CN117224706A - 一种抗硝化no纳米药物、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗硝化NO纳米药物、其制备方法及应用，所述抗硝化NO纳米药物以空心介孔有机硅纳米颗粒作为载体，所述载体装载有SNAP，所述SNAP装载在所述空心介孔有机硅纳米颗粒的空腔中，所述载体掺杂有MnTMPyP，所述MnTMPyP掺杂在所述空心介孔有机硅纳米颗粒的骨架中。所述抗硝化NO纳米药物既可以提供NO供体释放NO进行降眼压，又可以减少过氧亚硝基的产生发挥抗硝化的作用，所述抗硝化NO纳米药物对小梁网细胞不会产生细胞毒性，对眼表不产生刺激，不会损伤角膜上皮细胞，适用于青光眼或高眼压症的治疗。本发明的制备方法简单、成本较低，在青光眼治疗领域具有较大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及医用纳米材料领域，具体涉及一种具有抗硝化作用的NO纳米药物、其制备方法及应用。
背景技术
青光眼是一类不可逆致盲性眼病，根据房角的宽窄和开放可以分为闭角型和开角型青光眼。其中原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma，POAG)是一种危害非常大的青光眼类型。患者在不知不觉中视力慢慢的就丧失，视野变的越来越小。目前原发性开角型青光眼的主要治疗包括药物、激光和手术。对于早期原发性开角型青光眼，药物是非常重要的治疗手段。眼压升高是POAG最主要的危险因素，降低眼压是唯一被证实有效控制POAG进展的手段。NO是一种气体小分子，研究表明NO可以降低眼压，目前国外已经有NO供体药物在临床中使用，用于降眼压，但是研究发现长期使用NO供体药物治疗效果不佳。
发明内容
本发明的目的是克服NO供体药物治疗青光眼效果不佳的缺陷。
为了达到上述目的，本发明提供了一种抗硝化NO纳米药物，所述抗硝化NO纳米药物以空心介孔有机硅纳米颗粒作为载体，所述载体装载有SNAP，所述SNAP装载在所述空心介孔有机硅纳米颗粒的空腔中，所述载体掺杂有MnTMPyP，所述MnTMPyP掺杂在所述空心介孔有机硅纳米颗粒的骨架中。
较佳地，以质量百分比计，所述SNAP的装载量为所述空心介孔有机硅纳米颗粒的3.8％。
较佳地，所述空心介孔有机硅纳米颗粒的直径为44.8nm±4.5nm，所述空心介孔有机硅纳米颗粒的空腔尺寸为33.2nm±3.4nm，所述空心介孔有机硅纳米颗粒的孔尺寸为4.2nm～4.6nm。
本发明还提供了一种如上所述的抗硝化NO纳米药物的制备方法，至少包含以下步骤：
步骤S1，制备实心二氧化硅纳米颗粒溶液：
将十六烷基三甲基氯化铵、水、三乙醇胺混合，搅拌均匀后得到混合溶液，向所述混合溶液中滴加正硅酸四乙酯得到实心二氧化硅纳米颗粒溶液；
步骤S2，制备介孔有机硅包被的实心二氧化硅纳米颗粒溶液：
将有机硅源前驱体与MnTMPyP混合后加入步骤S1中所述实心二氧化硅纳米颗粒溶液中进行反应，反应结束得到MnTMPyP杂化的介孔有机硅包被的实心二氧化硅纳米颗粒溶液；
步骤S3，制备HMMN溶液：
将步骤S2中所述MnTMPyP杂化的介孔有机硅包被的实心二氧化硅纳米颗粒溶液离心，对离心后的沉淀物分散于乙醇溶液中，加热去除作为模板的十六烷基三甲基氯化铵，使用氨水选择性刻蚀实心二氧化硅纳米颗粒内核，得到硅骨架掺杂MnTMPyP的HMMN溶液；
步骤S4，制备抗硝化纳米药物SNAP@HMMN：
将步骤S3中所述HMMN溶液和SNAP溶液分散于纯水中，室温下搅拌，离心得到产物，在超声条件下将所述产物溶于水中，得到抗硝化NO纳米药物SNAP@HMMN。
较佳地，步骤S2中，所述有机硅源前驱体为BTES。
较佳地，步骤S1中，所述十六烷基三甲基氯化铵：水：三乙醇胺：正硅酸四乙酯＝(1.8g～2.0g)：(20ml～25ml)：(0.06g～0.1g)：(0.8ml～1.0ml)。
