BR112019011036A2

BR112019011036A2 - ingredientes alimentícios de stevia rebaudiana

Info

Publication number: BR112019011036A2
Application number: BR112019011036A
Authority: BR
Inventors: Markosyan Avetik; Liao Chunlong; Nizam Bin Nawi Khairul; Chen Koh Pei; RAMANDACH Saravanan; Yin Chow Siew
Original assignee: Purecircle Usa Inc
Priority date: 2016-11-29
Filing date: 2017-11-29
Publication date: 2019-10-15
Also published as: EP3547849A4; JP2020505907A; EP3547849A2; AU2022204019B2; WO2018102447A2; AU2017367105A1; JP2023026461A; WO2018102447A3; MX2019006162A; AU2022204019A1; RU2019118458A3; CN117256831A; CN110662432A; RU2019118458A; US20190322692A1; AU2017367105B2

Abstract

a invenção refere-se a um processo para a produção de ingredientes alimentícios da planta stevia rebaudiana e seu uso em produtos alimentícios, bebidas e outros insumos. as composições obtidas são úteis como aromatizantes, adoçantes, antioxidantes e outros ingredientes funcionais.

Description

“INGREDIENTES ALIMENTÍCIOS DE STEVIA REBAUDIANA”

PEDIDOS RELACIONADOS [001]Este pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente U.S. No. 62/427.539, depositado em 29 de Novembro de 2016, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Para os propósitos dos Estados Unidos da América, este pedido é também uma continuação em parte do Pedido de Patente U.S. No. 15/284.265, depositado em 3 de outubro de 2016, que é uma continuação do Pedido de Patente U.S. No. 14/677.538, depositado em 2 de abril de 2015, agora concedido como Patente U.S. No. 9.456.626, que é uma continuação do Pedido de Patente U.S. No. 13/993.415, depositado em 12 de junho de 2013, agora concedido como Patente U.S. No. 9.029.426, que é um Pedido U.S. de Fase Nacional do Pedido Internacional No. PCT/US2011/064343, depositado em 12 de dezembro de 2011, que reivindica prioridade ao Pedido de Patente U.S. No. 61/424.798, depositado em 20 de dezembro de 2010, e Pedido de Patente U.S. No. 61/422.403, depositado em 13 de dezembro de 2010, cada um destes pedidos é incorporado por referência aqui na sua totalidade. Este pedido também incorpora para referência cada uma dos seguintes pedidos na sua totalidade: Pedido de Patente U.S. No. 13/530.113, depositado em 22 de Junho de 2012, agora concedido como Patente U.S. No. 8.530.527; Pedido de Patente U.S. No. 13/580,098, depositado em 6 de Novembro de 2012, agora concedido como Patente U.S. No. 8.981.081; Pedido de Patente U.S. No. 13/943.776, depositado em 16 de julho de 2013; Pedido de Patente U.S. No. 13/957,098, depositado em 1 de Agosto de 2013, agora concedido como Patente U.S. No. 9.510.611; Pedido de Patente U.S. No. 14/195,812, depositado em 3 de março de 2014; e Pedido de Patente U.S. No. 14/829.127, depositado em 18 de agosto de 2015, agora concedido como Patente U.S. No. 9.771.434.

CAMPO DE INVENÇÃO [002]A invenção refere-se a um processo para a produção de ingredientes

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2/39 alimentícios da planta Stevia rebaudiana e seu uso em produtos alimentícios, bebidas e outros insumos.

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA [003]Adoçantes de alta intensidade possuem um nível de doçura muitas vezes superior ao da sacarose. Eles são essencialmente não calóricos e amplamente utilizados na fabricação de alimentos dietéticos e com teor calórico reduzido. Embora adoçantes calóricos naturais como sacarose, frutose e glicose forneçam o sabor mais desejável aos consumidores, eles possuem altos valores calóricos. Os adoçantes de alta intensidade não afetam o nível de glicose no sangue e fornecem pouco ou nenhum valor nutritivo.

[004]Stev/a rebaudiana Bertoni é um arbusto perene da família Asteraceae (Compositae), nativa de certas regiões da América do Sul. As folhas da planta contêm de 10 a 20% de glicosídeos diterpênicos, que são cerca de 150 a 450 vezes mais doces que o açúcar. As folhas são tradicionalmente usadas há centenas de anos no Paraguai e no Brasil para adoçar os chás e remédios locais.

[005]Atualmente, existem mais de 230 espécies de Stevia com propriedades adoçantes significativas. A planta foi cultivada com sucesso sob uma ampla gama de condições, desde suas latitudes subtropicais nativas até as latitudes frias do norte.

[006]O extrato da planta Stevia rebaudiana contém uma mistura de diferentes glicosídeos diterpênicos doces, que possuem uma única base - esteviol e diferem pela presença de resíduos de carboidratos nas posições C13 e C19. Estes glicosídeos se acumulam nas folhas de Stevia e compõem aproximadamente 10% 20% do peso seco total. Tipicamente, com base no peso seco, os quatro principais glicosídeos encontrados nas folhas da Stevia são o Dulcosídeo A (0,3%), Rebaudiosídeo C (0,6-1,0%), Rebaudiosídeo A (3,8%) e Esteviosídeo (9,1%). Outros glicosídeos identificados no extrato de Stevia incluem o Rebaudiosídeo B, C, D, E e F, Esteviolbiosídeo e Rubusosídeo.

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3/39 [007]Glicosídeos de esteviol têm zero calorias e podem ser usados sempre que o açúcar for usado. Eles são ideais para dietas diabéticas e hipocalóricas.

[008]Por outro lado, deve notar-se que no processo de fabricação, juntamente com os glicosídeos de esteviol, grandes quantidades de outros constituintes da planta Stevia são também extraídas com água. Esses outros constituintes são principalmente separados durante o processamento a jusante e descartados no ambiente.

[009]Pouco se sabe sobre esses outros constituintes da planta Stevia rebaudiana. Poucos autores relataram compostos fenólicos, aminoácidos livres, etc. entretanto, a informação sobre a identidade desses constituintes permanece escassa e seus possíveis usos em alimentos, bebidas e outros insumos não são descritos (Karakõse, et al, 2011, 2015; Wõlwer-Rieck, 2001). 2012; Periche et al, 2014).

[010]Não há relatos até o momento sobre o processamento dos outros componentes extraídos da planta Stevia em qualquer ingrediente alimentício. Portanto, se realizado em larga escala, isso pode proporcionar benefícios econômicos e ambientais significativos, pois pode proporcionar uma oportunidade para a inclusão de toda a planta estévia na cadeia alimentar, criando um processamento de estévia praticamente sem desperdício.

[011]Portanto, é necessário desenvolver um método para isolar efetivamente os constituintes da planta Stevia rebaudiana e usá-los como ingredientes em diferentes consumíveis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [012]A presente invenção visa a superar as desvantagens dos esquemas de processamento industrial para Stevia existentes. A invenção descreve um processo para a produção de ingredientes alimentícios da planta Stevia rebaudiana e sua utilização em vários consumíveis, incluindo produtos alimentícios e bebidas.

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4/39 [013]A invenção, em parte, refere-se a composições compreendendo fenólicos e outros compostos glicosídicos sem esteviol, derivados da planta Stevia rebaudiana.

[014]Daqui em diante o termo glicosídeo (s) de esteviol significará glicosídeos de esteviol que ocorre naturalmente em Stevia rebaudiana, incluindo mas não limitado a esteviolmonosídeo, e esteviolbiosídeo, rubusosido, dulcosídeo B, dulcosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo G, esteviosídeo, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo I, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo H, rebaudiosídeo L, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo J, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo O e combinações dos mesmos.

[015]A seguir, os termos “RebA”, “RebB”, “RebC”, “RebD”, “RebE”, “RebF”, “RebM”, “RebN” e “RebO” referem-se a Rebaudiosídeos A, B, C, D, E, F, M, N e O.

[016]A seguir, os termos “Stev”, “Sbio”, “DulA”, “Rub”, referem-se a Esteviosídeo, Esteviolbiosídeo, Dulcosídeo A e Rubusosídeo.

[017]A seguir, o termo “conteúdo de TSG” significará o conteúdo total de Glicosídeos de Esteviol (ETG), e será calculado como a soma das concentrações de Rebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo B, Rebaudiosídeo C, Rebaudiosídeo D,

Rebaudiosídeo E, Rebaudiosídeo F, Rebaudiosídeo M, Rebaudiosídeo N,

Rebaudiosídeo O, Eesteviosídeo, Esteviolbiosídeo, Dulcosídeo A e Rubusosídeo em uma base seca de peso/peso.

[018]Daqui em diante o termo CGA (s) significará ácidos clorogênicos e seus derivados que ocorrem naturalmente em plantas, incluindo mas não limitado a ácido neoclorogênico (neo-CGA; ácido 5-O-cafeoilquínico ou 5-CQA), ácido criptoclorogênico (cripto-CGA; ácido 4-O-cafeoilquínico ou 4-CQA), ácido n-clorogênico (nCGA; ácido 3-O-cafeoilquínico ou 3-CQA), ácido iso-clorogênico A (iso-CGAA; ácido

3,5-dicafoilquínico) ácido iso-clorogênico B (iso-CGA B; ácido 3,4-dicafoilquínico), ácido iso-clorogênico C (iso-CGA C; ácido 4,5-dicafoilquínico) e suas combinações.

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5/39 [019]Daqui em diante, o termo “teor de TCGA” significará o teor de Ácidos Clorogênicos Totais (TCGA), e será calculado como a soma das concentrações de neo-CGA, crypto-CGA, n-CGA, iso-CGA A, iso-CGA B e iso-CGA C em uma base seca de peso/peso.

[020]Na invenção, o material da planta Stevia rebaudiana, particularmente as folhas e/ou caules, foi usado como material de partida.

[021 ]O material vegetal foi submetido à extração utilizando água ou solvente aquoso alcoólico.

