CN105001281B

CN105001281B - 一种同步生产甜菊糖苷、黄酮和绿原酸的工业化生产方法

Info

Publication number: CN105001281B
Application number: CN201510339325.7A
Authority: CN
Inventors: 徐美利; 牛志平; 田洪; 王立志; 李乾丽
Original assignee: Chenguang Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Chenguang Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2015-06-18
Filing date: 2015-06-18
Publication date: 2018-02-09
Anticipated expiration: 2035-06-18
Also published as: CN105001281A

Abstract

本发明为一种同步生产甜菊糖苷、黄酮和绿原酸的工业化生产方法。步骤如下：（1）称取甜菊叶，加水提取，过滤得提取液，保温条件下加絮凝剂，调pH至7‑12，30‑75℃静置0‑120min，过滤，得到滤泥和滤液，滤液经树脂纯化得甜菊糖苷产品；（2）滤泥用酸性溶剂提取，合并提取液，浓缩；（3）浓缩液加溶剂稀释，上大孔吸附树脂吸附；（4）对步骤（3）中的大孔吸附树脂进行梯度解析，低度解析液浓缩干燥得绿原酸产品，高度解析液浓缩备用；（5）高度解析浓缩液加水稀释后，用等体积有机溶剂萃取，合并有机相，浓缩干燥得黄酮产品。该方法实现了甜菊糖苷、黄酮和绿原酸的同时提取，降低了生产成本，提高了甜叶菊的综合利用价值。

Description

一种同步生产甜菊糖苷、黄酮和绿原酸的工业化生产方法

技术领域

本发明属于天然产物提取技术领域，尤其涉及一种同步生产甜菊糖苷、黄酮和绿原酸的工业化生产方法。

背景技术

甜菊糖苷为萜苷类天然产物，是从甜叶菊的叶片中分离提取的一种低热量的高倍甜味剂，其甜度为蔗糖的150-300倍，热量却仅为蔗糖的1/300。随着人们对健康问题的日益关注，甜菊糖苷以其低能量、高甜度的优势，已在食品、饮料及日化用品等行业得到了广泛的应用，甜叶菊也已成为继甘蔗和甜菜之后的第三大糖源。

甜叶菊属菊科甜菊属多年生草本植物，在其发源地作为甜茶、药茶饮用已有一百多年的历史。甜叶菊中除甜菊糖苷外还含有黄酮、绿原酸等成分，且这些成分都有重要的生物活性，如抗菌、降血压、降血脂等。目前，关于甜菊糖苷的制备方法国内外均有报道，但只有少数关于甜菊糖苷副产物提取的研究。申请号2007101634536、200710111313.4、200710111314.9和论文《甜叶菊有效部位制备工艺及化学成分与质量控制方法研究》中将甜叶菊糖苷和黄酮同时提取出后，直接用树脂分离，得甜菊糖苷产品和黄酮产品。甜叶菊提取液中除甜菊糖苷和黄酮外，还含有绿原酸、无机盐、氨基酸等多种水溶性杂质，直接用树脂分离，不能得到高品质的糖苷和黄酮产品，该类专利虽已发布较长时间，但仍没有在工业上应用。论文《甜叶菊渣中总黄酮的纯化工艺研究》、《甜叶菊渣中总黄酮的提取工艺优选》和《甜叶菊中总糖苷和总黄酮的提取、纯化工艺及清除自由基研究》中提取糖苷成分后，用乙醇对叶渣进行再一次提取得甜叶菊黄酮产品。甜叶菊黄酮分子多含有糖基片段，大大增加了其水溶性，糖苷提取过程中约80%的黄酮成分已随糖苷一起浸出，液渣中只有少量黄酮残留，只对叶渣进行提取，造成了黄酮成分的大量损失，且再一次提取导致耗能增加，不利于工业化生产。文章中多采用紫外方法在358nm波长下检测黄酮含量，叶渣用乙醇提取过程中叶绿素、绿原酸等成分也被同时提出，且这些成分在该波长下也有较强吸收，对检测结果造成较大干扰。