较佳地，步骤S4中，按体积比计，所述HMMN溶液：SNAP溶液＝(1:1)～(4:1)。
本发明还提供了一种如上所述的抗硝化NO纳米药物的应用，所述抗硝化NO纳米药物用于制备治疗眼部疾病药物。
较佳地，所述眼部疾病为青光眼或高眼压症。
本发明的有益效果：
(1)本发明以骨架掺杂抗硝化剂MnTMPyP的空心介孔有机硅纳米颗粒作为载体材料，在空心介孔有机硅纳米颗粒的空腔中装载有NO供体SNAP，制备得到了一种具有抗硝化作用的NO纳米药物，所述NO纳米药物可以在特定波长(840nm±10nm)光照下被激活释放出更多的NO，产生降眼压的作用，与此同时还具有抗硝化的作用，增强降眼压作用的同时减少副作用的产生。
(2)本发明制备得到的NO纳米药物在长期使用时不会对周围组织产生刺激，不会对细胞产生毒性作用，具有较佳的生物安全性，适合长期使用。
(3)本发明制备方法简单、成本较低、无需复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产，在治疗青光眼领域具有较大的应用前景。
附图说明
图1为本发明的纳米药物SNAP@HMMN设计、合成和降眼压示意图。
图2为本发明的不同浓度的纳米药物SNAP@HMMN对小梁网细胞的细胞毒性评价结果图。
图3为本发明的纳米药物SNAP@HMMN的眼表毒性评价结果图。
图4为使用本发明的纳米药物SNAP@HMMN以及光照处理后，不同时间点小鼠的眼压测量图。
图5为使用本发明的纳米药物SNAP@HMMN以及光照处理后，sGC和NT表达量的结果图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法均为本领域常规实验方法，本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均为市售取得。使用的主要试剂包括十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)溶液(25wt.％inH2O)，三乙醇胺(TEA)，(3-氨基丙基)三乙基氧基硅烷(APTES)，正硅酸四乙酯(TEOS)，二[3-(三乙基氧基)丙基]四硫醚(BTES)，s-亚硝基-n-乙酰基-l-青氨胺(SNAP)，锰(III)四(1-甲基-4-吡啶基)卟啉(MnTMPyP)，异硫氰酸荧光素(FITC)，氨溶液(28wt.％in H2O)、二甲亚砜(DMSO)、甲醇和氯化钠(NaCl)购自Sigma-Aldrich。所有试剂均为分析级，使用时未进行任何纯化。
眼压的维持依靠房水的产生和排出，房水从眼内睫状突产生后，主要通过两条途径排出眼球，一条主要通路为房水通过瞳孔到达前房，经过前房角的小梁网，到达Schlemm管，然后到达集合管，经房水静脉最终汇入静脉系统，另一条为葡萄膜巩膜通路，房水经睫状肌间隙，到达脉络膜上腔，然后被吸收进入静脉系统。而眼压的升高主要是由于小梁网-Schlemm管通路阻力升高。目前临床上常用的降眼压药物降眼压机制主要是通过减少房水生成或者增加房水从葡萄膜通路的流出。因此，如果药物可以通过增加小梁网-Schlemm管通路的房水外流，将针对青光眼的致病部位，达到更加对因的治疗效果。
虽然目前已有NO供体药物在临床使用，但是研究发现长期使用反而会引起眼压的过度升高，从而导致治疗效果不佳。经过实验发现，大量的NO和过氧阴离子反应生成了毒性作用非常强的过氧亚硝基，过氧亚硝基是一种强大的氧化剂，会对DNA造成损伤，从而导致细胞死亡。因此，在使用NO供体类药物时需要同时进行抗硝化。本发明基于上述发现，为了同时解决降眼压和抗硝化的问题，提出一种抗硝化NO纳米药物及其制备方法，将NO供体SNAP负载于具有抗硝化作用的HMMN纳米载体上，制备得到的抗硝化NO纳米药物既可以同时提供NO供体也可以抗硝化，从而对于POAG达到更好的治疗效果。