[022]A água obtida ou extrato alcoólico aquoso foi processada adicionalmente para separar a fração de glicosídeos de esteviol. A fração restante foi designada como “composição de glicosídeo sem esteviol” (NSGC) - significando uma composição predominantemente compreendendo compostos, diferentes dos glicosídeos de esteviol, que ocorrem na água ou extratos alcoólicos aquosos da planta Stevia rebaudiana (doravante “moléculas de glicosídeos sem esteviol”). Exemplos não limitantes de “moléculas de glicosídeos sem esteviol” incluem compostos fenólicos, polifenóis, flavonóides, ácidos quínico e cafeico e seus derivados, ácido neoclorogênico (neo-AGC; ácido 5-O-cafeoilquínico ou 5-CQA), ácido cripto-clorogênico (ácido cripto-CGA; ácido 4-O-cafeoilquínico ou 4-CQA), ácido n-clorogênico (ácido n-CGA; ácido 3-O-cafeoilquínico ou 3-CQA), ácido isoclorogênico A (iso-CGA A Ácido 3,5-dicafeoilquínico) ácido iso-clorogênico B (isoCGA B; ácido 3,4-dicafeoilquínico), ácido iso-clorogênico C (iso-CGA C; ácido 4,5dicafeoilquínico), outros ácidos clorogênicos e ácidos iso-clorogênicos conhecidos da técnica, retinóides, pigmentos, polissacarídeos, oligossacarídeos, dissacarídeos, monossacarídeos, componentes voláteis do óleo, esteróis, terpenóides, sesquiterpenóides, diterpenos, triterpenos, cumarinas, ácidos graxos e seus derivados, aminoácidos e seus derivados, dipeptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas, austroinulina, quercetina, esteribinas, espatulenol, ácido

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6/39 decanóico, ácido 8,11,14-ecossatrienóico, 2-metilactadecano, pentacosano, octacosano, estigmasterol, bsitosterol, a- e b-amirina, lupeol, acetato de b-amirina, triterpenos pentacíclicos e/ou glicosídeos dos mesmos.

[023]As composições preparadas em algumas modalidades da presente invenção e designadas como NSGC podem também conter algumas quantidades residuais de glicosídeos de esteviol.

[024]Algumas NSGCs podem ser ainda purificadas e/ou processadas por qualquer método de processamento de ingredientes alimentícios conhecido na técnica para obter outros NSGCs.

[025]As NSGCs da presente invenção são aplicáveis em vários consumíveis, alimentos e bebidas como, aromatizantes, modificadores de sabor, intensificadores de sabor, adoçantes, conservantes, antioxidantes, emulsionantes, agentes texturizantes, agentes de volume, estabilizantes, solubilizantes e outros ingredientes alimentícios.

[026] Deve ser entendido que tanto a descrição geral anterior como a descrição detalhada que se segue são exemplares e explicativas e destinam-se a fornecer uma explicação adicional da invenção como reivindicada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [027]O desenho anexo está incluído para fornecer uma compreensão adicional da invenção. O desenho ilustra modalidades da invenção e em conjunto com a descrição servem para explicar os princípios das modalidades da invenção.

[028]FIG. 1 mostra as estruturas de alguns CGAs.

[029]FIG. 2 mostra o cromatograma de HPLC de CGA de Stevia rebaudiana.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [030]Vantagens da presente invenção se tornarão mais evidentes a partir da descrição detalhada dada a seguir. No entanto, deve entender-se que a descrição detalhada e exemplos específicos, embora indiquem modalidades preferidas da

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7/39 invenção, são apresentados apenas a título ilustrativo, uma vez que várias alterações e modificações dentro do espírito e âmbito da invenção se tornarão evidentes para os versados na técnica desta descrição detalhada.

[031 ]Os versados na técnica também reconhecerão que uma ou mais das etapas do processo descritas abaixo, podem ser omitidas. Aqueles versados na técnica também entenderão que, embora o processo descrito abaixo assuma certa ordem das etapas descritas, essa ordem pode ser alterada em alguns casos.

Extração [032]Na invenção, material vegetal de Stevia rebaudiana, particularmente as folhas e/ou caules da planta Stevia rebaudiana, foram usados como material de partida. O extrato de material vegetal de Stevia rebaudiana pode ser obtido utilizando qualquer método tal como, mas não limitado aos métodos de extração descritos na Patente US No. 7.862.845, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência, bem como filtração por membrana, extração de fluido supercrítico, extração assistida por enzimas, extração assistida por micro-organismos, extração assistida por ultrassom, extração assistida por micro-ondas, etc.

[033]Em uma modalidade, o material vegetal de Stevia rebaudiana (por exemplo, folhas) pode ser seco a temperaturas entre cerca de 20 ^QC e cerca de 100 ^QC até ser alcançado um teor de umidade entre cerca de 5% e cerca de 15%. Em uma modalidade particular, o material vegetal pode ser seco entre cerca de 20 ^QC e cerca de 60 ^QC durante um período de tempo de cerca de 1 a cerca de 240 horas.

[034]Em outras modalidades particulares, o material vegetal pode ser seco a temperaturas entre cerca de 20 ^QC e cerca de 35 ^QC para evitar a decomposição.

[035]Em algumas modalidades, o material vegetal de Stevia rebaudiana pode ser seco sob vácuo ou pressão reduzida.

[036]Em algumas modalidades, o material vegetal de Stevia rebaudiana pode ser seco na presença de gás inerte tal como N2.

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8/39 [037]Em algumas modalidades, o material vegetal de Stevia rebaudiana pode ser liofilizado.

[038]Em algumas modalidades, o material vegetal seco é opcionalmente moído. Os tamanhos de partícula podem estar entre cerca de 0,1 e cerca de 20 mm.

[039]O material vegetal (moído ou não moído) pode ser extraído por qualquer processo de extração adequado, como, por exemplo, extração de refluxo contínuo ou descontínuo, extração com fluido supercrítico, extração assistida por enzima, extração assistida por micro-organismo, extração assistida por ultrassom, extração assistida po rmicro-ondas, etc. O solvente usado para a extração pode ser qualquer solvente adequado, como por exemplo, solventes orgânicos polares (desgaseificados, vacuolizados, pressurizados ou destilados), solventes orgânicos não polares, água (desgaseificada, vacuolizada, pressurizada, deionizada, destilada, tratada por carbono ou osmose reversa) ou uma mistura destes. Em uma modalidade particular, o solvente compreende água e um ou mais álcoois. Em outra modalidade, o solvente é água. Em outra modalidade, o solvente é um ou mais álcoois. O álcool pode ser selecionado de, por exemplo, metanol, etanol, n-propanol, 2-propanol, 1 butanol, 2-butanol e suas misturas.

[040]Em uma modalidade particular, o material vegetal é extraído com água em um extrator de refluxo contínuo. Um versado na técnica reconhecerá que a razão de solvente de extração para o material vegetal variará com base na identidade do solvente e na quantidade de material vegetal a ser extraído. Geralmente, a razão de solvente de extração para quilograma de material vegetal seco é de cerca de 20 litros a cerca de 25 litros para cerca de um quilograma de folhas.

[041 ]O pH do solvente de extração pode estar entre cerca de pH 2,0 e 7,0, tal como, por exemplo, entre cerca de pH 2,0 e cerca de pH 5,0, entre cerca de pH 2,0 e cerca de pH 4,0 ou entre cerca de pH 2,0 e cerca de pH 3,0. Em uma modalidade particular, o solvente de extração é aquoso, por exemplo, água e,

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9/39 opcionalmente, ácido e/ou base em uma quantidade para proporcionar um pH entre cerca de pH 2,0 e 7,0, tal como, por exemplo, entre cerca de pH 2,0 e cerca de pH 5,0, entre cerca de pH 2,0 e cerca de pH 4,0 ou pH 2,0 e cerca de pH 3,0. Qualquer ácido ou base adequado pode ser utilizado para proporcionar o pH desejado para o solvente de extração, tal como, por exemplo, HCI, NaOH, ácido cítrico e semelhantes.

[042]A extração pode ser realizada a temperaturas entre cerca de 25 ^QC e cerca de 100 ^QC, tais como, por exemplo, entre cerca de 30 ^QC e cerca de 80 ^QC, entre cerca de 35 ^QC e cerca de 75 ^QC, entre cerca de 40 ^QC e cerca de 70 ^QC, entre cerca de 45 ^QC e cerca de 65 ^QC ou entre cerca de 50 ^QC e cerca de 60 ^QC.

[043]Em modalidades em que o processo de extração é um processo de extração em lote, o duração da extração pode variar de cerca de 0,5 hora a cerca de 24 horas, tal como, por exemplo, de cerca de 1 hora a cerca de 12 horas, de cerca de 1 hora a cerca de 8 horas, ou de cerca de 1 hora a cerca de 6 horas.

[044]Em modalidades em que o processo de extração é um processo contínuo, a duração da extração pode variar de cerca de 1 hora a cerca de 5 horas, tal como, por exemplo, de cerca de 2,5 horas a cerca de 3 horas.

[045]Após a extração, o material vegetal insolúvel pode ser separado da solução por filtração para fornecer um filtrado contendo glicosídeos de esteviol e outras moléculas, descritas acima como “moléculas de glicosídeo sem esteviol”. Esta separação sólido-líquido pode ser conseguida por qualquer meio adequado incluindo, mas não limitado a filtração por gravidade, um filtro-prensa de placa e quadro, filtros de fluxo cruzado, filtros de tela, filtros Nutsche, filtros de correia, filtros cerâmicos, filtros de membrana, microfiltros, nanofiltros, ultrafiltros ou centrifugação. Opcionalmente, vários auxiliares de filtração, tais como terra diatomáceas, bentonita, zeólito, etc., podem também ser usados neste processo.

Pré-tratamento do filtrado contendo glicosídeos de esteviol e “moléculas de

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10/39 qlicosídeos sem esteviol” [046]Em algumas modalidades, o filtrado contendo glicosídeos de esteviol e moléculas de glicosídeo sem esteviol é opcionalmente pré-tratado antes de entrar em contato com o adsorvente polimérico macroporoso. O referido pré-tratamento pode ser conseguido, por exemplo, pelo menos por um agente selecionado a partir do grupo incluindo mas não limitado a terra diatomácea, diatomita, kieselgur/kieselguhr, Celite®, bentonita, carvão ativado, qualquer auxiliadores de filtração de grau alimentício, qualquer agente de floculação, qualquer agente quelante, qualquer ácido, qualquer base / alcalina, qualquer resina de permuta iônica conhecida na técnica, ou suas combinações. Em algumas modalidades, o prétratamento pode ser alcançado por filtração adicional através de ultrafiltração e/ou nanofitração e/ou sistemas de membrana de RO-filtração conhecidos da técnica.

