CN117256831A - 来自甜叶菊的食物成分 - Google Patents

Abstract

本发明涉及来自甜叶菊的食物成分。本发明涉及生产来自甜叶菊植物的食物成分的方法及其在食品、饮料和其它消费品中的用途。获得的组合物可用作调味剂、甜味剂、抗氧化剂和其他功能性成分。

Description

来自甜叶菊的食物成分

本申请是申请日为2017年11月29日、申请号为201780083746.5、发明名称为“来自甜叶菊的食物成分”的发明专利申请的分案申请。

相关申请

本申请要求2016年11月29日提交的美国专利申请号62/427,539的优先权，该申请通过引用整体并入本文。出于美国的目的，本申请也是2016年10月3日提交的美国专利申请号15/284,265的部分继续申请，该申请是2015年4月2日提交的美国专利申请号14/677,538并现在授予美国专利号9,456,626的继续申请，美国专利申请号14/677,538是2013年6月12日提交的美国专利申请号13/993,415并现在授予美国专利号9,029,426的继续申请，美国专利申请号13/993,415是2011年12月12日提交的国际申请号PCT/US2011/064343的美国国家阶段申请，其要求2010年12月20日提交的美国专利申请号61/424,798和2010年12月13日提交的美国专利申请号61/422,403的优先权，每个申请通过引用整体并入本文。本申请还通过引用整体并入以下各申请：2012年6月22日提交的美国专利申请号13/530,113并现在授予美国专利号8,530,527；2012年11月6日提交的美国专利申请号13/580,098并现在授予美国专利号8,981,081；2013年7月16日申请的美国专利申请号13/943,776；2013年8月1日申请的美国专利申请号13/957,098并现在授予美国专利号9,510,611；2014年3月3日提交的美国专利申请号14/195,812；和2015年8月18日提交的美国专利申请号14/829,127并现在授予美国专利号9,771,434。

技术领域

本发明涉及生产来自甜叶菊(Stevia rebaudiana)植物的食物成分的方法及其在食品、饮料和其它消费品中的用途。

背景技术

高强度甜味剂的甜度水平是蔗糖的甜度水平的许多倍。它们基本上是无热量的并且广泛用于制造膳食和减少热量的食物。尽管天然的热量甜味剂如蔗糖、果糖和葡萄糖为消费者提供了最理想的味道，但它们具有高热量值。高强度甜味剂不影响血糖水平并提供很少或没有营养价值。

甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)是菊科(Asteraceae(Compositae))的多年生灌木，原产于南美洲的某些地区。该植物的叶子含有10-20％的二萜糖苷，是糖的甜度的约150至450倍。在巴拉圭和巴西，在传统上使用这些叶子以增甜当地的茶和药物已经有数百年。

目前，有超过230种具有显著增甜特性的甜菊属(Stevia)的种。该植物已成功种植在从其原生亚热带到寒冷的北纬地区的各种条件下。

甜叶菊植物的提取物含有不同甜味二萜糖苷的混合物，所述二萜糖苷具有单一的基础(甜菊醇)并且不同之处在于在C13和C19位置存在碳水化合物残基。这些糖苷在甜菊叶中积累，占总干重的约10％-20％。通常，基于干重，在甜菊的叶中发现的四种主要糖苷是杜克苷A(0.3％)、莱鲍迪苷C(0.6-1.0％)、莱鲍迪苷A(3.8％)和甜菊苷(9.1％)。在甜菊提取物中鉴定的其他糖苷包括莱鲍迪苷B、C、D、E和F、甜菊醇双糖苷和甜茶苷。

甜菊糖苷具有零热量并且能够在任何使用糖的地方使用。它们是糖尿病和低热量膳食的理想选择。

另一方面，必须注意的是，在与甜菊糖苷一起的制造方法中，甜菊植物的大量其他成分也用水提取。这些其他成分主要在下游加工过程中分离(separate)并丢弃到环境中。

关于甜叶菊植物的这些其他成分知之甚少。有一些作者报告酚类化合物、游离氨基酸等，但有关这些成分的身份的信息仍然很少并且没有描述它们在食品、饮料和其他消费品中的可能用途(et al,2011,2015；/>2012；Periche etal,2014)。

迄今为止没有关于将甜菊植物的其他提取成分加工成任何食物成分的报道。因此，如果大规模实现，这能够提供显著的经济和环境效益，因为它可以提供将整个甜叶菊植物包含在食物链中的机会，从而产生实际上无废的甜菊加工。

因此，需要开发一种方法来有效地从甜叶菊植物中分开(isolate)这些成分(constituent)并将它们用作不同消费品中的成分(ingredient)。

发明概述

本发明旨在克服现有甜菊工业加工方案的缺点。本发明描述了生产来自甜叶菊植物的食物成分的方法及其在包括食品和饮料在内的各种消费品中的用途。

本发明部分地涉及包含酚类和其他非甜菊糖苷化合物的组合物，其衍生自甜叶菊植物。

在下文中，术语“甜菊糖苷”将指甜叶菊中天然存在的甜菊糖苷，包括但不限于甜菊醇单糖苷、甜菊醇双糖苷、甜茶苷、杜克苷B、杜克苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷G、甜菊苷、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷H、莱鲍迪苷L、莱鲍迪苷K、莱鲍迪苷J、莱鲍迪苷M、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷N、莱鲍迪苷O及其组合。

在下文中，术语“RebA”、“RebB”、“RebC”、“RebD”、“RebE”、“RebF”、“RebM”、“RebN”和“RebO”是指莱鲍迪苷A、B、C、D、E、F、M、N和O。

在下文中，术语“Stev”、“Sbio”、“DulA”、“Rub”是指甜菊苷、甜菊醇双糖苷、杜克苷A和甜茶苷。

在下文中，术语“TSG含量”将指总甜菊糖苷(TSG)含量，并且基于wt/wt干重计，将其计算为莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷M、莱鲍迪苷N、莱鲍迪苷O、甜菊糖苷、甜菊醇双糖苷、杜克苷A和甜茶苷的浓度之和。

在下文中，术语“CGA”将指天然存在于植物中的绿原酸及其衍生物，包括但不限于新绿原酸(neo-CGA；5-O-咖啡酰奎宁酸或5-CQA)、隐黄绿原酸(crypto-CGA；4-O-咖啡酰奎宁酸或4-CQA)、正绿原酸(n-CGA；3-O-咖啡酰奎宁酸或3-CQA)、异绿原酸A(iso-CGAA；3,5-二咖啡酰奎宁酸)异绿原酸B(iso-CGAB；3,4-二咖啡酰奎宁酸)、异绿原酸C(iso-CGA C；4,5-二咖啡酰奎宁酸)及其组合。

在下文中，术语“TCGA含量”将指总绿原酸(TCGA)含量，并且基于wt/wt干重计，将其计算为neo-CGA、crypto-CGA、n-CGA、iso-CGA A、iso-CGAB和iso-CGAC的浓度之和。