由于技术欠缺，目前国内外甜菊糖苷生产厂商只将甜叶菊作为甜菊糖苷的原料，市场上没有其它副产物推出，造成了甜叶菊资源的极大浪费。本申请专利中提供了一种甜菊糖苷副产物黄酮和绿原酸的工业化生产方法，可很大程度上提高甜叶菊的综合利用价值。

发明内容

为了克服现有技术缺点，本发明提供了一种同步生产甜菊糖苷、黄酮和绿原酸的工业化生产方法，它对设备要求低，可用于甜菊糖苷、黄酮和绿原酸的工业化生产。

本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：

（1）称取甜菊叶，加水提取，过滤得提取液，保温条件下加絮凝剂，调pH至7-12，30-75℃静置0-120min，过滤，得到滤泥和滤液，滤液经树脂纯化得甜菊糖苷产品；

（2）滤泥用酸性溶剂提取，合并提取液，浓缩；

（3）浓缩液加溶剂稀释，上大孔吸附树脂吸附；

（4）对步骤（3）中的大孔吸附树脂进行梯度解析，低度解析液浓缩干燥得绿原酸产品，高度解析液浓缩备用；

（5）高度解析浓缩液加水稀释后，用等体积有机溶剂萃取，合并有机相，浓缩干燥得黄酮产品。

本发明所述步骤（1）中的树脂为HP20、ADS-4、69M、DM30、001×6、001×8、SQ338、330中的任意一种或几种。

本发明所述步骤（1）中的絮凝剂为硫酸铝钾、聚合氯化铝、硫酸亚铁中的任意一种或几种，添加量为滤液重量的0.1-5%。

本发明所述步骤（1）中的提取方式为回流、超声辅助、微波辅助、连续逆流中的任意一种或几种；加水量为甜菊叶重量的10-30倍；加热温度为50-100℃，提取时间为1-5h，提取次数为2-5次。

本发明所述步骤（2）中的提取次数为1-5次，所述浓缩为浓缩至固含量10-100%；所述步骤（2）中酸性溶剂为水、乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮、1,4-二氧六环中的任意一种或几种，pH=0.1-5.5。

本发明所述步骤（3）中稀释用溶剂为水、乙醇、甲醇中的任意一种或几种；所述浓缩液稀释至原来浓度的1/2-1/20；所述大孔吸附树脂为AB-8、D101、LX-5中的任意一种或几种；所述吸附流速为0.5-3BV/h。

本发明所述步骤（4）中的解析用溶剂为水、乙醇、甲醇、丙醇、1,4-二氧六环、丙酮中的任意一种或几种。

本发明所述步骤（4）中的梯度解析，低度解析溶剂中有机溶剂浓度为5-30%，用量为1-5倍柱体积，高度解析溶剂中有机溶剂浓度为50-90%，用量为1-5倍柱体积；所述高度解析液浓缩至固含量为50-90%。

本发明所述步骤（5）中的加水稀释至原来浓度的1/2-1/20；所述步骤（5）中的有机溶剂为与水不互溶的有机溶剂。

本发明所述步骤（5）中的有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、甲苯、二甲苯中的任意一种或几种；所述有机溶剂萃取次数1-5次。

本发明质量控制方法可包括以下含量测定方法中的一种或几种：

1. 总糖苷

本发明提出的甜叶菊甜菊苷类，是从甜菊叶中提取的甜菊苷类活性成分的组合，主要包括甜菊苷、瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、瑞鲍迪苷D、瑞鲍迪苷F、杜克苷A、甜茶苷和甜菊双糖苷，总糖苷含量检测参照《JECFA第73届会议制定的甜菊糖苷检测标准》。