Adsorção dos qlicosídeos de esteviol [047]Em certas modalidades, o filtrado contendo glicosídeos de esteviol e moléculas de glicosídeo sem esteviol é colocado em contato com adsorvente polimérico macroporoso. O adsorvente polimérico macroporoso pode ser qualquer resina de adsorção polimérica macroporosa neutra, ácida ou alcalina capaz de adsorver glicosídeos de esteviol, como, por exemplo, a série Amberlite® XAD (Rohm and Haas), série Diaion® HP (Mitsubishi Chemical Corp), série Sepabeads® SP (Mitsubishi Chemical Corp), série Cangzhou Yuanwei YWD (Cangzhou Yuanwei Chemical Co. Ltd., China), ou o equivalente. O adsorvente pode ser embalado em colunas até cerca de 75% a cerca de 100% do seu volume total.

[048]Os glicosídeos de esteviol e algumas “moléculas de glicosídeo sem esteviol” são adsorvidos pelo adsorvente polimérico macroporoso, enquanto outras “moléculas de glicosídeo sem esteviol” não são adsorvidas e passam através da coluna no efluente de passagem.

[049]A resina de adsorção macroporosa pode ser eluída por concentrações

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11/39 variáveis de etanol aquoso para obter várias feações de eluato enriquecidas em glicosídeos de esteviol e/ou moléculas de glicosídeo sem esteviol.

[050]Em algumas modalidades, a resina de adsorção macroporosa pode ser eluída variando o pH do solvente de eluição.

Precipitação Opcional de Impurezas [051 ]O pH de filtrado centende glicesídees de esteviel e/eu “meléculas de glicesídee sem esteviel” pede ser ajustade para remever as impurezas adicienais. Em uma medalidade, e pH de filtrado pode ser ajustado para entre cerca de 8,5 e cerca de 10,0 por tratamento com uma base, tal como, por exemplo, óxido ou hidróxido de cálcio (cerca de 1,0% do volume de filtrado) com agitação lenta.

[052]O tratamento do filtrado com a base, como exposto acima, resulta em uma suspensão, cujo pH pode ser ajustado para cerca de 3,0 a cerca de 4,0 por tratamento com qualquer agente adequado de floculação / coagulação. Agentes de floculação / coagulação adequados incluem, por exemplo, alúmen de potássio, sulfato de alumínio, hidróxido de alumínio, óxido de alumínio, CO2, H3PO4, P2O5, MgO, SO2, poliacrilamidas aniônicas, compostos de amônio quaternário com substituintes de ácido graxo de cadeia longa, bentonita, terra diatomácea, série KemTab Sep, série Superfloc, série KemTab Flote, série Kemtalo Mel, Midland PCS3000, Magnafloc LT-26, Zuclar 100, Prastal 2935, Talofloc, Magox, sais de ferro ou uma combinação dos mesmos. Sais de ferro exemplares incluem, mas não estão limitados a, FeSCU, FeCl2, Fe(NOs)3, Fe2(SO4)s, FeCIs e suas combinações. Em uma modalidade particular, 0 sal férrico é FeCIs. O filtrado pode ser tratado com 0 agente de floculação / coagulação durante um período de tempo entre cerca de 5 minutos a cerca de 1 hora, tal como, por exemplo, de cerca de 5 minutos a cerca de 30 minutos, de cerca de 10 minutos a cerca de 20 minutos ou cerca de 10 minutos a cerca de 15 minutos. Agitação agitada ou lenta também pode ser usada para facilitar 0 tratamento. Opcionalmente, 0 pH da mistura resultante pode então ser ajustado

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12/39 para entre cerca de 8,5 e cerca de 9,0 com uma base, tal como, por exemplo, óxido de cálcio ou hidróxido de sódio. A duração do tempo para tratamento com base e, opcionalmente, com agitação, é entre cerca de 5 minutos a cerca de 1 hora, tal como, por exemplo, de cerca de 10 minutos a cerca de 50 minutos, de cerca de 15 minutos a cerca de 45 minutos, de cerca de 20 minutos a cerca de 40 minutos ou de cerca de 25 minutos a cerca de 35 minutos. Em uma modalidade particular, a base é o óxido de cálcio utilizado durante entre cerca de 15 e cerca de 40 minutos com agitação lenta.

[053]Em uma modalidade, o filtrado contendo glicosídeos de esteviol e/ou “moléculas de glicosídeo sem esteviol”, pode ser misturado com pelo menos um álcool para precipitar algumas impurezas.

[054]Os compostos precipitados e partículas insolúveis são separados do filtrado para proporcionar uma composição compreendendo “moléculas de glicosídeo sem esteviol”. A separação por precipitação pode ser conseguida por qualquer meio adequado incluindo, mas não limitado à filtração por gravidade, um filtro-prensa de placa e quadro, filtros de fluxo cruzado, filtros de tela, filtros Nutsche, filtros de correia, filtros ceriâmcos, filtros de membrana, microfiltros, nanofiltros, ultrafiltros ou centrifugação. Opcionalmente, vários auxiliares de filtração, tais como terra diatomácea, bentonita, zeólito, etc., podem ser usados neste processo.

Deionizacão [055]O filtrado contendo glicosídeos de esteviol e/ou “moléculas de glicosídeo sem esteviol” pode ser submetido à deionização por qualquer método adequado incluindo, por exemplo, eletrodiálise, filtração (nano ou ultrafiltração), osmose reversa, permuta iônica, permuta iônica de leito misto ou uma combinação de tais métodos. Em uma modalidade, o filtrado contendo “moléculas de glicosídeo sem esteviol” é deionisado por tratamento com uma ou mais resinas de permuta iônica para proporcionar um filtrado tratado com resina. Em uma modalidade, o

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13/39 filtrado contendo glicosídeos de esteviol e/ou “moléculas de glicosídeo sem esteviol” é passado através de uma resina de permuta catiônica de ácido forte. Em outra modalidade, o filtrado contendo glicosídeos de esteviol e/ou “moléculas de glicosídeo sem esteviol” é passado através de uma resina de permuta aniônica de base fraca. Ainda em outra modalidade, o filtrado contendo glicosídeos de esteviol e/ou “moléculas de glicosídeo sem esteviol” é passado através de uma resina de permuta catiônica de ácido forte seguida por uma resina de permuta aniônica de base fraca. Ainda em outra modalidade, o filtrado contendo glicosídeos de esteviol e/ou moléculas de glicosídeo sem esteviol é passado através de uma resina de permuta aniônica de base fraca seguida por uma resina de troca catiônica de ácido forte.

[056]A resina de permuta catiônica pode ser qualquer permutador catiônico ácido forte em que o grupo funcional é, por exemplo, ácido sulfônico. As resinas de troca catiônica de ácido forte adequadas são conhecidas na técnica e incluem, mas não estão limitadas a, resina Amberlite® 10 FPC22H da Rohm & Haas, que é um copolímero de divinil benzeno estireno sulfonado, resinas de permuta iônica Dowex® da Dow Chemical Company, 15 resinas de permuta iônica Serdolit® disponíveis na Serva Electrophoresis GmbH, resina de permuta catiônica acídica forte T42 e de base forte A23, uma resina de permuta iônica disponível na Qualichem, Inc. e resinas de permuta iônica fortes Lewatit disponíveis na Lanxess. Em uma modalidade particular, a resina de permuta catiônica de ácido forte é a resina Amberlite® 10 FPC22H (H+). Tal como seria do conhecimento dos versados na técnica, outras resinas de permuta catiônica de ácido forte adequadas para utilização em modalidades desta invenção estão comercialmente disponíveis.

[057]A resina de troca aniônica pode ser qualquer permutador aniônico de base fraca, em que o grupo funcional é, por exemplo, uma amina terciária. As resinas de permuta aniônica de base fraca adequadas são conhecidas na técnica e

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14/39 incluem, mas não estão limitadas a, resinas tais como Amberlite-FPA53 (OH-), Amberlite IRA-67, Amberlite IRA-95, Dowex 67, Dowex 77 e Diaion WA 30 podem ser usados. Em uma modalidade particular, a resina de permuta catiônica de ácido forte é resina Amberlite-FPA53 (OH-). Tal como seria do conhecimento dos versados na técnica, outras resinas de troca aniônica de base fraca adequadas para utilização com as modalidades desta invenção estão comercialmente disponíveis.

[058]Em uma modalidade particular, o filtrado contendo glicosídeos de esteviol e/ou “moléculas de glicosídeo sem esteviol” é passado através de uma resina de permuta catiônica de ácido forte, por exemplo, Resina Amberlite® 10 FPC22H (H+), seguida por uma resina de troca aniônica de base fraca, por exemplo, Amberlite-FPA53 (OH-), para proporcionar um filtrado tratado com resina. A velocidade específica (SV) através de uma ou mais colunas de troca iônica pode estar entre cerca de 0,01 a cerca de 5 horas -1, tal como, por exemplo entre cerca de 0,05 a cerca de 4 horas -1, entre cerca de 1 e cerca de 3 horas -1 ou entre cerca de 2 e cerca de 3 horas -1. Em uma modalidade particular, a velocidade específica através de uma ou mais colunas de troca iônica é de cerca de 0,8 hora-1. Após conclusão da passagem do segundo filtrado contendo glicosídeos de esteviol através de uma ou mais colunas de permuta iônica, uma ou mais colunas de permuta iônica são lavadas com água, preferivelmente água de osmose inversa (RO). A solução obtida da lavagem com água e do filtrado tratado com resina pode ser combinada antes de prosseguir para a etapa com múltiplas colunas.

Descoloração [059]Descoloração do filtrado contendo glicosídeos de esteviol e/ou “moléculas de glicosídeo sem esteviol” podem ser obtidas com qualquer método conhecido, como, por exemplo, contato com carvão ativado. A quantidade do carvão ativado pode ser de cerca de 0,1% (p/vol) a cerca de 0,8% (p/vol). Em uma modalidade particular, a quantidade de carvão ativado é de cerca de 0,25% (p/vol) a

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15/39 cerca de 0,30% (p/vol). A suspensão pode ser continuamente agitada. A temperatura do tratamento pode estar entre cerca de 20 ^QC e cerca de 30 ^QC, tal como, por exemplo, cerca de 25 ^QC. O tratamento pode ser por qualquer duração suficiente para descolorir a solução eluída, tal como, por exemplo, entre cerca de 20 minutos e cerca de 3 horas, entre 20 minutos e cerca de 2 horas, entre cerca de 30 minutos e

1,5 horas ou entre cerca de 1 hora e cerca de 1,5 horas. Após o tratamento, a separação do carbono usado pode ser realizada por qualquer meio de separação conhecido, tal como, por exemplo, filtração por gravidade ou por sucção, centrifugação ou filtro-prensa de placa e quadro.