在本发明中，甜叶菊植物材料、特别是叶和/或茎用作起始材料。

使用水或含水醇溶剂对植物材料进行提取。

进一步处理所获得的水或含水醇提取物以分离甜菊糖苷级分。剩余的级分被称为“非甜菊糖苷组合物”(NSGC)-意指主要包含除甜菊糖苷以外的化合物的组合物，其存在于甜叶菊植物的水或含水醇提取物中(下文称为“非甜菊糖苷分子”)。“非甜菊糖苷分子”的非限制性实例包括酚类化合物、多酚类、类黄酮、奎尼酸和咖啡酸及其衍生物、新绿原酸(neo-CGA；5-O-咖啡酰奎宁酸或5-CQA)、隐绿原酸(crypto-CGA；4-O-咖啡酰奎宁酸或4-CQA)、正绿原酸(n-CGA；3-O-咖啡酰奎宁酸或3-CQA)、异绿原酸A(iso-CGAA；3,5-二咖啡酰奎宁酸)异绿原酸B(iso-CGA B；3,4-二咖啡酰奎宁酸)、异绿原酸C(iso-CGA C；4,5-二咖啡酰奎宁酸)、本领域已知的其他绿原酸和异绿原酸、类视黄醇、色素、多糖、寡糖、二糖、单糖、挥发油组分、甾醇、萜类化合物、倍半萜、二萜、三萜、香豆素、脂肪酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、二肽、寡肽、多肽、蛋白质、澳泽兰素、槲皮素、甜叶菊素、桉油烯醇(spathulenol)、癸酸、8,11,14-二十碳三烯酸(ecosatrienoic acid)、2-甲基十八烷、二十五烷、二十八烷、豆甾醇、b-谷甾醇(bsitosterol)、a-和b-香树素(amyrine)、羽扇豆醇(lupeol)、b-香树素乙酸酯(b-amyrin acetate)、五环三萜(pentacyclic triterpene)和/或其苷类。

在本发明的一些实施方案中制备并命名为NSGC的组合物还可含有一些残留量的甜菊糖苷。

一些NSGC可以通过本领域已知的任何食物成分加工方法进一步纯化和/或以其他方式加工以获得其他NSGC。

本发明的NSGC适用于各种消费品、食品和饮料，如香料、调味剂、增味剂、甜味剂、防腐剂、抗氧化剂、乳化剂、增稠剂(texturizing)、膨胀剂(bulking)、稳定剂、增溶剂和其它食物成分。

应理解，前面的一般性描述和以下的详述都是示例性和说明性的，并且旨在提供对要求保护的本发明的进一步说明。

附图简要说明

包括附图以提供对本发明的进一步理解。附图示例显示了本发明的实施方案，并与说明书一起用于解释本发明的实施方案的原理。

图1显示了一些CGA的结构。

图2显示甜叶菊CGA的HPLC色谱图。

发明详述

根据下文给出的详述，本发明的优点将变得更加明显。然而，应该理解的是，详述和具体实施例虽然表明了本发明的优选实施方案，但是仅以示例说明的方式给出，因为从该详述出发，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。

本领域技术人员还将认识到，可以省略下面描述的一个或多个其他加工步骤。本领域技术人员也将理解，尽管下面描述的方法假设所述步骤的某种顺序，但在一些情况下可以改变该顺序。

提取

在本发明中，甜叶菊植物材料、特别是甜叶菊植物的叶和/或茎用作起始材料。甜叶菊植物材料提取物可以使用任何方法获得，例如但不限于美国专利号7,862,845中描述的提取方法，其全部内容通过引用并入本文，以及膜过滤、超临界流体提取、酶辅助提取、微生物辅助提取、超声辅助提取、微波辅助提取等。

在一个实施方案中，甜叶菊植物材料(例如叶)可以在约20℃至约100℃的温度干燥，直至达到约5％至约15％的水分含量。在具体实施方案中，植物材料可在约20℃至约60℃干燥约1至约240小时的时间段，

在其他具体实施方案中，植物材料可以在约20℃至约35℃的温度干燥以防止分解。

在一些实施方案中，甜叶菊植物材料可在真空或减压下干燥。

在一些实施方案中，甜叶菊植物材料可以在惰性气体如N₂的存在下干燥。

在一些实施方案中，甜叶菊植物材料可以冷冻干燥。

在一些实施方案中，任选地研磨干燥的植物材料。粒度可以为约0.1至约20mm。

植物材料(研磨的或未研磨的)可以通过任何合适的提取方法提取，例如连续或分批回流提取、超临界流体提取、酶辅助提取、微生物辅助提取、超声辅助提取、微波助提取等。用于提取的溶剂可以是任何合适的溶剂，例如极性有机溶剂(脱气、真空、加压或蒸馏)、非极性有机溶剂、水(脱气、真空、加压、去离子、蒸馏、碳处理或反渗透)或其混合物。在具体实施方案中，溶剂包含水和一种或多种醇。在另一个实施方案中，溶剂是水。在另一个实施方案中，溶剂是一种或多种醇。醇可选自，例如甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇及其混合物。

在具体实施方案中，在连续回流提取器中用水提取植物材料。本领域技术人员将认识到，提取溶剂与植物材料的比例将基于溶剂的特性和待提取的植物材料的量而变化。通常，提取溶剂与千克干植物材料的比例为约20升至约25升对于约1千克叶。

提取溶剂的pH可以是约pH2.0至7.0，例如，约pH2.0至约pH5.0，约pH2.0至约pH4.0，或约pH2.0至约pH3.0。在具体实施方案中，提取溶剂是含水的，例如水和任选地以提供约pH2.0至7.0的pH，例如约pH2.0至约pH5.0，约pH2.0至约pH4.0或约pH2.0至约pH 3.0的量的酸和/或碱。可以使用任何合适的酸或碱来为提取溶剂提供所需的pH，例如HCl、NaOH、柠檬酸等。

提取可以在约25℃至约100℃的温度进行，例如，约30℃至约80℃，约35℃至约75℃，约40℃至约70℃，约45℃至约65℃或约50℃至约60℃。

在提取方法是分批提取方法的实施方案中，提取的持续时间可以为约0.5小时至约24小时，例如约1小时至约12小时、约1小时至约8小时或约1小时至约6小时。

在提取方法是连续方法的实施方案中，提取的持续时间可以为约1小时至约5小时，例如约2.5小时至约3小时。

提取后，可通过过滤将不溶性植物材料与溶液分离，从而提供含有甜菊糖苷和其他分子如上所述为“非甜菊糖苷分子”的滤液。这种固液分离可以通过任何合适的手段实现，包括但不限于重力过滤、板框式压滤器、错流过滤器、筛网过滤器、Nutsche过滤器、带式过滤器、陶瓷过滤器、膜过滤器、微过滤器、纳米过滤器、超滤器或离心。任选地，各种助滤剂如硅藻土、膨润土、沸石等也可用于该方法中。

含有甜菊糖苷和“非甜菊糖苷分子”的滤液的预处理

在一些实施方案中，含有甜菊糖苷和“非甜菊糖苷分子”的滤液任选地在与大孔聚合物吸附剂接触之前进行预处理。所述预处理可以例如通过选自包括但不限于硅藻土(diatomaceous earth)、硅藻土(diatomite)、硅藻土/硅藻土(kieselgur/kieselguhr)、膨润土、活性炭、任何食品级过滤助剂、任何絮凝剂、任何螯合剂、任何酸、任何碱(base)/强碱(alkali)、本领域已知的任何离子交换树脂的至少一种试剂或其组合来实现。在一些实施方案中，预处理可以通过本领域已知的超滤和/或纳米过滤和/或RO-过滤膜系统的额外过滤来实现。

