CN117233295A - 一种测定2,4-d的单体氯稳定同位素的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种测定2,4‑D的单体氯稳定同位素的方法及其应用，该方法首先将水相中的2,4‑D通过液‑液萃取至有机相中后进行衍生化反应，生成2,4‑D甲酯后在常温下稳定，再利用GC‑qMS测定2,4‑D甲酯的离子强度，通过计算进一步得出氯同位素比值；此方法通过所得氯同位素比值的变化判断2,4‑D是否发生了同位素分馏效应，从而进一步推断其是否发生化学键变化，为解释2,4‑D此类有机污染物在降解过程中的转化机理提供更简便、更有力、更新型的方法。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域。更具体地，涉及一种测定2,4-D的单体氯稳定同位素的方法及其应用。
背景技术
2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid)是一种典型的化学除草剂，具有高效率、低成本等显著特点而被广泛应用于农业生产中；但大量的使用也导致废水、地下水、土壤中能普遍检测到。2,4-D化学性质稳定，难自然降解，作为常见有机氯污染物中的一种，具有一定的生物毒性和致癌性，严重威胁生态安全。因此，迫切需要研究2,4-D的转化机理，以便更好地对其进行管控，减少污染。
目前，国内外研究中对有机物的转化机理研究主要为对底物浓度变化的检测以及基于传统质谱技术测定和鉴定中间产物，随后根据底物和中间产物化学结构式、底物和中间产物之间的关系，阐明其可能的转化机理，但是物理影响(如稀释、挥发和吸附)可能导致测定浓度不准确、检测中间产物种类不全，而无法准确推断其转化机理，因此必须探寻更科学、高效解释污染物转化途径的新方法。
单体稳定同位素分析(CSIA)技术可以有效克服传统质谱技术在解释污染物转化机理方面的局限性，有效识别各种有机物的转化途径和评价其转化机制，成为近年来识别有机物转化途径的新工具。其中，稳定同位素自然丰度技术则是利用测定化合物中特定元素的天然稳定同位素组成的变化开展研究，由于质子数相同、中子数不同的同位素原子或化合物之间存在物理化学性质上的差异，在物理、化学及生物作用过程中同位素会以不同比例分配于不同物质中，即发生同位素分馏效应。也即同位素分馏与转化途径密切相关，因此，常用同位素分馏来识别有机物的降解途径。基于以上特性，将化合物元素的同位素组成作为一种指纹特征，就可以获取化合物的环境行为信息，阐明化合物可能的转化机理。如张原和祁士华学者(张原,祁士华.稳定氯同位素分析技术及其在有机氯污染物研究中的应用[J].化学进展,2012,24(12):2384-2390.)报道了近来还有研究者采用GC与四极杆质谱联用(GC-qMS)测试空气中三氯乙烯(TCE)中氯同位素，通过设定质谱参数并选取特定的碎片离子质量扫描，最后计算积分结果得到对应化合物中的氯同位素比值。此法优点在于样品量需求较小，可以在毫秒级的时间内扫描较广的质量范围，提高了灵敏度和分析速度，从而降低了环境样品氯同位素分析的难度。但是由于环境体系复杂，现有技术的方法往往不能真正做到对2,4-D的来源、生成和转化机制进行示踪，因此，对2,4-D机制的分析也就具有不确定性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术无法准确对2,4-D的来源、生成和转化机制进行示踪，准确分析2,4-D的转化机理的缺陷和不足，提供一种测定2,4-D的单体氯稳定同位素的前处理方法。
本发明的另一目的是提供一种测定2,4-D的单体氯稳定同位素的方法。
本发明的另一目的是提供所述前处理方法和测定2,4-D的单体氯稳定同位素的方法在分析2,4-D的降解机制中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明保护一种测定2,4-D的单体氯稳定同位素的前处理方法，具体包括以下步骤：