[060]Alternativamente, o filtrado contendo glicosídeos de esteviol e/ou “moléculas de glicosídeo sem esteviol” pode ser passado através da coluna empacotada com carbono ativado.

[061]Deve entender-se também que o tratamento com carbono ou outro agente descolorante pode resultar não apenas no efeito de descoloração, mas também proporcionar melhoria do paladar, sabor, aroma e outras características organolépticas.

Concentração e/ou Secagem [062]A água ou álcool do filtrado contendo “moléculas de glicosídeo sem esteviol” podem ser removidos por qualquer meio adequado, incluindo, mas não limitado a evaporação sob pressão reduzida ou nanofiltração a vácuo, liofilização, secagem instantânea, secagem por pulverização ou uma combinação destes para proporcionar uma composição concentrada ou seca compreendendo “moléculas de glicosídeo sem esteviol”. As composições secas podem ser opcionalmente aglomeradas e/ou granuladas por técnicas de granulação compactas ou úmidas.

Cromatografia [063]As moléculas de glicosídeo sem esteviol e as NSGCs da presente invenção podem ser ainda purificadas e separadas utilizando várias técnicas

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16/39 cromatográficas incluindo cromatografia em papel, cromatografia em camada fina, cromatografia em coluna, cromatografia líquida LC, LC de media pressão (MPLC), LC de alto desempenho (HPLC), LC de ultra alto desempenho (UHPLC), cromatografia em coluna flash, cromatografia de deslocamento, cromatografia por afinidade, cromatografia por fluido supercrítico, cromatografia de permuta iônica, cromatografia por exclusão de tamanho, cromatografia de adsorção, cromatografia de adsorção em leito expandido, cromatografia de fase reversa, cromatografia de fase normal, cromatografia de interação hidrofílica (HILIC), cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia bidimensional, cromatografia em leito em movimento simulado (SMBC), cromatografia em contracorrente e cromatografia quiral conduzida em escala analítica, preparativa, piloto ou industrial.

[064]Em uma modlaidade, é utilizado um sistema de cromatografia compreendendo uma coluna empacotada com resina de adsorção e a eluição conseguida aplicando solvente alcoólico (por exemplo, etanol) com gradiente de aumento de concentração, para separar frações enriquecidas com glicosídeos de esteviol ou”moléculas de glicosídeo sem esteviol”.

[065]Em outra modlaidade, é utilizado um sistema de cromatografia compreendendo uma coluna empacotada com resina de troca iônica e a eluição conseguida por aplicação de solvente acídico ou alcalino, para separar frações enriquecidas com glicosídeos de esteviol ou moléculas de glicosídeo sem esteviol.

[066]Em outra modalidade, é utilizado um sistema de cromatografia compreendendo uma pluralidade de colunas conectadas consecutivamente empacotadas com adsorção e/ou resinas de permuta iônica, semelhante à descrita na Patente US 8.981.081 que é aqui incorporada na sua totalidade como referência.

[067]Ainda em outra modalidade, a separação é conduzida por sistema de HPLC com a seguinte configuração:

• HPLC da série Agilent 1200 - equipado com bomba binária, amostrador

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17/39 automático, forno de coluna e detector de DAD;

• Coluna de HPLC - Poroshell 120 SB-C18, 4,6x150 mm, 2,7 pm a 40 ^QC;

• Volume de injeção - 5 pL;

• Detector - UV 210 nm;

• Fase móvel A - 25:75 (% v/v) de acetonitrila e tampão (10 mmol/L de tampão de fosfato de sódio com pH 2,6);

• Fase móvel B - 32:68 (% v/v) de acetonitrila e tampão (10 mmol/L de tampão de fosfato de sódio com pH 2,6);

• Gradiente de fase móvel:

min - 100% A, 0% B min - 100% A, 0% B

12,5 min - 50% A, 50% B min - 0%A, 100% B min - 0%A, 100% B • Taxa de fluxo - 0,5 mL / min;

• Tempo de execução - 45 minutos;

• Pós Hora -10 minutos.

Cristalização [068]As moléculas de glicosídeo sem esteviol e as NSGCs da presente invenção podem ser adicionalmente purificadas e separadas utilizando várias técnicas de cristalização incluindo, mas não se limitando a, cristalização por arrefecimento, cristalização evaporativa, cristalização fracionada, salting out (relargagem), etc.

[069]Em algumas modalidades, a cristalização pode ser conduzida em concentrações que variam de 0,1% a 99% (p/p).

[070]Em algumas modalidades, a cristalização é realizada a partir de solvente compreendendo pelo menos um solvente selecionado a partir do grupo

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18/39 incluindo água, etanol, metanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, clorofórmio, tolueno, benzeno, xileno, tetracloreto de carbono, ciclohexano, 1,2-dicloroetano, diclorometano, dietil éter, dimetilformamida, acetato de etila, heptano, hexano, metilterc-butil éter, pentano, 2,2,4-trimetilpentano, acetona, tetra-hidrofurano, ácido fórmico, ácido acético e suas combinações.

[071]Ainda em outra modalidade, a cristalização é conseguida adicionando uma base, ou álcali, ou sal, ou ácido ou qualquer outro agente capaz de formar derivados menos solúveis de moléculas de glicosídeo sem esteviol, e em que outro processo pode incluir um etapa para converter a molécula de glicosídeo sem esteviol derivatizada de volta ao estado nativo.

[072]Em outras modalidades, a temperatura de cristalização pode variar entre -20 ^QC e 80 ^QC. Em algumas modalidades, o aumento e/ou diminuição da temperatura pode ser feito pelo método gradiente.

[073]Em outras modalidades, a polaridade do solvente ou mistura de solventes utilizada na cristalização varia de não polar a polar. Incluindo solventes cuja constante dielétrica varia de 1 a 88.

[074]Em algumas modalidades, a força iônica da solução de cristalização varia entre 0 mol/L e 20 mol/L.

[075]Em outra modalidade, o pH da solução de cristalização varia de 1 a 12.

Extração líquido-líquido e sólido [076]NSGCs compreendendo moléculas de glicosídeo sem esteviol da presente invenção, ou seus derivados, podem ser ainda purificadas e separadas usando várias técnicas de extração sólido-líquido e líquido-líquido incluindo mas não limitadas a extração líquido-líquido dispersiva, extração orgânica direta, extração em contracorrente contínua, extração em contracorrente contínua multiestágio, extração centrífuga, extração aquosa de duas fases, extração de polímero-polímero, extração de sal polimérico etc.

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19/39 [077]Os solventes adequados incluem água e solventes orgânicos selecionados a partir do grupo incluindo etanol, metanol, n-propanol, isopropanol, nbutanol, clorofmio, toluene, benzene, xileno, tetracloreto de carbono, ciclo-hexano, 1,2-dicloroetano, diclorometano, dietil éter, dimetilformamida, acetato de etila, heptane, hexano, metil-terc-butil éter, pentano, 2,2,4-trimetilpentano, acetona, tetrahidrofurano, ácido fómico, ácido acético e suas combinações.

Separação de membrana [078]NSGCs compreendendo moléculas de glicosídeo sem esteviol da presente invenção, ou seus derivados, podem ser ainda purificadas e separadas usando várias técnicas de separação de membrana incluindo ultrafiltração, nanofiltração, osmose reversa, diálise, osmose direta, eletrodiálise, eletrodionização, eletrofiltração, filtração de fluxo cruzado, filtração de fluxo tangencial, filtração sem saída, filtração de membranas spiral would, filtração de membranas de fibra oca, filtração por cartucho, filtração de membrana em cascata etc.

Consumíveis com NSGCs [079]Uma modalidade da presente invenção é uma NSGC compreendendo pelo menos uma molécula de glicosídeo sem esteviol.

[080]Em algumas modalidades, a NSGC confere sabor doce.

[081 ]Em uma modalidade, a presente invenção é uma composição adoçante compreendendo NSGC.

[082]Em outra modalidade, a presente invenção é NSGC que é utilizada em produtos consumíveis como fonte de antioxidante, fibra dietética, ácidos graxos, vitaminas, minerais, conservantes, agentes de hidratação, probióticos, prebióticos, agentes de controle de peso, agentes de gerenciamento da osteoporose, fitoestrogênios, álcoois saturados alifáticos primários de cadeia longa, fitoesteróis e combinações destes.

[083]Em outra modalidade, a presente invenção é uma composição

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20/39 intensificadora de sabor compreendendo NSGC, em que a NSGC está presente em uma quantidade eficaz para proporcionar uma concentração no nível de reconhecimento de aroma limite ou inferior à NSGC quando a composição intensificadora de sabor é adicionada a um consumível. Em uma modalidade particular, a NSGC está presente em uma quantidade eficaz para proporcionar uma concentração abaixo do nível de reconhecimento de aroma limite da NSGC quando a composição intensificadora de aroma é adicionada a um consumível. Em uma modalidade, a NSGC está presente em uma quantidade eficaz para proporcionar uma concentração de pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20% ou pelo menos cerca de 25% ou mais abaixo do nível limite de reconhecimento de sabor da NSGC quando a composição intensificadora de sabor é adicionada a um consumível.

[084]Em ainda outra modalidade, a presente invenção é uma composição intensificadora de doçura compreendendo NSGC, em que a NSGC está presente em uma quantidade eficaz para proporcionar uma concentração igual ou inferior ao nível de reconhecimento de doçura limite da NSGC quando a composição intensificadora de doçura é adicionada a um consumível. Em uma modalidade particular, a NSGC está presente em uma quantidade eficaz para proporcionar uma concentração abaixo do nível de reconhecimento de doçura limite da NSGC quando a composição intensificadora de doçura é adicionada a um consumível. Em uma modalidade, a NSGC está presente em uma quantidade eficaz para proporcionar uma concentração de pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20% ou pelo menos cerca de 25% ou mais abaixo do nível limite de reconhecimento de doçura da NSGC quando a composição intensificadora a doçura é adicionada a um consumível.

[085]Em ainda outra modalidade, a presente invenção é um consumível

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21/39 compreendendo NSGC. Os consumiveis adequados incluem, mas não estão limitados a, consumiveis líquidos ou secos, tais como, por exemplo, composições farmacêuticas, misturas e composições de gel comestíveis, composições dentárias, produtos alimentares, bebidas e produtos de bebidas.