2. 绿原酸

本发明提出的甜叶菊绿原酸提取物，是从甜菊叶中提取的绿原酸类活性成分的组合，主要包括咖啡酰奎尼酸，阿魏酰奎尼酸，二咖啡酰奎尼酸，p-香豆酰奎尼酸，咖啡酰阿魏酰奎尼酸等，其含量检测参照2013年美国Chromadex机构检测方法。

3. 总黄酮

本发明提出的甜叶菊黄酮提取物，是从甜菊叶中提取的黄酮类活性成分的组合，主要成分有：槲皮素、槲皮苷、槲皮素-3-O-β-D-阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-[4'''-O-反式-咖啡酰基-α-L-鼠李糖-(1→6)-β-D-半乳糖苷]、芹菜素、芹菜素-4'-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷和山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷等，苷元为槲皮素、山奈酚、芹菜素和木犀草素。

样品的前处理方法：精密称取0.1000g样品至100mL三角瓶中，加入25mL 甲醇-25%盐酸水溶液，80℃水浴回流45min，冷却至室温，转移至50mL容量瓶中，甲醇定容。

色谱条件：仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪，配置紫外检测器；色谱柱：C18柱（4.6×250mm，5μm）色谱柱；检测波长：360nm；色谱柱温度：30℃；进样量：10μL；运行时间：30min；流速1.3 mL/min；流动相：pH=1.0, 40%甲醇水溶液。

标准曲线绘制：分别精密吸取槲皮素、山奈酚、芹菜素和木犀草素对照品溶液（浓度为0.67μg/μL）0、2、4、6、8、10μL注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，以对照品进样量为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

利用UPLC-MS技术，确定各成分比例，确定水解系数。UPLC条件：色谱柱 C18（2.3 μm, 2.1 × 100 mm）; 流速 0.3 mL/min; 进样量 7 μL; 流动相 pH=1.0,40%甲醇水溶液；MS-ESI (-)：毛细管电压 2.7 kv；进样锥电压 10 v；离子源温度 120℃; 去溶剂温度 350℃；UV吸收波长 360 nm。

含量测定：精密称取3批合适量的甜叶菊黄酮产品3份，置10mL量瓶中，加70%乙腈超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为总黄酮含量测定的样品溶液。精密吸取上述供试溶液5μL,注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，乘以各自水解系数后，得总黄酮含量。

采用上述技术方案的有益效果在于：

（1）工艺简单，流程短，对设备要求低，利于工业化生产；

（2）以水为甜菊叶提取液，无环境污染，符合绿色环保的生产理念；

（3）实现了甜菊糖苷、黄酮和绿原酸的同时提取，节省了能耗，降低了生产成本，且提高了甜叶菊的综合利用价值。

具体实施方式

实施例1

（1）称取甜菊叶100g，加15倍水100℃条件下回流提取2.5h，过滤得提取液，重复3次，合并提取液，保温条件下加1%絮凝剂硫酸亚铁，搅拌条件下加CaO调pH至11.0，65℃静置60min，过滤，得到滤泥和滤液，滤液以1.5BV/h的流速经大孔吸附树脂ADS-4吸附，以50%乙醇水溶液解析，经脱盐树脂001×6、脱色树脂330纯化后，得到甜菊糖产品，糖苷含量90%。

（2）滤泥用pH=5乙醇与水体积比7:3的混合溶液提取3次，合并提取液，浓缩至固含量45%；

（3）浓缩液加5%乙醇水溶液稀释至原来浓度的1/5，以1.5BV/h流速上大孔吸附树脂D101；

（4）对步骤（3）中的大孔吸附树脂进行梯度解析，低度解析溶剂为15%的乙醇水溶液，用量为1BV，得到低度解析液，浓缩干燥得绿原酸产品，绿原酸含量80%（HPLC）；