甜菊糖苷的吸附

在某些实施方案中，含有甜菊糖苷和“非甜菊糖苷分子”的滤液与大孔聚合物吸附剂接触。大孔聚合物吸附剂可以是能够吸附甜菊糖苷的任何中性、酸性或碱性大孔聚合物吸附树脂，例如XAD系列(Rohm and Haas)、/>HP系列(MitsubishiChemical Corp)、/>SP系列(Mitsubishi Chemical Corp)、CangzhouYuanwei YWD系列(Cangzhou Yuanwei Chemical Co.Ltd.,China)或同等产品。吸附剂可以填充到柱子中，直至其总体积的约75％至约100％。

甜菊糖苷和一些“非甜菊糖苷分子”被大孔聚合物吸附剂吸附，而其他“非甜菊糖苷分子”不被吸附并通过流过柱子在流穿流出物中。

可以通过改变含水乙醇的浓度来洗脱大孔吸附树脂，以获得富含甜菊糖苷和/或“非甜菊糖苷分子”的各种洗脱液级分。

在一些实施方案中，可以通过改变洗脱溶剂的pH来洗脱大孔吸附树脂。

可选的沉淀杂质

可以调节含有甜菊糖苷和/或“非甜菊糖苷分子”的滤液的pH以除去额外的杂质。在一个实施方案中，通过用碱(例如氧化钙或氢氧化钙)(滤液体积的约1.0％)处理并缓慢摇动，可将滤液的pH调节至约8.5至约10.0。

如上所述，用碱处理滤液得到悬浮液，通过用任何合适的絮凝/凝结剂处理，将pH可以调节到约3.0至约4.0。合适的絮凝/凝结剂包括，例如，钾明矾、硫酸铝、氢氧化铝、氧化铝、CO₂、H₃PO₄、P₂O₅、MgO、SO₂、阴离子聚丙烯酰胺、具有长链脂肪酸取代基的季铵化合物、膨润土、硅藻土、KemTab Sep系列、Superfloc系列、KemTab Flote系列、Kemtalo Mel系列、Midland PCS-3000、Magnafloc LT-26、Zuclar 100、Prastal 2935、Talofloc、Magox、铁盐或其组合。示例性的铁盐包括但不限于FeSO₄、FeCl₂、Fe(NO3)₃、Fe₂(SO4)₃、FeCl₃及其组合。在具体实施方案中，三价铁盐是FeCl₃。可以用絮凝/凝结剂处理滤液持续约5分钟至约1小时，例如约5分钟至约30分钟，约10分钟至约20分钟或约10分钟至约15分钟。搅拌或缓慢摇动(agitation)也可用于促进处理。任选地，然后可以用碱(例如氧化钙或氢氧化钠)将所得混合物的pH调节至约8.5至约9.0。用碱处理和任选地摇动的持续时间为约5分钟至约1小时，例如约10分钟至约50分钟，约15分钟至约45分钟，约20分钟至约40分钟或约25分钟至约35分钟。在具体实施方案中，碱是氧化钙，在缓慢摇动下使用约15至约40分钟。

在一个实施方案中，含有甜菊糖苷和/或“非甜菊糖苷分子”的滤液可以与至少一种醇混合以沉淀一些杂质。

从滤液中分离沉淀的化合物和不溶性颗粒，从而提供包含“非甜菊糖苷分子”的组合物。沉淀分离可通过任何合适的手段实现，包括但不限于重力过滤、板框式压滤器、错流过滤器、筛网过滤器、Nutsche过滤器、带式过滤器、陶瓷过滤器、膜过滤器、微过滤器、纳米过滤器、超滤器或离心。任选地，可以在该方法中使用多种助滤剂，例如硅藻土、膨润土、沸石等。

去离子

含有甜菊糖苷和/或“非甜菊糖苷分子”的滤液可以通过任何合适的方法进行去离子，包括例如电渗析、过滤(纳米过滤或超滤)、反渗透、离子交换、混合床离子交换或这些方法的组合。在一个实施方案中，含有“非甜菊糖苷分子”的滤液通过用一种或多种离子交换树脂处理而去离子，以提供树脂处理的滤液。在一个实施方案中，含有甜菊糖苷和/或“非甜菊糖苷分子”的滤液通过强酸阳离子交换树脂。在另一个实施方案中，使含有甜菊糖苷和/或“非甜菊糖苷分子”的滤液通过弱碱阴离子交换树脂。在另一个实施方案中，使含有甜菊糖苷和/或“非甜菊糖苷分子”的滤液通过强酸阳离子交换树脂，然后通过弱碱阴离子交换树脂。在另一个实施方案中，使含有甜菊糖苷和/或“非甜菊糖苷分子”的滤液通过弱碱阴离子交换树脂，然后通过强酸阳离子交换树脂。

阳离子交换树脂可以是任何强酸阳离子交换剂，其中官能团是例如磺酸。合适的强酸阳离子交换树脂是本领域已知的，包括但不限于Rohm&Haas10FPC22H树脂，它是磺化的二乙烯基苯苯乙烯共聚物；得自Dow Chemical Company的/>离子交换树脂；得自Serva Electrophoresis GmbH的15/>离子交换树脂；得自Qualichem,Inc.的T42强酸性阳离子交换树脂和A23强碱离子交换树脂；以及得自Lanxess的Lewatit强离子交换树脂。在具体实施方案中，强酸阳离子交换树脂是/>10FPC22H树脂(H+)。如本领域技术人员所知，用于本发明实施方案的其它合适的强酸阳离子交换树脂是可商购的。

阴离子交换树脂可以是任何弱碱阴离子交换剂，其中官能团是例如叔胺。合适的弱碱阴离子交换树脂是本领域已知的，包括但不限于树脂，例如Amberlite-FPA53(OH-)、Amberlite IRA-67、Amberlite IRA-95、Dowex 67、Dowex 77和Diaion WA30可以使用。在具体实施方案中，弱碱阴离子交换树脂是Amberlite-FPA53(OH-)树脂。如本领域技术人员所知，用于本发明实施方案的其它合适的弱碱阴离子交换树脂是可商购的。

在具体实施方案中，含有甜菊糖苷和/或“非甜菊糖苷分子”的滤液通过强酸阳离子交换树脂，例如10FPC22H树脂(H+)，然后通过弱碱阴离子交换树脂，例如Amberlite-FPA53(OH-)，从而提供树脂处理的滤液。通过一个或多个离子交换柱的比速(SV)可以是约0.01至约5小时-1，例如约0.05至约4小时-1，约1至约3小时-1或约2至约3小时-1。在具体实施方案中，通过一个或多个离子交换柱的比速为约0.8小时-1。在使含有甜菊糖苷的第二滤液通过一个或多个离子交换柱完成后，用水、优选地反渗透(RO)水洗涤一个或多个离子交换柱。在进行多柱步骤之前，可以将从水洗和树脂处理的滤液获得的溶液合并。

脱色

含有甜菊糖苷和/或“非甜菊糖苷分子”的滤液的脱色可以用任何已知的方法实现，例如与活性炭接触。活性炭的量可以为约0.1％(wt/vol)至约0.8％(wt/vol)。在具体实施方案中，活性炭的量为约0.25％(wt/vol)至约0.30％(wt/vol)。可以连续摇动悬浮液。处理温度可以是约20℃至约30℃，例如约25℃。处理可以是足以使洗脱的溶液脱色的任何持续时间，例如，约20分钟至约3小时，20分钟至约2小时，约30分钟至1.5小时或约1小时至约1.5小时。在处理之后，可以通过任何已知的分离手段进行对用过的碳的分离，例如重力或抽滤，离心或板框式压滤器。