[086]Em uma modalidade particular, a presente invenção é uma bebida compreendendo NSGC. Em uma modalidade particular, a NSGC está presente na bebida em uma concentração que está acima, em, ou abaixo da concentração limite de reconhecimento de doçura da NSGC.

[087]Em outra modalidade particular, a presente invenção é um produto de bebida compreendendo NSGC. Em uma modalidade particular, a NSGC está presente no produto de bebida em uma concentração que está acima ou abaixo da concentração limite de reconhecimento de sabor da NSGC.

[088]Em outro aspecto, a presente invenção é um método para preparar um consumível compreendendo (i) fornecer uma matriz consumível e (ii) adicionar NSGC à matriz consumível para fornecer um consumível. Em uma modalidade particular, a NSGC está presente no consumível em uma concentração acima, em ou abaixo do reconhecimento de doçura limite da NSGC. Em outra modalidade particular, a NSGC está presente no consumível em uma concentração acima, igual ou inferior ao reconhecimento de sabor limite da NSGC.

[089]Em uma modalidade particular, a presente invenção é um método de preparação de uma bebida compreendendo (i) proporcionar uma matriz de bebida e (ii) adicionar NSGC à matriz consumível para proporcionar uma bebida. Em uma modalidade particular, a NSGC está presente no consumível em uma concentração acima, em ou abaixo do limite de reconhecimento de doçura da NSGC. Em outra modalidade particular, a NSGC está presente no consumível em uma concentração acima, em ou abaixo da concentração de reconhecimento de sabor limite da NSGC.

[090]Em outro aspecto, a presente invenção é um método para aumentar a

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22/39 doçura de um consumível compreendendo (i) fornecer um consumível compreendendo pelo menos um ingrediente adocicado e (ii) adicionar NSGC ao consumível para fornecer um consumível com doçura intensificada, em que a NSGC está presente na bebida com doçura intensificada em uma concentração igual ou inferior à concentração limite de reconhecimento de doçura da NSGC.

[091 ]Em uma modalidade particular, a presente invenção é um método para aumentar a doçura de uma bebida compreendendo (i) proporcionar uma bebida compreendendo pelo menos um ingrediente doce e (ii) adicionar NSGC à bebida para proporcionar uma bebida com doçura melhorada, em que a NSGC está presente na bebida com doçura intensificada em uma concentração abaixo da concentração de reconhecimento de doçura limite da NSGC. Em uma modalidade, a concentração da NSGC está presente na bebida com doçura intensificada a uma concentração que é pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%. %, ou pelo menos cerca de 25% ou mais abaixo da concentração limite de reconhecimento de doçura da NSGC.

[092]Em um outro aspecto, a presente invenção é um método para melhorar o sabor de um consumível compreendendo (i) fornecer um consumível compreendendo pelo menos um ingrediente aromatizante e (ii) adicionar NSGC ao consumível para proporcionar um consumível com sabor melhorado, em que a NSGC presente no consumível com sabor melhorado a uma concentração igual ou inferior à concentração limite de reconhecimento de sabor da NSGC.

[093]Em uma modalidade particular, a presente invenção é um método de intensificar o sabor de uma bebida compreendendo (i) proporcionar uma bebida compreendendo pelo menos um ingrediente aromatizante e (ii) adicionar NSGC à bebida para proporcionar uma bebida com sabor melhorado, em que a NSGC está presente na bebida com sabor melhorado em uma concentração igual ou inferior à

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23/39 concentração limite de reconhecimento de sabor da NSGC. Em uma modalidade, a concentração da NSGC está presente na bebida com doçura intensificada a uma concentração que é pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20% ou pelo menos cerca de 25% ou mais abaixo da concentração limite de reconhecimento de sabor da NSGC.

[094]Nos métodos acima, a NSGC pode ser adicionada como tal, ou na forma de uma composição compreendendo a NSGC. Quando a NSGC pe proporcionada como uma composição, a concentração da NSGC na composição é eficaz para proporcionar uma concentração acima, em ou abaixo do sabor limite ou composição adoçante da NSGC, quando a composição é adicionada ao consumível, por exmeplo, a comida ou bebida.

[095]Em algumas modalidades, as composições da presente invenção compreendem ainda um ou mais mogrosídeos, em que os mogrosídeos são selecionados, mas não limitados a, o grupo que consiste em extrato de Luo han guo, subprodutos de outros processos de isolamento e purificação de mogrosídeos, um extrato de Luo han guo comercialmente disponível, mogrosídeo IIE, mogrosídeo I IB, mogrosídeo III, mogrosídeo IV, mogrosídeo V, 11-oxo- mogrosídeo V, mogrosídeo VI, siamenosídeo I, grosmomosídeo I, neomogrosídeo, e outros glicosídeos de mogrol e oxo-mogrol que ocorrem na fruta Siraitia grosvenorii e suas combinações.

[096]Em outras modalidades, as composições da presente invenção compreendem ainda um ou mais adoçantes ou adoçantes adicionais. Em uma modalidade, o adoçante adicional é um adoçante natural ou um adoçante sintético. Em uma modalidade particular, o adoçante adicional é um adoçante de alta intensidade. Em uma modalidade particular, o adoçante adicional é um mogrosídeo.

[097]Em algumas modalidades, as composições da presente invenção compreendem ainda um ou mais aditivos. Em uma modalidade particular, o aditivo é

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24/39 selecionado a partir do grupo consistindo em carboidratos, polióis, aminoácidos e seus sais correspondentes, poli-aminoácidos e seus sais correspondentes, ácidos de açúcar e seus sais correspondentes, nucleácidos, ácidos orgânicos, ácidos inorgânicos, sais orgânicos incluindo sais de ácidos orgânicos e sais de bases orgânicas, sais inorgânicos, compostos amargos, aromatizantes e ingredientes aromatizantes, compostos adstringentes, proteínas ou hidrolisados proteicos, surfactante, emulsionantes, flavonóides, álcoois, polímeros e combinações dos mesmos.

[098]Em algumas modalidades, as composições da presente invenção compreendem ainda um ou mais ingredientes funcionais. Em uma modalidade particular, o ingrediente funcional é selecionado a partir do grupo consistindo em cafeína, saponinas, antioxidantes, fontes de fibra dietética, ácidos graxos, vitaminas, glucosamina, minerais, conservantes, agentes de hidratação, probióticos, prebióticos, agentes de controle de peso, agentes de gerenciamento de osteoporose, fitoestrogênios, álcoois saturados alifáticos primários de cadeia longa, fitoesteróis e suas combinações.

[099]Em uma modalidade particular, a presente invenção é um consumível compreendendo uma NSGC e um ou mais adoçantes, adoçantes adicionais, aditivos ou ingredientes funcionais.

[0100]Em outra modlaidade particular, a presente invenção uma bebida compreendendo NSGC e um ou mais adoçantes, adontes adicionais, aditivos ou ingredientes funcionais.

[0101]As NSGCs podem ser usadas sozinhas ou em combinação com pelo menos um outro adoçante em consumíveis incluindo alimentos, bebidas, composição farmacêutica, tabaco, nutracêuticos, composição higiênica oral ou cosméticos. Os outros adoçantes são selecionados a partir do grupo incluindo sacarose, gliceraldeídeo, di-hidroxiacetona, eritrose, treose, eritrulose, arabinose,

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25/39 lipose, ribose, xilose, ribulose, xilulose, alose, altrose, alulose, galactose, glucose, gulose, idose, manose, talose., frutose, psicose, sorbose, tagatose, manoheptulose, sedoheltulose, octolose, fucose, ramnose, arabinose, turanose, sialose, inulina, inulooligosacarídeos, frutooligossacarídeos, xarope de milho rico em frutose (HFCS), maltodextrina, açúcar de acoplamento, mel, estévia, rebaudiosídeo A , rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo G, rebaudiosídeo H, rebaudiosídeo I, rebaudiosídeo J, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo L, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo O, dulcosídeo A, dulcosídeo B, rubusosídeo, esteviolbiosido, esteviosídeo, outros glicosídeos de esteviol que ocorrem na planta Stevia rebaudiana, glicosídeos de esteviol biossintéticos, glicosídeos de esteviol glicosilados, glicosídeos de esteviol glicosilados (GSGs), mogrosídeo IV, mogrosídeo V, mogrosídeo VI, Luo han guo, siamenosídeo, outros mogrosídeos presentes nos frutos de Siraitia grosvenorii, monatina e seus sais, curculina, ácido glicirrízico e seus sais, taumatina, monelina, mabinlina, brazeína, hernandulcina, filodulcina, glicifilina, floridzina, trilobatina, baiyunosídeo, osladina, polipodosídeo A, pterocariosídeo A, pterocariosídeo B, mucuroziosídeo, flomisosídeo I, periandrina I, abrusosídeo A, e ciclocariosídeo I, álcoois de açúcar, sucralose, acesulfame de potássio, ácido de acesulfame e sais disso, aspartame, alitame, sacarina e seus sais, neohesperidina di-hidrochalcona, ciclamato, ácido ciclâmico e seus sais, neotame, advantame e suas combinações.

[0102]0s exemplos seguintes ilustram modalidades preferidas da invenção. Será entendido que a invenção não está limitada aos materiais, proporções, condições e procedimentos estabelecidos nos exemplos, que são apenas ilustrativos.

EXEMPLO 1

Preparação de NSGC [0103]Cinco quilogramas de folhas secas de Stevia rebaudiana (tendo cerca

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26/39 de 8% (p/p) de teor de umidade e cerca de 10% (p/p, base seca) de glicosídeos de esteviol totais) foram moídas em partículas de 10-20 mm. O material das folhas secas foi carregado em um tanque de extração e a extração foi realizada com 100 L de água RO a 65 ^QC por 10 min. O material insolúvel foi removido por filtração. O filtrado amarelado foi coletado e alimentado com uma coluna empacotada com 8,5 L de resina adsorvente macroporosa polimérica (YWD-03, Cangzhou Yuanwei, China), com vazão de aproximadamente 50 L/hora. Após a conclusão do filtrado, a coluna foi adicionalmente lavada com 45 L de água e ambos os efluentes foram combinados. A solução combinada foi evaporada sob vácuo, à temperatura entre 30 ^QC-35 ^QC, até um volume final de 10 L.

[0104]A maioria dos glicosídeos de esteviol foram absorvidos em resina adsorvente macroporosa e foram eluídos com cerca de 45 L de etanol aquoso a 70%. O eluato aquoso de etanol foi posteriormente processado para produzir cerca de 400 g de extrato de estévia com cerca de 96% p/p de teor total de glicosídeos de esteviol.

