. De acordo com modalidades particulares, o agonista do receptor do tipo toll é pelo menos um de um agonista do receptor do tipo toll 4 e um agonista do receptor do tipo toll 9.

[0107] Como aqui utilizado, o termo "agonista do receptor de toll 4" refere-se a qualquer composto que atua como um agonista de TLR4. Qualquer agonista do receptor do tipo toll 4 adequado conhecido dos versados na técnica em vista da presente descrição pode ser utilizado na invenção. Exemplos de ligante de receptor do tipo toll 4 úteis para a invenção incluem agonista de TLR4, incluindo, mas não limitado a, monofosforil lipídio A (MPLA). Como usado aqui, o termo "monofosforil lipídio A" ou MPLA "refere-se a uma forma modificada de lipídio A, que é a parte biologicamente ativa da endotoxina de lipopolissacarídeo bacteriano Gram-negativo (LPS). O MPLA é menos tóxico que o LPS, mantendo a atividade imunoestimuladora. Como adjuvante de vacina, o MPLA estimula as respostas celulares e humorais ao antígeno de vacina. Exemplos de MPLA incluem, mas não estão limitados a, 3-O- desacil-4’-monofosforil lipídio A, monofosforil hexa-acil lipídio A, 3- desacil, monofosforil 3-desacil lipídio A, e variantes estruturalmente relacionadas dos mesmos. O MPLA útil para a invenção pode ser obtido usando métodos conhecidos na técnica ou a partir de uma fonte comercial, tal como 3D-(6-acil) PHAD®, PHAD®, PHAD®, PHAD®-504, 3D-PHAD® a partir de Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama, USA) ou MPLTM de várias fontes comerciais. De acordo com modalidades particulares, o agonista do receptor do tipo toll 4 é MPLA. Como usado aqui, o termo "agonista do receptor do tipo toll 9" refere-se a qualquer composto que atua como um agonista de TLR9. Qualquer agonista adequado do receptor do tipo toll 9 conhecido pelos versados na técnica em vista da presente descrição pode ser utilizado na invenção. Exemplos de ligante de receptor do tipo toll 9 útil para a invenção incluem agonista de TLR9 incluindo, mas não limitado a, oligonucleotídeos CpG.

[0108] Como aqui utilizado, o termo "oligonucleotídeo CpG", "oligodeoxinucleotídeo CpG" ou "CpG ODN" refere-se a um oligonucleotídeo compreendendo pelo menos um motivo CpG. Como usado aqui, "oligonucleotídeo", "oligodeoxinucleotídeo" ou "ODN" refere-se a um polinucleotídeo formado a partir de uma pluralidade de unidades de nucleotídeos ligadas. Tais oligonucleotídeos podem ser obtidos a partir de fontes de ácido nucleico existentes ou podem ser produzidos por métodos sintéticos. Como usado aqui, o termo "motivo CpG" refere-se a uma sequência de nucleotídeos que contém dinucleotídeos de citosina-fosfato-guanina não metilados (CpG) (isto é, uma citosina (C) seguida por uma guanina (G)) ligada por uma ligação fosfato ou uma cadeia principal de fosfodiéster ou outras ligações internucleotídicas.

[0109] De acordo com modalidades particulares, o oligonucleotídeo CpG é lipidado, isto é, conjugado (ligado covalentemente) a uma porção lipídica.

[0110] Como usado aqui, uma "porção lipídica" refere-se a uma porção contendo uma estrutura lipofílica. Porções lipídicas, tal como um grupo alquila, um ácido graxo, um triglicerídeo, diglicerídeo, esteroide, esfingolipídio, glicolipídio ou fosfolipídio, particularmente um esterol, tal como colesterol ou ácidos graxos, quando ligadas a moléculas altamente hidrofílicas, tal como ácidos nucleicos, pode melhorar substancialmente a ligação às proteínas plasmáticas e, consequentemente, a meia-vida de circulação das moléculas hidrofílicas. Além disso, foi demonstrado que a ligação a certas proteínas plasmáticas, tal como lipoproteínas, aumenta a captação em tecidos específicos que expressam os correspondentes receptores de lipoproteínas (por exemplo, receptor de LDL-receptor HDL-receptor ou o sequestrador de receptor SR-B1). Em particular, uma porção lipídica conjugada com os fosfopeptídeos e / ou oligonucleotídeo CpG permite ancorar os ditos peptídeos e / ou oligonucleotídeos na membrana de um lipossoma através de uma porção hidrofóbica.

[0111] De acordo com modalidades particulares, tendo em vista a presente descrição, o oligonucleotídeo CpG pode compreender quaisquer ligações internucleotídicas adequadas.

[0112] Como aqui utilizado, o termo "ligação internucleotídica" refere-se a uma ligação química para unir dois nucleotídeos através de seus açúcares, consistindo em um átomo de fósforo e um grupo carregado ou neutro entre nucleosídeos adjacentes. Exemplos de ligação internucleotídica incluem fosfodiéster (po), fosforotioato (ps), fosforoditioato (ps2), metilfosfonato (mp) e metilfosforotioato (rp). Fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato e metilfosforotioato são ligações internucleotídicas estabilizantes, enquanto o fosfodiéster é uma ligação internucleotídica de ocorrência natural. Os oligonucleotídeos fosforotioatos são tipicamente sintetizados como uma mistura racêmica aleatória de ligações fosforotioato Rp e Sp.

[0113] Qualquer oligonucleotídeo CpG adequado conhecido dos versados na técnica pode ser usado na invenção em vista da presente descrição. Exemplos de tais oligonucleotídeos CpG incluem, mas não estão limitados a, CpG2006 (também conhecido como CpG 7909), CpG 1018, CpG2395, CpG2216 ou CpG2336.

[0114] Um oligonucleotídeo CpG pode ser lipidado usando métodos conhecidos na técnica em vista da presente descrição. Em algumas modalidades, o terminal 3’ de um oligonucleotídeo CpG é covalentemente ligado a uma molécula de colesterol através de uma ligação fosfato, opcionalmente através de um ligante PEG. Outra porção lipofílica também pode ser ligada covalentemente ao terminal 3’ de um oligonucleotídeo CpG. Por exemplo, um oligonucleotídeo CpG pode ser covalentemente ligado a uma âncora lipídica do mesmo comprimento que os fosfolipídios do lipossoma: uma cadeia de ácido palmítico (usando Pal-OH ou similar, ativado para acoplamento) ou dois ácidos palmíticos (por exemplo, usando 1,2 -dipalmitoil-sn-glicero-3-

fosfoetanolamina-N- (sucinil) ou similar, ativado para acoplamento), opcionalmente através de um ligante PEG. Ver, por exemplo, a descrição relevante na Patente U.S. No. 7.741.297, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência. O comprimento de PEG pode variar, por exemplo, de 1 a 5 unidades de PEG.

[0115] Outros ligantes também podem ser usados para conectar covalentemente um oligonucleotídeo CpG a uma porção lipofílica (tal como uma molécula de colesterol), cujos exemplos incluem, mas não estão limitados a, um espaçador alquila com 3 a 12 carbonos. É necessário um ligante curto compatível com a química de oligonucleotídeos como aminodiol. Em algumas modalidades, nenhum ligante é usado para a ligação covalente. Ver, por exemplo, Ries e out- ros, "Convenient synthesis and application of versatile nucleic acid lipid membrne anchors in the assembly and fusion of liposomes, Org. Biomol. Chem., 2015, 13, 9673, cuja descrição relevante é aqui incorporada por referência.

[0116] De acordo com as modalidades particulares, o oligonucleotídeo CpG lipidado útil para a invenção compreende uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NO: 18 a SEQ ID NO: 22, em que a sequência nucleotídica compreende uma ou mais ligações internucleotídicas de fosforotioato, e a sequência nucleotídica está ligada covalentemente a pelo menos um colesterol por meio de um ligante. Quaisquer ligantes adequados podem ser utilizados para ligar covalentemente um oligonucleotídeo CpG a uma molécula de colesterol. De preferência, o ligante compreende polietileno glicol (PEG).

[0117] De acordo com modalidades particulares, o lipossoma compreende:

[0118] a. um fosfopeptídeo tau;

[0119] b. um epítopo de célula T auxiliar;

[0120] c. um oligonucleotídeo CpG lipidado; e

[0121] d. um ligante de receptor do tipo toll 4;

[0122] em que o fosfopeptídeo tau é apresentado na superfície do lipossoma e o epítopo de célula T auxiliar é encapsulado no lipossoma.

[0123] De acordo com modalidades particulares, o lipossoma compreende:

[0124] a. um peptídeo tau tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NO: 27 a SEQ ID NO: 38;

[0125] b. um epítopo de célula T auxiliar que tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste da SEQ ID NO: 39 a SEQ ID NO: 44, preferencialmente, o epítopo de célula T auxiliar que consiste de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID NO : 13 a SEQ ID NO: 17;

[0126] c. um oligonucleotídeo CpG lipidado com uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID NO: 18 a SEQ ID NO: 22, em que o oligonucleotídeo CpG compreende uma ou mais ligações internucleotídicas fosforotioato, e o oligonucleotídeo CpG está covalentemente ligado a pelo menos um colesterol via um ligante; e

[0127] d. monofosforil lipídio A (MPLA).

[0128] De acordo com modalidades particulares, o lipossoma compreende ainda um ou mais lipídios selecionados a partir do grupo que consiste de 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocololina (DMPC), 1,2- dimiristoil-sn-glicero-3 -fosforil-3’-rac-glicerol (DMPG), e colesterol.

[0129] De acordo com modalidades particulares, o lipossoma compreende ainda um tampão. Qualquer tampão adequado conhecido dos versados na técnica, tendo em vista a presente descrição, pode ser usado na invenção. Em uma modalidade, o lipossoma compreende uma solução salina tamponada com fosfato. De acordo com modalidades particulares, o tampão compreende histidina e sacarose.

[0130] De acordo com modalidades particulares, o lipossoma compreende DMPC, DMPG, colesterol, fosfopeptídeo tau e epítopo de célula T auxiliar na relação molar de 9:1:7:0,07:0,04.

[0131] Os lipossomas da invenção podem ser produzidos usando métodos conhecidos na técnica, tendo em vista a presente descrição.

[0132] Um lipossoma exemplificativo do presente pedido é ilustrado na Figura 1. Mais especificamente, um fosfopeptídeo tau tetrapalmitoilado (peptídeo pTau T3, SEQ ID NO: 28) é apresentado na superfície do lipossoma por meio de dois ácidos palmíticos em cada terminal do peptídeo tau. Um ligante TLR-9 compreendendo CpG lipidado (Adjuvante CpG7909-Chol) é incorporado na membrana lipossômica através do colesterol covalentemente ligado. Um ligante TLR-4 (Adjuvante 3D- (6-acil) PHAD®) também é incorporado na membrana. Um epítopo de célula T auxiliar (ligante PAN-DR T50) é encapsulado. Conjugados

[0133] Em um aspecto geral, a invenção refere-se a um conjugado compreendendo um peptídeo tau e um veículo imunogênico conjugado a ele.

[0134] De acordo com aspectos particulares, o conjugado tem a seguinte estrutura: Peptídeo tau

VEÍCULO ,

[0135] ou a estrutura da fórmula (II):

Peptídeo tau Carreador em que

[0136] x é um número inteiro de 0 a 10; e

[0137] n é um número inteiro de 2 a 15, de preferência 3 a 11.

[0138] De acordo com modalidades particulares, x é um número inteiro de 1 a 10, 2 a 9, 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5, 2 a 4 ou 2 a 3. De acordo com modalidades particulares, x é 3.

[0139] De acordo com modalidades particulares, n é 2 a 15, 3 a 11, 3 a 9, 3 a 8 ou 3 a 7.

[0140] De acordo com modalidades particulares, o conjugado compreende um ou mais peptídeos tau. De acordo com modalidades particulares, os peptídeos tau do conjugado podem ser iguais ou diferentes.

[0141] De acordo com modalidades particulares, em vista da presente descrição, quaisquer peptídeos tau adequados podem ser utilizados na invenção. De acordo com modalidades particulares, um ou mais dos peptídeos tau compreendem a sequência de aminoácidos de uma das SEQ ID NOs: 1-12 ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica à sequência de aminoácidos de uma das SEQ ID NOs: 1-12, em que nenhum, um ou mais dos resíduos de aminoácidos são fosforilados.

[0142] De acordo com modalidades particulares, um ou mais dos peptídeos tau é um fosfopeptídeo tau. De acordo com modalidades particulares, os um ou mais fosfopeptídeos tau compreendem a sequência de aminoácidos de uma das SEQ ID NOs: 1-3 ou 5-12, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%

ou 95% idêntica à sequência de aminoácidos de uma das SEQ ID NOs: 1-3 ou 5-12, em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos indicados são fosforilados.

[0143] De acordo com modalidades particulares, o fosfopeptídeo tau consiste na sequência de aminoácidos de uma das SEQ ID NOs: 1-

3.

[0144] Como usado aqui, o termo "veículo imunogênico" refere-se a uma substância imunogênica que pode ser acoplada a um peptídeo tau. Uma porção imunogênica acoplada a um peptídeo tau pode induzir uma resposta imune e provocar a produção de anticorpos que podem se ligar especificamente ao peptídeo tau. As porções imunogênicas são porções operativas que incluem proteínas, polipeptídeos, glicoproteínas, polissacarídeos complexos, partículas, ácidos nucleicos, polinucleotídeos e similares que são reconhecidos como estranhos e, assim, provocam uma resposta imunológica a partir do hospedeiro. Qualquer veículo imunogênico adequado conhecido dos versados na técnica em vista da presente descrição pode ser usado na invenção. De acordo com modalidades particulares, o veículo imunogênico é hemocianina de lapa californiana (KLH), toxoide tetânico, CRM197 (uma forma não tóxica de toxina de difteria), uma mistura de proteínas da membrana externa de N. meningitidis (OMP) ou um derivado dos mesmos. De acordo com modalidades particulares, o veículo imunogênico é KLH ou CRM197.

[0145] De acordo com modalidades particulares, o peptídeo tau é conjugado ao veículo através de um ligante. Como usado aqui, o termo "ligante" refere-se a uma porção química que une um veículo imunogênico a um peptídeo tau. Qualquer ligante adequado conhecido dos versados na técnica em vista da presente descrição pode ser usado na invenção. Os ligantes podem ser, por exemplo, uma ligação covalente única, uma alquila substituída ou não substituída, uma porção heteroalquila substituída ou não substituída, um ligante de polietileno glicol (PEG), um ligante de peptídeo, um ligante à base de açúcar, ou um ligante clivável, tal como uma ligação dissulfeto ou um sítio de clivagem de protease, ou um aminoácido, ou uma combinação dos mesmos. Exemplos do ligante podem compreender um ou mais de polietileno glicol (PEG), sucinimidil 3- (bromoacetamido) propionato (SBAP), m-maleimidobenzoil-N-hidroxisucinimida éster (MBS) ou um ou mais aminoácidos tal como Cys, Lys ou às vezes Ser ou Thr, ou uma combinação dos mesmos.

[0146] De acordo com modalidades particulares, o ligante compreende (C2H4O)x-cisteína-acetamidopropionamida ou m- maleimidobenzoil-N-hidroxisucinimida éster - cisteína - (C2H4O)x, em que x é um número inteiro de 0 a 10, tal como 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.

[0147] De acordo com modalidades particulares, o veículo está covalentemente ligado ao N terminal do peptídeo tau, através de um ligante.

[0148] De acordo com outras modalidades particulares, o veículo está covalentemente ligado ao C-terminal do peptídeo tau, através de um ligante.

[0149] De acordo com modalidades particulares, o conjugado tem a estrutura de:

[0150] em que n é um número inteiro de 2 a 15, preferencialmente 3 a 11, mais preferencialmente 3 a 7.

[0151] Os conjugados da invenção podem ser feitos por métodos conhecidos na técnica, tendo em vista a presente descrição. Por exemplo, o conjugado acima pode ser formado pela reação sucinimidil- 3- (bromoacetamido) propionato (SBAP):

[0152] com um grupo amino de CRM197 para formar uma ligação amida. Esse precursor CRM197 pode ser subsequentemente reagido com o peptídeo tau (por exemplo, o peptídeo tau fosforilado de SEQ ID NO: 2) conjugado no seu N terminal ou no seu C terminal a um ligante PEG-cisteína com um grupo tiol nucleofílico livre para formar o conjugado de fosfopeptídeo tau.

[0153] Um conjugado exemplificativo de acordo com uma modalidade do presente pedido é ilustrado na Figura 1. Mais especificamente, múltiplos fosfopeptídeos tau (pTau Peptídeo T3.76) estão covalentemente ligados a uma proteína carreadora CRM197.