备选地，含有甜菊糖苷和/或“非甜菊糖苷分子”的滤液可以通过填充有活性炭的柱。

还应理解，用碳或其它脱色剂处理不仅可以产生脱色效果，而且还可以改善味道、风味、香味和其它感官特性。

浓缩和/或干燥

来自含有“非甜菊糖苷分子”的滤液中的水或醇可以通过任何合适的手段除去，包括但不限于减压蒸发或真空纳米过滤、冷冻干燥、急骤干燥、喷雾干燥或其组合，从而提供包含“非甜菊糖苷分子”的浓缩的或干燥的组合物。干燥的组合物可任选地进行成团和/或通过压实或湿法制粒技术进行造粒。

色谱

本发明的非甜菊糖苷分子和NSGC可以使用各种色谱技术进一步纯化和分离，包括在分析、制备、试验或工业规模进行纸色谱、薄层色谱、柱色谱、液相色谱(LC)中压LC(MPLC)、高效LC(HPLC)、超高效LC(UHPLC)、快速柱色谱、置换色谱、亲和色谱、超临界流体色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、吸附色谱、膨胀床吸附色谱、反相色谱、正相色谱、亲水相互作用色谱(HILIC)、疏水相互作用色谱、二维色谱、模拟移动床色谱(SMBC)、逆流色谱和手性色谱。

在一个实施方案中，使用包含填充有吸附树脂的柱的色谱系统，并且通过施加具有梯度增加浓度的醇(例如乙醇)溶剂来实现洗脱，从而分离富含甜菊糖苷或“非甜菊糖苷分子”的级分。

在其他实施方案中，使用包含填充有离子交换树脂的柱的色谱系统，并通过施加酸性或碱性溶剂实现洗脱，从而分离富含甜菊糖苷或“非甜菊糖苷分子”的级分。

在另一个实施方案中，使用包含多个填充有吸附和/或离子交换树脂的连续连接的色谱柱的色谱系统，类似于美国专利8,981,081中所述的色谱系统，其全部内容并入本文作为参考。

在另一个实施方案中，通过HPLC系统进行分离，具有以下配置：

·Agilent 1200系列HPLC-配备二元泵、自动进样器、柱温箱和DAD检测器；

·HPLC柱-Poroshell 120SB-C18，4.6×150mm，2.7μm，40℃；

·进样量-5μL；

·探测器-UV 210nm；

·流动相A-25:75(％v/v)乙腈和缓冲液(10mmol/L磷酸钠缓冲液，pH值为2.6)；

·流动相B-32:68(％v/v)乙腈和缓冲液(10mmol/L磷酸钠缓冲液，pH值为2.6)；

·流动相位梯度：

0分钟-100％A，0％B

12分钟-100％A，0％B

12.5分钟-50％A，50％B

13分钟-0％A，100％B

40分钟-0％A，100％B

·流速-0.5mL/min；

·运行时间-45分钟；

·柱后时间-10分钟。

结晶

本发明的非甜菊糖苷分子和NSGC可以使用各种结晶技术进一步纯化和分离，包括但不限于冷却结晶、蒸发结晶、分级结晶、盐析等。

在一些实施方案中，结晶可以在0.1％至99％(w/w)的浓度进行。

在一些实施方案中，结晶由包含选自包括水、乙醇、甲醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、氯仿、甲苯、苯、二甲苯、四氯化碳、环己烷、1,2-二氯乙烷、二氯甲烷、乙醚、二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、庚烷、己烷、甲基叔丁基醚、戊烷、2,2,4-三甲基戊烷、丙酮、四氢呋喃、甲酸、乙酸及其组合的至少一种溶剂的溶剂进行。

在另一个实施方案中，通过添加碱、或强碱、或盐、或酸或能够形成不太可溶的非甜菊糖苷分子衍生物的任何其他试剂来实现结晶，并且其中进一步的方法可以包括转化衍生的非甜菊糖苷分子回到天然状态的步骤。

在其他实施方案中，结晶温度可以在-20℃至80℃发生变化。在一些实施方案中，温度升高和/或降低可以通过梯度方法完成。

在其他实施方案中，结晶中使用的溶剂或溶剂混合物的极性在非极性至极性之间变化。包括介电常数范围为1至88的溶剂。

在一些实施方案中，结晶溶液离子强度在0mol/L至20mol/L变化。

在其他实施方案中，结晶溶液的pH在1至12发生变化。

液-液和固液提取

包含本发明的非甜菊糖苷分子或其衍生物的NSGC可以使用多种固-液和液-液提取技术进一步纯化和分离，包括但不限于分散液-液提取、直接有机提取、连续逆流提取、多级连续逆流提取、离心提取、含水两相提取、聚合物-聚合物提取、聚合物-盐提取等。

合适的溶剂包括水和有机溶剂，所述有机溶剂选自乙醇、甲醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、氯仿、甲苯、苯、二甲苯、四氯化碳、环己烷、1,2-二氯乙烷、二氯甲烷、乙醚、二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、庚烷、己烷、甲基-叔丁基醚、戊烷、2,2,4-三甲基戊烷、丙酮、四氢呋喃、甲酸、乙酸及其组合。

膜分离

包含本发明的非甜菊糖苷分子或其衍生物的NSGC可以使用多种膜分离技术进一步纯化和分离，所述膜分离技术包括超滤、纳米过滤、反渗透、透析、正向渗透、电渗析、电去离子、电过滤、错流过滤、切向流过滤、死端过滤、螺旋膜过滤(spiral would membranefiltration)、中空纤维膜过滤、筒式过滤、级联膜过滤等。

具有NSGC的消费品

本发明的一个实施方案是包含至少一种非甜菊糖苷分子的NSGC。

在一些实施方案中，NSGC赋予甜味。

在一个实施方案中，本发明是包含NSGC的甜味剂组合物。

在另一个实施方案中，本发明是NSGC，其在消费品中用作抗氧化剂、膳食纤维、脂肪酸、维生素、矿物质、防腐剂、水合剂、益生菌、益生元、体重控制剂、骨质疏松症管理剂、植物雌激素、长链伯脂族饱和醇、植物甾醇及其组合的来源。

在另一个实施方案中，本发明是包含NSGC的风味增强组合物，其中当将风味增强组合物添加到消费品中时，NSGC以有效提供浓度等于或低于NSGC的阈值风味识别水平的量存在。在具体实施方案中，当将风味增强组合物添加到消费品中时，NSGC以有效提供低于NSGC的阈值风味识别水平的浓度存在。在一个实施方案中，当将风味增强组合物添加到消费品中时，NSGC以有效提供低于NSGC的阈值风味识别水平至少约1％，至少约5％，至少约10％，至少约15％，至少约20％或至少约25或更多的浓度的量存在。

在另一个实施方案中，本发明是包含NSGC的甜味增强组合物，其中当将甜味增强组合物添加到消费品中时，NSGC以有效提供浓度等于或低于NSGC的阈值甜味识别水平的量存在。在具体实施方案中，当将甜味增强组合物添加到消费品中时，NSGC以有效提供低于NSGC的阈值甜味识别水平的量存在。在一个实施方案中，当将甜味增强组合物添加到消费品中时，NSGC以有效提供低于NSGC的阈值甜味识别水平的至少约1％，至少约5％，至少约10％，至少约15％，至少约20％或至少约25或更多的浓度的量存在。

在又一个实施方案中，本发明是包含NSGC的消费品。合适的消费品包括但不限于基于液体的或干燥的消费品，例如药物组合物、可食用凝胶混合物和组合物、牙科组合物、食品、饮料和饮料产品。