[0105]A solução combinada e evaporada de 10 L acima mencionada foi misturada com 90 L de etanol puro e a mistura foi mantida durante 10 min com agitação lenta. O precipitado resultante foi removido por filtração a vácuo. O filtrado foi coletado e depois submetido à evaporação a vácuo (a 30^QC - 35^QC) para remover o etanol e depois concentrado a cerca de 4 L de NSGC em forma de xarope contendo 22% p/p de sólidos. O ensaio de HPLC desta solução mostra cerca de 1,3% de glicosídeos de esteviol residuais em que a % de razão de glicosídeos de esteviol individuais foi: Rebaudiosídeo E 0,41%, Rebaudiosídeo O 10,52%, Rebaudiosídeo D 5,95%, Rebaudiosídeo N 1,49%, Rebaudiosídeo M 3,07%, Rebaudiosídeo A 56,98%, Esteviosídeo 11,66%, Rebaudiosídeo F 0,89%, Rebaudiosídeo C 4,37%, Dulcosídeo A 0,11% e Rebaudiosídeo B 0,35%. O concentrado foi seco utilizando evaporação a vácuo seguido de secagem em forno a

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27/39 vácuo a 30^QC - 35^QC.

EXEMPLO 2

Extração de NSGC por etanol aquoso [0106]50 kg de folhas de Stevia rebaudiana secas (tendo cerca de 8% (p/p) de teor de umidade e cerca de 8,5% (p/p) de glicosídeos de esteviol totais) foram triturados a partículas de 10-20 mm. O ensaio de HPLC desta folha também mostra cerca de 3,2% p/p de conteúdo total de CGA, compreendendo 1,34% de CGAs (neoCGA, n-CGA e crypto-CGA), e 1,86% de iso-CGAs (iso-CGA-B, iso-CGA-A e isoCGA-C). O material das folhas secas foi carregado em um tanque de extração e a extração foi realizada com 800 L de etanol a 30% (v/v) a 65 ^QC durante 30 min. A mistura foi filtrada através de 800 g de terra diatomáceas. O filtrado amarelado foi coletado e arrefecido a 30 ^QC. O EtOH foi removido do filtrado por membrana de nanofiltração (NF90-400, Dow Chemical Company, EUA) a 45 ^QC sob pressão de 0,5-0,8 MPa.

[0107]320 L do retentado obtido a partir de nanofiltração estimado em cerca de 1,57 kg de CGAs total e 4,1 kg de glicosídeos de esteviol total foram alimentados para a coluna empacotada com 125 Lde resina adsorvente macroporosa polimérica (YWD-03, Cangzhou Yuanwei, China), taxa de fluxo de 125 L/hora. Depois de alimentar o retentado, a coluna foi adicionalmente lavada com 62,5 L de água e ambos os efluentes foram combinados para fazer um produto de fluxo de passagem, que foi ainda concentrado usando membrana de nanofiltração (NF90-400, Dow Chemical Company, EUA) para 20% de teor de sólidos totais. A floculação do produto de fluxo concentrado foi realizada utilizando 9 volumes de etanol. O precipitado floculado foi separado por filtração e o Etanol foi removido por membrana de nanofiltração (NF90-400, Dow Chemical Company, EUA) como mencionado acima. O concentrado foi seco usando liofilizador. O produto de fluxo purificado continha 12,24% p/p (base seca) de CGA total, que compreendia 2,66% de neo

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CGA, 7,46% de n-CGA, 1,87% de crypto-CGA, 0,07% de iso-CGA-B, iso -CGA-A 0,16% e iso-CGA-C 0,06% e 0,70% p/p de glicosídeos de esteviol totais.

[0108]0s CGAs adsorvidos foram eluídos da resina adsorvente macroporosa usando 690 L de etanol a 25% (v/v). A solução foi passada através de membrana de nanofiltração (NF90-400, Dow Chemical Company, EUA) para remover Etanol e depois seca por liofilização como mencionado acima para fazer produto com 25% de etanol. O produto com 25% de etanol continha 19,52% p/p de CGA total, que incluía neo-CGA 0,78%, n-CGA 3,59%, croco-CGA 1,04%, iso-CGA B 2,64%, iso-CGA-A 4,14. % e iso-CGA-C 7,33% e 12,28% p/p de glicosídeos de esteviol totais incluindo Rebaudiosídeo E 1,43%, Rebaudiosídeo D 1,54%, Rebaudiosídeo A 5,31%, Esteviosídeo 2,49% e outros.

[0109]Os restantes glicosídeos de esteviol foram eluídos da resina adsorvente macroporosa com cerca de 380 L de etanol aquoso a 70% e processados adicionalmente para produzir um extrato de stévia com um teor de TSG de 71%.

EXEMPLO 3

Extração de NSGC por água [0110]50 kg de material de folha seca de Stevia rebaudiana, semelhante ao utilizado no Exemplo 2, foram carregados em um tanque de extração e a extração foi realizada com 800 L de água a 90 durante 30 min. A mistura foi filtrada através de 800 g de terra diatomáceas. O filtrado amarelado foi coletado e arrefecido a 30 ^QC, e foi alimentado a uma coluna com 125 L de resina adsorvente macroporosa polimérica (YWD-03, Cangzhou Yuanwei, China). As etapas subsequentes foram semelhantes às descritas no Exemplo 2.

[0111 ]O produto de passage de fluxo continha 14,47% p/p de CGA total, que incluía neo-CGA 4,67%, n-CGA 5,67%, cripto-CGA 3,44%, iso-CGA-B 0,24%, isoCGA-A 0,21 % e iso-CGA-C 0,24% e 0,59% p/p de glicosídeos de esteviol totais. O

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29/39 produto com 25% de etanol continha 17,97% p/p do total de CGA, composto por neo-CGA 0,78%, n-CGA 1,56%, cripto-CGA a 0,91%, iso-CGA-B a 5,36%, iso-CGAA. 3,21% e iso-CGA-C 6,15% e 13,83% p/p de glicosídeos de esteviol totais, incluindo Rebaudiosídeo E 2,89%, Rebaudiosídeo D 1,52%, Rebaudiosídeo A 5,31%, Esteviosídeo 2,49% e outros.

EXEMPLO 4

Extração de NSGC por água [0112]50 kg de material de folha seca de Stevia rebaudiana, semelhante ao utilizado no Exemplo 2, foram carregados em um tanque de extração e a extração foi realizada com 800 L de água a 65 ^QC durante 30 min. A mistura foi filtrada através de 800 g de terra diatomáceas. O filtrado amarelado foi coletado e arrefecido a 30 ^QC, e foi alimentado a uma coluna empacotada com 125 L de resina adsorvente macroporosa polimérica (YWD-03, Cangzhou Yuanwei, China). O processo subsequente foi semelhante ao descrito no Exemplo 2.

[0113]O produto com 25% de etanol continha 19,90% p/p de CGA total, que compreendia neo-CGA 0,35%, n-CGA 4,30%, cripto-CGA 1,23%, iso-CGA-B 0,81%, iso-CGA-A8,19% e iso-CGA-C 5,02% e 13,47% p/p de glicosídeos de esteviol totais, incluindo Rebaudiosídeo D 1,86%, Rebaudiosídeo A 7,45%, Esteviosídeo 2,13% e outros.

EXEMPLO 5

Purificação da NSGC [0114]6 gramas do produto de etanol a 25% seco do Exemplo 3 foram dissolvidos em 20 ml de água. Adicionou-se 180 mL de etanol puro à mistura e agitou-se à temperatura ambiente durante 1 hora. A suspensão obtida foi filtrada e adicionou-se 0,72 g de carvão ativado ao filtrado e deixou-se agitar à temperatura ambiente durante mais 1 hora. A mistura foi filtrada novamente para remover o carvão ativado. O filtrado obtido foi concentrado utilizando evaporador rotativo a 40

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30/39 ^QC e seco em estufa de vácuo a 40 ^QC para dar 3,6 g de produto de etanol a 25%. O produto processado com etanol a 25% continha 22,32% p/p de CGA total, incluindo neo-CGA 0,84%, n-CGA 1,26%, cripto-CGA 0,91%, iso-CGA B 6,85%, iso-CGA-A 4,99% e iso-CGA-C 7,48% e 23,26% p/p de glicosídeos de esteviol totais incluindo Rebaudiosídeo D 2,03%, Rebaudiosídeo A 12,18%, Eesteviosídeo 6,70% e outros.

EXEMPLO 6

Purificação de Membrana de NSGC [0115]Um grama do produto de etanol a 25% processado do Exemplo 5 foi dissolvido em 100 mLde água RO e a solução foi alimentada no sistema de filtração de células em agitação de alta pressão Sterlitech HP4750 (Sterlitech Corporation, EUA) a 20 ^QC, até 50 ^QC mL de permeado foi coletado. Ambos o retentado e o permeado foram liofilizados e testados por HPLC.

[0116]A experiência foi repetida usando diferentes discos de membrana de 47 mm obtidos da Sterlitech Corporation (EUA). Particularmente GE 2000 UFGH (Sterlitech No. Cat. YMGHSP475), GE 1000 (Sterlitech Cat. No. YMGESP475), Synder NFG (Sterlitech Cat. No. YMNFG475), Microdyn Nadir NP010 (Sterlitech Cat. No. YMNP010475), Evonik Duramem 900 (Sterlitech Cat. No. 1120773) e Synder XT, PES, UF (Sterlitech Cat. No. YMXT475).

[0117]Os resultados da análise de permeado e retentado estão resumidos na Tabela 1.