纳米药物载体(Nanoscale Drug Carriers)是一种属于纳米级微观范畴的亚微粒药物载体输送系统。将药物包封于亚微粒中，可以调节释药的速度，增加生物膜的透过性、改变药物在体内的分布、提高生物利用度等。纳米粒(nanoparticle,NP)又称毫微粒，是大小在10-1000nm之间的固态胶体颗粒，一般由天然高分子物质或合成高分子物质构成，可作为传导或输送药物的载体。由于材料和制备工艺的差异，可以形成纳米球(nanosphere)与纳米囊(nanocapsule)，两者统称为纳米粒。纳米药物是指将药物负载在纳米药物载体上形成的药物，或指溶解或分散有药物的各种纳米粒。
本发明中使用的缩写具有本领域常规含义，例如以下缩写的含义如表1所示：
表1本发明缩写的含义
本发明的SNAP是一种一氧化氮供体药物，其化学结构式如下式I所示：
本发明的MnTMPyP是一种金属卟啉，它有一个金属中心Mn和一个卟啉环，是一种抗硝化剂，其化学结构如下式II所示：
实施例1纳米药物SNAP@HMON及SNAP@HMMN的制备
如图1所示，本实施例提供了一种纳米药物SNAP@HMMN的制备方法，包含以下步骤：
HMON的制备：
在95℃水浴下，将2g的十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)的水溶液与0.1g三乙醇胺(TEA)搅拌均匀后，向其中滴加1mL的正硅酸四乙酯(TEOS)，反应1h，加入含硫醚的有机硅源前驱体，继续反应4h，得到介孔有机硅(MMN)包被的MSN(MSN@MMN)。
将上述产物离心，使用乙醇洗涤离心后沉淀物，将沉淀物分散于100mL乙醇与10mL浓盐酸(37％)的混合溶液中，加热至78℃反应12h，以除去模板CTAC，重复上述步骤3次，洗涤后再次分散在20mL水中。取1mL上述溶液，向其中加入0.4mL氨水在95℃下反应3h，选择性刻蚀MSN内核，最终得到小尺寸空心介孔有机硅纳米颗粒(HMON)。其中，所述有机硅源前驱体为：bis[3-(triethoxysilyl)propyl]tetrasulfide(BTES)；对应的所合成的HMON的硅骨架中的有机活性官能团为:硫醚。
HMMN的制备：
在95℃水浴下，将2g的十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)的水溶液与0.1g三乙醇胺(TEA)搅拌均匀后，滴加1mL正硅酸四乙酯(TEOS)，反应1h，加入含硫醚的有机硅源前驱体与MnTMPyP的混合液，继续反应4h，得到MnTMPyP杂化的介孔有机硅包被的MSN(MSN@MMN)。
将上述产物离心，使用乙醇洗涤离心后沉淀物，将沉淀物分散于100mL乙醇与10mL浓盐酸(37％)的混合溶液中，加热至78℃反应12h，以除去模板CTAC，重复上述步骤3次，洗涤后再次分散在20mL水中。取1mL上述溶液，向其中加入0.4mL氨水在95℃下反应3h，选择性刻蚀MSN内核，最终得到硅骨架掺杂MnTMPyP的HMMN。其中，所述有机硅源前驱体为：bis[3-(triethoxysilyl)propyl]tetrasulfide(BTES)；对应的所合成的HMMN的硅骨架中的有机活性官能团为:硫醚。HMMN中Mn：Si的质量比为0.31。
SNAP@HMON及SNAP@HMMN的制备：
采用“真空灌注”法，将SNAP载入HMON或HMMN的空腔中，制备得到SNAP@HMON或SNAP@HMMN，所述“真空灌注”法是指在HMON空腔内外制造巨大的压力差，将SNAP装载入HMON的空腔中。采用所述“真空灌注”法可以大大提高SNAP的负载量。
如图1的设计、合成以及药理作用示意图所示，制备得到的SNAP@HMMN可以穿透角膜，在光照下释放出更多的NO，到达降眼压的靶部位-小梁网/Schlemm管部位，可以舒张小梁网，增加Schlemm管的通透性，从而有效的降低眼压。
实施例2纳米药物SNAP@HMMN对小梁网细胞的细胞毒性