S1、取含2,4-D的样品加入pH为2～4的甲醇水溶液充分溶解后，加入极性有机溶剂充分萃取，后处理，得到2,4-D萃取液；若含2,4-D的样品为溶液状态则不需要加入甲醇水溶液进行溶解，直接进入萃取这一步骤即可；
S2、将步骤S1所得2,4-D萃取液加入三氟化硼-甲醇溶液，在60～70℃下进行衍生化反应，后处理，得到2,4-D甲酯。
优选地，在60℃下进行衍生化反应。
优选地，所述三氟化硼-甲醇溶液的浓度为10～14％，w/v(表示质量体积比，g/mL)。
优选地，步骤S1中，2,4-D样品与甲醇水溶液的质量体积比为1～10：90～99g/mL。
优选地，步骤S1中，甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为2～4：996～998。
优选地，步骤S1中，所述极性有机溶剂为乙酸乙酯、正己烷或二氯甲烷。
优选地，步骤S1中，所述极性有机溶剂为乙酸乙酯。
进一步地，步骤S1中，所述含2,4-D的样品的来源包括环境大气、颗粒物或水体。
进一步地，步骤S1中，所述后处理为取含2,4-D的样品加入极性有机溶剂萃取3～5次，合并有机相，过无水硫酸钠旋转蒸发，转移至液相瓶中，用温和的氮气吹至近干。
进一步地，步骤S2中，所述后处理为加入超纯水终止反应，再用正己烷萃取有机相，重复两次，用温和的氮气将收集萃取得到的有机层吹干，再加入正己烷定容，放至0～6℃冰箱保存待测。
本发明保护一种测定2,4-D的单体氯稳定同位素的方法，采用GC-qMS(气相色谱-串联四极杆质谱检测器)测定所述前处理方法所得2,4-D甲酯，选定离子的离子强度，计算氯同位素比值；
其中，所述GC-qMS的气相色谱条件中，进样口温度设置为245～255℃，传输线温度为275～285℃，升温程序设置为：115～125℃保持1～2min，以5～15℃/min升温到175～185℃，再以15～25℃/min升温到260～280℃，保留1～5min。
优选地，所述GC-qMS的气相色谱条件中，进样口温度设置为250℃，传输线温度为280℃，升温程序设置为：120℃保持1min，以10℃/min升温到180℃，再以20℃/min升温到260～280℃，保留1～5min。
优选地，所述计算氯同位素比值的计算方案为丰度最高二离子法、分子离子法、全分子离子法或丰度最高四离子法。
更优选地，所述计算氯同位素比值的方法为丰度最高二离子法。
进一步地，所述GC-qMS的气相色谱条件中，以HP-5MS石英毛细管柱为色谱柱，采用不分流模式，进样量为5～10μL，高纯氦气流速为0.5～1.0mL/min。
更优选地，气相色谱条件中，进样量为10μL，高纯氦气流速为1.0mL/min。
优选地，所述GC-qMS的质谱条件为：质荷比为175～238m/z，EI模式电子能为60～80eV，驻留时间为20～150ms。
优选地，质谱条件中，所述驻留时间为20ms、50ms、80ms、100ms或150ms。
更优选地，质谱条件中，所述驻留时间为80ms。
优选地，所述选定离子为175/177/179m/z、199/201m/z或234/236/238m/z。
更优选地，所述选定离子为199/201m/z。
本发明还保护所述前处理方法或所述方法在分析2,4-D的降解机制中的应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明将溶解于超纯水中的2,4-D通过液-液萃取至有机相中，氮吹至近干，进行衍生化处理，利用GC-qMS测定2,4-D甲酯选定的离子强度，并根据计算方案进一步推导出氯同位素比值，实现2,4-D的单体氯稳定同位素的测定，首次开发出利用GC-qMS测定2,4-D中单体氯稳定同位素的方法，对不同衍生剂用量、衍生温度进行了实验以研究出最优的前处理方法；之后对不同的离子组进行了检测以判断出最优的检测离子和最佳的计算方法；最后优化了驻留时间等仪器参数，进一步提高了GC-qMS测定2,4-D氯同位素的测量精度。