在具体实施方案中，本发明是包含NSGC的饮料。在具体实施方案中，NSGC以高于、等于或低于NSGC的阈值甜味识别浓度的浓度存在于饮料中。

在另一个具体实施方案中，本发明是包含NSGC的饮料产品。在具体实施方案中，NSGC以高于、等于或低于NSGC的阈值风味识别浓度的浓度存在于饮料产品中。

在另一方面，本发明是制备消费品的方法，包括(i)提供消费品基质和(ii)将NSGC添加到消费品基质中以提供消费品。在具体实施方案中，NSGC以高于、等于或低于NSGC的阈值甜度识别的浓度存在于消费品中。在另一个具体实施方案中，NSGC以高于、等于或低于NSGC的阈值风味识别的浓度存在于消费品中。

在具体实施方案中，本发明是制备饮料的方法，包括(i)提供饮料基质和(ii)将NSGC添加到饮料基质中以提供饮料。在具体实施方案中，NSGC以高于、等于或低于NSGC的阈值甜度识别的浓度存在于消费品中。在另一个具体实施方案中，NSGC以高于、等于或低于NSGC的阈值风味识别浓度的浓度存在于消费品中。

另一方面，本发明是增强消费品的甜度的方法，包括(i)提供包含至少一种甜味成分的消费品和(ii)将NSGC添加到消费品中以提供具有增强甜味的消费品，其中NSGC以等于或低于NSGC的阈值甜味识别浓度的浓度存在于具有增强甜味的消费品中。

在具体实施方案中，本发明是增强饮料的甜度的方法，包括(i)提供包含至少一种甜味成分的饮料和(ii)向饮料中加入NSGC以提供具有增强甜味的饮料，其中NSGC以低于NSGC的阈值甜味识别浓度的浓度存在于具有增强甜味的饮料中。在一个实施方案中，NSGC以低于NSGC的阈值甜味识别浓度的至少约1％，至少约5％，至少约10％，至少约15％，至少约20％，或至少约25％或更多的浓度存在于具有增强甜味的饮料中。

在另一方面，本发明是增强消费品的风味的方法，包括(i)提供包含至少一种风味成分的消费品和(ii)将NSGC添加到消费品中以提供具有增强风味的消费品，其中NSGC等于或低于NSGC的阈值风味识别浓度的浓度存在于具有增强风味的消费品中。

在具体实施方案中，本发明是增强饮料风味的方法，包括(i)提供包含至少一种风味成分的饮料和(ii)将NSGC添加到饮料中以提供具有增强风味的饮料，其中NSGC以等于或低于NSGC的阈值风味识别浓度的浓度存在于具有增强风味的饮料中。在一个实施方案中，NSGC以低于NSGC的阈值风味识别浓度的至少约1％，至少约5％，至少约10％，至少约15％，至少约20％，或至少约25％或更多的浓度存在于具有增强风味的饮料中。

在上述方法中，NSGC可以原样加入，或以包含NSGC的组合物的形式加入。当NSGC作为组合物提供时，当组合物被添加到消费品例如食物或饮料中时，组合物中NSGC的浓度有效地提供高于、等于或低于NSGC的阈值风味剂或甜味剂组合物的浓度。

在一些实施方案中，本发明的组合物还包含一种或多种罗汉果苷，其中罗汉果苷选自但不限于罗汉果提取物、其他罗汉果苷的分开和纯化方法的副产物、市售的罗汉果提取物、罗汉果苷IIE、罗汉果苷IIB、罗汉果苷III、罗汉果苷IV、罗汉果苷V、11-氧代-罗汉果苷V、罗汉果苷VI，赛门苷I(siamenoside I)、光果木鳖皂苷Ⅰ(grosmomoside I)、新罗汉果苷(neomogroside)和罗汉果(Siraitiagrosvenorii)果实中的其他罗汉果苷和氧代-罗汉果苷及其组合。

在其他实施方案中，本发明的组合物还包含一种或多种甜味剂或另外的甜味剂。在一个实施方案中，另外的甜味剂是天然甜味剂或合成甜味剂。在具体实施方案中，另外的甜味剂是高强度甜味剂。在具体实施方案中，另外的甜味剂是罗汉果苷。

在一些实施方案中，本发明的组合物还包含一种或多种添加剂。在具体实施方案中，添加剂选自碳水化合物，多元醇，氨基酸及其相应的盐，聚氨基酸及其相应的盐，糖酸及其相应的盐，核苷酸，有机酸，无机酸，有机物盐包括有机酸盐和有机碱盐，无机物盐，苦味化合物，香料和调味成分，收敛剂化合物，蛋白质或蛋白质水解产物，表面活性剂，乳化剂，类黄酮，醇，聚合物及其组合。

在一些实施方案中、本发明的组合物还包含一种或多种功能成分。在具体实施方案中、功能成分选自咖啡因、皂苷、抗氧化剂、膳食纤维来源、脂肪酸、维生素、葡糖胺、矿物质、防腐剂、水合剂、益生菌、益生元、体重控制剂、骨质疏松症管理剂、植物雌激素、长链伯脂族饱和醇、植物甾醇及其组合。

在具体实施方案中，本发明是包含NSGC和一种或多种甜味剂、另外的甜味剂、添加剂或功能成分的消费品。

在另一个具体实施方案中，本发明是包含NSGC和一种或多种甜味剂、另外的甜味剂、添加剂或功能成分的饮料。

NSGC可以单独使用或与至少一种其它甜味剂组合使用在消费品中，所述消费品包括食品、饮料、药物组合物、烟草、营养品、口腔卫生组合物或化妆品。其他甜味剂选自蔗糖、甘油醛、二羟基丙酮、赤藓糖(erythrose)、苏糖、赤藓酮糖(erythrulose)、阿拉伯糖、来苏糖、核糖、木糖、核酮糖、木酮糖、阿洛糖、阿卓糖、阿卢糖、半乳糖、葡萄糖、古洛糖、艾杜糖、甘露糖、塔罗糖、果糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、甘露庚酮糖、景天庚酮糖(sedoheltulose)、辛酮糖、岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、土拉糖、唾液糖、菊粉、低聚菊糖、低聚果糖、高果糖玉米糖浆(HFCS)、麦芽糖糊精、偶联糖、蜂蜜、甜叶菊、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷G、莱鲍迪苷H、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷J、莱鲍迪苷K、莱鲍迪苷L、莱鲍迪苷M、莱鲍迪苷N、莱鲍迪苷O、杜克苷A、杜克苷B、甜茶苷、甜菊醇双糖苷、甜菊苷、甜叶菊植物中出现的其他甜菊糖苷、生物合成甜菊糖苷、糖基化甜菊糖苷、糖基化甜菊糖苷(GSG)、罗汉果苷IV、罗汉果苷V、罗汉果苷VI、罗汉果、赛门苷、罗汉果果实中的其他罗汉果苷、莫纳甜及其盐、仙茅素、甘草酸及其盐、奇异果甜蛋白、应乐果甜蛋白、马槟榔甜蛋白(mabinlin)、植物甜蛋白(brazzein)、hernandulcin、叶甘素(phyllodulcin)、菝葜苷(glycyphyllin)、根皮苷(phloridzin)、三叶苷(trilobatin)、白云参苷(baiyunoside)、osladin、polypodoside A、pterocaryoside A、pterocaryoside B、mukurozioside、糙苏苷I(phlomisoside I)、巴西甘草甜素I(periandrin I)、abrusosideA、青钱柳苷I(cyclocarioside I)、糖醇、三氯蔗糖、乙酰磺胺酸钾、乙酰磺胺酸及其盐、阿斯巴甜、阿力甜、糖精及其盐、新橙皮苷二氢查尔酮、环己基氨基磺酸、环己基氨基磺酸及其盐、纽甜、爱德万甜及其组合。