[0154] Composições Farmacêuticas

[0155] Em um aspecto geral, a invenção refere-se a composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de lipossoma ou conjugado da invenção, juntamente com um excipiente e / ou veículo farmaceuticamente aceitável. Excipientes e / ou veículos farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica (ver Remington's Pharmaceutical Science (15ª ed.), Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1980). A formulação preferencial da composição farmacêutica depende do modo pretendido de administração e aplicação terapêutica. As composições podem incluir veículos ou diluentes não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis, que são definidos como veículos comumente usados para formular composições farmacêuticas para administração a animais ou humanos. O diluente é selecionado para não afetar a atividade biológica da combinação. Exemplos de tais diluentes são água destilada, solução salina fisiológica tamponada com fosfato, soluções de Ringer, solução de dextrose, e solução de Hank. Além disso, a composição ou formulação farmacêutica também pode incluir outros veículos, adjuvantes ou estabilizadores não tóxicos, não terapêuticos, não imunogênicos e similares. Entende-se que as características do veículo, excipiente ou diluente dependerão da via de administração para uma aplicação particular.

[0156] A composição farmacêutica pode conter uma mistura do mesmo peptídeo imunogênico tau. Alternativamente, a composição farmacêutica pode conter uma mistura de diferentes peptídeos imunogênicos tau da presente invenção.

[0157] Outro problema associado a vacinas contra doenças neuronais é que é provável que sejam necessárias titulações de anticorpos excepcionalmente altas para garantir a eficácia. Isso ocorre porque o antígeno alvo para a vacina está localizado no cérebro. O cérebro é separado da circulação por uma estrutura celular especializada chamada de barreira hematoencefálica (BBB). A BBB restringe a passagem de substâncias da circulação para o cérebro. Isso evita a entrada de toxinas, micróbios, etc. no sistema nervoso central. A BBB também tem o efeito potencialmente menos desejável de impedir a entrada eficiente de mediadores imunes (tal como anticorpos) no fluido intersticial e cefalorraquidiano que envolve o cérebro.

[0158] Aproximadamente 0,1% dos anticorpos que estão presentes na circulação sistêmica atravessam a BBB e entram no cérebro. Isso significa que as titulações sistêmicas induzidas por uma vacina direcionada a um antígeno do SNC devem ser pelo menos 1000 vezes maiores do que a titulação mínima eficaz para ser eficaz no cérebro.

[0159] De acordo com modalidades particulares, as composições farmacêuticas da presente invenção compreendem ainda um ou mais adjuvantes adequados. Assim, os peptídeos tau da presente invenção,

presentes no lipossoma ou no conjugado, podem ser administrados em combinação com um adjuvante adequado para alcançar a resposta imune desejada no indivíduo.

Adjuvantes adequados podem ser administrados antes, depois ou concomitantemente com a administração de lipossoma ou conjugado da presente invenção.

Os adjuvantes preferenciais aumentam a resposta intrínseca a um imunogene sem causar alterações conformacionais no imunogene que afetam a forma qualitativa da resposta.

Exemplos de adjuvantes são os sais de alumínio (alúmen), tal como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio e sulfato de alumínio.

Tais adjuvantes podem ser utilizados com ou sem outros agentes imunoestimulantes específicos, tal como Classe MPLA (3 De-O-acilado monofosforil lipídio A (MPLTM), monofosforil hexa-acil Lipídio A 3-desacil-sintético (3D- (6-acil) PHAD®), PHAD™, PHAD®-504, 3D-PHAD®) lipídio A), aminoácidos poliméricos ou monoméricos, tal como ácido poliglutâmico ou polilisina.

Esses adjuvantes podem ser usados com ou sem outros agentes imunoestimulantes específicos, tal como peptídeos de muramil (por exemplo, N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil- normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L- alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (1’-2’ dipalmitoil-sn-glicero-3- hidroxifosforiloxi) -etilamina (MTP-PE), N- acetilglucsaminil-N- acetilmuramil-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxi propilamida (DTP-DPP) Theramide™) ou outros componentes da parede celular bacteriana.

As emulsões de óleo em água incluem MF59 (ver WO 90/14837), contendo esqualeno a 5%, Tween 80 a 0,5% e Span 85 a 0,5% (opcionalmente contendo várias quantidades de MTP-PE) formuladas em partículas submicrônicas usando um microfluidizador; SAF, contendo esqualeno a 10%, Tween 80 a 0,4%, polímero plurônico-bloqueado L121 a 5%, e thr- MDP, ou microfluidizado em uma emulsão submicrônica ou agitado em vórtice para gerar uma emulsão de tamanho de partícula maior; e o sistema adjuvante Ribi™ (RAS) (Ribi ImmunoChem, Hamilton, Mont.) Tween 80 a 0,2% e um ou mais componentes da parede celular bacteriana selecionados a partir do grupo que consiste de monofosforil lipídio A (MPLTM), trealose dimicolato (TDM), e esqueleto da parede celular (CWS), preferencialmente MPLTM + CWS (Detox™). Outros adjuvantes incluem o adjuvante completo de Freund (CFA) e citocinas, tal como interleucinas (IL-1, IL-2 e IL-12), fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF), e fator de necrose tumoral (TNF).

[0160] Como usado aqui, o termo "em combinação", no contexto da administração de duas ou mais terapias a um indivíduo, refere-se ao uso de mais de uma terapia. O uso do termo "em combinação" não restringe a ordem na qual as terapias são administradas a um indivíduo. Por exemplo, uma primeira terapia (por exemplo, uma composição descrita aqui) pode ser administrada antes de (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas antes), concomitantemente com ou após (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas após) a administração de uma segunda terapia a um indivíduo.

[0161] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. As relações ótimas de cada componente nas composições podem ser determinadas por técnicas bem conhecidas dos versados na técnica, tendo em vista a presente descrição. Métodos de Uso

[0162] Outro aspecto geral da invenção refere-se a métodos para induzir uma resposta imune contra a proteína tau em um indivíduo que sofre de uma doença, distúrbio ou condição neurodegenerativa, compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica de acordo com uma modalidade da invenção. De acordo com aspectos particulares, a resposta imune é induzida contra a proteína tau fosforilada, preferencialmente ePHF.

[0163] Outro aspecto geral da invenção refere-se a métodos para tratar ou prevenir uma doença, distúrbio ou condição neurodegenerativa, compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica de acordo com uma modalidade da invenção.

[0164] Como usado aqui, os termos "induzir" e "estimular" e variações dos mesmos se referem a qualquer aumento mensurável na atividade celular. A indução de uma resposta imune pode incluir, por exemplo, ativação, proliferação ou maturação de uma população de células imunes, aumentando a produção de uma citocina e / ou outro indicador de função imune aumentada. Em certas modalidades, a indução de uma resposta imune pode incluir aumentar a proliferação de células B, produzir anticorpos específicos para antígenos, aumentar a proliferação de células T específicas para antígenos, melhorar a apresentação de antígenos de células dendríticas e / ou aumentar a expressão de certas citocinas, quimiocinas e marcadores coestimuladores.

[0165] A capacidade de induzir ou estimular uma resposta imune anti-tau após a administração em um organismo animal ou humano pode ser avaliada in vitro ou in vivo usando uma variedade de ensaios que são padrão na técnica. Para uma descrição geral das técnicas disponíveis para avaliar o início e a ativação de uma resposta imune, ver, por exemplo, Coligan e outros (1992 e 1994, Current Protocols in Immunology; ed. J. Wiley & Sons Inc, National Institute of Health). A medição da imunidade celular pode ser realizada por métodos facilmente conhecidos na técnica, por exemplo, pela medição de perfis de citocinas secretadas por células efetoras ativadas, incluindo aquelas derivadas de células T CD4+ e CD8+ (por exemplo, quantificação de células produtoras de IL-4 ou IFN gama por ELISPOT), pela determinação do estado de ativação das células imunológicas efetoras (por exemplo, ensaios de proliferação de células T por uma captação clássica de [3H] timidina), testando linfócitos T específicos para antígenos em um indivíduo sensibilizado (por exemplo, lise específica de peptídeos em um ensaio de citotoxicidade, etc.).

[0166] A capacidade de estimular uma resposta celular e / ou humoral pode ser determinada testando uma amostra biológica (por exemplo, sangue, plasma, soro, PBMCs, urina, saliva, fezes, CSF ou fluido linfático) a partir do indivíduo para o presença de anticorpos dirigidos ao(s) peptídeo(s) imunogênico(s) tau administrado(s) na composição farmacêutica (ver, por exemplo, Harlow, 1989, Antibodies, Cold Spring Harbor Press). Por exemplo, as titulações de anticorpos produzidos em resposta à administração de uma composição que fornece um imunogene podem ser medidos por ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA), dot blots, géis SDS-PAGE, ELISPOT ou ensaio de fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP).

[0167] Como usado aqui, o termo "indivíduo" refere-se a um animal. De acordo com modalidades particulares, o indivíduo é um mamífero incluindo um não primata (por exemplo, um camelo, burro, zebra, vaca, porco, cavalo, cabra, ovelha, gato, cachorro, rato, coelho, porquinho da Índia ou camundongo) ou um primata (por exemplo, um macaco, chimpanzé ou humano). De acordo com modalidades particulares, o indivíduo é um humano.

[0168] Como usado aqui, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um ingrediente ativo ou componente que provoca a resposta biológica ou medicinal desejada em um indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser determinada empiricamente e de maneira rotineira, em relação ao objetivo declarado. Por exemplo, ensaios in vitro podem opcionalmente ser empregados para ajudar a identificar faixas de dosagem ideais. A seleção de uma dose eficaz específica pode ser determinada (por exemplo, por meio de ensaios clínicos) por aqueles versados na técnica, com base na consideração de vários fatores, incluindo a doença a ser tratada ou prevenida, os sintomas envolvidos, a massa corporal do paciente, o estado imunológico do paciente e outros fatores conhecidos pelo versado na técnica. A dose exata a ser empregada na formulação também dependerá da via de administração e da gravidade da doença, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do médico e as circunstâncias de cada paciente. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas dose-resposta derivadas de sistemas de teste in vitro ou em modelo animal.

[0169] Conforme usado neste documento, os termos "tratar", "tratando" e "tratamento" são todos destinados a se referir a uma melhoria ou reversão de pelo menos um parâmetro físico mensurável relacionado a uma doença, distúrbio ou condição neurodegenerativa, que não é necessariamente discernível no indivíduo, mas que pode ser discernível no indivíduo. Os termos "tratar", "tratando" e "tratamento" também podem se referir a causar regressão, impedir a progressão ou, pelo menos, retardar a progressão da doença, distúrbio ou condição. Em uma modalidade específica, "tratar", "tratando" e "tratamento" se referem a um alívio, prevenção do desenvolvimento ou início, ou redução na duração de um ou mais sintomas associados à doença, distúrbio ou condição neurodegenerativa. Em uma modalidade específica, "tratar", "tratando" e "tratamento" se referem à prevenção da recorrência da doença, distúrbio ou condição. Em uma modalidade específica, "tratar", "tratando" e "tratamento" se referem a um aumento na sobrevida de um indivíduo com a doença, distúrbio ou condição. Em uma modalidade específica, "tratar", "tratando" e "tratamento" se referem à eliminação da doença, distúrbio ou condição no indivíduo.

[0170] De acordo com modalidades particulares, uma quantidade terapeuticamente eficaz se refere à quantidade de terapia que é suficiente para atingir um, dois, três, quatro ou mais dos seguintes efeitos: (i) reduzir ou melhorar a gravidade da doença, distúrbio ou condição a ser tratada ou um sintoma associado a ela; (ii) reduzir a duração da doença, distúrbio ou condição a ser tratada ou um sintoma associado a ela; (iii) impedir a progressão da doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma associado a ela; (iv) causar regressão da doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma associado a ela; (v) impedir o desenvolvimento ou início da doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma associado a ela; (vi) impedir a recorrência da doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma associado a ela; (vii) reduzir a hospitalização de um indivíduo tendo a doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma associado a ela; (viii) reduzir o tempo de hospitalização de um indivíduo com a doença, distúrbio ou condição a ser tratada ou um sintoma associado a ela; (ix) aumentar a sobrevida de um indivíduo com a doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma associado a ela; (x) inibir ou reduzir a doença, distúrbio ou condição a ser tratada, ou um sintoma associado a ela em um indivíduo; e / ou (xi) aumentar ou melhorar o efeito profilático ou terapêutico de outra terapia.

[0171] Como aqui utilizado, uma "doença, distúrbio ou condição neurodegenerativa" inclui qualquer doença, distúrbio ou condição neurodegenerativa conhecida pelos versados na técnica, tendo em vista a presente descrição. Exemplos de doenças, distúrbios ou condições neurodegenerativas incluem doenças ou distúrbios neurodegenerativos causados ou associados à formação de lesões neurofibrilares, tal como doenças, distúrbios ou condições associadas à tau, conhecidas como tauopatias. De acordo com modalidades particulares, a doença, distúrbio ou condição neurodegenerativa inclui qualquer uma das doenças ou distúrbios que mostram a coexistência de patologias de tau e amiloide, incluindo, mas não limitadas a, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Creutzfeldt-Jacob, Demência pugilística, Síndrome de Down, doença de Gerstmann-Sträussler-Scheinker, miosite do corpo de inclusão, angiopatia amiloide cerebral por proteína de prião, lesão cerebral traumática, esclerose lateral amiotrófica, parkinsonismo-demência do complexo de Guam, doença de neurônio motor não guamaniana com emaranhados neurofibrilares, demência de grãos argirofílicos, degeneração corticobasal, esclerose lateral amiotrófica - demência por corpos de Lewy, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, demência frontotemporal, de preferência demência frontotemporal com parkinsonismo associado ao cromossomo 17 (FTDP-17), demência lobar frontotemporal, doença de Hallevorden-Spatz, atrofia de múltiplos sistemas, doença de Niemann- Pick tipo C, Doença de Pick, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, panencefalite esclerosante subaguda, demência apenas por emaranhado, parkinsonismo pós-encefalítico, distrofia miotônica, encefalopatia traumática crônica (CTE), tauopatia relacionada à idade primária (PART) ou demência de corpos de Lewy (LBD). De acordo com modalidades particulares, a doença, distúrbio ou condição neurodegenerativa é a doença de Alzheimer ou outra tauopatia.

[0172] A presente invenção também fornece um método para promover a depuração de agregados de tau do cérebro de um indivíduo, o dito método compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica de acordo com uma modalidade da invenção, sob condições eficazes para promover a depuração de agregados de tau a partir do cérebro do indivíduo. De acordo com modalidades particulares, os agregados de tau são emaranhados neurofibrilares ou seus precursores de tau patológica.

[0173] A presente invenção também fornece um método para retardar a progressão de um fenótipo comportamental relacionado à patologia de tau em um indivíduo, o dito método compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica de acordo com uma modalidade da invenção, sob condições eficazes para retardar a progressão do fenótipo comportamental relacionado à patologia de tau no indivíduo.

[0174] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a administração de um peptídeo tau, via administração de uma composição farmacêutica de acordo com uma modalidade da invenção, induz uma resposta imune ativa no indivíduo ao peptídeo tau e à forma patológica de tau, facilitando assim a depuração de agregados de tau relacionados, retardando a progressão do comportamento relacionado à patologia de tau e / ou tratando a tauopatia subjacente. De acordo com este aspecto da presente invenção, uma resposta imune envolve o desenvolvimento de uma resposta humoral benéfica (mediada por anticorpos) direcionada contra o peptídeo tau e uma resposta celular (mediada por células T específicas do antígeno ou seus produtos de secreção) direcionada contra o epítopo de células T ou o veículo imunogênico.

[0175] Como usado aqui, um fenótipo comportamental relacionado à patologia de tau inclui, sem limitação, deficiências cognitivas, alteração e desinibição precoce de personalidade, apatia, abulia, mutismo, apraxia, perseveração, movimentos / comportamentos estereotipados, hiperoralidade, desorganização, incapacidade de planejar ou organizar tarefas sequenciais, egoísmo / insensibilidade, traços antissociais, falta de empatia, interrupção, fala agramática com erros parafásicos frequentes, mas compreensão relativamente preservada, compreensão deficiente e déficits na busca de palavras, instabilidade da marcha lentamente progressiva, retropulsões, congelamento, quedas frequentes, rigidez axial não responsiva a levodopa, paralisia supranuclear do olhar, espasmos em onda quadrada, sacadas verticais lentas, paralisia pseudobulbar, apraxia do membro, distonia, perda sensorial cortical, e tremor.