2、本发明采用的样品前处理方法对样品稳定同位素值不产生分馏影响，保证样品稳定同位素值在前处理前后保持一致。
3、本发明实现了2,4-D单体氯稳定同位素的分析测定，通过测定残留中待测元素重同位素可以判断有机化合物是否发生了转化；而有机化合物在转化过程中产生的同位素比值大小取决于断裂键的类型和过渡态化学键断裂的过程，根据同位素比值阐明2,4-D的转化机理，解决了传统质谱技术对2,4-D转化机制解释的技术局限性。
附图说明
图1为本发明实施例1中2,4-D甲酯化原理图。
图2为本发明实施例1中2,4-D的单体氯稳定同位素测定的GC-qMS色谱图。
图3为本发明实施例1中2,4-D的单体氯稳定同位素测定的GC-qMS质谱图。
图4为本发明应用例1中完整细胞降解2,4-D的37Cl/35Cl值变化图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
2,4-D标样：上海安谱，≥98％，CAS:94-75-7。
实施例1一种测定2,4-D的单体氯稳定同位素的方法
一种测定2,4-D的单体氯稳定同位素的方法具体包括以下步骤：
1.GC-qMS方法设置：
仪器型号为：7890B-5977B型气相色谱-质谱仪(美国，Agilent公司)
气相色谱参数为：进样口温度设置为250℃，传输线温度为280℃，高纯氦气流速为1.0mL/min；升温程序设置为：120℃(1min)→180℃(10℃/min)→280℃(20℃/min，1min)，色谱柱为HP-5MS石英毛细管柱，所述毛细管柱的尺寸为30m×0.25mm×0.25μm。
质谱参数为：检测离子为199/201m/z；EI模式电子能70eV。
2.样品制备：
2,4-D储备液：将2,4-D标样加入超纯水中溶解(加入适量甲醇溶解)，同时加入稀盐酸溶液，得到弱酸性的2,4-D溶液。
前处理：将上述所得2,4-D储备液配置成1.0ppm的2,4-D溶液，取200μL的1.0ppm2,4-D溶液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，旋转蒸发至近干，用乙酸乙酯洗涤，转移至离心管中，再转移至进样瓶中，用温和的氮气吹至近干，加入100μL衍生化试剂BF3-甲醇溶液(10％,w/v)，衍生化原理如图1所示，在60℃进行衍生化反应，生成2,4-D甲酯后在常温下稳定一段时间；加入400μL超纯水终止反应，再用500μL正己烷萃取有机相，重复两次，用温和的氮气将收集萃取得到的有机层吹干，再加入200μL正己烷定容，放至4℃冰箱保存待测。
3.结果处理
利用GC-qMS测定2,4-甲酯选定离子的离子强度，每个样品检测5次，并根据丰度最高二离子法计算方案进一步推导出氯同位素比值。分子离子法的计算公式如下：
R2,4-D＝I201/I199
4.检测结果如表1所示：
表1实施例137Cl/35Cl值
| 物质 | 37Cl/35Cl值 |
| 2,4-甲酯 | 0.3286±0.0026 |
从图2(出峰时间为9.260的色谱峰即为目标物质2,4-D甲酯)、图3中可知，2,4-甲酯得到了很好的分离，成功实现了2,4-D标样单体氯稳定同位素测定。表1为每个样品检测5次的检测结果，SD小于0.0050，结果显示，该方法重现性好。
实施例2一种测定2,4-D的单体氯稳定同位素的方法
实施例2检测方法与实施例1不同之处在于，将实施例1中的样品制备前处理中衍生化试剂用量100μL分别替换为200μL、300μL和400μL，其余参数参考实施例1，结果参见表2。
表2实施例2结果表
| 衍生化试剂用量 | 37Cl/35Cl值 |
| 200μL | 0.3274±0.0034 |
| 300μL | 0.3279±0.0049 |
| 400μL | 0.3277±0.0036 |
由表2可见，用衍生化试剂BF3-甲醇溶液(10％,w/v)用量200μL、300μL和400μL替换用量100μL后，37Cl/35Cl值在平均值上下波动，由此可见，衍生化过程反应充分，衍生化试剂用量并不会造成显著同位素分馏。
