CN117230126A - 一种己二酸发酵生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种己二酸发酵生产方法，是己二酸生产菌经过多级种子培养，然后发酵培养得到己二酸，所述己二酸生产菌大肠杆菌E.coli‑KS‑PAD29(2‑2)‑3。本发明的己二酸发酵生产方法发酵效果好，生产成本低，产己二酸水平较高。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵领域，特别是涉及一种己二酸发酵生产方法。
背景技术
己二酸是一种二元羧酸，其最重要的应用是生产热塑性聚氨酯树脂，合成尼龙46和尼龙66；尼龙66主要用途是工程塑料和尼龙化纤(高档特殊用途服装面料)；此前己二酸是用化石能源生产，主要是KA油(环己醇和环己酮)经过硝酸催化氧化得到的。化学合成会产生大量的温室气体和严重的环境污染等。
本申请提出了一种全新的生物合成己二酸的方法，是一种更可靠、可再生、经济的己二酸合成方法。
发明内容
本发明提供了一种己二酸发酵生产方法，产酸浓度高，环保经济。
本发明提供一种己二酸发酵生产方法，是用含有葡萄糖的培养基培养己二酸生产菌得到的，所述己二酸生产菌为：保藏在中国典型培养物保藏中心的，保藏编号为：CCTCCNO：M20231762，大肠杆菌E.coli-KS-PAD29(2-2)-3 Escherichia coli KS-PAD29（2-2）-3。
作为优选方案，种子培养基的配方为：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl10 g/L。培养基中抗生素终浓度统一为硫酸链霉素50mg/L、硫酸卡那霉素50mg/L。
作为优选方案，发酵培养基为改良TB培养基，包括：蛋白胨14g/L，酵母提取物28g/L，玉米浆3.3g/L，甘油 4ml/L，KH2PO42.31g/L，K2HPO4•H2O 16.43g/L。培养基中抗生素终浓度统一为硫酸链霉素50mg/L、硫酸卡那霉素50mg/L。发酵培养基的pH值6.9～7.1。
作为进一步地优选方案，步骤如下：
（1）将己二酸生产菌菌种接入已灭菌的种子培养基中，培养温度35-37℃，摇床转速250转/分，培养16-20小时获得摇瓶种子培养液；
（2）将上述摇瓶种子培养液通过无菌操作转入已灭菌的种子罐，培养基使用种子培养基，搅拌转速200-300r/min，罐温35-37℃培养8-10h，获得种子罐种子培养液；
（3）将上述种子罐种子培养液转入发酵罐培养，培养基使用发酵培养基，搅拌转速200-300r/min；温度32℃～ 37℃ ,罐压0.25 MPa, 每分钟内通气比1vvm；发酵72小时。
作为优选方案，步骤（1）中接种量为1毫升菌液/50毫升培养基。
本发明的己二酸发酵生产方法发酵产己二酸浓度高。图1可见。
菌株和培养基：
1.己二酸生产菌：大肠杆菌E.coli-KS-PAD29(2-2)-3，该菌株是保藏在中国典型培养物保藏中心的，保藏编号为：CCTCC NO：M20231762。
2.培养基：
2.1.种子培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L， NaCl 10 g/L， pH值6.9-7.1。
2.2.发酵培养基（g/100ml）： 改良TB培养基中包括：蛋白胨14g/L，酵母提取物28g/L，玉米浆3.3g/L，甘油 4ml/L，KH2PO42.31g/L，K2HPO4•H2O 16.43g/L。
培养基中抗生素终浓度统一为硫酸链霉素50mg/L、硫酸卡那霉素50mg/L。发酵培养基的pH值6.9～7.1。
本发明的己二酸发酵生产方法步骤如下：
（1）将冷冻管保藏的生产菌种E.coli-KS-PAD29(2-2)-3接入已灭菌的种子培养基中，接种量为2%，培养温度35-37℃，摇床转速250转/分，培养16小时获得摇瓶种子培养液。
（2）将上述摇瓶种子培养液通过无菌操作转入已灭菌的种子罐，培养基使用种子培养基，搅拌转速300rpm，罐温35-37℃培养8-10h，获得种子罐种子培养液。
（3）将上述种子罐种子培养液转入发酵罐培养，培养基使用发酵培养基，搅拌转速250rpm；温度30℃～ 37℃ ,罐压0.25 MPa, 每分钟内通气比1vvm。
（4）从8h 开始每4小时检测一次己二酸浓度，发酵72±4小时，得到含己二酸的发酵液。
（5）结论：结果参见图1，从图1中可以看出，使用该方法发酵，能够达到高浓度己二酸。
目前，国内的生物法制己二酸的发酵生产工艺基本没有，现多是摇瓶和5L小试的工艺，中试和大生产发酵工艺基本没有。