以下实施例示例说明了本发明的优选实施方案。应当理解，本发明不限于实施例中提出的材料、比例、条件和程序，这些仅是说明性的。

实施例1：

NSGC的制备

将5千克干燥的甜叶菊叶(具有约8％(w/w)水分含量和约10％(w/w，基于干重)总甜菊糖苷)研磨成10-20mm颗粒。将干燥的叶材料装入提取罐中并用100L的RO水在65℃进行提取10分钟。通过过滤除去不溶物。收集淡黄色滤液，并进料到装有8.5L聚合物大孔吸附树脂(YWD-03，Cangzhou Yuanwei，China)的柱，流速约为50L/小时。滤液完成后，另外用45L的水洗涤柱子，合并两种流出物。将合并的溶液在真空下蒸发，温度为30℃-35℃，最终体积为10L。

大多数甜菊糖苷被吸附在大孔吸附树脂上，并用约45L的70％乙醇水溶液洗脱。进一步加工乙醇水溶液洗脱液，从而得到约400g甜菊提取物，其中总甜菊糖苷含量为约96％w/w。

将上述10L合并并蒸发的溶液与90L的纯乙醇混合，并在缓慢摇动下将混合物保持10分钟。通过真空过滤除去所得沉淀物。收集滤液，然后进行真空蒸发(在30℃-35℃)以除去乙醇，并进一步浓缩至含有22％w/w固体的糖浆形式的约4LNSGC。该溶液的HPLC测定法显示约1.3％的残余甜菊糖苷，其中各种甜菊糖苷的百分比比例为：莱鲍迪苷E 0.41％、莱鲍迪苷O10.52％、莱鲍迪苷D 5.95％、莱鲍迪苷N1.49％、莱鲍迪苷M 3.07％、莱鲍迪苷A56.98％、甜菊苷11.66％、莱鲍迪苷F 0.89％、莱鲍迪苷C 4.37％、杜克苷A 0.11％和莱鲍迪苷B0.35％。使用真空蒸发干燥浓缩物，然后在30℃-35℃的真空烘箱中干燥。

实施例2：

通过乙醇水溶液提取NSGC

将50kg干燥的甜叶菊叶(具有约8％(w/w)水分含量和约8.5％(w/w)总甜菊糖苷)研磨至10-20mm颗粒。该叶片的HPLC测定法还显示约3.2％w/w总CGA含量，包含1.34％CGA(neo-CGA、n-CGA和crypto-CGA)和1.86％iso-CGA(iso-CGA-B、iso-CGA-A和iso-CGA-C)。将干燥的叶材料装入提取罐中，并用800L的30％(v/v)乙醇在65℃进行提取30分钟。将混合物通过800g硅藻土过滤。收集浅黄色滤液并冷却至30℃。通过纳米滤膜(NF90-400，DowChemical Company，USA)在45℃，0.5-0.8MPa的压力下从滤液中除去EtOH。

将估计含有约1.57kg总CGA和4.1kg总甜菊糖苷的从纳米过滤获得的320L截留物进料到填充有125L聚合物大孔吸附树脂(YWD-03，Cangzhou Yuanwei，中国)的柱中，以约125L/小时的流速。在进料截留物后，另外用62.5L的水洗涤柱子，并将两种流出物合并以制备流穿产物，使用纳米滤膜(NF90-400，Dow Chemical Company，USA)将其进一步浓缩至20％总固体含量。通过使用9体积的乙醇进行浓缩流穿产物的絮凝(flocculation)。通过过滤分离絮凝的沉淀物，并如上所述通过纳米滤膜(NF90-400，Dow Chemical Company，USA)除去乙醇。使用冷冻干燥器干燥浓缩物。纯化的流穿产物含有12.24％w/w(干基)的总CGA，其包含neo-CGA2.65％、n-CGA 7.46％、crypto-CGA 1.84％、iso-CGA-B 0.07％、iso-CGA-A0.16％和iso-CGA-C 0.06％以及0.70％w/w的总甜菊糖苷。

使用690L的25％(v/v)乙醇从大孔吸附树脂洗脱吸附的CGA。使溶液通过纳米滤膜(NF90-400，Dow Chemical Company，USA)以除去乙醇，然后如上所述通过冷冻干燥器干燥以制备25％的乙醇产物。25％-乙醇产物含有19.52％w/w的总CGA，其包含neo-CGA 0.78％、n-CGA 3.59％、crypto-CGA 1.04％、iso-CGA B 2.64％，iso-CGA-A4.14％和iso-CGA-C7.33％，以及12.28％w/w的总甜菊糖苷，包括莱鲍迪苷E1.43％、莱鲍迪苷D1.54％、莱鲍迪苷A 5.31％、甜菊苷2.49％等。

用大约380L的70％乙醇水溶液从大孔吸附树脂上洗脱剩余的甜菊糖苷，并进一步加工，从而得到TSG含量为71％的甜菊提取物。

实施例3

通过水提取NSGC

将50kg与实施例2中所使用的类似的甜叶菊干燥叶材料装入提取罐中，并用800L的水在90℃进行提取30分钟。将混合物通过800g硅藻土过滤。收集淡黄色滤液并冷却至30℃，并进料到填充有125L聚合物大孔吸附树脂(YWD-03，Cangzhou Yuanwei，China)的柱中。后续步骤类似于实施例2中描述的步骤。

流穿产物含有14.47％w/w的总CGA，包含neo-CGA 4.67％、n-CGA 5.67％、crypto-CGA 3.44％、iso-CGA-B 0.24％、iso-CGA-A 0.21％和iso-CGA-C 0.24％以及0.59％w/w的总甜菊糖苷。25％-乙醇产物含有17.97％w/w的总CGA，包含neo-CGA 0.78％、n-CGA1.56％、crypto-CGA0.91％、iso-CGA-B 5.36％、iso-CGA-A3.21％和iso-CGA-C 6.15％，以及13.83％w/w的总甜菊糖苷，包含莱鲍迪苷E 2.89％、莱鲍迪苷D1.52％、莱鲍迪苷A5.31％、甜菊苷2.49％等。

实施例4

通过水提取NSGC

将50kg与实施例2中所使用的类似的甜叶菊干叶材料装入提取罐中，并用800L的水在65℃进行提取30分钟。将混合物通过800g硅藻土过滤。收集淡黄色滤液并冷却至30℃，并进料到填充有125L聚合物大孔吸附树脂(YWD-03，Cangzhou Yuanwei，China)的柱中。后续过程类似于实施例2中描述的过程。

25％-乙醇产物含有19.90％w/w的总CGA，其包含neo-CGA 0.35％、n-CGA 4.30％、crypto-CGA 1.23％、iso-CGA-B 0.81％、iso-CGA-A 8.19％和iso-CGA-C 5.02％，以及13.47％w/w的总甜菊糖苷，包括莱鲍迪苷D1.86％、莱鲍迪苷A7.45％、甜菊苷2.13％等。