实施例3一种测定2,4-D的单体氯稳定同位素的方法
实施例3检测方法与实施例1不同之处在于，将实施例1中的样品制备前处理中衍生化温度60℃替换为70℃，其余步骤与参数参考实施例1，结果参见表3。
表3实施例3结果表
| 衍生化温度 | 37Cl/35Cl值 |
| 实施例1中衍生化温度60℃ | 0.3286±0.0026 |
| 70℃ | 0.3285±0.0018 |
结果显示，该方法在60～70℃范围内具有较好的重现性。
实施例4一种测定2,4-D的单体氯稳定同位素的方法
实施例4检测方法与实施例1不同之处在于，将实施例1中的样品制备中样品溶液的浓度分别调整为5.00ppm和10.00ppm，其余参数参考实施例1，结果参见表4。
表4实施例4结果表
| 样品浓度 | 37Cl/35Cl值 |
| 实施例1中样品浓度1.00ppm | 0.3185±0.0030 |
| 5.00ppm | 0.3207±0.0016 |
| 10.00ppm | 0.3227±0.0018 |
结果显示，该方法在1.00～10.00ppm浓度范围内具有较好的重现性。
实施例5一种测定2,4-D的单体氯稳定同位素的方法
实施例5检测方法与实施例1不同之处在于，将实施例1中的结果处理中计算方案分别替换为分子离子法、全分子离子法、丰度最高四离子法，其余参数参考实施例1，结果参见表5。
表5实施例5结果表
| 计算方案 | 37Cl/35Cl值 |
| 分子离子法(MIM) | 0.3207±0.0016 |
| 全分子离子法(CMIM) | 0.3242±0.0018 |
| 丰度最高二离子法(TTIM) | 0.3286±0.0026 |
| 丰度最高四离子法(TFIM) | 0.3222±0.0017 |
由表5可见，四种计算方案的方差(SD)均小于0.0050且测量精度比较接近。
实施例6一种测定2,4-D的单体氯稳定同位素的方法
实施例6检测方法与实施例1不同之处在于，将实施例1中的升温程序替换为120℃保持1min，以10℃/min升温到180℃，再以20℃/min升温到260℃，保留5min。
其余参数参考实施例1，结果参见表6。
表6实施例6结果表
| 衍生化温度 | 37Cl/35Cl值 |
| 实施例1中升温程序 | 0.3286±0.0026 |
| 实施例6中升温程序 | 0.3284±0.0019 |
结果显示，将实施例1中升温程序替换后，37Cl/35Cl值的精度符合要求。
对比例1一种测定2,4-D的单体氯稳定同位素的方法
对比例1检测方法与实施例1不同之处在于，将实施例1的样品制备前处理中衍生化温度60℃分别替换为30℃、40℃和50℃，其余步骤与参数参考实施例1，结果参见表7。
表7衍生化温度对比结果表
| 衍生化温度 | 37Cl/35Cl值 |
| 30℃ | / |
| 40℃ | / |
| 50℃ | 0.2820±0.0113 |
| 实施例1中衍生化温度60℃ | 0.3286±0.0026 |
结果显示，分别用衍生化温度30℃、40℃和50℃替换温度60℃后，衍生化温度为30℃和40℃时由于检测离子峰未检出，因此无法计算37Cl/35Cl值；衍生化温度为50℃时37Cl/35Cl值与衍生化温度为60℃时相比较小，且与前人研究中测量所得37Cl/35Cl值相比数值不在正常范围(正常范围为0.31～0.33)，可能与衍生化过程反应发生不完全有关。
对比例2一种测定2,4-D的单体氯稳定同位素的方法
对比例2检测方法与实施例1不同之处在于，将实施例1中的样品制备前处理中衍生化试剂三氟化硼-甲醇溶液(10％,w/v)分别替换为三氟化硼-正丁醇溶液(10％,w/v)和硫酸-正丁醇溶液(1:4,v/v)，其余步骤与参数参考实施例1，结果参见表8。
表8衍生化试剂对比结果表