[0176] Ao executar os métodos da presente invenção, é preferencial selecionar um indivíduo tendo ou em risco de ter a doença de Alzheimer ou outra tauopatia, um indivíduo com agregados de tau no cérebro, ou um indivíduo exibindo um fenótipo comportamental relacionado ao emaranhado antes da administração dos peptídeos ou anticorpos imunogênicos da presente invenção. Os indivíduos passíveis de tratamento incluem indivíduos em risco de doença, mas que não apresentam sintomas, bem como pacientes atualmente apresentando sintomas. No caso da doença de Alzheimer, praticamente qualquer pessoa corre o risco de sofrer da doença de Alzheimer. Portanto, os presentes métodos podem ser administrados profilaticamente à população em geral, sem a necessidade de qualquer avaliação do risco do paciente em questão. Os presentes métodos são especialmente úteis para indivíduos que têm um risco genético conhecido de doença de Alzheimer. Esses indivíduos incluem aqueles que têm parentes que sofreram a doença e aqueles cujo risco é determinado pela análise de marcadores genéticos ou bioquímicos.

[0177] Em pacientes assintomáticos, o tratamento pode começar em qualquer idade (por exemplo, 10, 20, 30 anos). Normalmente, no entanto, não é necessário iniciar o tratamento até que um paciente atinja 40, 50, 60 ou 70 anos de idade. O tratamento normalmente envolve várias dosagens ao longo de um período de tempo. O tratamento pode ser monitorado através da análise de anticorpos ou respostas de células

T ou células B ativadas ao agente terapêutico ao longo do tempo. Se a resposta diminuir, uma dose de reforço é indicada.

[0178] Em aplicações profiláticas, as composições farmacêuticas contendo os peptídeos tau são administradas a um paciente susceptível a, ou de outra forma em risco de ter doença de Alzheimer ou outra tauopatia, em uma quantidade suficiente para eliminar ou reduzir o risco, diminuir a gravidade ou atrasar a início da doença, incluindo sintomas bioquímicos, histológicos e / ou comportamentais da doença, suas complicações e fenótipos patológicos intermediários apresentados durante o desenvolvimento da doença. Em aplicações terapêuticas, as composições farmacêuticas contendo um peptídeo tau são administradas a um paciente com suspeita ou que já sofre dessa doença em uma quantidade suficiente para curar ou pelo menos interromper parcialmente os sintomas da doença (bioquímicos, histológicos e / ou comportamentais), incluindo suas complicações e fenótipos patológicos intermediários no desenvolvimento da doença.

[0179] As doses eficazes de uma composição farmacêutica da invenção, para a prevenção e / ou tratamento da doença, distúrbio ou condição neurodegenerativa variam de acordo com muitos fatores diferentes, incluindo modo de administração, sítio alvo, estado fisiológico do paciente, outros medicamentos administrados, e se o tratamento é profilático ou terapêutico. A quantidade de peptídeos depende se o adjuvante também é administrado, sendo necessárias doses mais altas na ausência de adjuvante. O momento das injeções pode variar significativamente de uma vez ao dia, uma vez ao ano e uma vez por década. Um regime típico consiste de uma imunização seguida de injeções de reforço em intervalos de tempo, tal como intervalos de 6 semanas. Outro regime consiste de uma imunização seguida de injeções de reforço 1, 2, 6, 9 e 12 meses depois. Outro regime implica uma injeção a cada dois meses por toda a vida.

Alternativamente, as injeções de reforço podem ser irregulares, conforme indicado pelo monitoramento da resposta imune.

[0180] É facilmente apreciado pelos versados na técnica que o regime para as administrações de início e de reforço pode ser ajustado com base nas respostas imunes medidas após as administrações. Por exemplo, as composições de reforço são geralmente administradas semanas ou meses após a administração da composição de início, por exemplo, cerca de 2 a 3 semanas ou 4 semanas, ou 8 semanas, ou 16 semanas, ou 20 semanas, ou 24 semanas, ou 26 semanas, ou 28 semanas, ou 30 semanas, ou 32 semanas, ou 36 semanas ou um a dois anos após a administração da composição de início.

[0181] Os peptídeos podem ser administrados por meios parentéricos, tópicos, intravenosos, orais, subcutâneos, intra-arteriais, intracranianos, intraperitoneais, intradérmicos, intranasais ou intramusculares para tratamento profilático e / ou terapêutico. A via de administração mais típica de um agente imunogênico é a injeção subcutânea ou intramuscular. Este último tipo de injeção é realizado mais tipicamente nos músculos do braço ou da perna.

[0182] De acordo com aspectos particulares, uma ou mais imunizações de reforço podem ser administradas. Os antígenos nas respectivas composições de início e reforço, embora sejam utilizadas muitas composições de reforço, não precisam ser idênticos, mas devem compartilhar determinantes antigênicos ou ser substancialmente semelhantes entre si.

[0183] A composição pode, se desejado, ser apresentada em um kit, embalagem ou dispensador, que pode conter uma ou mais formas de dosagem unitárias contendo o ingrediente ativo. O kit, por exemplo, pode compreender folha metálica ou plástica, tal como um blister. O kit, embalagem ou dispensador pode ser acompanhado de instruções para administração.

[0184] De acordo com modalidades particulares, o kit compreende pelo menos uma composição farmacêutica compreendendo um lipossoma de acordo com uma modalidade da invenção e uma composição farmacêutica compreendendo um conjugado de acordo com uma modalidade da invenção. Modalidades

[0185] A invenção também fornece as seguintes modalidades não limitantes.

[0186] A Modalidade 1 é um lipossoma, que compreende:

[0187] a. um peptídeo tau; e

[0188] b. um epítopo de célula T auxiliar;

[0189] em que o peptídeo tau é apresentado na superfície do lipossoma.

[0190] A Modalidade 2 é o lipossoma da Modalidade 1, em que o peptídeo tau é um fosfopeptídeo tau.

[0191] A Modalidade 3 é o lipossoma da Modalidade 1 ou 2, compreendendo ainda um ligante de receptor do tipo toll.

[0192] A Modalidade 4 é o lipossoma da Modalidade 3, em que o ligante de receptor do tipo toll compreende pelo menos um dentre um ligante de receptor do tipo toll 4 e um ligante de receptor do tipo toll 9.

[0193] A Modalidade 5 é o lipossoma da Modalidade 3 ou 4, em que o ligante de receptor do tipo toll é um ligante de receptor do tipo toll 4.

[0194] A Modalidade 6 é o lipossoma da Modalidade 5, em que o ligante de receptor do tipo toll 4 compreende monofosforil lipídio A (MPLA).

[0195] A Modalidade 7 é o lipossoma da Modalidade 3 ou 4, em que o ligante de receptor do tipo toll é um ligante de receptor do tipo toll 9.

[0196] A Modalidade 8 é o lipossoma da Modalidade 7, em que o ligante de receptor do tipo toll 9 compreende um oligonucleotídeo CpG lipidado.

[0197] A Modalidade 9 é o lipossoma da Modalidade 1, compreendendo:

[0198] a. um peptídeo tau;

[0199] b. um epítopo de célula T auxiliar; e

[0200] c. pelo menos um dentre

[0201] i. um ligante de receptor do tipo toll 9, e

[0202] ii. um ligante de receptor do tipo toll 4.

[0203] A Modalidade 10 é o lipossoma da Modalidade 9, em que o peptídeo tau é um fosfopeptídeo tau.

[0204] A Modalidade 11 é o lipossoma da Modalidade 9 ou 10, em que o ligante de receptor do tipo toll 9 é um oligonucleotídeo CpG lipidado.

[0205] A Modalidade 12 é o lipossoma de qualquer uma das Modalidades 9 a 11, em que o lipossoma compreende o ligante de receptor do tipo toll 4 e o ligante de receptor do tipo toll 9.

[0206] A Modalidade 13 é o lipossoma da Modalidade 12, em que o ligante de receptor do tipo toll 4 compreende monofosforil lipídio A (MPLA).

[0207] A Modalidade 14 é um lipossoma, que compreende:

[0208] a. um fosfopeptídeo tau;

[0209] b. um epítopo de célula T auxiliar;

[0210] c. um oligonucleotídeo CpG lipidado; e

[0211] d. um adjuvante contendo um ligante de receptor do tipo toll 4;

[0212] em que o fosfopeptídeo tau é apresentado na superfície do lipossoma.

[0213] A Modalidade 15 é o lipossoma da Modalidade 14, em que o ligante de receptor do tipo toll 4 compreende monofosforil lipídio A (MPLA).

[0214] A Modalidade 16 é o lipossoma de qualquer uma das

Modalidades 1 a 15, em que o epítopo de célula T auxiliar é encapsulado no lipossoma.

[0215] A Modalidade 16a é o lipossoma de qualquer uma das Modalidades 1 a 15, em que o epítopo de célula T auxiliar é incorporado na membrana do lipossoma.

[0216] A Modalidade 16b é o lipossoma de qualquer uma das Modalidades 1 a 15, em que o epítopo de célula T auxiliar é apresentado na superfície do lipossoma.

[0217] A Modalidade 17 é uma composição de lipossoma, compreendendo:

[0218] a. um fosfopeptídeo tau;

[0219] b. um epítopo de célula T auxiliar;

[0220] c. um oligonucleotídeo CpG lipidado; e

[0221] d. um monofosforil lipídio A (MPLA);

[0222] em que o fosfopeptídeo tau é apresentado na superfície do lipossoma, e

[0223] o epítopo de célula T é encapsulado no lipossoma.

[0224] A Modalidade 17a é o lipossoma da Modalidade 17, em que o MPLA é 3-O-desacil-4’-monofosforil-lipídio A, de preferência MPLTM.

[0225] A Modalidade 17b é o lipossoma da Modalidade 17, em que o MPLA é monofosforil hexa-acil lipídio A, 3-desacil, preferencialmente 3D- (6-acil) PHAD®.

[0226] A Modalidade 17c é o lipossoma da Modalidade 17, em que o MPLA é monofosforil-3-desacil-lipídio A, de preferência 3D-PHAD®.

[0227] A Modalidade 18 é o lipossoma de qualquer uma das Modalidades 1 a 17c, compreendendo ainda um ou mais lipídios selecionados a partir do grupo que consiste de 1,2-dimiristoil-sn-glicero- 3-fosfocololina (DMPC), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosforil-3’-rac- glicerol (DMPG), e colesterol.

[0228] A Modalidade 19 é o lipossoma de qualquer uma das

Modalidades 1 a 18, em que o peptídeo tau tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 12, ou pelo menos 85%, 90% ou 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 12.

[0229] A Modalidade 19-1 é o lipossoma da Modalidade 19, em que o peptídeo tau é um fosfopeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 1-3 e 5-12.

[0230] A Modalidade 19-2 é o lipossoma da Modalidade 19-1, em que o fosfopeptídeo tau compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[0231] A Modalidade 19-3 é o lipossoma da Modalidade 19-1, em que o fosfopeptídeo tau compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[0232] A Modalidade 19-4 é o lipossoma da Modalidade 19-1, em que o fosfopeptídeo tau compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

[0233] A Modalidade 19a é o lipossoma de qualquer uma das Modalidades 19, 19-1, 19-2, 19-3 e 19-4, em que a sequência de aminoácidos compreende ainda uma ou mais modificações para permitir que o peptídeo tau seja apresentado na superfície do lipossoma.

[0234] A Modalidade 19b é o lipossoma da Modalidade 19a, em que as uma ou mais modificações compreendem pelo menos uma de palmitoilação e modificação dodecil.

[0235] A Modalidade 19c é o lipossoma da Modalidade 19a ou 19b, em que o peptídeo tau é modificado em seu N terminal por uma ou mais modificações.

[0236] A Modalidade 19d é o lipossoma de qualquer uma das

Modalidades 19a a 19c, em que o peptídeo tau é modificado em seu C terminal por uma ou mais modificações.

[0237] A Modalidade 19e é o lipossoma da Modalidade 19d, em que o peptídeo tau é palmitoilado em seu N terminal e C terminal.

[0238] A Modalidade 19f é o lipossoma de qualquer uma das Modalidades 19a-19e, em que o peptídeo tau compreende ainda um ou mais aminoácidos adicionais para facilitar uma ou mais modificações.

[0239] A Modalidade 19g é o lipossoma da Modalidade 19f, em que um ou mais aminoácidos adicionais são selecionados a partir do grupo que consiste de Lys, Cys, Ser e Thr.

[0240] A Modalidade 19h é o lipossoma de qualquer uma das Modalidades 19 a 19g, em que o peptídeo tau é amidado no seu C terminal.

[0241] A Modalidade 19i é o lipossoma de qualquer uma das Modalidades 19 a 19h, em que o peptídeo tau consiste de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NO: 27 a SEQ ID NO: 38.

[0242] A Modalidade 19j é o lipossoma de qualquer uma das Modalidades 19-19i, em que o peptídeo tau consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.

[0243] A Modalidade 19k é o lipossoma de qualquer uma das Modalidades 19-19i, em que o peptídeo tau consiste da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.

[0244] A Modalidade 19l é o lipossoma de qualquer uma das Modalidades 19-19i, em que o peptídeo tau consiste da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.

[0245] A Modalidade 20 é o lipossoma de qualquer uma das Modalidades 1 a 19l, em que o epítopo de célula T auxiliar compreende pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de: SEQ ID NO: 23 a SEQ ID NO: 26.

[0246] A Modalidade 20a é o lipossoma da Modalidade 20, em que o epítopo de célula T auxiliar compreende pelo menos duas sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste de: SEQ ID NO: 23 a SEQ ID NO: 26.

[0247] A Modalidade 20b é o lipossoma da Modalidade 20, em que o epítopo de célula T auxiliar compreende pelo menos três sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste de: SEQ ID NO: 23 a SEQ ID NO: 26.

[0248] A Modalidade 20c é o lipossoma da Modalidade 20, em que o epítopo de célula T auxiliar compreende as quatro sequências de aminoácidos de: SEQ ID NO: 23 a SEQ ID NO: 26.

[0249] A Modalidade 20d é o lipossoma de qualquer uma das Modalidades 20a a 20c, em que as duas ou mais sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste das SEQ ID NO: 23 a SEQ ID NO: 26 são ligadas covalentemente por um ligante.

[0250] A Modalidade 20e é o lipossoma da Modalidade 20d, em que o ligante compreende um ou mais aminoácidos selecionados a partir do grupo que consiste de Val (V), Ala (A), Arg (R), Gly (G), Ser (S), Lys (K).

[0251] A Modalidade 20f é o lipossoma da Modalidade 20e, em que o ligante compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de VVR, GS, RR e RK.

[0252] A Modalidade 20g é o lipossoma de qualquer uma das Modalidades 20 a 20f, em que o epítopo de célula T auxiliar é amidado no seu C terminal.

[0253] A Modalidade 20h é o lipossoma de qualquer uma das Modalidades 20 a 20g, em que o epítopo de célula T auxiliar é modificado para inserção na membrana do lipossoma, apresentação na superfície do lipossoma ou encapsulamento no lipossoma, dependendo da localização destinada do epítopo de célula T auxiliar.

[0254] A Modalidade 20i é o lipossoma de qualquer uma das

Modalidades 20 a 20h, em que o epítopo de célula T auxiliar consiste de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NO: 13 a SEQ ID NO: 17.

[0255] A Modalidade 20j é o lipossoma de qualquer uma das Modalidades 1 a 20i, em que o lipossoma compreende o peptídeo tau e o epítopo de célula T auxiliar na relação em peso de 6:1.

[0256] A Modalidade 20k é o lipossoma de qualquer uma das Modalidades 1 a 20i, em que o lipossoma compreende o peptídeo tau e o epítopo de célula T auxiliar na relação em peso de 5:1.

[0257] A Modalidade 20l é o lipossoma de qualquer uma das Modalidades 1 a 20i, em que o lipossoma compreende o peptídeo tau e o epítopo de célula T auxiliar na relação em peso de 4:1.

[0258] A Modalidade 20m é o lipossoma de qualquer uma das Modalidades 1 a 20i, em que o lipossoma compreende o peptídeo tau e o epítopo de célula T auxiliar na relação em peso de 3:1.

[0259] A Modalidade 20n é o lipossoma de qualquer uma das Modalidades 1 a 20i, em que o lipossoma compreende o peptídeo tau e o epítopo de célula T auxiliar na relação em peso de 2:1.

[0260] A Modalidade 20o é o lipossoma de qualquer uma das Modalidades 1 a 20i, em que o lipossoma compreende o peptídeo tau e o epítopo de célula T auxiliar na relação em peso de 1:1.

[0261] A Modalidade 21 é o lipossoma de qualquer uma das Modalidades 1 a 20o, em que o oligonucleotídeo CpG lipidado compreende a sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NO: 18 a SEQ ID NO: 22.