纳米药物SNAP@HMMN主要通过作用于小梁网细胞(HTM)发挥生物效应，因此本实施例研究纳米药物SNAP@HMMN对小梁网细胞存活率的影响。
实验方法：本实验中使用原代人眼小梁网细胞，购买自ScienCell公司(货号6590)。将HTM细胞以每孔5000个细胞的密度接种到96孔细胞培养液中，在37℃孵育过夜后，将细胞用PBS洗涤，然后向其中加入100μL含不同浓度(0.001、0.01、0.1和1mg/mL)的纳米药物SNAP@HMMN的新鲜细胞培养基，孵育24小时。之后，加入10μL的CCK-8溶液(10％)继续孵育1小时。使用酶标仪测量450nm处的吸光度，实验中设置空白组(不接种细胞)，对照组(细胞加不含纳米药物SNAP@HMMN的培养基)和实验组(细胞加含纳米药物SNAP@HMMN的培养基)，据此计算实验组的细胞活性。
实验结果：如图2所示，添加不同浓度的纳米药物作用24h，均不会显著影响HTM细胞的存活率。
实施例3纳米药物SNAP@HMMN的眼表毒性实验
实验方法：实验中使用野生型C57BL/6J小鼠，年龄范围为8-10周。取2只小鼠，第一只小鼠双眼眼表滴PBS(1滴，2μL/滴)，第二只小鼠双眼的眼表滴入纳米药物SNAP@HMMN(1滴，2μL/滴，15mg/mL),分别在1周，2周和4周用裂隙灯显微镜系统拍照，明确角膜和巩膜损伤，之后用荧光素钠眼表染色观察角膜上皮细胞的损伤。
实验结果：如图3所示，使用纳米药物SNAP@HMMN滴入小鼠眼表后，在1周、2周和4周对小鼠眼表进行检查，发现纳米药物SNAP@HMMN对小鼠眼表不会产生刺激，不会损伤角膜上皮细胞。
实施例4纳米药物SNAP@HMMN的药理学实验
实验方法：眼压的测量均在相同时间段，小鼠清醒状态下，使用芬兰动物专用眼压计(型号：tonolab)眼压计进行测量。测量眼压时，左手轻抓小鼠耳后颈部皮肤，使小鼠放松的趴在笼盖上，右手持眼压计测量眼压。测量三次，取其平均值作为一次眼压测量值。动物实验中均按照美国国立卫生研究院的临床中心动物保健和使用委员会通过的动物使用和保健制度进行实验操作。实验中使用了一种高眼压小鼠模型-CAV1基因敲除小鼠。为了使小鼠熟悉和习惯眼压测量，在药理学实验前1周，小鼠会被多次测量眼压。药理学实验方案均为右眼滴药(1滴，2μL/滴)，左眼滴PBS(1滴，2μL/滴)。纳米药物SNAP@HMMN浓度为15mg/mL。滴药前以及滴药后5h，1天-5天使用tonolab眼压计测量小鼠双眼眼压。
实验结果：如图4所示，其中，图4的a表示对照组和纳米药物组处理后小鼠的眼压对比，图4的b表示对照组和纳米药物+光照组处理后小鼠的眼压对比，纳米药物SNAP@HMMN从5h开始就显著降低小鼠眼压，降眼压作用可以持续到测量的第5天，当小鼠眼表点药后，继续光照10分钟，结果表明纳米药物SNAP@HMMN的降眼压作用更加显著，可能是光照后产生了更多的NO，从而促进降眼压。
实施例5纳米药物SNAP@HMMN的作用机制研究
SNAP@HMMN既可以提供NO供体，又具有抗硝化的作用，推测其作用机制可能是通过产生NO，激活了NO的受体sGC(可溶性鸟苷酸环化酶)来发挥降眼压的作用，同时又具有降低过氧亚硝基的作用。过氧亚硝基活性强，检测困难，故采用蛋白质硝基化的水平硝基酪氨酸(nitrotyrosine,NT)来表示过氧亚硝基的产生。
实验方法：将HTM细胞接种到6孔细胞培养板中，在37℃孵育2天后，将细胞用PBS洗涤，然后向其中加入含0.15mg/ml的纳米药物(HMMN、SNAP@HMMN、SNAP@HMMN+光照)的新鲜细胞培养基，孵育24小时，收集细胞，通过Western Blot检测sGC和NT的表达。
实验结果：如图5所示，其中，图5的a表示分别在HMMN、SNAP@HMMN、SNAP@HMMN+光照(SNAP@HMMN+L)作用下sGC的表达量，图5的b表示分别在HMMN、SNAP@HMMN、SNAP@HMMN+光照(SNAP@HMMN+L)作用下NT的表达量。实验结果表示，SNAP@HMMN显著增加了sGC的表达量，光照条件下sGC的表达量更加显著，与此同时，SNAP@HMMN还可以减少NT的产生。说明本发明制备得到的纳米药物SNAP@HMMN既可以降眼压，又可以抗硝化，利用该纳米药物可用于制备治疗眼部疾病药物。