结果显示，使用三氟化硼-正丁醇溶液(10％,w/v)和硫酸-正丁醇溶液(1:4,v/v)为衍生剂时，检测离子峰未检出，因此无法计算37Cl/35Cl值。
对比例3一种测定2,4-D的单体氯稳定同位素的方法
对比例3检测方法与实施例1不同之处在于，将实施例1的样品制备中样品溶液的浓度分别调整为0.10ppm和0.50ppm，其余步骤与参数参考实施例1，结果参见表9。
表9样品分析浓度对比结果表
| 样品浓度 | 37Cl/35Cl值 |
| 0.10ppm | 0.3231±0.0202 |
| 0.50ppm | 0.3128±0.0056 |
结果显示，样品浓度为0.10ppm和0.50ppm时，方差(SD)均大于0.0050，重现性较差，准确度低。
对比例4一种测定2,4-D的单体氯稳定同位素的方法
对比例4的检测方法与实施例1不同之处在于，将实施例1中的升温程序替换为80℃(1min)→140℃(1.5℃/min)→180℃(30℃/min)→230℃(保留4min)，其余参数参考实施例1，结果参见表10。
表10对比例4结果表
| 衍生化温度 | 37Cl/35Cl值 |
| 实施例1中升温程序 | 0.3286±0.0026 |
| 实施例6中升温程序 | / |
结果显示，将实施例1中升温程序替换后，未检测到目标物质，不满足检测要求。
应用例1
本应用例水环境样品来自于微生物降解的2,4-D溶液。
1.GC-qMS方法设置：
仪器型号为：7890B-5977B型气相色谱-质谱仪(美国，Agilent公司)
气相色谱参数为：进样口温度设置为250℃，传输线温度为280℃，高纯氦气流速为1.0mL/min；升温程序设置为：120℃(1min)→180℃(10℃/min)→280℃(20℃/min，1min)，色谱柱为HP-5MS石英毛细管柱，所述毛细管柱的尺寸为30m×0.25mm×0.25μm。
质谱参数为：检测离子为199/201；EI模式电子能70eV。
2.样品制备
本实施例采用嗜麦芽窄食单胞菌对2,4-D进行生物降解。先在锥形瓶中配制100mL加入无机盐培养基配方组分，配置无机盐培养基，在121℃高压灭菌30min备用。再将菌株在固体培养基中富集增菌培养18h后，离心收集菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤三次，然后以10％接种量悬浮在上述装有100mL无机盐培养基的锥形瓶中，然后加入一定量2,4-D溶液使得其浓度分别为1mg/L，并在温度37℃、振动频率200r/min下培养，进行降解实验。并于12、24、48、72、96h取1mL经过降解处理的无机盐液体培养液，10,000g离心5min，收集上清液，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，旋转蒸发至近干，用乙酸乙酯洗涤，转移至离心管中，再转移至进样瓶中，用温和的氮气吹至近干，加入100μL衍生化试剂BF3-甲醇溶液(10％,w/v)进行衍生化反应，加入400μL超纯水终止反应，再用500μL正己烷萃取有机相，重复两次，用温和的氮气将收集萃取得到的有机层吹干，再加入200μL正己烷定容，放至4℃冰箱保存待测。
3.结果处理
利用GC-qMS测定2,4-甲酯选定离子的离子强度，每个样品检测5次，并根据丰度最高二离子法计算方案进一步推导出氯同位素比值。分子离子法的计算公式如下：
R2,4-D＝I201/I199
4.检测结果参见图4和表11。
表11完整细胞降解2,4-D的氯同位素值变化表