[0262] A Modalidade 21a é o lipossoma da Modalidade 21, em que o oligonucleotídeo CpG tem uma ou mais ligações internucleotídicas fosforotioato.

[0263] A Modalidade 21b é o lipossoma da Modalidade 21a, em que o oligonucleotídeo CpG tem todas as ligações internucleotídicas fosforotioato.

[0264] A Modalidade 21c é o lipossoma de qualquer uma das Modalidades 21 a 21b, em que o oligonucleotídeo CpG lipidado compreende o oligonucleotídeo CpG covalentemente ligado a pelo menos um grupo lipofílico por meio de um ligante.

[0265] A Modalidade 21d é o lipossoma da Modalidade 21c, em que o ligante compreende (C2H4O)n, em que n é um número inteiro de 0 a

10.

[0266] A Modalidade 21e é o lipossoma da Modalidade 21c, em que o ligante compreende um espaçador alquila com 3 a 12 carbonos.

[0267] A Modalidade 21f é o lipossoma de qualquer uma das Modalidades 21 a 21e, em que pelo menos um grupo lipofílico é colesterol.

[0268] A Modalidade 21g é o lipossoma de qualquer uma das Modalidades 21 a 21f, em que o oligonucleotídeo CpG lipidado compreende a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 19 ligada covalentemente a uma molécula de colesterol através de um ligante compreendendo (C2H4O)n, em que n é um número inteiro de 3 a 5.

[0269] A Modalidade 22 é um lipossoma, que compreende:

[0270] a. um peptídeo tau tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NO: 27 a SEQ ID NO: 38;

[0271] b. um epítopo de célula T auxiliar que tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID NO: 39 a SEQ ID NO: 44, preferencialmente, o epítopo de célula T auxiliar que consiste de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID NO : 13 a SEQ ID NO: 17;

[0272] c. um oligonucleotídeo CpG lipidado com uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID NO:

18 a SEQ ID NO: 22, em que o oligonucleotídeo CpG compreende uma ou mais ligações internucleotídicas fosforotioato, e o oligonucleotídeo CpG está covalentemente ligado a pelo menos um colesterol via um ligante; e

[0273] d. monofosforil lipídio A (MPLA).

[0274] A Modalidade 22a é um lipossoma da Modalidade 22, compreendendo:

[0275] a. um fosfopeptídeo tau consistindo da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29;

[0276] b. um epítopo de célula T auxiliar que consiste da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13

[0277] c. um oligonucleotídeo CpG lipidado consistindo da sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 19 ligada covalentemente a um colesterol através de um ligante compreendendo (C2H4O)n, em que n é um número inteiro de 3 a 7; e

[0278] d. monofosforil lipídio A (MPLA).

[0279] A Modalidade 22b é o lipossoma da Modalidade 22 ou 22a, em que o MPLA é 3-O-desacil-4’-monofosforil-lipídio A, de preferência MPLTM.

[0280] A Modalidade 22c é o lipossoma da Modalidade 22 ou 22a, em que o MPLA é preferencialmente 3D- (6-acil) PHAD®.

[0281] A Modalidade 22d é o lipossoma da Modalidade 22 ou 22a, em que o MPLA é, preferencialmente 3D-PHAD®.

[0282] A Modalidade 23 é o lipossoma de qualquer uma das Modalidades 22 a 22d, em que o epítopo de célula T auxiliar é encapsulado no lipossoma.

[0283] A Modalidade 24 é uma composição farmacêutica compreendendo o lipossoma de qualquer uma das Modalidades 1 a 23 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0284] A Modalidade 25 é um conjugado que compreende um fosfopeptídeo tau e um veículo imunogênico conjugado a ele via um ligante, tendo a seguinte estrutura: Peptídeo tau Carreador

[0285] em que x é um número inteiro de 0 a 10; e

[0286] n é um número inteiro de 2 a 15.

[0287] A Modalidade 25a é um conjugado que compreende um fosfopeptídeo tau e um veículo imunogênico conjugado a ele via um ligante, tendo a estrutura da fórmula (II): Peptídeo tau Carreador

[0288] em que

[0289] x é um número inteiro de 0 a 10; e

[0290] n é um número inteiro de 2 a 15.

[0291] A Modalidade 26 é o conjugado da Modalidade 25 ou 25a, em que x é um número inteiro de 2 a 6.

[0292] A Modalidade 27 é o conjugado da Modalidade 25 ou 25a, em que x é 3.

[0293] A Modalidade 28 é o conjugado de qualquer uma das Modalidades 25 a 25a, em que n é 3 a 7.

[0294] A Modalidade 29 é o conjugado de qualquer uma das Modalidades 25 a 28, em que o veículo é um veículo imunogênico selecionado a partir do grupo que consiste de hemocianina de lapa californiana (KLH), toxoide tetânico, CRM197 e uma mistura de proteínas da membrana externa de N. meningitidis (OMP) ou um derivado dos mesmos.

[0295] A Modalidade 30 é o conjugado de qualquer uma das Modalidades 25 a 29, em que o fosfopeptídeo tau consiste da sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 12.

[0296] A Modalidade 30a é o conjugado da Modalidade 30, em que o fosfopeptídeo tau consiste da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.

[0297] A Modalidade 31 é o conjugado de qualquer uma das Modalidades 25 a 30, em que o veículo é CRM197.

[0298] A Modalidade 32 é o conjugado da Modalidade 25, com a estrutura de:

[0299] em que n é 3-7.

[0300] A Modalidade 32a é o conjugado da Modalidade 25, em que KLH– [m-maleimidobenzoil-N-hidroxisucinimida éster - cisteína - (C2H4O)x - peptídeo Tau]n Peptídeo Tau

[0301] em que

[0302] o peptídeo Tau consiste de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3;

[0303] x é um número inteiro de 0 a 10; e

[0304] n é um número inteiro de 2 a 15.

[0305] A Modalidade 33 é uma composição farmacêutica que compreende o conjugado de qualquer uma das Modalidades 25 a 32a e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0306] A Modalidade 33a é a composição farmacêutica da reivindicação 33, compreendendo ainda um adjuvante.

[0307] A Modalidade 33b é a composição farmacêutica da reivindicação 33a, em que o adjuvante compreende pelo menos um dentre um ligante TLR-4 e um ligante TLR-9.

[0308] A Modalidade 34 é um método para induzir uma resposta imune em um indivíduo que sofre de um distúrbio neurodegenerativo, compreendendo administrar ao indivíduo pelo menos uma das composições farmacêuticas das Modalidades 24 e 33 a 33b.

[0309] A Modalidade 35 é o método da Modalidade 34, compreendendo administrar ao indivíduo pelo menos uma das composições farmacêuticas das Modalidades 24 e 33 a 33b para iniciar a imunização, e administrar ao indivíduo pelo menos uma das composições farmacêuticas das Modalidades 24 e 33 a 33b para reforçar a imunização.

[0310] A Modalidade 36 é um método para o tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio neurodegenerativo em um indivíduo em necessidade de tratamento, compreendendo administrar ao indivíduo pelo menos uma das composições farmacêuticas da Modalidade 24 ou 33.

[0311] A Modalidade 37 é o método da Modalidade 36, compreendendo administrar ao indivíduo pelo menos uma das composições farmacêuticas das Modalidades 24 e 33 a 33b para iniciar a imunização, e administrar ao indivíduo pelo menos uma das composições farmacêuticas das Modalidades 24 e 33 a 33b para reforçar a imunização.

[0312] A Modalidade 38 é o método de qualquer uma das Modalidades 34 a 37, em que a doença ou distúrbio neurodegenerativo é causado por ou associado à formação de lesões neurofibrilares.

[0313] A Modalidade 39 é o método de qualquer uma das Modalidades 34 a 38, em que a doença ou distúrbio neurodegenerativo é a Doença de Alzheimer, Doença de Parkinson, Doença de Creutzfeldt- Jacob, demência pugilística, Síndrome de Down, Doença de Gerstmann-Sträussler-Scheinker, miosite do corpo de inclusão, angiopatia amiloide cerebral por proteína de prião, lesão cerebral traumática, esclerose lateral amiotrófica, complexo de parkinsonismo- demência do complexo de Guam, doença neurológica não guamaniana com emaranhados neurofibrilares, demência de grãos argirofílicos, degeneração corticobasal, demência de corpos de Lewy - esclerose lateral amiotrófica, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, demência frontotemporal, preferencialmente demência frontotemporal com parkinsonismo associado ao cromossomo 17 (FTDP-17), demência lobar frontotemporal, doença de Hallevorden- Spatz, atrofia de múltiplos sistemas, doença de Niemann-Pick tipo C, doença de Pick, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, panencefalite esclerosante subaguda, demência apenas por emaranhado, Parkinsonismo pós-encefalítico, distrofia miotônica, encefalopatia traumática crônica (CTE), tauopatia relacionada à idade primária (PART), ou demência de corpos de Lewy (LBD).

[0314] A Modalidade 40 é o método de qualquer uma das Modalidades 34 a 39, em que a doença ou distúrbio neurodegenerativo é a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, síndrome de Down, paralisia supranuclear progressiva (PSP), demência frontotemporal e parkinsonismo associado ao cromossomo 17 (FTDP- 17), doença de Pick, degeneração corticobasal, demência de corpos de Lewy - esclerose lateral amiotrófica, dispasia miotônica, encefalopatia traumática crônica (CTE), angiopatia cerebral, tauopatia relacionada à idade primária (PART), ou demência de corpos de Lewy (LBD).

[0315] A Modalidade 40b é o método de qualquer uma das Modalidades 34 a 39, em que a doença ou distúrbio neurodegenerativo é a doença de Alzheimer, paralisia supranuclear progressiva (PSP), demência frontotemporal e parkinsonismo associado ao cromossomo 17 (FTDP-17) ou doença de Pick e PART (tauopatia relacionada à idade primária).

[0316] A Modalidade 40c é o método de qualquer uma das Modalidades 34 a 39, em que a doença ou distúrbio neurodegenerativo é a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, síndrome de Down, demência frontotemporal e parkinsonismo associado ao cromossomo 17 (FTDP-17), degeneração corticobasal, demência de corpos de Lewy - esclerose lateral amiotrófica, dispasia miotônica, encefalopatia traumática crônica (CTE), angiopatia cerebral, tauopatia relacionada à idade primária (PART) ou demência de corpos de Lewy (LBD).

[0317] A Modalidade 41 é um kit que compreende pelo menos uma da composição farmacêutica da Modalidade 24 e a composição farmacêutica da Modalidade 33, 33a ou 33b.

[0318] A Modalidade 42 é um epítopo de célula T auxiliar que consiste de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NO: 13 a SEQ ID NO: 17.

[0319] A Modalidade 43 é uma composição farmacêutica compreendendo o epítopo de célula T auxiliar da Modalidade 42.

[0320] A Modalidade 44 é um método para melhorar uma resposta imune a um antígeno em um indivíduo em necessidade de tratamento, compreendendo administrar ao indivíduo o antígeno juntamente com a composição farmacêutica da Modalidade 43.

EXEMPLOS

[0321] Os exemplos a seguir da invenção são para ilustrar ainda mais a natureza da invenção. Dever-se-ia entender que os exemplos a seguir não limitam a invenção e que o escopo da invenção deve ser determinado pelas reivindicações em anexo.

[0322] Os métodos experimentais usados nos exemplos a seguir, a menos que indicado de outra forma, são todos métodos comuns. Os reagentes utilizados nas seguintes modalidades, a menos que indicado de outra forma, são todos adquiridos a partir de fornecedores comuns de reagentes. Exemplo 1: Preparação de Vacinas Lipossômicas Preparação da vacina lipossômica de controle (técnica de injeção de etanol)

[0323] A vacina lipossômica de controle foi produzida pela técnica de injeção de etanol (EtOH) seguida por extrusão. Primeiro, DMPC (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Alemanha), DMPG (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Alemanha), colesterol (Dishman, Holanda) e MPLA (Avanti Polar Lipids, AL, USA) foram solubilizados em uma relação molar de 9:1:7:0,05 em uma mistura 20:1 (em volume) de EtOH e ter- butanol (t-BuOH) a 60° C. A solução de lipídio / etanol foi diluída em solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4 a 60° C para manter a concentração de EtOH a 10% e resultando na formação de vesículas lipossômicas multilamelares (MLVs). As MLVs foram então submetidas a 5 passagens sequenciais de extrusão através de três filtros de policarbonato (Whatman) com tamanho de poro de 0,08 um em série usando Emulsiflex-C5 (Avestin, Canadá). Os lipossomas resultantes foram diluídos em PBS pH 7,4 e aquecidos a 60° C para obter uma solução de lipossomas antes da adição do peptídeo tau.

[0324] Um peptídeo tau fosforilado acetato tetrapalmitoilado de

SEQ ID NO: 2 (Bachem AG, Suíça), aqui chamado de ingrediente farmacêutico ativo (API), foi dissolvido em PBS a pH 11,4 com octil β- D-glucopiranosídeo a 2,0% (Sigma-Aldrich, USA) a uma concentração de 1 mg / mL, e a solução peptídica foi injetada na solução lipossômica a 60° C, seguida de agitação por 30 minutos a 60° C. A concentração foi realizada através de ultrafiltração até um volume final alvo, e a troca de tampão foi realizada 10 vezes com PBS pH 7,4 durante a diafiltração. Os lipossomas resultantes, com a API apresentada na superfície dos lipossomas, foram então filtrados por esterilização passando através de dois filtros de seringa de policarbonato de 0,2 um em série, e o produto final foi armazenado a 5° C. Preparação das Vacinas de Lipossomas X, Y, Z e Z+

[0325] As vacinas de lipossomas X e Y foram produzidas pela tecnologia de filmes lipídicos finos, seguida de homogeneização e extrusão.

[0326] As vacinas de lipossomas Z+, com uma concentração final de API de 1200 ug / ml e uma concentração final de T50 de 1200 ug / ml foram produzidas pela técnica de injeção de etanol seguida de extrusão e as vacinas de lipossoma Z, com uma concentração final de API de 400 ug / ml e a concentração final de T50 de 100 ug / ml, foram produzidas por tecnologia de filmes lipídicos finos seguida de homogeneização e extrusão.

[0327] A vacina de lipossomas Z++, com uma concentração final de API de 400 ug / ml e uma concentração final de T50 de 400 ug / ml, foi produzida pela tecnologia de filmes lipídicos finos seguida de homogeneização e extrusão.

[0328] As vacinas de lipossomas Z+++, com uma concentração final de API de 1200 ug / ml e uma concentração final de T50 de 300 ug / ml, foram produzidas pela técnica de injeção de etanol seguida de extrusão.

[0329] Preparação de Vacinas de Lipossomas X, Y, Z e Z ++ pela técnica de filmes lipídicos finos

[0330] As vacinas de lipossomas X, Y, Z e Z++ foram produzidas por tecnologia de filmes lipídicos finos seguida de homogeneização e extrusão. Primeiro, DMPC (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Alemanha), DMPG (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Alemanha), colesterol (Dishman, Holanda) e monofosforil hexa-acil Lipídio A 3-desacil-sintético (3D- (6- acil) PHAD®) (Avanti Polar Lipids, AL, USA) foram solubilizados na relação molar de 9:1:7:0,05 em EtOH a 60° C, com exceção do lipossoma Y, que não continha o 3D- (6-acil) PHAD®. O etanol foi evaporado sob rotavapor a vácuo para obter um filme lipídico fino.

[0331] O filme lipídico foi reidratado com PBS em pH 7,4, DMSO a 5% (todos de Sigma-Aldrich) contendo 0,15 mg / mL de peptídeo T50 (Peptides & Elephants, Alemanha). A amostra foi agitada suavemente por 15 min e foi vigorosamente agitada em vórtice para dissolver o filme lipídico fino. As vesículas multilamelares resultantes foram submetidas a 10 ciclos de gelo-degelo (N2 líquido e banho de água a 37° C) e submetidas à homogeneização seguida de extrusão sequencial através de membranas de policarbonato (Whatman, Reino Unido) com tamanho de poro de 0,08 um. As etapas de homogeneização e extrusão foram realizadas em um EmulsiFlex-C5 (Avestin, Canadá). Os lipossomas extrudados com peptídeo T50 encapsulado foram concentrados por ultrafiltração, e o tampão foi trocado para PBS pH 7,4 por diafiltração. Os lipossomas resultantes foram diluídos em PBS pH 7,4 e aquecidos a 60° C para obter uma solução de lipossomas antes da adição de peptídeo tau e adjuvante.