高度解析溶剂为80%的乙醇水溶液，用量为1BV，得到高度解析液浓缩至固含量为80%。

（5）高度解析浓缩液加水稀释至原来浓度的1/5，等体积二氯甲烷萃取5次，合并有机相，浓缩干燥得黄酮产品，总黄酮含量为60%（HPLC）。

实施例2

（1）称取甜菊叶500g，加10倍水50℃条件下超声提取1h，过滤得提取液，重复2次，合并提取液，保温条件下加0.8%絮凝剂硫酸亚铁，搅拌条件下加CaO调pH至9.0，55℃静置45min，过滤，得到滤泥和滤液，滤液以1.5BV/h的流速经大孔吸附树脂DM30吸附，以50%乙醇水溶液解析，经脱盐树脂001×6、脱色树脂SQ338纯化后，得到甜菊糖产品，糖苷含量95%。

（2）滤泥用pH=3.5甲醇与水体积比3:2的混合溶液提取4次，合并提取液，浓缩至固含量35%；

（3）浓缩液加5%甲醇水溶液稀释至原来浓度的1/10，以2.0BV/h流速上大孔吸附树脂AB-8；

（4）对步骤（3）中的大孔吸附树脂进行梯度解析，低度解析溶剂为25%的甲醇水溶液，用量为2BV，得到低度解析液，浓缩干燥得绿原酸产品，绿原酸含量85%（HPLC）；

高度解析溶剂为75%的甲醇水溶液，用量为2BV，得到高度解析液浓缩至固含量为75%。

（5）高度解析浓缩液加水稀释至原来浓度的1/10，等体积三氯甲烷萃取5次，合并有机相，浓缩干燥得黄酮产品，总黄酮含量为45%（HPLC）。

实施例3

（1）称取甜菊叶100g，加20倍水82℃条件下微波辅助提取3h，过滤得提取液，重复5次，合并提取液，保温条件下加1.3%絮凝剂聚合氯化铝与硫酸亚铁等质量混合物，搅拌条件下加CaO调pH至12.0，75℃静置0min，直接过滤，得到滤泥和滤液，滤液以1.5BV/h的流速经大孔吸附树脂69M吸附，以50%乙醇水溶液解析，经脱盐树脂001×8、脱色树脂330纯化后，得到甜菊糖产品，糖苷含量90%。

（2）滤泥用pH=0.1乙醇与异丙醇等体积的混合溶液提取1次，提取液浓缩至固含量100%；

（3）浓缩液加10%乙醇水溶液稀释至原来浓度的1/2，以0.5BV/h流速上大孔吸附树脂LX-5；

（4）对步骤（3）中的大孔吸附树脂进行梯度解析，低度解析溶剂为5%的1,4-二氧六环水溶液，用量为5BV，得到低度解析液，浓缩干燥得绿原酸产品，绿原酸含量70%%（HPLC）；

高度解析溶剂为50%的1,4-二氧六环水溶液，用量为5BV，得到高度解析液浓缩至固含量为90%。

（5）高度解析浓缩液加水稀释至原来浓度的1/2，等体积正己烷萃取1次，合并有机相，浓缩干燥得黄酮产品，总黄酮含量为60%（HPLC）。

实施例4

（1）称取甜菊叶500g，加30倍水68℃条件下连续逆流提取5h，过滤得提取液，重复3次，合并提取液，保温条件下加2.0%絮凝剂硫酸铝钾，搅拌条件下加CaO调pH至7.0，30℃静置120min，过滤，得到滤泥和滤液，滤液以1.5BV/h的流速经大孔吸附树脂HP20吸附，以50%乙醇水溶液解析，经脱盐树脂001×8、脱色树脂SQ338纯化后，得到甜菊糖产品，糖苷含量95%。

（2）滤泥用pH=5.5的1,4-二氧六环与水等体积混合溶液提取5次，合并提取液，浓缩至固含量10%；

（3）浓缩液加8%甲醇水溶液稀释至原来浓度的1/20，以3.0BV/h流速上大孔吸附树脂D101；

（4）对步骤（3）中的大孔吸附树脂进行梯度解析，低度解析溶剂为30%的丙酮水溶液，用量为1BV，得到低度解析液，浓缩干燥得绿原酸产品，绿原酸含量75%（HPLC）；