实施例5

NSGC的纯化

将6克实施例3的干燥的25％-乙醇产物溶解在20mL水中。向混合物中加入180mL的纯乙醇并在室温搅拌1小时。过滤得到的悬浮液，向滤液中加入0.72g活性炭，再在室温搅拌1小时。再次过滤混合物以除去活性炭。使用旋转蒸发器在40℃浓缩所得滤液，并在40℃的真空烘箱中干燥，从而得到3.6g经加工的25％-乙醇产物。加工的25％-乙醇产物含有22.32％w/w的总CGA，包括neo-CGA 0.84％、n-CGA 1.26％、crypto-CGA 0.91％、iso-CGA B6.85％、iso-CGA-A 4.99％和iso-CGA-C 7.48％，以及23.26％w/w的总甜菊糖苷，包括莱鲍迪苷D2.03％、莱鲍迪苷A12.18％、甜菊苷6.70％等。

实施例6

NSGC的膜纯化

将1克实施例5的经加工的25％-乙醇产物溶解在100mL的RO水中，并将该溶液在20℃进料到Sterlitech HP4750高压搅拌细胞过滤系统(Sterlitech Corporation，USA)中，直至收集到50mL的渗透物。将截留物和渗透物冷冻干燥并通过HPLC进行测试。

使用从Sterlitech Corporation(USA)获得的不同的47mm膜盘重复该实验。特别是GE 2000UFGH(Sterlitech目录号YMGHSP475)、GE 1000(Sterlitech目录号YMGESP475)、Synder NFG(Sterlitech目录号YMNFG475)、Microdyn Nadir NP010(Sterlitech目录号YMNP010475)、Evonik Duramem 900(Sterlitech目录号1120773)和Synder XT,PES,UF(Sterlitech目录号YMXT475)。

渗透物和截留物分析结果总结在表1中。

表1渗透物和截留物HPLC测定法

*注：Ret：截留物；Per：渗透物

选择膜GE 1000用于进一步的实验。

实施例7

使用膜通过渗滤步骤纯化NSGC

将1克实施例5的经加工的25％-乙醇产物与100mL的RO水混合，并在20℃进料到装有GE 1000(Sterlitech Corporation，USA)的Sterlitech HP4750高压搅拌细胞过滤系统(Sterlitech Cat No YMGESP475)中，直至收集到50mL渗透物。收集到50mL渗透物后，向细胞中加入50mL的RO水，并重复过滤以再收集50mL的渗透物。重复该方法以获得10个渗透物级分。将截留物和渗透物冷冻干燥并通过HPLC进行测试。

对于截留物，总CGA为16.51％(w/w，干基)，包含neo-CGA0.35％、n-CGA 0.65％、crypto-CGA 1.11％、iso-CGA-B 5.52％、iso-CGA-A2.75％和iso-CGA-C 6.13％，以及总甜菊糖苷含量为37.69％w/w，包括莱鲍迪苷D 2.75％、莱鲍迪苷A20.48％、甜菊苷10.39％、莱鲍迪苷C 1.35％等。对于10个渗透物样品的组合样品，总CGA为30.33％(w/w，干基)，包括neo-CGA 0.97％、n-CGA 2.52％、crypto-CGA 2.28％、iso-CGA-B 8.23％、iso-CGA-A8.24％、iso-CGA-C 8.08％，以及总甜菊糖苷含量为5.99％w/w，包括莱鲍迪苷A2.66％、甜菊苷2.89％等。

实施例8

使用吸附色谱系统纯化NSGC

将含有10.07g来自实施例4的25％乙醇产物的100mL水溶液进料到填充有300mL聚合物大孔吸附树脂(TF3，Cangzhou Yuanwei，China)的柱中，在室温以约300mL/小时的流速进行。装载完成后，另外用600mL水洗涤柱，合并两个流出物并收集作为流穿产物。流穿产物通过纳米滤膜(NF90-400，Dow Chemical Company，USA)浓缩，然后使用喷雾干燥器进行干燥，从而得到1.9g干燥的流穿产物，其含有27.82％w/w(干基)的总CGA，包含neo-CGA4.11％、n-CGA 17.21％、crypto-CGA 6.25％、iso-CGA-B 0.04％、iso-CGA-A0.17％和iso-CGA-C 0.04％以及0.12％w/w的总甜菊糖苷。

使用1,500mL的20％(v/v)乙醇从大孔吸附树脂洗脱吸附的CGA。使溶液通过纳米滤膜(NF90-400，Dow Chemical Company，USA)以除去乙醇并浓缩。使用喷雾干燥器干燥浓缩物，并收集4.3g干燥的样品作为20％乙醇产物。该产物含有21.99％w/w的总CGA，包含neo-CGA 0.03％、n-CGA 0.23％、crypto-CGA 0.16％、iso-CGA-B 2.39％、iso-CGA-A11.93％和iso-CGA-C 7.25％以及2.18％w/w的总甜菊糖苷。

用约900mL的60％乙醇水溶液洗脱吸附在大孔树脂上的剩余甜菊糖苷，并进一步加工，从而得到3.6g含有60.50％w/w总甜菊糖苷的甜菊提取物。

实施例9

使用吸附色谱系统纯化NSGC

将含有9.0g来自实施例4的25％-乙醇产物的100mL水溶液进料到填充有300mL聚合物大孔吸附树脂(TF3，Cangzhou Yuanwei，China)的柱中，在室温以约300ml/小时的流速进行。在装载完成后，另外用900mL的水洗涤柱，合并两个流出物并作为流穿产物收集。通过使用纳米滤膜(NF90-400，Dow Chemical Company，USA)浓缩产物，然后喷雾干燥，从而得到1.51g干燥的流穿产物，其含有31.27％w/w(干基)的总CGA，包含neo-CGA4.19％、n-CGA19.35％、crypto-CGA 7.10％、iso-CGA-B 0.11％、iso-CGA-A0.43％和iso-CGA-C 0.10％以及0.01％w/w的总甜菊糖苷。

然后依次用900mL的15％(v/v)乙醇、900mL的20％(v/v)乙醇、900mL的25％(v/v)乙醇和900mL的60％(v/v)乙醇洗涤大孔吸附树脂。通过使用纳米滤膜(NF90-400，DowChemical Company，USA)浓缩所有收集的溶液，然后使用喷雾干燥器进行干燥，从而分别获得15％-乙醇产物、20％-乙醇产物、25％-乙醇产物和60％-乙醇产物。这些级分的HPLC测定法总结在表2中。

表2洗脱液级分的HPLC测定法

实施例10

使用吸附色谱系统纯化NSGC

将含有9.0g来自实施例4的25％-乙醇产物的100mL水溶液进料到填充有300mL聚合物大孔吸附树脂(TF3，Cangzhou Yuanwei，China)的柱中，在室温以约300ml/小时的流速进行。在装载完成后，另外用600mL的水洗涤柱，合并两个流出物并作为流穿产物收集。通过使用纳米滤膜(NF90-400，Dow Chemical Company，USA)浓缩流穿产物，然后干燥，从而得到1.45g干燥的流穿产物，其含有18.04％w/w(干基)的总CGA，包含neo-CGA2.12％、n-CGA13.40％、crypto-CGA 2.47％、iso-CGA-A 0.04％和iso-CGA-C 0.01％以及0.74％w/w的总甜菊糖苷。

然后依次用1500mL的20％(v/v)乙醇和900mL的60％(v/v)乙醇洗涤大孔吸附树脂。通过使用纳米滤膜(NF90-400，Dow Chemical Company，USA)浓缩所有收集的溶液，然后干燥，从而分别得到20％-乙醇产物和60％-乙醇产物。