[0332] CpG2006-colesterol (CpG2006-Chol) (Microsynth, Suíça) é um oligonucleotídeo de DNA com todas as ligações internucleotídicas como tiofosfato que é modificado no terminal 5’ com uma molécula de colesterol através de uma ligação fosfato por meio de um espaçador PEG. CpG2006-Colesterol (CpG2006-Chol) (Microsynth, Suíça) foi dissolvido em PBS pH 7,4 a 1 mg / mL e injetado nas soluções de lipossomas (com exceção do lipossoma X, que não contém CpG2006- Chol) seguido de incubação por 15 minutos antes da inserção do API.

[0333] O API (Bachem AG, Suíça) foi dissolvido em PBS pH 11,4 com Octil-β-D-glucopiranosídeo a 2% (Sigma-Aldrich, USA) a uma concentração de 1 mg / mL, e a solução peptídica foi injetada na solução de lipossomas a 60° C seguida de agitação durante 30 minutos a 60° C. A concentração foi realizada através de ultrafiltração para obter o valor alvo (400 ug / ml de API e 100 µg / ml de T50 para o lipossoma X, Y, Z; e 400 ug / ml de API e 400 ug / ml T50 para o lipossoma Z++), e a troca de tampão foi realizada 10 vezes com PBS pH 7,4 durante a diafiltração. Os lipossomas resultantes com o API apresentado na superfície dos lipossomas foram então filtrados estéreis passando através de filtros de seringa de policarbonato de 0,2 um e o produto final foi armazenado a 5°C. Preparação de Lipossoma O por Técnica de Injeção de Etanol

[0334] A vacina de lipossomas O foi produzida pela técnica de injeção de etanol (EtOH) seguida por extrusão. Primeiro, DMPC (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Alemanha), DMPG (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Alemanha), colesterol (Dishman, Holanda) e MPLA (Avanti Polar Lipids, AL, USA) foram solubilizados em uma relação molar de 9:1:7:0,05 em uma mistura 20:1 (em volume) de EtOH e ter-butanol (t-BuOH) a 60° C. A solução de lipídio / etanol foi diluída em solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4 a 60° C para manter a concentração de EtOH a 10% e resultando na formação de vesículas lipossômicas multilamelares (MLVs). As MLVs foram então submetidas a 5 passagens sequenciais de extrusão através de três filtros de policarbonato (Whatman) com tamanho de poro de 0,08 um em série usando o Emulsiflex-C5 (Avestin, Canadá). Os lipossomas resultantes foram diluídos em PBS pH 7,4 e aquecidos a 60° C para obter uma solução de lipossomas antes da adição do peptídeo tau.

[0335] O peptídeo T46 (Pepscan, Holanda) foi dissolvido em PBS pH 7,4 a 1 mg / mL e injetado nas soluções de lipossomas, seguido de incubação por 15 minutos antes da inserção do API.

[0336] O API (Bachem, Suíça) foi dissolvido em PBS pH 11,4 com Octil-D-glucopiranosídeo a 2% (Sigma-Aldrich, USA) a uma concentração de 1 mg / mL, e a solução peptídica foi injetada na solução de lipossoma a 60° C seguida de agitação durante 30 min a 60° C. A concentração foi realizada através de ultrafiltração para obter o valor alvo (400 µg / ml de API e 100 µg / ml de T46), e a troca de tampão foi realizada 10 vezes com PBS pH 7,4 durante a diafiltração. Os lipossomas resultantes com o API apresentado na superfície dos lipossomas foram então filtrados estéreis passando através de filtros de seringa de policarbonato de 0,2 um e o produto final foi armazenado a 5° C.

[0337] Preparação de Vacinas de Lipossomas Z+ e Lipossomas Z+++ por Injeção de Etanol

[0338] As vacinas de lipossomas Z+ e lipossomas Z+++ foram produzidas usando um processo baseado em injeção de etanol. Primeiro, DMPC (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Alemanha), DMPG (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Alemanha), colesterol (Dishman, Holanda) e 3D- (6-acil) PHAD® (Avanti Polar Lipids, AL, USA) foram solubilizados em uma relação molar de aproximadamente 9:1:7:0,04 em EtOH a 60° C. O peptídeo T50 (Bachem AG, Suíça) foi dissolvido em 10 mM de His / 270 mM de sacarose (pH 5,8 a 6,0). Em seguida, a solução de lipídio - etanol foi injetada na solução contendo peptídeo T50 e agitada suavemente por 15 min, resultando em vesículas multilamelares (MLVs). As MLVs foram submetidas à homogeneização (6 vezes para o lipossoma Z+, e sem homogeneização para o lipossoma Z+++), seguida de extrusão sequencial através de membranas de policarbonato

(Whatman, UK) com tamanho de poro de 0,08 um (5 passagens para o lipossoma Z+, 3 a 5 vezes para Lipossoma Z+++). As etapas de homogeneização e extrusão foram realizadas em um EmulsiFlex-C5 (Avestin, Canadá) para o lipossoma Z+. A extrusão do lipossoma Z+++ foi realizada utilizando extrusora de filtro LIPEX. Os lipossomas extrudados foram concentrados por ultrafiltração e o tampão foi trocado para 20 mM de His / 145 mM de NaCL pH 7,4 por diafiltração. Os lipossomas resultantes com peptídeo T50 encapsulado foram diluídos em 20 mM de His / 145 mM de NaCL, pH 7,4 e aquecidos a 60° C para obter uma solução de lipossomas antes das adições do API e do adjuvante.

[0339] CpG2006-Chol (Microsynth, Suíça para o lipossoma Z+; Avecia, USA para o lipossoma Z+++) foi dissolvido em 20 mM de His / 145 mM de NaCl pH 7,4 a 1 mg / mL e injetado na solução lipossômica seguida de incubação por 15 minutos antes da inserção do API.

[0340] O API (Bachem AG, Suíça) foi dissolvido em tampão de carbonato pH 10,2 com Octil β-D-glucopiranosídeo a 1% (Sigma- Aldrich, USA), a uma concentração de 1 mg / mL, e a solução peptídica foi injetada na solução de lipossoma Z+ a 60° C, seguido de agitação por 30 min a 60° C. A solução de peptídeo foi misturada na solução de lipossoma Z+ utilizando mistura em linha T a 60° C, seguido de agitação durante 30 min a 60° C. A concentração foi realizada através de ultrafiltração para obter o valor alvo (1200 ug / ml de API e 1200 ug / ml de T50 para lipossoma Z+; e 1200 ug / ml de API e 300 ug / ml de T50 para lipossoma Z+++), e a troca de tampão foi realizada 10 vezes com 10 mM de His / 270 mM de Sacarose, pH 6,5 durante a diafiltração. Os lipossomas Z+ resultantes com o API apresentado na superfície dos lipossomas e os lipossomas Z+++ resultantes com o API apresentado na superfície dos lipossomas foram então filtrados estéreis, passando por filtros de seringa / cápsula de policarbonato de 0,2 um e o produto final foi armazenado a 5° C.

Preparação de Vacinas de Lipossomas L, M e N

[0341] As vacinas de lipossomas L, M e N foram produzidas por tecnologia de filmes lipídicos finos, seguida por homogeneização e extrusão. Primeiro, DMPC (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Alemanha), DMPG (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Alemanha), colesterol (Dishman, Holanda) e MPLA (Avanti Polar Lipids, AL, USA) foram solubilizados na relação molar de 9:1:7:0,05 em EtOH a 60° C. O etanol foi evaporado sob rotavapor a vácuo, a fim de obter um filme lipídico fino.

[0342] O filme lipídico foi reidratado com PBS pH 7,4, DMSO a 5% (todos de Sigma-Aldrich) contendo ou:

[0343] • 0,15 mg / mL de peptídeo T48 (Peptides & Elephants, Alemanha) - para lipossoma M; ou

[0344] • 0,13 mg / mL de peptídeo T50 (Peptides & Elephants, Alemanha) - para lipossoma L; ou

[0345] • 0,15 mg / mL de peptídeo T52 (Peptides & Elephants, Alemanha) - para lipossoma N.

[0346] A amostra foi agitada suavemente por 15 minutos e foi vigorosamente agitada em vórtice para dissolver o filme lipídico fino. As vesículas multilamelares resultantes foram submetidas a 10 ciclos de gelo-degelo (N2 líquido e banho de água a 37° C) e submetidas à homogeneização seguida de extrusão sequencial através de membranas de policarbonato (Whatman, Reino Unido) com tamanho de poro de 0,08 um. As etapas de homogeneização e extrusão foram realizadas em um EmulsiFlex-C5 (Avestin, Canadá). Os lipossomas extrudados foram concentrados por ultrafiltração e o tampão foi trocado para PBS pH 7,4 por diafiltração. Os lipossomas resultantes com peptídeo T48, T50 ou T52 encapsulado foram diluídos em PBS pH 7,4 e aquecidos a 60° C para obter uma solução de lipossomas antes da adição do peptídeo tau.

[0347] O API (Bachem AG, Suíça) foi dissolvido em PBS pH 11,4 com Octil-β-D-glucopiranosídeo a 2% (Sigma-Aldrich, USA) a uma concentração de 1 mg / mL e a solução peptídica foi injetada na solução de lipossoma a 60° C seguida de agitação durante 30 min a 60° C. A concentração foi realizada através de ultrafiltração para obter um valor alvo (400 ug / ml de API e 100 ug / ml de T48, T50 ou T52) e a troca de tampão foi realizada 10 vezes com PBS pH 7,4 durante a diafiltração. Os lipossomas resultantes com o API apresentado na superfície dos lipossomas foram então filtrados estéreis passando por filtros de seringa de policarbonato de 0,2 um e o produto final foi armazenado a 5° C. Preparação de Vacinas de Lipossomas R, S e T

[0348] As vacinas de lipossomas R, S e T foram produzidas usando um processo baseado em injeção de etanol seguido de extrusão. Primeiro, DMPC (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Alemanha), DMPG (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Alemanha), colesterol (Dishman, Holanda) e 3D- (6-acil) PHAD® (Avanti Polar Lipids, AL, USA) foram solubilizados em uma relação molar de 9:1:7:0,04 em EtOH a 60° C. Para os lipossomas R e T, a solução de lipídio - etanol acima foi misturada com 10 mM de histidina, pH 5,8, suplementada com 270 mM de sacarose para atingir 10% de solvente (EtOH) e depois incubada por 30 minutos a 60°C. Para o lipossoma S, o peptídeo T50 (Bachem AG, Suíça) foi dissolvido em 10 mM de His / 270 mM de sacarose (pH 5,8 a 6,0). A mistura lipídio - tampão relacionada aos lipossomas R, S e T foi agitada suavemente por 15 min, resultando em vesículas multilamelares (MLVs). As vesículas multilamelares resultantes foram submetidas à extrusão através de membranas de policarbonato (Whatman, Reino Unido) com tamanho de poro de 0,08 um (5X) realizado em um sistema de alta pressão EmulsiFlex-C5 (Avestin, Canadá).

[0349] Os lipossomas extrudados foram concentrados por ultrafiltração e o tampão foi trocado para 20 mM de His / 145 mM de NaCL pH 7,4 por diafiltração. Os lipossomas resultantes com T50 encapsulado para o lipossoma S e os lipossomas R e T resultantes foram ainda diluídos em 20 mM de His / 145 mM de NaCL pH 7,4 e aquecidos a 60°C para obter uma solução lipossômica antes das adições do API e T57 para o Lipossoma T.

[0350] Para o lipossoma T, T57 foi dissolvido a 1 mg / mL em Octil- β-D-glucopiranosídeo a 1% (Sigma-Aldrich, USA) em água destilada desionizada e inserido no lipossoma, seguido de incubação por 15 minutos a 60° C antes Inserção do API.

[0351] O API (Bachem AG, Suíça) foi dissolvido em tampão de carbonato pH 10,2 com Octil- β-D-glucopiranosídeo a 1% (Sigma- Aldrich, USA), a uma concentração de 1 mg / mL, e a solução peptídica foi misturada na solução de lipossomas a 60°C, seguido de agitação durante 30 min a 60°C. A concentração foi realizada por ultrafiltração para obter o seguinte valor alvo:

[0352] – 1200 ug / ml de API para o lipossoma R;

[0353] – 1200 ug / ml de API e 300 ug / ml de T50 para o lipossoma S; e

[0354] – 1200 ug / ml de API e 300 ug / ml de T57 para o lipossoma T.

[0355] A troca de tampão foi realizada 10 vezes com 10 mM de His / 270 mM de sacarose pH 6,5 durante a diafiltração. Os lipossomas resultantes com o API apresentado na superfície dos lipossomas foram então filtrados estéreis passando através de filtros de seringa de policarbonato de 0,2 um e o produto final foi armazenado a 5° C. Exemplo 2: Preparação de Vacina Conjugada Peptídeos e Adjuvantes

[0356] As sequências de dois epítopos de peptídeo multifosforilados (TAUVAC-p7.1 e TAUVAC-p22.1 que têm três e dois aminoácidos fosforilados, respectivamente) foram refinadas, otimizando o comprimento, de modo a ligar melhor a imunoglobulina de superfície de

B células, e de modo que as sequências não contenham epítopos previstos para se ligarem a moléculas humanas de classe IA, B e C de HLA com alta afinidade. O último critério foi importante para evitar a indução de uma resposta de células T CD8+ citotóxicas contra tau que poderia causar potencialmente danos neuronais significativos. Usando a ferramenta de predição de epítopos de células T do Immune Epitope Database and Analysis Resources, o peptídeo TAUVAC-p7.1 não mostrou epítopos previstos capazes de se ligarem a moléculas humanas de HLA classe I A, B, C e HLA classe II DQ e DR com alta afinidade, enquanto se previu que o peptídeo TAUVAC-p22.1 continha epítopos que se ligavam a moléculas de HLA classe II DQ e DR com afinidade intermediária / alta (dados não mostrados).

[0357] Os peptídeos tau fosforilados (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3) utilizados neste estudo foram produzidos sinteticamente (Pepscan, NL) com os fosfo-resíduos adicionados durante a síntese. Um conjugado compreendendo peptídeo tau fosforilado tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 ligada covalentemente a um veículo KLH por meio de um ligante é aqui chamado de Conjugado B ou Conjugado C, respectivamente. Um conjugado compreendendo peptídeo tau fosforilado tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ligada covalentemente a um veículo CRM por meio de um ligante é aqui chamado de Conjugado A.

[0358] Para fabricar os Conjugados B e C, os peptídeos de vacina foram conjugados à proteína carreadora KLH por meio de um ligante m- maleimidobenzoil-N-hidroxisucinimida éster (MBS) e uma cisteína extra no N terminal do peptídeo. O peptídeo não ligado foi removido utilizando uma coluna Sephadex G25 antes de concentrar o conjugado. Os conjugados foram misturados antes da injeção para um potente adjuvante multicomponente (Sigma Adjuvant System, Sigma-Aldrich) ou um adjuvante de depósito de componente único (hidróxido de alumínio,

Alhydrogel®, Invivogen) seguindo as instruções do fabricante.

[0359] Os peptídeos de vacina foram conjugados à proteína carreadora CRM197 por meio de um ligante polietileno glicol (PEG) – cisteína - acetamidopropionamida. O peptídeo tau fosforilado tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 foi produzido sinteticamente (Polypeptide Laboratories SAS), com fosfo-resíduos e o espaçador PEG3 adicionados durante a síntese. O conjugado A foi fabricado conjugando a proteína carreadora CRM197 através de um ligante sucinimidil 3- (bromoacetamida) propionato (SBAP) a uma cisteína no N terminal do peptídeo. O SBAP foi ligado a aminas primárias da proteína CRM197 (-NH2) via química da reação de NHS éster. O excesso de ligante SBAP foi removido usando ultrafiltração e diafiltração (UF / DF). O intermediário CRM197-SBAP foi conjugado com o peptídeo tau fosforilado e, uma vez concluída a reação, a reação de conjugação foi encerrada adicionando-se uma quantidade excessiva de L-cistina para resfriar a reação. O produto bruto conjugado com peptídeo CRM197 foi purificado usando uma coluna de cromatografia Capto Q ImpRes (GE Healthcare) e eluído usando um método isocrático de sal. O produto de peptídeo CRM197 purificado foi então formulado em 20 mM de Tris, 250 mM de sacarose, pH 8,1 a uma concentração de 0,5 mg / mL usando UF / DF. A substância de fármaco (DS) CRM197 - peptídeo tau foi gerada adicionando-se um tampão estoque de PS80 a 10% para atingir uma concentração final de PS80 a 0,01%. A solução foi completamente misturada antes da filtração. Exemplo 3: Anticorpos IgG Induzidos por Vacina Específicos para Fosfopeptídeo Tau

[0360] Todos os experimentos com animais foram aprovados e realizados de acordo com a legislação local sobre experimentos com animais. Os macacos rhesus (Macaca mulatta) foram obtidos a partir de Kunming Biomed International Ltd, China, Yunnan Yinmore Bio-Tech

Co. LTD, China e Yunnan Laboratory Primates Inc., China. Os animais tinham dois a cinco anos de idade no início da imunização e seu peso mínimo era de 2,5 kg. Um exame clínico detalhado foi realizado antes do início do tratamento e semanalmente depois. Além disso, os macacos foram observados duas vezes ao dia e os sinais clínicos foram registrados.