Tabela 1

ID de Amostra	Inicia 1	Tipo de Membrana
GE 2000 UFGH	GE 1000	Synder NFG	Microdyn Nadir NP010	Evonik Duramem 900	Synder XT, PES, UF
Ret*	Per*	Ret	Per	Ret	Per	Ret	Per	Ret	Per	Ret	Per
% de ensaio HPLC de CGA (como	neo- CGA	0.84	0.87	1.23	0.88	1.15	0.88	0.07	1.09	0.62	1.08	0.14	0.88	0.62
n-CGA	1.26	1.26	2.22	1.28	2.15	1.33	0.11	1.41	1.07	1.41	0.15	1.33	0.96
cryptoCGA	0.91	0.91	1.55	0.93	1.52	0.96	0.08	1.02	0.81	1.02	0.13	0.93	0.72
iso-	6.85	7.14	6.88	6.96	5.96	7.09	0.03	7.47	2.89	6.99	0.44	7.54	2.13

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seco)	CGA-B
isoCGA-A	4.99	4.99	7.95	5.03	7.17	5.21	0.02	5.27	3.04	5.11	0.38	5.32	2.17
isoCGA-C	7.48	ΊΊΊ	7.11	7.63	5.94	7.76	0.03	7.92	2.65	7.60	0.38	7.93	1.83
Total CGA	22.32	22.94	26.93	22.71	23.90	23.23	0.34	24.18	11.08	23.22	1.62	23.93	8.44
% de ensaio HPLC de SG (como seco )	Reb E	0.32	0.35	0.00	0.96	0.00	1.15	0.00	0.51	0.00	0.80	0.31	0.89	0.47
RebO	0.20	0.21	0.05	0.15	0.00	0.18	0.00	0.10	0.00	0.12	0.22	0.14	0.00
Reb D	2.03	2.02	0.12	1.80	0.10	1.73	0.15	2.01	0.00	1.70	0.22	1.81	0.23
Reb N	0.34	0.38	0.00	0.43	0.00	0.43	0.06	0.27	0.00	0.35	0.04	0.39	0.03
Reb M	0.36	0.39	0.00	0.38	0.00	0.34	0.00	0.26	0.00	0.36	0.00	0.39	0.04
RebA	12.18	13.31	1.79	12.65	1.10	12.71	1.00	12.93	1.23	12.62	1.51	12.87	1.71
Stev	6.70	7.29	1.91	6.92	1.30	6.97	0.59	6.98	1.57	6.80	0.97	6.91	1.17
Reb F	0.16	0.20	0.07	0.18	0.04	0.18	0.11	0.18	0.05	0.16	0.21	0.18	0.03
RebC	0.81	0.87	0.11	0.83	0.08	0.83	0.08	0.83	0.12	0.81	0.09	0.78	0.12
Dul A	0.04	0.05	0.05	0.05	0.09	0.04	0.12	0.05	0.02	0.04	0.15	0.05	0.02
Rub	0.03	0.03	0.19	0.02	0.17	0.03	0.02	0.03	0.04	0.02	0.04	0.03	0.01
Reb B	0.06	0.08	0.02	0.09	0.00	0.07	0.02	0.14	0.19	0.05	0.02	0.09	0.01
Sbio	0.04	0.04	0.03	0.03	0.00	0.03	0.02	0.06	0.07	0.03	0.01	0.06	0.00
Total SG	23.26	25.22	4.34	24.49	2.89	24.69	2.17	24.34	3.30	23.86	3.79	24.58	3.86

* Nota: Ret: Retentate; Per: Permeado [0118]A membrana GE 1000 foi selecionada para outras experiências.

EXEMPLO 7

Purificação de NSGC Usando Membrana com Etapa de Diafiltração [0119]Um grama de produto de etanol processado a 25% do Exemplo 5 foi misturado com 100 mL de água RO e foi alimentado ao sistema de filtração de células em agitação de alta pressão Sterlitech HP4750 (Sterlitech Corporation, EUA) equipado com GE 1000 (Sterlitech Cat No YMGESP475) a 20 ^QC, até que 50 mL de permeado fossem coletados. Após a coleta de 50 mL de permeado, 50 mL de água RO foram adicionados à célula e a filtração foi repetida para coletar mais 50 mL do permeado. Este processo foi repetido para obter dez frações de permeado. O retentado e os permeatos foram liofilizados e testados por HPLC.

[0120]Para o retentado, o CGA total foi 16,51% (p/p, base seca), composto

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32/39 por neo-CGA 0,35%, n-CGA 0,65%, cripto-CGA 1,11%, iso-CGA-B 5,52%, iso-CGAA 2,75% e iso-CGA-C 6,13% e o teor total de glicosídeo de esteviol foi de 37,69% p/p, incluindo Rebaudiosídeo D 2,75%, Rebaudiosídeo A 20,48%, Eesteviosídeo 10,39%, Rebaudiosídeo C 1,35% e outros. Para amostra combinada de 10 amostras de permeado, o CGA total foi de 30,33% (p/p, base seca), composto de neocat097%, n-CGA 2,52%, criptocraco-CGA 2,28%, iso-CGA-B 8,23% , iso-CGA-A 8,24% e iso-CGA-C 8,08%, e o teor total de glicosídeo de esteviol foi de 5,99% p/p, incluindo Rebaudiosídeo A 2,66%, Esteviosídeo 2,89% e outros.

EXEMPLO 8

Purificação de NSGC usando sistema de cromatografia de adsorção [0121 ]100 mL de solução aquosa contendo 10,07 g de produto de Etanol a 25% do Exemplo 4 foram alimentados a uma coluna empacotada com 300 mL de resina adsorvente polimérica macroporosa (TF3, Cangzhou Yuanwei, China), a uma taxa de fluxo de 300 mL/hora à temperatura ambiente. Após a conclusão do carregamento, a coluna foi adicionalmente lavada com 600 mL de água e ambos os efluentes foram combinados e coletados como produto de fluxo de passagem. O produto de fluxo foi concentrado por membrana de nanofiltração (NF90-400, Dow Chemical Company, EUA) e depois seco usando secador por pulverização para obter fluxo de 1,9 g de produto seco contendo 27,82% p/p (base seca) do total de CGAs, compreendendo de neo-CGA 4,11%, n-CGA 17,21%, crypto-CGA 6,25%, isoCGA-B 0,04%, iso-CGA-A 0,17% e iso-CGA-C 0,04% e 0,12% p/p de glicosídeos de esteviol totais.

[0122]Os CGAs adsorvidos foram eluídos da resina adsorvente macroporosa usando 1.500 mL de etanol a 20% (v/v). A solução foi passada através de membrana de nanofiltração (NF90-400, Dow Chemical Company, EUA) para remover Etanol e para concentrar. O concentrado foi seco usando secador por pulverização e 4,3 g de amostra seca foi coletada como produto de etanol a 20%. Este produto continha

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21,99% p/p de CGA total, composto por neo-CGA 0,03%, n-CGA 0,23%, cripto-CGA 0,16%, iso-CGA-B 2,39%, iso-CGA-A 11,93% e iso- CGA-C 7,25% e 2,18% p/p de glicosideos de esteviol totais.

[0123]Os glicosideos de esteviol restantes absorvidos em uma resina macroporosa foram eluídos com cerca de 900 ml_ de etanol aquoso a 60% e processados adicionalmente para proporcionar 3,6 g de extrato de Stevia contendo 60,5% p/p de glicosideos de esteviol totais.

EXEMPLO 9

Purificação de NSGC usando sistema de cromatografia de adsorção [0124]100 mL de solução aquosa contendo 9,0 g de Etanol a 25% do Exemplo 4 foram alimentados a uma coluna empacotada com 300 mL de resina adsorvente polimérica macroporosa (TF3, Cangzhou Yuanwei, China), com uma taxa de fluxo de 300 mL/hora à temperatura ambiente. Após a conclusão da carga, a coluna foi adicionalmente lavada com 900 mL de água e ambos os efluentes foram combinados e coletados como produto de fluxo de passagem. O produto foi concentrado usando membrana de nanofiltração (NF90-400, Dow Chemical Company, EUA) e depois seco por pulverização para produzir 1,51 g de produto de fluxo seco contendo 31,27% p/p (base seca) de CGA total, composto de neo -CGA 4,19%, n-CGA 19,35%, crypto-CGA 7,10%, iso-CGA-B 0,11%, iso-CGA-A 0,43% e iso-CGA-C 0,10% e 0,01% p/p de glicosideos de esteviol totais .

[0125]A resina adsorvente macroporosa foi então sequencialmente lavada com 900 mL de etanol a 15% (v/v), 900 mL de etanol a 20% (v/v), 900 mL de etanol a 25% (v/v) e 900 mL etanol a 60% (v/v). Todas as soluções coletadas foram concentradas utilizando-se membrana de nanofiltração (NF90-400, Dow Chemical Company, EUA) e depois secas usando secador por pulverização para obter 15% de produto de etanol, 20% produto de etanol, 25% de produto de etanol e produto de etanol a 60%, respectivamente. O ensaio de HPLC dessas frações está resumido na

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Tabela 2.

Tabela 2

Ensaio de HPLC de frações de eluato

Fração	% de Ensaio HPLC (como seco)
neoCGA	n-CGA	cryptoCGA	isoCGA-B	isoCGA-A	isoCGAC	CGA Total	TSG Total
Fluxo de passagem	4.19	19.35	7.10	0.11	0.43	0.10	31.27	0.01
15%Etanol	0.04	0.11	0.06	4.04	14.43	3.97	22.65	0.11
20%Etanol	0.01	0.02	0.01	0.77	9.84	17.24	27.89	0.93
25%Etanol	0.01	0.03	0.01	0.13	1.66	16.62	18.46	9.30
60%Etanol	0.00	0.00	0.00	0.02	0.10	0.18	0.30	48.81

EXEMPLO 10

Purificação de NSGC usando sistema de cromatografia de adsorção [0126] 100 mL de solução aquosa contendo 9,0 g do produto de etanol a 25% do Exemplo 4 foram alimentados a uma coluna empacotada com 300 mL de resina adsorvente polimérica macroporosa (TF3, Cangzhou Yuanwei, China), com uma taxa de fluxo de 300 mL/hora à temperatura ambiente. Após a conclusão da carga, a coluna foi adicionalmente lavada com 600 mL de água e ambos os efluentes são combinados e coletados como produto de fluxo de passagem. O produto de fluxo foi concentrado usando membrana de nanofiltração (NF90-400, Dow Chemical Company, EUA) e depois seco para produzir 1,45 g de produto total contendo 18,04% p/p (base seca) do total de CGA, composto por neo-CGA 2,12%, n-CGA 13,40%, cripto-CGA 2,47%, iso-CGA-A 0,04% e iso-CGA-C 0,01 % e 0,74% p/p de glicosídeos de esteviol totais.

[0127]A resina adsorvente macroporosa foi ent lavada sequencialmente com 1500 mL de etanol a 20% (v/v) e 900 mL de etanol a 60% (v/v). Todas as soluções

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35/39 coletadas foram concentradas utilizando membranas de nanofiltração (NF90-400, Dow Chemical Company, EUA) e depois secas para obter produto de etanol a 20% e produto de etanol a 60%, respectivamente.

[0128]O ensaio de HPLC dessas frações está resumido na Tabela 3.