通过优化大生产发酵工艺，提高己二酸产率，是本领域技术人员所要解决的技术问题。本申请填补了生物法制己二酸发酵生产方法的空白。
附图说明
图1是己二酸浓度增长情况，其中，横坐标为小时，纵坐标为浓度（克/升）。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：本实施例公开了一种己二酸发酵生产方法，具体制备步骤如下：
（1）将冷冻管保藏的生产菌种E.coli-KS-PAD29(2-2)-3接入已灭菌的种子培养基中，接种量为2%，培养温度37℃，摇床转速250转/分，培养18小时获得摇瓶种子培养液。
种子培养基的配方为：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L， NaCl 10 g/L， pH值6.9-7.1。
（2）将上述摇瓶种子培养液通过无菌操作转入已灭菌的种子罐，培养基使用种子培养基，搅拌转速250rpm ，罐温37℃培养8h，获得种子罐种子培养液。
（3）将上述种子罐种子培养液转入发酵罐培养，培养基使用发酵培养基，搅拌转速300rpm；温度37℃ ,罐压0.25 MPa, 每分钟内通气比1vvm。
发酵培养基配方为：蛋白胨12 g/L，酵母提取物24 g/L，甘油 4ml/L，KH2PO42.31g/L，K2HPO4•H2O 16.43g/L，pH6.9～7.1。
（4）发酵72小时，得到己二酸，己二酸的浓度为80.52g/L。
实施例2：本实施例公开了一种己二酸发酵生产方法，具体制备步骤如下：
（1）将冷冻管保藏的生产菌种E.coli-KS-PAD29(2-2)-3接入已灭菌的种子培养基中，接种量为2%，培养温度37℃，摇床转速300转/分，培养16小时获得摇瓶种子培养液。
种子培养基的配方为：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L， NaCl 10 g/L， pH值6.9-7.1。
（2）将上述摇瓶种子培养液通过无菌操作转入已灭菌的种子罐，培养基使用种子培养基，搅拌转速250rpm ，罐温37℃培养8h，获得种子罐种子培养液。
（3）将上述种子罐种子培养液转入发酵罐培养，培养基使用发酵培养基，搅拌转速300rpm；温度37℃ ,罐压0.25 MPa, 每分钟内通气比1.5vvm。
发酵培养基配方为：蛋白胨14g/L，酵母提取物28 g/L，甘油 4ml/L，玉米浆3.3g/L，KH2PO42.31g/L，K2HPO4•H2O 16.43g/L，pH6.9～7.1。
（4）发酵72小时，得到己二酸，己二酸的浓度为82.55g/L。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种己二酸发酵生产方法，其特征在于：制备步骤如下：
(1)将大肠杆菌E.coli-KS-PAD29(2-2)-3菌株从-80℃超低温冰箱拿出溶解后划线活化，于37℃的恒温培养箱培养24h；划线所用培养基为固体LB培养基；
(2)将上述平板划线后，挑取单菌落转接至含4g/L葡萄糖的摇瓶中，培养基为LB培养基，于摇床培养16h，摇床转速250rpm，温度37℃；获得摇瓶种子液；
(3)将摇瓶二级种子液以2％接种量转入已灭菌的种子罐，培养基使用LB培养基，搅拌转速300rpm，罐温35-37℃培养6-8h，获得种子罐种子培养液；
其中(2)-(3)中的种子培液养基均为LB培养基，成分包含：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L；培养基中抗生素终浓度统一为硫酸链霉素50mg/L、硫酸卡那霉素50mg/L；
(4)将上述种子罐种子培养液转入含8g/L葡萄糖的发酵罐中培养，培养基为改良TB培养基；搅拌转速200-400r/min；温度35℃～37℃,罐压0.02-0.04MPa,每分钟内通气比1.0-1.5vvm；发酵72±4小时，得到含己二酸的发酵液；改良TB培养基中包括：蛋白胨14g/L，酵母提取物28g/L，玉米浆3.3g/L，甘油4ml/L，KH2PO42.31g/L，K2HPO4·H2O 16.43g/L；培养基中抗生素终浓度统一为硫酸链霉素50mg/L、硫酸卡那霉素50mg/L；发酵培养基的pH值6.9～7.1；
(5)将己二酸发酵液进行一系列的后处理过程，最终得到己二酸晶体。
2.根据权利要求1所述的己二酸发酵生产方法，其特征在于：步骤(4)中有流加葡萄糖，且葡萄糖浓度控制为1-2g/L。
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