这些级分的HPLC测定法总结在表3中。

表3洗脱液级分的HPLC测定法

实施例11

使用吸附色谱系统纯化NSGC

将来自实施例4的25％-乙醇产物的500mg/L水溶液进料到填充有150mL聚合物大孔吸附树脂(TF3，Cangzhou Yuanwei，China)的柱中，在室温以约150mL/小时的流速进行。收集流出物并通过感官方法定期分析其甜度。当在流出物中检测到甜味时停止进料。将流出物合并，浓缩，然后使用喷雾干燥器进行干燥，从而得到流出产物，含有21.65％w/w(干基)的总CGA，其包含neo-CGA 1.37％、n-CGA 5.42％、crypto-CGA 1.97％、iso-CGA-B1.90％、iso-CGA-A6.12％和iso-CGA-C4.87％以及0.42％w/w的总甜菊糖苷。

然后依次用300mL的20％(v/v)乙醇和450mL的60％(v/v)乙醇洗涤大孔吸附树脂。通过使用纳米滤膜(NF90-400，Dow Chemical Company，USA)浓缩所有收集的溶液，然后使用喷雾干燥器进行干燥，从而分别获得20％-乙醇产物和60％-乙醇产物。

这些级分的HPLC测定法总结在表4中。

表4洗脱液级分的HPLC测定法

实施例12

使用结晶纯化NSGC

将1克实施例3的干燥的25％-乙醇产物溶解在20mL水中。加入100mg的Ca(OH)₂并将混合物保持1小时直至形成沉淀。过滤得到的悬浮液，并将沉淀物重新悬浮在水中，用乙酸滴定至溶解，并进料填充有100mL聚合物大孔吸附树脂(YWD-03，Cangzhou Yuanwei，China)的柱中。后续方法类似于实施例2中描述的方法。

25％-乙醇产物含有42.90％w/w的总CGA，其包含neo-CGA 0.51％、n-CGA 1.30％、crypto-CGA 0.34％、iso-CGA-B 5.78％、iso-CGA-A 6.89％和iso-CGA-C 28.08％以及0.3％w/w的总甜菊糖苷，包括莱鲍迪苷A 0.2％、甜菊苷0.1％等。

实施例13

包括NSGC的消费品

根据表5中所示的配方制备碳酸饮料样品。

表5碳酸饮料配方

成分	量,％
		可乐风味剂	0.340
正磷酸	0.100
		柠檬酸钠	0.310
苯甲酸钠	0.018
		柠檬酸	0.018
甜味剂组合物	0.050
		碳酸水	至100

以下样品用作配方中的“甜味剂组合物”。(i)莱鲍迪苷A的市售样品(纯度97％)，和(ii)市售莱鲍迪苷A(纯度97％)和根据实施例3制备的NSGC的混合物(95:5w/v比例)。饮料样品的感官评价由20名小组成员进行。结果总结在表6中。

表6碳酸饮料样品的感官评估

在配方中使用的“甜味剂组合物”	甜味持久*	苦味*	延迟甜味开始*	甘草味*	整体味道
						RebA97+NSGC(95:5)	2	1	1	2	愉快
纯RebA97	5	5	5	5	不愉快

*对于“甜味持久”、“苦味”、“延迟甜味开始”和“甘草味”特征，小组成员在1到5之间打分，其中较低的分数代表小组成员更愉快的味觉

结果显示使用包含NSGC的甜味剂组合物制备的饮料具有最佳的感官特征。

实施例14

包含新型NSGC的消费品

根据表7中的配方制备巧克力样品。

表7巧克力样品配方

成分	量,％
		巧克力液体	30.0
可可脂	11.5
		奶粉	14.0
山梨糖醇	44.0
		盐	0.1
甜味剂组合物	0.1
		卵磷脂	0.3

将巧克力液体、可可脂、奶粉、山梨糖醇、盐和“甜味剂组合物”充分揉捏，然后将混合物置于精制机中24小时以减小其粒度。此后，将内容物转移到巧克力精炼机中，加入卵磷脂，并将组合物在50℃揉捏48小时。然后，将内容物放入成形装置中并固化。

以下样品用作表3的配方中的“甜味剂组合物”。(i)市售莱鲍迪苷A的商业样品(纯度97％)和(ii)市售莱鲍迪苷A(纯度97％)和根据实施例3制备的NSGC的混合物(具有95:5w/v比例)。巧克力样品的感官评价由20名小组成员进行。结果总结在表8中。

表8巧克力样品的感官评估

在配方中使用的“甜味剂组合物”	甜味持久*	苦味*	甘草味*	整体味道
					RebA 97+NSGC(95:5)	1	2	2	愉快
纯RebA 97	5	5	5	不愉快

对于“甜味持久”、“苦味”和“甘草味”特征，小组成员在1到5之间打分，其中较低的分数代表小组成员更愉快的味觉

结果显示使用包含NSGC的甜味剂组合物制备的巧克力样品具有最佳的感官特征。

尽管前面已经描述了本发明的一个或多个实施方案，但是本领域技术人员将理解，可以进行各种改变和修改，并且可以用等同物替代其元件或组合物而不脱离本发明的实际范围。因此，本发明不是限于所公开的特定实施方案，而是本发明将包括落入所附权利要求书范围内的所有实施方案。

Claims (4)

1.制备非甜菊糖苷组合物的方法，包括以下步骤：

a.提供甜叶菊(Stevia rebaudiana)植物材料；

b.提供提取溶剂；

c.混合甜叶菊植物材料和提取溶剂，从而提供甜菊植物材料和溶剂混合物；

d.分离甜菊植物材料和溶剂混合物，从而得到包含甜菊糖苷分子和非甜菊糖苷分子的滤液；

e.从滤液中分开或分离甜菊糖苷分子，从而得到非甜菊糖苷组合物，并且

其中所获得的非甜菊糖苷组合物包含至少一种选自以下的非甜菊糖苷分子：酚类化合物、多酚、类黄酮、奎尼酸和咖啡酸及其衍生物、新绿原酸(neo-CGA；5-O-咖啡酰奎宁酸或5-CQA)、隐绿原酸(crypto-CGA；4-O-咖啡酰奎宁酸或4-CQA)、正绿原酸(n-CGA；3-O-咖啡酰奎宁酸或3-CQA)、异绿原酸A(iso-CGAA；3,5-二咖啡酰奎宁酸)、异绿原酸B(iso-CGA B；3,4-二咖啡酰奎宁酸)、异绿原酸C(iso-CGA C；4,5-二咖啡酰奎宁酸)、本领域已知的其他绿原酸和异绿原酸、类视黄醇、色素、多糖、寡糖、二糖、单糖、挥发油组分、甾醇、萜类化合物、倍半萜、二萜、三萜、香豆素、脂肪酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、二肽、寡肽、多肽、蛋白质、澳泽兰素、槲皮素、甜叶菊素、桉油烯醇、癸酸、8,11,14-二十碳三烯酸、2-甲基十八烷、二十五烷、二十八烷、豆甾醇、b-谷甾醇、a-和b-香树素、羽扇豆醇、b-香树素乙酸酯、五环三萜和/或其苷类，以及其组合。

2.权利要求1的非甜菊糖苷组合物。

3.包含权利要求1的非甜菊糖苷组合物的消费品。

4.制备消费品的方法，包括将权利要求1的非甜菊糖苷组合物加入消费品中的步骤。