Tabela 3

Ensaio de HPLC de frações de eluato

Fração	% de ensaio de HPLC (como seco)
neoCGA	n-CGA	cryptoCGA	isoCGA-B	isoCGA-A	isoCGA-C	Total CGA	Total SG
Fluxo de Passage m	2.12	13.40	2.47	0.00	0.04	0.01	18.04	0.74
20%Etanol	0.07	0.87	0.27	1.97	15.85	5.31	24.34	0.21
60%Etanol	0.00	0.01	0.00	0.06	0.42	0.70	1.20	48.51

EXEMPLO 11

Purificação de NSGC usando sistema de cromatografia de adsorção [0129]500 mg/L de solução aquosa de 25% de produto de etanol do Exemplo 4 foi alimentado a uma coluna empacotada com 150 mL de resina adsorvente macroporosa polimérica (TF3, Cangzhou Yuanwei, China), com uma taxa de fluxo de cerca de 150 mL/hora à temperatura ambiente. O efluente foi coletado e sua doçura foi periodicamente analisada pelo método sensorial. A alimentação foi interrompida quando a doçura foi detectada no efluente. Os efluentes foram combinados, concentrados e depois secos usando secador por pulverização para obter um produto efluente contendo 21,65% p/p (base seca) do total de CGAs, composto por neo-CGA 1,37%, n-CGA 5,42%, crypto-CGA 1,97%, iso-CGA-B 1,90%, iso-CGA-A 6,12% e iso-CGA-C 4,87% e 0,42% p/p de glicosídeos de esteviol totais.

[0130]A resina adsorvente macroporosa foi então lavada sequencialmente com 300 mL de etanol a 20% (v/v) e 450 mL de etanol a 60% (v/v). Todas as

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36/39 soluções coletadas foram concentradas utilizando membranas de nanofiltração (NF90-400, Dow Chemical Company, EUA) e depois secas usando um secador por pulverização para obter produto de etanol a 20% e produto de etanol a 60%, respectivamente.

[0131 ]O ensaio de HPLC dessas frações está resumido na Tabela 4.

Tabela 4

Ensaio de HPLC de frações de eluato

Fração	% de ensaio de HPLC (como seco)
neoCGA	n-CGA	cryptoCGA	isoCGA-B	isoCGA-A	isoCGAC	CGA Total	SG Total
Fluxo de passage	1.37	5.42	1.97	1.9	6.12	4.87	21.65	0.42
20%Etanol	0.43	2.39	0.81	1.23	5.08	5.37	15.31	3.37
60%Etanol	0	0.01	0	0.03	0.04	0.08	0.16	67.79

EXEMPLO 12

Purificação de NSGC usando cristalização [0132]1 grama do produto de etanol a 25% seco do Exemplo 3 foi dissolvido em 20 mL de água. Adicionou-se 100 mg de Ca(OH)2 e a mistura foi mantida durante 1 hora até se formar um precipitado. A suspensão obtida foi filtrada e o precipitado foi ressuspenso em água e titulado com ácido acético até dissolução e foi alimentado a uma coluna empacotada com 100 mL de resina adsorvente macroporosa polimérica (YWD-03, Cangzhou Yuanwei, China). O processo subsequente foi semelhante ao descrito no Exemplo 2.

[0133]O produto com 25% de etanol continha 42,90% p/p de CGA total, que compreendia 0,5% de neo-CGA, 1,37% de n-CGA, 0,37% de crypto-CGA, 5,68% de iso-CGA-B, iso-CGA-A 6,89% e iso-CGA-C 28,08% e 0,3% p/p de glicosídeos de esteviol totais, incluindo, Rebaudiosídeo A 0,2%, Esteviosídeo 0,1% e outros.

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EXEMPLO 13

Consumível compreendendo NSGC [0134]Amostras de bebidas carbonatadas foram preparadas de acordo com a fórmula apresentada na Tabela 5.

Tabela 5

Fórmula para bebidas carbonatadas

Ingredientes	Quantidade, %
Sabor de cola	0.340
Ácido orto-fosfórico	0.100
Citrato de sódio	0.310
Benzoato de sódio	0.018
Ácido cítrico	0.018
COmposição adoçante	0.050
Água carbonada	a 100

[0135]As seguintes amostras foram usadas como “composição adoçante” na fórmula, (i) amostra comercial de Rebaudiosídeo A (97% puro) e (ii) mistura (com razão 95: 5 p/v) de Rebaudiosídeo A comercial (97% puro) e NSGC preparado de acordo com o Exemplo 3. A avaliação sensorial de amostras de bebidas foram conduzidas por 20 palestrantes. Os resultados estão resumidos na Tabela 6.

Tabela 6

Avaliação sensorial de amostras de bebidas carbonatadas

“Composição adoçante” usada na formula	Doçura persistente*	Amargor*	Início de doçura atrasada*	Paladar de alcaçuz*	Paladar geral
RebA 97 + NSGC (95:5)	2	1	1	2	agradável
RebA 97 Puro	5	5	5	5	desagradável

*Para as características de “Doçura persistente”, “Amargor”, “Início de doçura atrasada”, e “Paladar de alcaçuz” os palestrantes pontuaram entre 1 a 5, onde a menor pontuação representa sensação de paladar mais agradável pelos palestrantes

Petição 870190050380, de 29/05/2019, pág. 48/55

38/39 [0136]Os resultados mostraram que as bebidas preparadas usando a composição adoçante compreendendo NSGC possuíam as melhores características organolépticas.

EXEMPLO 14

Consumível compreendendo a nova NSGC [0137]As amostras de chocolate foram postas de acordo com a fórmula da Tabela 7.

Tabela 7

Ingredientes	Quantidade, %
Licor de chocolate	30.0
Manteiga de cacao	11.5
Leite em pó	14.0
Sorbitol	44.0
Sal	0.1
Composição adoçante	0.1
Lecitina	0.3

[0138]Licor de chocolate, manteiga de cacau, leite em pó, sorbitol, sal e a “composição adoçante” foram amassados o suficiente, e a mistura foi então colocada em um refinador para reduzir seu tamanho de partícula por 24 horas. Posteriormente, o conteúdo foi transferido para uma concha, a lecitina foi adicionada e a composição foi amassada a 50 ^QC durante 48 horas. Em seguida, o conteúdo foi colocado em um aparelho de modelagem e solidificado.

[0139]As seguintes amostras foram usadas como “composição adoçante” na fórmula da Tabela 3. (i) Amostra comercial de Rebaudiosídeo A (97% puro) e (ii) mistura (com razão 95:5 p/v) de Rebaudiosídeo A comercial (97% puro) e NSGC preparados de acordo com o Exemplo 3. A avaliação sensorial de amostras de chocolate foi realizada por 20 palestrantes. Os resultados estão resumidos na Tabela 8.

Petição 870190050380, de 29/05/2019, pág. 49/55

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Tabela 8

Avaliação sensorial de amostras de chocolate

“Composição adoçante” usada na formula	Doçura persistente*	Amargor*	Paladar de alcaçuz*	Paladar geral
RebA97 + NSGC (95:5)	1	2	2	agradável
Pure RebA 97	5	5	5	desagradávelt

*Para as características de “Doçura persistente”, “Amargor” e “Paladar de alcaçuz” os palestrantes pontuaram entre 1 a 5, onde a menor pontuação representa sensação de paladar mais agradável pelos palestrantes [0140]0s resultados mostraram que as amostras de chocolate preparadas usando a composição adoçante compreendendo NSGC possuíam as melhores características organolépticas.

[0141]Embora o precedente tenha descrito uma ou mais modalidades da presente invenção, será entendido pelos versados na técnica que podem ser feitas várias alterações e modificações e equivalentes podem ser substituídos por elementos ou suas composições sem se afastarem do verdadeiro âmbito da invenção. Por conseguinte, pretende-se que esta invenção não seja limitada a uma modalidade particular divulgada, mas que a invenção inclua todas as modalidades abrangidas pelo âmbito das reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para preparar composição de glicosídeo sem esteviol, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de:

a. fornecer material vegetal de Stevia rebaudiana;

b. fornecer solvente de extração;

c. misturar material vegetal de Stevia rebaudiana e solvente de extração para fornecer material vegetal de estévia e mistura de solventes;

d. separar material vegetal de estévia e misturar solventes para obter filtrado compreendendo moléculas de glicosídeo de esteviol e moléculas de glicosídeo sem esteviol;

e. isolar ou separar as moléculas de glicosídeo de esteviol do filtrado para obter uma composição de glicosídeo sem esteviol, e em que a composição de glicosídeo sem esteviol obtida compreende pelo menos uma molécula de glicosídeo sem esteviol selecionada a partir de compostos fenólicos, polifenóis, flavonóides, ácidos quínico e cafeico e seus derivados, ácido neoclorogênico (neo-AGC; ácido 5-O-cafeoilquínico ou 5-CQA), ácido croctoclorogênico (crypto-CGA; ácido 4-O-cafeoilquínico ou 4-CQA), ácido n-clorogênico (n-CGA; ácido 3-O-cafeoilquínico ou 3-CQA), ácido iso-clorogênico A (iso-CGA A; ácido 3,5-dicafeoilquínico) ácido iso-clorogênico B (iso-CGA B; ácido 3,4dicafeoilquínico), ácido iso-clorogênico C (iso-CGA C; ácido 4,5-dicafeoilquínico), outros ácidos clorogênicos e ácidos iso-clorogênicos conhecidos da técnica, retinóides, pigmentos, polissacarídeos, oligossacarídeos, dissacarídeos, monossacarídeos, componentes voláteis do óleo, esteróis, terpenóides, sesquiterpenóides, diterpenos, triterpenos, cumarinas, ácidos graxos e seus derivados, aminoácidos e seus derivados, dipeptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas, austroínulina, quercetina, esteribinas, spatulenol, ácido decanóico, ácido 8,11,14-ecosatrienóico, 2-metilactadecano, pentacosane,

Petição 870190050380, de 29/05/2019, pág. 51/55
2/2 octacosano, estigmasterol, bsitosterol, a e b-amirina, lupeol, acetato de b-amirina, triterpenos pentacíclicos e/ou glicosídeos e suas combinações.

2. Composição de glicosídeo sem esteviol CARACTERIZADA pelo fato de que é como definida na reivindicação 1.
3. Consumível CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a composição de glicosídeo sem esteviol definida na reivindicação 1.
4. Método de preparação de consumível CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a etapa de adicionar composição de glicosídeo sem esteviol definida na reivindicação 1 ao consumível.