高度解析溶剂为75%丙酮，用量为1BV，得到高度解析液浓缩至固含量为90%。

（5）高度解析浓缩液加水稀释至原来浓度的1/20，等体积乙酸乙酯萃取4次，合并有机相，浓缩干燥得黄酮产品，总黄酮含量为45%（HPLC）。

Claims

1.一种同步生产甜菊糖苷、黄酮和绿原酸的工业化生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

（2）滤泥用酸性溶剂提取，合并提取液，浓缩；

（3）浓缩液加溶剂稀释，上大孔吸附树脂吸附，所述稀释用溶剂为水、乙醇、甲醇中的任意一种或几种；所述浓缩液稀释至原来浓度的1/2-1/20；所述大孔吸附树脂为AB-8、D101、LX-5中的任意一种或几种；所述吸附流速为0.5-3BV/h；

（5）高度解析浓缩液加水稀释后，用等体积有机溶剂萃取，合并有机相，浓缩干燥得黄酮产品；

所述步骤（1）中加热温度为50-100℃，提取时间为1-5h，提取次数为2-5次。

2.根据权利要求1所述的一种同步生产甜菊糖苷、黄酮和绿原酸的工业化生产方法，其特征在于，所述步骤（1）中的树脂为HP20、ADS-4、69M、DM30、001×6、001×8、SQ338、330中的任意一种或几种。

3.根据权利要求1所述的一种同步生产甜菊糖苷、黄酮和绿原酸的工业化生产方法，其特征在于，所述步骤（1）中的絮凝剂为硫酸铝钾、聚合氯化铝、硫酸亚铁中的任意一种或几种，添加量为滤液重量的0.1-5%。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的一种同步生产甜菊糖苷、黄酮和绿原酸的工业化生产方法，其特征在于，所述步骤（1）中的提取方式为回流、超声辅助、微波辅助、连续逆流中的任意一种或几种；加水量为甜菊叶重量的10-30倍。

5.根据权利要求1-3任意一项所述的一种同步生产甜菊糖苷、黄酮和绿原酸的工业化生产方法，其特征在于，所述步骤（2）中的提取次数为1-5次，所述浓缩为浓缩至固含量10-100%；所述步骤（2）中酸性溶剂为水、乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮、1,4-二氧六环中的任意一种或几种，pH=0.1-5.5。

6.根据权利要求1-3任意一项所述的一种同步生产甜菊糖苷、黄酮和绿原酸的工业化生产方法，其特征在于，所述步骤（4）中的解析用溶剂为水、乙醇、甲醇、丙醇、1,4-二氧六环、丙酮中的任意一种或几种。

7.根据权利要求1-3任意一项所述的一种同步生产甜菊糖苷、黄酮和绿原酸的工业化生产方法，其特征在于，所述步骤（4）中的梯度解析，低度解析溶剂中有机溶剂浓度为5-30%，用量为1-5倍柱体积，高度解析溶剂中有机溶剂浓度为50-90%，用量为1-5倍柱体积；所述高度解析液浓缩至固含量为50-90%。

8.根据权利要求1-3任意一项所述的一种同步生产甜菊糖苷、黄酮和绿原酸的工业化生产方法，其特征在于，所述步骤（5）中的加水稀释至原来浓度的1/2-1/20；所述步骤（5）中的有机溶剂为与水不互溶的有机溶剂。

9.根据权利要求1-3任意一项所述的一种同步生产甜菊糖苷、黄酮和绿原酸的工业化生产方法，其特征在于，所述步骤（5）中的有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、甲苯、二甲苯中的任意一种或几种；所述有机溶剂萃取次数1-5次。