[0361] Macacos Rhesus adultos (n = 3 machos e 3 fêmeas por grupo) foram imunizados por via subcutânea com 1800 µg de peptídeo tau fosforilado tetrapalmitoilado com acetato de SEQ ID NO: 2 por dose da vacina lipossômica de controle (lipossoma com peptídeo tau fosforilado tetrapalmitoilado da SEQ ID NO: 2 e MPLA) ou uma vacina lipossômica de acordo com a modalidade da aplicação, por exemplo, Lipossoma Z (lipossoma com peptídeo tau fosforilado tetrapalmitoilado de SEQ ID NO: 2, 3D- (6-acil) PHAD®, oligonucleotídeo CpG lipidado CpG 2006 e peptídeo de células T T50) ou 15 µg por dose de uma vacina conjugada de acordo com uma modalidade da invenção (por exemplo, Conjugado A, peptídeo tau fosforilado de SEQ ID NO: 2 ligado ao CRM197) coinjetada com alúmen e oligonucleotídeo CpG CpG 2006 nos dias 1, 29 e 85. Os sangramentos foram realizados antes da imunização e nos dias 8, 22, 36, 50, 64, 78, 92, 106, 120, 134 e 148, e os soros foram isolados.

[0362] As titulações de anticorpos IgG específicos foram determinadas por ELISA, usando o peptídeo tau fosforilado de SEQ ID NO: 2 como antígeno de revestimento. O soro de um macaco imunizado individual foi diluído em série em tampão de ensaio (PBS, Tween20 a 0,05%, BSA a 1%) e aplicado em placas de 96 poços que foram revestidas com o peptídeo relevante. Após duas horas de incubação, as amostras foram removidas e as placas lavadas em PBST (PBS, Tween20 a 0,05%). Os anticorpos foram detectados usando uma IgG anti-macaco conjugada com HRP (KPL), seguida por substrato ABTS

(Roche). Todas as amostras foram corridas em oito diluições de duas vezes, com amostras de controle positivas e negativas incluídas em cada placa. Os dados foram expressos como média geométrica das titulações de desfecho (última diluição sérica induzindo uma resposta positiva) por grupo.

[0363] Como mostrado na Figura 4, a vacina de lipossoma Z e o conjugado A induziram titulações mais altas de IgG específicas para fosfopeptídeos, em comparação com a vacina lipossômica de controle. Exemplo 4: Anticorpos Induzidos por Vacina Específicos para Estruturas de Tau Patológica no Cérebro Humano

[0364] Todos os tecidos cerebrais foram obtidos a partir do Netherlands Brain Bank (NBB) e foram coletados a partir de doadores após a assinatura de um consentimento informado para uma autópsia cerebral e o uso das amostras, bem como suas informações clínicas, para fins de pesquisa. Seções de parafina de controles não dementes (saudáveis), doença de Alzheimer (AD), demência temporal frontal com patologia tau (FTD-tau), doença de Pick, tauopatia relacionada à idade primária (PART) e paralisia supranuclear progressiva (PSP) foram usadas. As regiões do cérebro incluíam córtex parietal, giro frontal médio, hipocampo ou núcleo caudado.

[0365] Em particular, as seções embebidas em parafina fixadas com formalina a partir de córtices parietais de um indivíduo humano de controle (saudável) e um indivíduo humano que sofre da doença de Alzheimer (AD Braak V / VI) foram coradas com soro de macaco pós- imune diluído 1:100 em diluente de anticorpo normal (Imunológico). As seções foram então lavadas e coradas com um HRP anti-macaco de cabra (Abcam). A coloração foi finalmente visualizada usando 3,3’- diaminobenzidina (ADB; Dako), que deposita uma coloração marrom específica na presença de peroxidase de rábano (HRP). As lâminas foram contrastadas com hematoxilina, desidratadas e montadas com meio de montagem Quick D (Klinipath). As imagens foram capturadas com um microscópio Leica DC500.

[0366] Os resultados da Figura 5 mostram que os soros pós- imunização de macacos Rhesus imunizados com lipossoma Z (lipossoma com peptídeo tau fosforilado tetrapalmitoilado de SEQ ID NO: 2, 3D-(6-acil) PHAD®, oligonucleotídeo CpG lipidado CpG 2006 e peptídeo de células T T50) coraram estruturas de tau patológica em seções do cérebro humano. O soro foi coletado a partir de macacos Rhesus no dia 106 após a imunização primária com os lipossomas melhorados. Este macaco recebeu imunizações nos meses 0, 1 e 3 antes da coleta de soro. O painel esquerdo (AD Braak V / VI) mostra coloração do córtex parietal a partir de um doador Braak Estágio V. As setas indicam a coloração dos emaranhados de tau. O painel direito (saudável) mostra a coloração do córtex parietal de um doador Braak Estágio 0. O soro foi aplicado nas seções com uma diluição de 1:100, seguido pelo anticorpo anti-macaco de cabra a 1:100, e a coloração foi visualizada usando um revelador DAB.

[0367] Os resultados na Figura 6 mostram que o soro de macacos Rhesus imunizados com o Conjugado A que contém peptídeo tau fosforilado de SEQ ID NO: 2 mais CpG solúvel e hidróxido de alúmen se liga a estruturas de tau patológica em seções cerebrais humanas de AD. O soro foi coletado no dia 106 após a imunização primária com a vacina conjugada CRM. Esses macacos receberam imunizações nos meses 0, 1 e 3 antes da coleta de soro. Os painéis superiores (AD) mostram a coloração do córtex parietal, incluindo emaranhados de tau, de um doador Braak Estágio V. Os painéis inferiores (CTRL) mostram a coloração do córtex parietal de um doador Braak Estágio 0. O soro foi aplicado nas seções com uma diluição de 1:100, seguido pelo anticorpo anti-macaco de cabra a 1:100, e a coloração foi visualizada usando um revelador DAB.

Exemplo 5: Vacinas Lipossômicas com Um ou Dois Adjuvantes

[0368] A adição de dois adjuvantes na vacina lipossômica melhorada aumenta o nível de titulações de anticorpos IgG específicos para fosfopeptídeos tau, bem como a consistência da resposta de anticorpos entre os indivíduos.

[0369] Os macacos Rhesus adultos (n = 3 machos e 3 fêmeas por grupo) foram imunizados por via subcutânea nos dias 1, 29, 85 e 169 com 1800 µg de peptídeo tau fosforilado tetrapalmitoilado com acetato de SEQ ID NO: 2 por dose da vacina lipossômica de controle ou da vacina lipossômica melhorada com epítopo de célula T50 encapsulado, contendo adjuvante 3D- (6-acil) PHAD® isoladamente (lipossoma X, Figura 7A), adjuvante oligonucleotídeo lipidado CpG 2006 isoladamente (lipossoma Y, Figura 7B), ou ambos os adjuvantes 3D- (6-acil) PHAD® e oligonucleotídeo lipídico CpG 2006 (Lipossoma Z, Figura 7C). Os sangramentos foram realizados antes da imunização e nos dias 8, 22, 36, 50, 64, 78, 92, 106, 120, 134, 148, 162, 176 e 190 e os soros foram isolados. As titulações de anticorpos IgG específicos nos soros foram determinadas por ELISA, usando o peptídeo tau fosforilado de SEQ ID NO: 2 como antígeno de revestimento e um anticorpo secundário IgG anti-macaco. Os níveis de anticorpos resultantes são apresentados coma titulações de desfecho (última diluição sérica induzindo uma resposta positiva) para cada macaco individual ao longo do tempo. Cada grupo de imunização é representado em um painel (Figuras 7A-C). A média geométrica das titulações de desfecho por grupo ± intervalo de confiança de 95% é apresentada na Figura 7D. Em resumo, as Figuras 7A-D mostram que a inclusão de dois adjuvantes na vacina lipossômica contendo T50 encapsulado melhorou o nível e a consistência da resposta do anticorpo ao fosfopeptídeo tau, resultando em menor variabilidade na resposta do anticorpo entre macacos individuais. Mais especificamente, como mostrado na Figura 7D, as vacinas lipossômicas melhoradas com peptídeo tau fosforilado de SEQ ID NO: 2, epítopo de célula T50 (lipossoma X, Y e Z) e 1 ou 2 adjuvantes, induziram titulações mais altas contra o fosfopeptídeo tau do que a vacina lipossômica de controle sem epítopo de células T. Todos os macacos responderam quando injetados com cada uma das vacinas lipossômicas melhoradas, enquanto 4 de 6 animais responderam com a vacina lipossômica de controle. Exemplo 6: Anticorpos Induzidos por Vacinas Específicos para os Filamentos Helicoidais Pareados Enriquecidos (ePHF)

[0370] Grupos de macacos Rhesus (n = 3 machos e 3 fêmeas por grupo) foram imunizados por via subcutânea por vacinação no dia 1 e dia 29 com (i) a vacina lipossômica melhorada contendo o epítopo de células T50 e adjuvante 3D- (6-acil) PHAD® isoladamente (lipossoma X), (ii) a vacina lipossômica melhorada contendo o epítopo de células T50 e adjuvante lipídico CpG 2006 isoladamente (lipossoma Y), (iii) a vacina lipossômica melhorada contendo o epítopo de célula T50 e dois adjuvantes (3D- (6-acil) PHAD® e CpG2006 lipídico, lipossoma Z) ou (iv) a vacina conjugada (peptídeo tau fosforilado de SEQ ID NO: 2 ligado ao CRM197) coinjetada com alúmen e oligonucleotídeo CpG CpG 2006 (Conjugado A).

[0371] As preparações de filamentos helicoidais pareados enriquecidos (ePHF) foram obtidas a partir de tecidos cerebrais após a morte de indivíduos com AD confirmados histologicamente por extração sarcosil de tau insolúvel, usando um método modificado de Greenberg e Davies (Greenberg e Davies, 1991, Proc Natl Acad Sci USA, 87 (15): 5827-31). As titulações de anticorpos específicos para filamentos helicoidais pareados enriquecidos (ePHF) foram avaliadas usando a plataforma Mesoscale Discovery (MSD). As placas de estreptavidina MSD foram revestidas com o anticorpo anti-tau biotinilado (HT7-biotina, ThermoScientific) antes da incubação com ePHF isolado de pacientes com doença de Alzheimer, enquanto os anticorpos IgG específicos para ePHF foram ainda detectados usando um anticorpo IgG anti-humano marcado com SulfoTag que reage com anticorpos IgG de macaco. Mais especificamente, o ePHF foi adicionado às placas de 96 poços de estreptavidina pequena MSD Gold (MSD) previamente saturadas com BSA a 1% e revestidas com HT-7 biotinilado (Thermo Scientific). Após uma hora de incubação, as placas foram lavadas com PBST e as diluições em série dos soros foram adicionadas e incubadas por duas horas. Os anticorpos ligados foram detectados usando um anticorpo IgG anti-humano marcado com SulfoTag seguido de uma etapa de fixação em PFA a 1% antes da adição do tampão de leitura T. As placas foram analisadas usando um Sector Imager (MSD). Os resultados foram expressos em unidades arbitrárias por mililitro (AU / mL) para cada macaco individual, juntamente com a média geométrica por grupo. As titulações de anticorpos específicos para ePHF no dia 50 após a primeira imunização são representadas.

[0372] A Figura 8 mostra que todas as vacinas induziram altas titulações de anticorpos IgG específicos para ePHF.

[0373] Resultados semelhantes com altas titulações de anticorpos IgG específicos para ePHF também foram obtidos com outros lipossomas, tal como o lipossoma Z+, administrados a macacos Rhesus por administração intramuscular.

[0374] Exemplo 7: A Amplitude de Anticorpo Específico para Fosfopeptídeo Tau Induzido por Vacina Lipossômica e Vacina Conjugada em Macacos Rhesus

[0375] Grupos de macacos Rhesus (n = 3 machos e 3 fêmeas por grupo) foram imunizados por via subcutânea nos dias 1 e 29 com (i) a vacina lipossômica melhorada contendo T50 encapsulado e dois adjuvantes: ligante TLR4 (3D-(6-acil) PHAD®) e oligonucleotídeo CpG 2006 lipidado (lipossoma Z) e (ii) a vacina conjugada (peptídeo tau fosforilado de SEQ ID NO: 2 ligado ao CRM) (conjugado A) coinjetada com alúmen e oligonucleotídeo CpG CpG 2006. O perfil de reconhecimento de epítopos dos anticorpos foi determinado por ELISA de mapeamento de epítopos três semanas após a segunda imunização (dia 50) usando uma biblioteca de peptídeos 8-mer biotinilados no N terminal, deslocados por um aminoácido e cobrindo a sequência do peptídeo tau fosforilado de SEQ ID NO: 2, bem como a sequência de SEQ ID NO: 4 (VYKSPVVSGDTSPRHL, peptídeo tau não fosforilado tendo a mesma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2) e os peptídeos biotinilados correspondentes de comprimento total.

[0376] A Figura 9 mostra que os macacos imunizados com lipossoma Z produziram anticorpos IgG que se ligam principalmente à parte N terminal do peptídeo fosforilado de SEQ ID NO: 2 (Figura 9A), enquanto macacos imunizados com a vacina conjugada (peptídeo tau fosforilado de SEQ ID NO: 2 ligado ao CRM) geraram anticorpos IgG que se ligam principalmente à parte C terminal do peptídeo tau de SEQ ID NO: 2 (Figura 9B).

[0377] Exemplo 8: Titulações Aumentadas de Anticorpos IgG Específicos para o Fosfopeptídeo Tau Induzido por Vacina Lipossômica com Epítopo de Célula T Encapsulado

[0378] Três grupos de camundongos C57BL / 6J (n = 10 por grupo) foram imunizados por via subcutânea nos dias 0 e 14 com i) vacina lipossômica contendo agonista de TLR4 (3D- (6-acil) PHAD®), (lipossoma R), ii) vacina lipossômica contendo epítopo de célula T encapsulado T50 e ligante TLR4 (3D- (6-acil) PHAD®) como adjuvante, (lipossoma S), ou iii) vacina lipossômica contendo epítopo de célula T ancorado T57 na superfície lipossômica (isto é, T50 dipalmitoilado) e ligante TLR4 (3D- (6-acil) PHAD®) como adjuvante (Lipossoma T). O nível de anticorpos IgG específicos para o peptídeo tau fosforilado de SEQ ID NO: 2 foi medido 21 e 35 dias após a primeira injeção no plasma de camundongo por ELISA; os resultados foram apresentados como valores de camundongos individuais, juntamente com a média geométrica por grupo ± 95% CI expresso em unidades arbitrárias (AU) por mL. Como mostrado na Figura 10A, a vacinação com a vacina lipossômica contendo T50 encapsulado (Lipossoma S) induziu titulações de anticorpos significativamente mais altas do que a vacina lipossômica de controle (Lipossoma R) e a vacina lipossômica contendo epítopo de célula T ancorado (Lipossoma T) 21 dias após a primeira imunização (teste de Kruskal-Wallis: p = 0,0089 e p = 0002, respectivamente) e também titulações de anticorpos mais altas do que a vacina lipossômica de controle e titulações de anticorpos significativamente mais altas do que a vacina lipossômica que contém epítopo de células T ancorado 35 dias após a primeira imunização (Teste de Kruskal - Wallis: p = 0,7591 e p = 0053, respectivamente) (Figura 10B). Exemplo 9: Resposta de Células T Induzida por Vacinas Lipossômicas Específica para o Epítopo de Células T Incorporado

[0379] Três grupos de camundongos C57BL / 6J (n = 5 por grupo) foram imunizados por via subcutânea nos dias 0, 14 e 28 com (i) a vacina lipossômica melhorada com o peptídeo T48 de células T encapsulado (contendo epítopos de células T PADRE, T2, T30 e T17 separados com o ligante GS) e um agonista de TLR4 como adjuvante (MPLA) (Lipossoma M), (ii) a vacina lipossômica melhorada com T52 encapsulado (contendo epítopos de células T PADRE, T2 e T30 separados com o ligante RK) e um agonista de TLR4 (MPLA) como adjuvante (Lipossoma N) ou (iii) PBS. Os baços dos camundongos foram colhidos 42 dias após a primeira imunização para a análise das respostas das células T por IL-4 e IFN- ELISPOT. As suspensões de célula única foram incubadas com meio, peptídeo T48 ou T52 a 10 µg / mL por 48 horas. As placas foram incubadas com anticorpos monoclonais IL-4 ou IFN- anti-camundongos biotinilados e com fosfatase alcalina de estreptavidina (AP). As manchas foram reveladas adicionando-se o substrato AP. A Figura 11 mostra que a reestimulação dos esplenócitos de camundongo com o mesmo peptídeo que o encapsulado no lipossoma induziu células formadoras de manchas IL-4 (Figura 11B) e IFN- (Figura 11A), enquanto os esplenócitos de camundongos injetados com PBS não. Isso confirmou que a adição de epítopo de célula T à vacina induziu a ativação de células T específicas, permitindo que elas prestassem ainda mais ajuda na produção de anticorpos para as células B específicas de tau. Exemplo 10: Vacinas Lipossômicas Contendo Epítopo de Célula T Encapsulado e Epítopo de Células T Ancorado