前期工作经过质谱鉴定2,4-D降解会产生中间产物2,4-DCP(2,4-二氯酚)，基于此进一步推导2,4-D的降解过程，但仅凭降解产物而推导降解过程，存在不确定性。为了弥补这一不足，通过测定降解过程中氯同位素的变化，能更好的阐明2,4-D的微生物降解过程，即2,4-D降解至2,4-DCP时化学键的断裂过程。由图4和表11可见，反应初始阶段37Cl/35Cl值为0.3185，随着反应的进行，2,4-D降解率达82％(120h)时，37Cl/35Cl值为0.3183，整个降解过程中37Cl/35Cl值维持在0.3182±0.0033～0.3188±0.0036，没有发生明显的氯同位素分馏效应，说明氯同位素分馏可能仅与脱氯过程影响有关，即未发生C-Cl键的断裂，验证了前期推导的降解过程是准确的；且该方法所得的SD小于0.5％，准确度高。这表明本发明方法可应用到2,4-D降解转化机理的探索中，为研究2,4-D生物降解的转化机制提供了一种新颖有效的方法。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种测定2,4-D的单体氯稳定同位素的前处理方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1、取含2,4-D的样品加入pH为2～4的甲醇水溶液充分溶解后，加入极性有机溶剂充分萃取，后处理，得到2,4-D萃取液；
S2、将步骤S1所得2,4-D萃取液加入三氟化硼-甲醇溶液，在60～70℃下进行衍生化反应，后处理，得到2,4-D甲酯；
其中，所述含2,4-D的样品中的2,4-D的浓度≥1ppm。
2.根据权利要求1所述前处理方法，其特征在于，所述三氟化硼-甲醇溶液的浓度为10～14％，w/v。
3.根据权利要求1所述前处理方法，其特征在于，步骤S1中，2,4-D样品与甲醇水溶液的质量体积比为1～10：90～99g/mL。
4.根据权利要求1所述前处理方法，其特征在于，步骤S1中，甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为2～4：996～998。
5.根据权利要求1所述前处理方法，其特征在于，步骤S1中，所述极性有机溶剂为乙酸乙酯、正己烷或二氯甲烷。
6.一种测定2,4-D的单体氯稳定同位素的方法，其特征在于，采用GC-qMS测定权利要求1～5任一所述前处理方法所得2,4-D甲酯，选定离子的离子强度，计算氯同位素比值；
其中，所述GC-qMS的气相色谱条件中，进样口温度设置为245～255℃，传输线温度为275～285℃，升温程序设置为：115～125℃保持1～2min，以5～15℃/min升温到175～185℃，再以15～25℃/min升温到260～280℃，保留1～5min。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述计算氯同位素比值的计算方案为丰度最高二离子法、分子离子法、全分子离子法或丰度最高四离子法。
8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述GC-qMS的气相色谱条件中，以HP-5MS石英毛细管柱为色谱柱，采用不分流模式，进样量为5～10μL，高纯氦气流速为0.5～1.0mL/min。
9.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述GC-qMS的质谱条件为：质荷比为175～238m/z，EI模式电子能为60～80eV，驻留时间为20～150ms。
10.权利要求1～5任一所述前处理方法或权利要求6～9任一所述方法在分析2,4-D的降解机制中的应用。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117805276A (zh) * | 2023-12-29 | 2024-04-02 | 广东省食品工业研究所有限公司 | 一种气相色谱联用质谱法测定柑橘类水果中2,4-滴残留量的方法 |
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2023
- 2023-08-08 CN CN202310996537.7A patent/CN117233295A/zh active Pending
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