综上所述，本发明制备了一种抗硝化NO纳米药物SNAP@HMMN，所述抗硝化NO纳米药物以空心介孔有机硅纳米颗粒作为载体，所述载体装载有SNAP，所述SNAP装载在所述空心介孔有机硅纳米颗粒的空腔中，所述载体掺杂有MnTMPyP，所述MnTMPyP掺杂在所述空心介孔有机硅纳米颗粒的骨架中。所述抗硝化NO纳米药物既可以提供NO供体释放NO进行降眼压，又可以减少过氧亚硝基的产生发挥抗硝化的作用，适用于青光眼或高眼压症的治疗。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (9)
1.一种抗硝化NO纳米药物，其特征在于，所述抗硝化NO纳米药物以空心介孔有机硅纳米颗粒作为载体，所述载体装载有SNAP，所述SNAP装载在所述空心介孔有机硅纳米颗粒的空腔中，所述载体掺杂有MnTMPyP，所述MnTMPyP掺杂在所述空心介孔有机硅纳米颗粒的骨架中。
2.如权利要求1所述的抗硝化NO纳米药物，其特征在于，以质量百分比计，所述SNAP的装载量为所述空心介孔有机硅纳米颗粒的3.8％。
3.如权利要求1所述的抗硝化NO纳米药物，其特征在于，所述空心介孔有机硅纳米颗粒的直径为44.8nm±4.5nm，所述空心介孔有机硅纳米颗粒的空腔尺寸为33.2nm±3.4nm，所述空心介孔有机硅纳米颗粒的孔尺寸为4.2nm～4.6nm。
4.一种如权利要求1～3中任意一项所述的抗硝化NO纳米药物的制备方法，其特征在于，至少包含以下步骤：
步骤S1，制备实心二氧化硅纳米颗粒溶液：
将十六烷基三甲基氯化铵、水、三乙醇胺混合，搅拌均匀后得到混合溶液，向所述混合溶液中滴加正硅酸四乙酯得到实心二氧化硅纳米颗粒溶液；
步骤S2，制备介孔有机硅包被的实心二氧化硅纳米颗粒溶液：
将有机硅源前驱体与MnTMPyP混合后加入步骤S1中所述实心二氧化硅纳米颗粒溶液中进行反应，反应结束得到MnTMPyP杂化的介孔有机硅包被的实心二氧化硅纳米颗粒溶液；
步骤S3，制备HMMN溶液：
将步骤S2中所述MnTMPyP杂化的介孔有机硅包被的实心二氧化硅纳米颗粒溶液离心，对离心后的沉淀物分散于乙醇溶液中，加热去除作为模板的十六烷基三甲基氯化铵，使用氨水选择性刻蚀实心二氧化硅纳米颗粒内核，得到硅骨架掺杂MnTMPyP的HMMN溶液；
步骤S4，制备抗硝化NO纳米药物SNAP@HMMN：
将步骤S3中所述HMMN溶液和SNAP溶液分散于纯水中，室温下搅拌，离心得到产物，在超声处理下将所述产物溶于水中，得到抗硝化NO纳米药物SNAP@HMMN。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述有机硅源前驱体为BTES。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述十六烷基三甲基氯化铵：水：三乙醇胺：正硅酸四乙酯＝(1.8g～2.0g)：(20ml～25ml)：
(0.06g～0.1g)：(0.8ml～1.0ml)。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中，按体积比计，所述HMMN溶液：SNAP溶液＝(1:1)～(4:1)。
8.一种如权利要求1～3中任意一项所述的抗硝化NO纳米药物的应用，其特征在于，所述抗硝化NO纳米药物用于制备治疗眼部疾病药物。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述眼部疾病为青光眼或高眼压症。
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