[0380] Grupos de macacos Rhesus (n = 6 por grupo) foram imunizados por via subcutânea nos dias 1, 29, 85 e 169 com (i) vacina lipossômica contendo epítopo de células T encapsulado T50 e ligante TLR4 (MPLA) como adjuvante (lipossoma L), (ii) vacina lipossômica contendo epítopo de célula T ancorado T46 e ligante TLR4 (MPLA) como adjuvante (lipossoma O) e (iii) vacina lipossômica de controle contendo um ligante TLR4 (MPLA) como adjuvante e sem epítopo de célula T. Os sangramentos foram realizados antes da imunização (no dia -14) e nos dias 8, 22, 36, 50, 64, 78, 92, 106, 120, 134, 148, 148, 162, 176 e 190, e os soros foram isolados. As titulações de anticorpos IgG específicos foram determinadas por ELISA, usando o peptídeo tau fosforilado de SEQ ID NO: 2 como antígeno de revestimento e um anticorpo secundário IgG anti-macaco. Os níveis de anticorpos resultantes foram calculados como as titulações de desfecho (última diluição sérica induzindo uma resposta positiva) e os dados foram expressos como média geométrica por grupo. Como mostrado na Figura 12, a vacina lipossômica que contém um epítopo de células T encapsulado (lipossoma L) e a vacina lipossômica que contém um epítopo de células T ancorado (lipossoma O) cada uma induziu titulações de anticorpos específicos para fosfopeptídeos tau mais altas do que a vacina lipossômica de controle sem epítopo de células T. Exemplo 11: Resposta de Anticorpo em Camundongos Induzida por Vacina Conjugada

[0381] Camundongos BALB / c fêmeas (14 camundongos por grupo) foram imunizados com o Conjugado B ou o Conjugado C (contendo SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 covalentemente ligada a KLH) seguindo o esquema representado na Figura 13A e usando os candidatos a vacina adjuvantados com um potente adjuvante multicomponente (Sigma Adjuvant System®, Sigma-Aldrich, em seguida chamado de Ribi) ou um adjuvante de depósito de componente único (adjuvante Alhydrogel® 2% ou gel de hidróxido de alumínio, InvivoGen, em seguida chamado de alúmen). A sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 contém apenas uma diferença de aminoácidos em comparação com a proteína de camundongo, enquanto a sequência de SEQ ID NO: 3 é 100% conservada entre humanos e camundongos. Assim, os epítopos selecionados podem ser razoavelmente considerados "auto" proteínas para camundongos e os camundongos devem ser um modelo relevante para investigar as limitações que a tolerância imune pode colocar na imunogenicidade.

[0382] Como uma primeira medida de imunogenicidade da vacina, a citometria de fluxo foi usada para medir a indução de células T auxiliares foliculares (TfHs) nos gânglios linfáticos cervicais que drenam o sítio de injeção da vacina (quatro camundongos por grupo). TfHs são uma população especializada de células T CD4+ caracterizadas pela expressão de CXCR5, PD-1 e ICOS entre outras moléculas. As TfHs se expandem após a exposição a uma vacina ou outros estímulos imunes e apoiam a maturação por afinidade das células B no centro germinal (Crotty, 2011, Annual Reviews of Immunology. Vol. 29: pág. 621 a 663).

O número de TfHs induzidas correlaciona-se positivamente com a eficácia de proteção de vacinas em seres humanos (Bentebibel e outros, 2013, Sci Transl Med., 5 (176): 176ra32; Spensieri e outros, 2013, Proc Natl Acad Sci USA., 110 (35): 14330-5) e animais pequenos. Como mostrado na Figura 13B, ambas as vacinas, bem como a imunização de controle KLH mais adjuvante, induziram TfHs mensuráveis em camundongos vacinados. Além disso, todos os animais que receberam vacina ativa (grupos de Conjugado B e Conjugado C) ou placebo ativo (KLH) mais alúmen, tiveram significativamente mais TfHs do que os animais que receberam um placebo inativo (grupo de PBS), quando a drenagem dos gânglios linfáticos cervicais foi colhida sete dias após a primeira imunização (P = 0,0044 para KLH-TAUVAC-p7.1; P = 0,0482 para KLH-TAUVAC-p22.1; P = 0,0063 para KLH, usando um teste ANOVA seguido pelo ajuste de Dunnett para múltiplas comparações).

[0383] Foi realizado ELISA para determinar a titulação sérica de anticorpos que se ligam aos fosfopeptídeos tau e ao KLH no dia 0 e em quatro momentos adicionais após a imunização (dias 14, 28, 56 e 84, ver as Figura 13C, D, G e H). Como mostrado na Figura 13C, a imunização com o Conjugado B induziu anticorpos de ligação reativos contra o peptídeo de vacina correspondente. Para animais imunizados com o Conjugado B e adjuvante Ribi, as titulações de ligação contra o peptídeo de vacina foram significativamente maiores do que as titulações de ligação induzidas pelo placebo ativo (comparar o conjugado B mais Ribi ao KLH mais Ribi) em todos os momentos medidos (P < 0,001 usando um Teste ANOVA seguido de ajuste de Tukey para múltiplas comparações). Para o grupo com adjuvante de alúmen, a diferença foi significativa apenas nos dias 56 e 84 (P = 0,001 e 0,012, respectivamente).

[0384] A resposta do anticorpo específico de tau ao Conjugado C (Figura 13D) foi de magnitude geral mais baixa do que a resposta ao

Conjugado B, embora as diferenças do ensaio (peptídeo de revestimento diferente) impeçam a comparação estatística direta entre as duas vacinas. No entanto, as titulações de anticorpos contra o Conjugado C foram significativamente maiores em camundongos vacinados com o Conjugado C mais Ribi do que em camundongos que receberam placebo ativo KLH - Ribi nos dias 28 e 84 (P = 0,001 e 0,008, respectivamente) após a imunização; as titulações do grupo com adjuvante alúmen não foram significativamente diferentes das do placebo ativo.

[0385] Embora a proteína carreadora proteja o fosfopeptídeo da degradação in vivo até certo ponto, era provável que a digestão com fosfatase dos antígenos peptídicos in vivo exporia algum peptídeo não fosforilado ao sistema imunológico. Para determinar se essa exposição resultou na geração de anticorpos capazes de se ligarem ao peptídeo não fosforilado no Conjugado B e no Conjugado C, ELISA foi realizado usando peptídeos não fosforilados como o antígeno de revestimento. Como mostrado nas Figuras 13E-F, a resposta aos peptídeos tau não fosforilados foi baixa, em comparação com a resposta dos placebos ativos ao mesmo peptídeo não fosforilado. Além disso, em animais imunizados com o Conjugado B e Ribi, as titulações de ligação ao peptídeo fosforilado foram significativamente maiores do que as titulações de ligação ao peptídeo não fosforilado em todos os momentos medidos (P = 0,009 no dia 14; P < 0,0001 no dia 28, 56 e 84 usando um teste ANOVA). Para o grupo com adjuvante de alúmen, a diferença foi significativa apenas nos dias 56 e 84 (P = 0,0002 e 0,001, respectivamente). Para animais imunizados com o Conjugado C, as respostas ao peptídeo fosforilado foram maiores apenas quando o adjuvante Ribi foi usado (P < 0,0001 no dia 28; P = 0,0001 nos dias 56 e 84). Exemplo 12: Anticorpos Induzidos por Vacinas Conjugadas se Ligam a

Formas Fisiologicamente Relevantes de Tau Alterada

[0386] Para determinar ainda se os anticorpos induzidos por vacina poderiam se ligar a formas fisiologicamente relevantes de tau alterada, usou-se soros pós-imunização a partir de camundongos vacinados para corar seções do cérebro humano após a morte coletadas de pacientes com doença de Alzheimer (5 casos de AD), de pacientes afetados por outras tauopatias (3 casos de PART, FTD, PICK e PSP) ou de controles saudáveis com a mesma idade (5 casos de controle, CTRL). Como esperado, os soros de animais de controle (grupos de PBS e placebo ativo) não se ligaram às seções do cérebro, enquanto o AT8, um anticorpo monoclonal que se liga a pTau [pSer202, pThr 205] obtido a partir de um clone de murino, mostrou forte imunorreatividade da patologia tau em uma seção de tecido adjacente da área correspondente (Figura 14). Os soros de animais imunizados com as vacinas ativas de Conjugado B e Conjugado C se ligam a estruturas de tau patológica não apenas nas seções de AD (dados não mostrados), mas também naquelas de outras tauopatias (Figura 14). Os anticorpos induzidos por conjugado B reagiram com (pré-)emaranhados, fios de neurópilo e placas neuríticas nos casos de AD. Esses soros pós- imunização também foram capazes de imunorreagir com emaranhados neurofibrilares e fios de neurópilo no tecido cerebral de PART, inclusões neuronais e fios de neurópilos no tecido de FTD-tau (MAPT P301S), inclusões e astrócitos em alguns casos de doença de Pick e, finalmente, as inclusões neuronais, fios de neurópilo e astrócitos típicos de PSP. Os soros policlonais induzidos pelo conjugado C também reagiram às características das estruturas de tau patológica de cada tauopatia. Nos casos de AD, a coloração foi focada principalmente em emaranhados neurofibrilares e, em menor extensão, em placas neuríticas e fios de neurópilo. Uma menor ampliação das áreas correspondentes mostrou resultados semelhantes (dados desconhecidos).

Exemplo 13: Anticorpos Induzidos por Vacina são Funcionais em Camundongos

[0387] A eficácia de proteção da vacina de Conjugado B foi testada em um modelo de injeção de tauopatia (Peeraer e outros, 2015, Neurobiol Dis., 73: 83 a 95). Neste modelo, os camundongos susceptíveis à tauopatia por uma mutação genética (P301L) recebem uma injeção intracerebral de PHF enriquecido isolado do cérebro humano de AD, seguindo os cronogramas indicados na Figura 15A. A injeção, realizada antes do início da tauopatia induzida por transgene, acelera o desenvolvimento da tauopatia nesses animais. Por outro lado, quando a "semente" de ePHF é pré-misturada com um anticorpo capaz de suprimir a atividade de semeadura de tau como AT8, a indução da tauopatia é reduzida (dados não publicados, não mostrados).

[0388] Seguindo o esquema da Figura 15A, avaliou-se o desenvolvimento da tauopatia após injeção estereotáxica de PHF humano enriquecido pré-misturado com IgG purificado a partir de soro de animais imunizados com o Conjugado B, Ribi ou com o controle ativo KLH - Ribi. Dois meses após a injeção, os cérebros desses camundongos foram colhidos e a quantidade de tau agregada nas frações totais e insolúveis em sarkosil foi determinada usando análise bioquímica padrão. Os dados obtidos mostraram que quando os camundongos foram injetados com ePHF que foram pré-misturados com IgG de camundongos vacinados com o Conjugado B, houve significativamente menos fosfo-tau agregado nas frações total (Figura 15B) e insolúvel em sarkosil (Figura 15C) em comparação com animais que receberam a injeção de controle (p < 0,0001 KLH Ribi vs KLH- TAUVAC-p7.1 Ribi usando um teste ANOVA seguido de ajuste de Holm- Bonferroni para múltiplas comparações). Como a tau insolúvel em sarkosil é bem aceita para correlacionar-se com as características patológicas da tauopatia, este resultado demonstra que os anticorpos induzidos por vacinação com KLH-TAUVAC-p7.1 são protetores in vivo. Exemplo 14: Anticorpos Induzidos por Vacina são Funcionais em Primatas Não Humanos

[0389] Os macacos rhesus foram imunizados com conjugado B adjuvantado com alúmen e oligonucleotídeo CpG (n = 6) ou com KLH (n = 2) nos dias 1, 29, 85 e 169. O sangue foi coletado a cada 14 dias e soros de animais imunizados com o conjugado B testados quanto à reatividade no peptídeo de imunização usando ELISA (Figura 16A) e ePHF humano usando MSD (Figura 16B). A imunização com o Conjugado B resultou em uma resposta de anticorpo sustentada e consistente contra o fosfopeptídeo de vacina. Além disso, todos os animais apresentaram níveis mensuráveis de anticorpos contra ePHF humano, com 3 de 6 animais mostrando alta reatividade nesse antígeno. Os soros coletados dos animais 50 dias após a imunização primária foram aplicados às seções do cérebro humano de indivíduos saudáveis ou de pacientes com AD (Figura 16C). Os soros pós-imunização do grupo de Conjugado B coraram as estruturas de tau patológica, ou seja, emaranhados neurofibrilares, fios de neurópilos e placas neuríticas no tecido cerebral de AD, enquanto os soros de camundongos imunizados com KLH não apresentaram reatividade. Não foi observada coloração no tecido de controle. Quando testados no ensaio de imunodepleção de tau, os animais que receberam o Conjugado B tinham anticorpos capazes de se ligarem e depletar a semente de tau (p = 0,03 no dia 50, usando um teste ANOVA seguido pelo ajuste de Dunnett para múltiplas comparações), enquanto a imunização com KLH não desencadeou tais anticorpos (Figura 16D). Os soros pré- e pós-imunização também foram testados no ensaio de neutralização como amostras individuais diluídas em série (Figura 16E). As alterações em relação à linha de base (CFB) foram calculadas como a diferença entre as contagens de FRET para leituras no dia -14 antes da vacinação (linha de base) e após a vacinação nos dias 50, 106 e 190, respectivamente. A resposta em um dia específico pós-vacinação (diai) foi calculada da seguinte forma: 𝑅𝑒𝑠𝑝𝑜𝑠𝑡𝑎 = %𝐹𝑅𝐸𝑇_𝑑𝑖𝑎𝑖 − %𝐹𝑅𝐸𝑇_𝑙𝑖𝑛ℎ𝑎 𝑑𝑒 𝑏𝑎𝑠𝑒

[0390] Foi aplicado um modelo misto linear geral nas respostas mencionadas acima, com animal como efeito aleatório, com grupos de vacina, dias e níveis séricos variáveis tratados como variáveis categóricas e todas as suas interações. Dada a natureza exploratória do estudo, nenhum ajuste de teste múltiplo foi considerado. O teste de hipótese foi realizado no nível de significância de 5%. Exemplo 15: Camundongos imunizados com a vacina conjugada em combinação de adjuvantes alúmen e oligonucleotídeo CpG resultaram em respostas de anticorpos de titulação mais alta ao peptídeo de vacina

[0391] Os camundongos C57BL / 6 fêmeas adultos (n = 5 a 6 por grupo) foram imunizados por via intramuscular com 2 ug (Figura 17A) ou 0,2 ug (Figura 17B) da vacina de Conjugado A. A vacina conjugada foi administrada isoladamente (sem adjuvante), com hidróxido de alúmen, com oligonucleotídeo CpG, ou com alúmen e oligonucleotídeo CpG combinados. Todos os camundongos receberam uma imunização primária no dia 0 do estudo, seguida por uma única imunização de reforço no dia 28. A dose para o adjuvante alúmen foi de 500 ug por camundongo por injeção e a dose para o adjuvante oligonucleotídeo CpG foi de 20 ug por camundongo por injeção. Os gráficos da Figura 17 mostram os resultados de ELISA de ligação usando soro coletado a partir de camundongos antes da imunização (dia 0) e em dois momentos após a imunização (dias 28 e 42) com o peptídeo de vacina T3.5 como o antígeno de revestimento. As titulações médias específicas de desfecho de T3.5 por grupo foram representadas, com barras de erro representando erro padrão. As tabelas mostram a análise estatística dos resultados, nos quais as titulações de anticorpos foram comparadas usando o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, e as comparações entre os grupos foram avaliadas pelo teste de Wilcoxon Signed Rank como post-hoc ao teste de Kruskal Wallis.

[0392] Os resultados mostrados na Figura 17 ilustram que em ambas as doses, a vacina não adjuvantada falhou em induzir uma forte resposta imune. O uso de alúmen ou oligonucleotídeo CpG ou uma combinação de ambos melhorou a magnitude da resposta do anticorpo (p ≤ 0,0152). Além disso, para animais imunizados com 2 ug de vacina, a combinação de adjuvante forneceu titulações de anticorpo significativamente mais altas do que os adjuvantes únicos no dia 28 (p = 0,0028). A combinação de alúmen - oligonucleotídeo CpG também teve um desempenho melhor do que o oligonucleotídeo CpG isoladamente para animais imunizados com 0,2 µg de vacina no dia 42 (p = 0,0497). Estes dados suportam o uso da combinação de adjuvante alúmen e oligonucleotídeo CpG.

[0393] Exemplo 16: Vacinas lipossômicas com diferentes relações peptídeo Tau : epítopos de células T induzem níveis altos e sustentados de titulações de anticorpos IgG específicos para fosfopeptídeos tau

[0394] Os macacos Rhesus adultos (n = 6 por grupo) foram imunizados por via subcutânea nos dias 1, 29, 85 e 169 com 1800 µg de peptídeo tau fosforilado tetrapalmitoilado com acetato de SEQ ID NO: 2 por dose na vacina lipossômica melhorada com epítopo de célula T encapsulado T50, contendo adjuvante 3D- (6-acil) PHAD® e oligonucleotídeo CpG 2006 lipidado com: i) 400 ug / mL de peptídeo tau fosforilado de SEQ ID NO: 2 e 100 ug / mL de T50 (lipossoma Z), ii) 1200 ug / mL de peptídeo tau fosforilado de SEQ ID NO: 2 e 1200 ug / mL de T50 (lipossoma Z+), iii) 400 ug / mL de peptídeo tau fosforilado de SEQ ID NO: 2 e 400 ug / mL de T50 (lipossoma Z++), iv) 1200 ug / mL de peptídeo tau fosforilado de SEQ ID NO: 2 e 300 ug / mL de T50 (lipossoma Z+++). Os sangramentos foram realizados antes da imunização e nos dias 8, 22, 36, 50, 64, 78, 92, 106, 120, 134, 148, 162,

176 e 190 e os soros foram isolados. As titulações de anticorpos IgG específicos nos soros foram determinadas por ELISA, usando o peptídeo tau fosforilado de SEQ ID NO: 2 como antígeno de revestimento e um anticorpo secundário IgG anti-macaco. Os níveis de anticorpos resultantes foram calculados como as titulações de desfecho (última diluição sérica induzindo uma resposta positiva) para cada macaco individual ao longo do tempo. A média geométrica das titulações de desfecho por grupo ± intervalo de confiança de 95% é apresentada na Figura 18, mostrando que todas as quatro vacinas lipossômicas testadas induziram titulações altas e sustentadas contra o peptídeo-tau. Listagem de Sequências

[0395] SEQ ID NO: 1 - peptídeo fosfo-tau (7.1)

[0396] GDRSGYS [pS] PG [pS] PG [pT] PGSRSRT

[0397] SEQ ID NO: 2 - peptídeo fosfo-tau (T3.5)

[0398] VYK [pS] PVVSGDT [pS] PRHL

[0399] SEQ ID NO: 3 - peptídeo fosfo-tau (22.1)

[0400] SSTGSIDMVD [pS] PQLA [pT] LA

[0401] SEQ ID NO: peptídeo tau 4

[0402] VYKSPVVSGDTSPRHL

[0403] SEQ ID NO: 5 - peptídeo fosfo-tau

[0404] RENAKAKTDHGAEIVYK [pS] PVVSGDT [pS] PRHL

[0405] SEQ ID NO: 6 - peptídeo fosfo-tau

[0406] RQEFEVMEDHAGT [pY] GL

[0407] SEQ ID NO: 7 - peptídeo fosfo-tau

[0408] PGSRSR [pT] P [pS] LPTPPTR

[0409] SEQ ID NO: 8 - peptídeo fosfo-tau

[0410] GYSSPG [pS] PG [pT] PGSRSR

[0411] SEQ ID NO: 9 - peptídeo fosfo-tau

[0412] GDT [pS] PRHL [pS] NVSSTGSID

[0413] SEQ ID NO: 10 - peptídeo fosfo-tau

[0414] PG [pS] PG [pT] PGSRSR [pT] P [pS] LP

[0415] SEQ ID NO: 11 - peptídeo fosfo-tau

[0416] HL [pS] NVSSTGSID

[0417] SEQ ID NO: 12 - peptídeo fosfo-tau

[0418] VSGDT [pS] PRHL

[0419] SEQ ID NO: 13 - Epítopo de células T T50

[0420] AKFVAAWTLKAAAVVRQYIKANSKFIGITELVVRFNNFTVS FWLRVPKVSASHLE-NH2

[0421] SEQ ID NO: 14 - Epítopo de células T T46

[0422] AKFVAAWTLKAAAGSQYIKANSKFIGITELGSFNNFTVSFW LRVPKVSASHLEK (Pal) K (Pal)-NH2

[0423] SEQ ID NO: 15 - Epítopo de células T auxiliares T48

[0424] AKFVAAWTLKAAAGSQYIKANSKFIGITELGSFNNFTVSFW LRVPKVSASHLEGSLINSTKIYSYFPSVISKVNQ-NH2

[0425] SEQ ID NO: 16 - Epítopo de células T auxiliares T51

[0426] AKFVAAWTLKAAARRQYIKANSKFIGITELRRFNNFTVSFW LRVPKVSASHLE-NH2

[0427] SEQ ID NO: 17 - Epítopo de células T auxiliares T52

[0428] AKFVAAWTLKAAARKQYIKANSKFIGITELRKFNNFTVSFW LRVPKVSASHLE-NH2

[0429] SEQ ID NO: 18 - CpG 2006 (também conhecido como CpG 7909)

[0430] 5’-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3’

[0431] em que as letras minúsculas significam ligações internucleotídicas fosforotioato (ps)

[0432] SEQ ID NO: 19 - CpG 1018

[0433] 5’-tgactgtgaacgttcgagatga-3’

[0434] em que letras minúsculas significam ligações internucleotídicas fosforotioato

[0435] SEQ ID NO: 20 - CpG2395

[0436] 5’-tcgtcgttttcggcgcgcgccg-3’

[0437] em que as letras minúsculas significam ligações internucleotídicas fosforotioato

[0438] SEQ ID NO: 21 - CpG2216

[0439] 5’-ggGGGACGATCGTCgggggg-3’

[0440] em que as letras minúsculas significam ligações internucleotídicas fosforotioato e as letras maiúsculas significam ligações fosfodiéster (po)

[0441] SEQ ID NO: 22 - CpG2336

[0442] 5'- gggGACGACGTCGTGgggggg -3',

[0443] em que as letras minúsculas significam ligações internucleotídicas fosforotioato e as letras maiúsculas significam ligações fosfodiéster

[0444] SEQ ID NO: 23 - peptídeo epítopo Pan DR (PADRE)

[0445] AKFVAAWTLKAAA

[0446] SEQ ID NO: 24 - P2

[0447] QYIKANSKFIGITEL

[0448] SEQ ID NO: 25 - P30

[0449] FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE

[0450] SEQ ID NO: 26 - TT586–605

[0451] LINSTKIYSYFPSVISKVNQ

[0452] SEQ ID NO: 27 - peptídeo fosfo-tau palmitoilado (palmitoilado 7.1)

[0453] K (pal) K (pal) GDRSGYS [pS] PG [pS] PG [pT] PGSRSRTK (pal) K (pal)

[0454] SEQ ID NO: 28 - peptídeo fosfo-tau palmitoilado (T3, palmitoilado T3.5)

[0455] K (pal) K (pal) VYK [pS] PVVSGDT [pS] PRHLK (pal) K (pal)

[0456] SEQ ID NO: 29 - peptídeo fosfo-tau palmitoilado

(palmitoilado 22,1)

[0457] K (pal) K (pal) SSTGSIDMVD [pS] PQLA [pT] LAK (pal) K (pal)

[0458] SEQ ID NO: 30 - peptídeo tau palmitoilado

[0459] K (pal) K (pal) VYKSPVVSGDTSPRHLK (pal) K (pal)

[0460] SEQ ID NO: 31 - peptídeo fosfo-tau palmitoilado

[0461] K (pal) K (pal) RENAKAKTDHGAEIVYK [pS] PVVSGDT [pS] PRHLK (pal) K (pal)

[0462] SEQ ID NO: 32 - peptídeo fosfo-tau palmitoilado

[0463] K (pal) K (pal) RQEFEVMEDHAGT [pY] GLK (pal) K (pal)

[0464] SEQ ID NO: 33 - peptídeo fosfo-tau palmitoilado

[0465] K (pal) K (pal) PGSRSR [pT] P [pS] LPTPPTRK (pal) K (pal)

[0466] SEQ ID NO: 34 - peptídeo fosfo-tau palmitoilado

[0467] K (pal) K (pal) GYSSPG [pS] PG [pT] PGSRSRK (pal) K (pal)

[0468] SEQ ID NO: 35 - peptídeo fosfo-tau palmitoilado

[0469] K (pal) K (pal) GDT [pS] PRHL [pS] NVSSTGSIDK (pal) K (pal)

[0470] SEQ ID NO: 36 - peptídeo fosfo-tau palmitoilado

[0471] K (pal) K (pal) PG [pS] PG [pT] PGSRSR [pT] P [pS] LPK (pal) K (pal)

[0472] SEQ ID NO: 37 - peptídeo fosfo-tau palmitoilado

[0473] K (pal) K (pal) HL [pS] NVSSTGSIDK (pal) K (pal)

[0474] SEQ ID NO: 38 - peptídeo fosfo-tau palmitoilado

[0475] K (pal) K (pal) VSGDT [pS] PRHLK (pal) K (pal)

[0476] SEQ ID NO: 39 - T50 sem a amida C-terminal

[0477] AKFVAAWTLKAAAVVRQYIKANSKFIGITELVVRFNNFTVS

FWLRVPKVSASHLE

[0478] SEQ ID NO: 40 - T46 sem -Lys (Pal) -Lys (Pal) -NH2 no C terminal

[0479] AKFVAAWTLKAAAGSQYIKANSKFIGITELGSFNNFTVSFW

LRVPKVSASHLE

[0480] SEQ ID NO: 41 - T48 sem a amida C terminal

[0481] AKFVAAWTLKAAAGSQYIKANSKFIGITELGSFNNFTVSFW

LRVPKVSASHLEGSLINSTKIYSYFPSVISKVNQ

[0482] SEQ ID NO: 42 - T51 sem a amida C terminal

[0483] AKFVAAWTLKAAARRQYIKANSKFIGITELRRFNNFTVSFW

LRVPKVSASHLE

[0484] SEQ ID NO: 43 - T52 sem a amida C terminal

[0485] AKFVAAWTLKAAARKQYIKANSKFIGITELRKFNNFTVSFW

LRVPKVSASHLE

[0486] SEQ ID NO: 44 - T57

[0487] AKFVAAWTLKAAAVVRQYIKANSKFIGITELVVRFNNFTVS FWLRVPKVSASHLE-K (Pal) K (Pal) -NH2 Referências

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[0504] WO 90/14837

[0505] WO 2010/115843

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Lipossoma, caracterizado pelo fato de que compreende: a. um peptídeo tau; e b. um epítopo de célula T auxiliar; em que o peptídeo tau é apresentado na superfície do lipossoma.

2. Lipossoma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente pelo menos um dentre um ligante de receptor do tipo toll 4 e um ligante de receptor do tipo toll 9.

3. Lipossoma, caracterizado pelo fato de que compreende: a. um fosfopeptídeo tau; b. um epítopo de célula T auxiliar; c. um oligonucleotídeo CpG lipidado; e d. um adjuvante contendo um ligante de receptor do tipo toll 4; em que o fosfopeptídeo tau é apresentado na superfície do lipossoma.

4. Lipossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um ou mais lipídios selecionados a partir do grupo que consiste em 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocololina (DMPC), 1,2- dimiristoil-sn-glicero-3-fosforil-3’-rac-glicerol (DMPG) e colesterol.

5. Lipossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o peptídeo tau tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 12, em que a sequência de aminoácidos compreende adicionalmente uma ou mais modificações para permitir que o fosfopeptídeo tau seja apresentado na superfície do lipossoma.

6. Lipossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o epítopo de célula T auxiliar compreende pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de: SEQ ID NO: 23 a SEQ ID NO: 26.

7. Lipossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende o oligonucleotídeo CpG lipidado com a sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID NO: 18 a SEQ ID NO: 22, em que o oligonucleotídeo CpG tem uma ou mais ligações internucleotídicas fosforotioato, e o oligonucleotídeo CpG está covalentemente ligado a pelo menos um grupo lipofílico.

8. Lipossoma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o ligante de receptor do tipo toll 4 é o monofosforil lipídio A (MPLA).

9. Lipossoma, caracterizado pelo fato de que compreende: a. um peptídeo tau com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 27 a SEQ ID NO: 38; b. um epítopo de célula T auxiliar tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 39 a SEQ ID NO: 44, preferencialmente, o epítopo de célula T auxiliar que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 13 a SEQ ID NO: 17; c. um oligonucleotídeo CpG lipidado com uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 18 a SEQ ID NO: 22, em que o oligonucleotídeo CpG compreende uma ou mais ligações internucleotídicas fosforotioato, e o oligonucleotídeo CpG está covalentemente ligado a pelo menos um colesterol via um ligante; e d. monofosforil lipídio A (MPLA).

10. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o lipossoma como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

11. Conjugado, caracterizado pelo fato de que compreende um fosfopeptídeo tau e um veículo imunogênico conjugado a ele via um ligante, o conjugado tendo a estrutura de: i) fórmula (I): Peptídeo tau Carreador ou ii) fórmula (II): Peptídeo tau veículo em que x é um número inteiro de 0 a 10, preferencialmente 2 a 6, mais preferencialmente 3; e n é um número inteiro de 3 a 15, de preferência 3 a 12.

12. Conjugado, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o veículo imunogênico é selecionado a partir do grupo que consiste em hemocianina de lapa californiana (KLH), toxoide tetânico, CRM197 e uma mistura de proteínas da membrana externa de N. meningitidis (OMP), ou um derivado dos mesmos.

13. Conjugado, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que o peptídeo tau tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 12.

14. Conjugado, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o conjugado tem a estrutura da fórmula (I) e o veículo imunogênico é CRM197.

15. Conjugado, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que tem a estrutura de: em que n é um número inteiro de 3 a 7.

16. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 15 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

17. Método para induzir uma resposta imune em um indivíduo que sofre de um distúrbio neurodegenerativo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica como definida na reivindicação 10 ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 16.

18. Método para tratar ou prevenir uma doença ou distúrbio neurodegenerativo em um indivíduo em necessidade de tratamento, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica como definido na reivindicação 10 ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 16.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 e 18, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio neurodegenerativo é causado por ou associado à formação de lesões neurofibrilares.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio neurodegenerativo é doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Creutzfeldt-Jacob, Demência pugilística, Síndrome de Down, Doença de Gerstmann- Sträussler-Scheinker, miosite do corpo de inclusão, angiopatia amiloide cerebral por proteína de prião, lesão cerebral traumática, esclerose lateral amiotrófica, parkinsonismo - demência do complexo de Guam, doença neurológica não guamaniana com emaranhados neurofibrilares, demência de grãos argirofílicos, degeneração corticobasal, demência de corpos de Lewy - esclerose lateral amiotrófica, emaranhados neurofibrilares difusos com calcificação, demência frontotemporal, preferencialmente demência frontotemporal com parkinsonismo associado ao cromossomo 17 (FTDP-17), doença de Hallevorden- Spatz, atrofia de múltiplos sistemas, doença de Niemann-Pick tipo C, doença de Pick, gliose subcortical progressiva, paralisia supranuclear progressiva, panencefalite esclerosante subaguda, demência apenas por emaranhado, Parkinsonismo pós-encefalítico, distrofia miotônica, encefalopatia traumática crônica (CTE), tauopatia relacionada à idade primária (PART), ou demência de corpos de Lewy (LBD).

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio neurodegenerativo é a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, síndrome de Down, demência frontotemporal e parkinsonismo ligado ao cromossomo 17 (FTDP-17), degeneração corticobasal, demência de corpos de Lewy – esclerose amiotrófica lateral, dispasia miotônica, encefalopatia traumática crônica (CTE), angiopatia cerebral, tauopatia relacionada à idade primária (PART) ou demência de corpos de Lewy (LBD).

22. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma da composição farmacêutica como definida na reivindicação 10 e a composição farmacêutica como definida na reivindicação 16 para uso no tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio neurodegenerativo em um indivíduo em necessidade de tratamento.