CN112870379B - 一种响应型no纳米药物、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种响应型一氧化氮(NO)纳米药物，该响应型NO纳米药物是利用空心介孔有机硅纳米颗粒(HOS)作为载体材料负载NO供体O2‑(2,4‑二硝基苯基)1‑[(4‑乙氧羰基)哌嗪‑1‑yl]偶氮‑1‑鎓‑1,2‑二醇(JS‑K)。本发明还提供该响应型NO纳米药物的制备方法及其应用。该响应型NO纳米药物在眼前节氧化还原环境中可以被激活缓释出NO，产生降眼压的效果。本发明制备工艺简单、操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产，因此在青光眼治疗领域具有良好的应用前景。

Description

一种响应型NO纳米药物、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及医用纳米材料领域，尤其是涉及一种用于治疗青光眼的纳米材料，具体涉及一种响应型一氧化氮(NO)纳米药物、其制备方法及应用。
背景技术
青光眼是一种复杂的遗传异质性疾病，病理性眼压升高是最重要的危险因素。临床上最有效的治疗青光眼的方法就是通过降低眼压。眼压是由房水的产生和流出来维持，房水由睫状体上皮细胞分泌，而流出主要是通过经典房水外流通路流出，还有一部分通过非经典通路房水外流通路流出。目前临床上使用的降眼压药物大部分是通过增加非经典通路房水外流来达到降眼压的目的。而一氧化氮(nitric oxide，NO)药物的优势在于可以降低经典通路房水外流通路的阻力,因此是一种针对病因的治疗药物。
房水经典通路主要由小梁网和许莱姆氏管(Schlemm管)组成。眼压的升高主要是这两个部位的压力升高导致。小梁网是由具有收缩性的小梁网细胞组成，NO可以舒张小梁网，使房水流出阻力降低。Schlemm管是由单层内皮细胞组成的管道，Schlemm管内皮细胞的通透性对于房水的外流起关键作用，而NO可以增加Schlemm管内皮细胞的通透性，降低房水外流阻力。
大量基础和临床研究都表明NO可以降低眼压，例如，2017年上市的0.024％latanoprostene bunod(LBN)滴眼液，向传统的青光眼药物拉坦前列素中添加了一氧化氮供体部分单丁酸丁二醇酯，用于治疗开角型青光眼和高眼压。但是NO供体类药物最显著的缺点就是半衰期短，降眼压时间短暂，因此需要多次的使用才能达到长期的降眼压效果，LBN也需要每晚一次使用，才能维持眼压的下降。因此NO前体类药物越来越受到研究者们的关注。其中偶氮鎓二醇盐类NO前体药具有半衰期长(约20h)的优点。JS-K是一种以重氮磺吡啶为基础的偶氮鎓二醇盐类的NO前药类代表性药物。但是JS-K溶解度和稳定性较差，NO储存量低，限制了其临床前研究和应用。因此需要一种角膜穿透性强的材料来输送JS-K进入眼前房。
空心介孔有机硅纳米颗粒(HOS)是一种有机介孔二氧化硅纳米颗粒，可以在还原性环境中被降解，大大增加了材料的生物相容性，降低了材料潜在的毒性效应，此外，具有内部空腔的中空结构是HOS的巨大优势，可以增加药物的负载量，特别是对于疏水性药物分子。眼前节中包含丰富的还原剂物质，比如维生素C。JS-K可以被还原剂激活，释放出大量的NO。因此，我们将JS-K装载在HOS中，通过HOS的穿透能力，将纳米药物递送入前房，在前房还原剂的作用下，释放中大量NO，通过房水的外流到达眼的小梁网/Schlemm管组织，从而达到降眼压的目的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种响应型NO纳米药物，该响应型NO纳米药物使用HOS负载药物，本发明方法制备的纳米颗粒能够被眼前节氧化还原环境激活释放NO，降低眼压。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是：
一种响应型NO纳米药物，以HOS作为载体材料，该载体材料负载JS-K。
在本方明的一些实施方案中，所述HOS的直径为45.4±5.2nm，空腔尺寸为33.4±5.2nm，孔尺寸为3-4.5nm。
在本方明的一些实施方案中，所述的JS-K装载在所述HOS的空腔中，所述JS-K在所述HOS的空腔中的装载量为所述HOS的质量百分比的3-8％。
本发明所述的响应型NO纳米药物的制备方法，包括如下步骤：
(a)实心二氧化硅纳米颗粒(MS)的制备：将十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、水与三乙醇胺(TEA)混合，搅拌均匀后，滴加正硅酸四乙酯(TEOS)，反应得到MS溶液；
(b)介孔有机硅包被的实心纳米颗粒(MS@MOS)的制备：将步骤(a)所获得的MS溶液中加入双-[r-(三乙氧基硅)丙基]-四硫化物(BTES)和正硅酸四乙酯(TEOS)的混合硅源，充分反应后，得到MS@MOS的悬浊液；
(c)HOS的制备：将步骤(b)中得到的MS@MOS的悬浊液离心后，得到的固体以乙醇洗涤后分散于浓盐酸的乙醇溶液中，加热反应除去作为模板的CTAC；再使用氨水选择性刻蚀MS内核，得到HOS；
(d)HOS-JR(负载JS-K的HOS)的制备：采用“真空灌注”法，将HOS分散到JS-K的DMSO溶液中；然后在超声处理下将水滴加到溶液中；通过离心，最后产物溶于水中，获得HOS-JR；
优选的，步骤(a)中，十六烷基三甲基氯化铵、水、三乙醇胺和正硅酸四乙酯的体积比为(1.8-2.0):(20-25):(0.06-0.1):(0.8-1.0)；所述反应的温度为80-95摄氏度，所述反应的时间为1-2小时。
优选的，步骤(b)中，所述MS溶液、BTES和TEOS的体积比为2:1:-1:1。
优选的，步骤(c)中，所述浓盐酸在乙醇溶液中的质量百分数是5-15％。
优选的，步骤(d)中，所述HOS和JS-K的质量比为1:1-4:1，所述JS-K在DMSO溶液中的浓度为5-10g/L,所述DMSO和水的体积比为1:1，所述超声的时间为5-15分钟。
本发明所述的响应型NO纳米药物在制备治疗眼部疾病的药物中的用途。在本发明的一些实施方案中，所述眼部疾病为青光眼或高眼压症。
本发明中所述浓盐酸是指质量百分比浓度为37％的盐酸水溶液；本发明实验室的室内温度，范围在20-25摄氏度。
有益效果：
本发明提供的响应型NO纳米药物能够在眼前节氧化还原环境中被激活，释放一氧化氮分子，产生降眼压的效果。
本发明提供的响应型NO纳米药物能够在眼部靶部位释放一氧化氮分子，不对周围组织产生刺激，没有潜在的毒性效应，具有良好的生物安全性。
本发明制备工艺简单、操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产，因此在青光眼治疗领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1：HOS-JR的合成和表征。其中，图1a为HOS-JR合成模式图；图1b为HOS的透射电子显微镜(TEM)图像；图1c为HOS-JR透射电子显微镜(TEM)图像；图1d为动态光散射测量HOS在超纯水中的粒径图；图1e为动态光散射测量HOS-JR在超纯水中的粒径图。
图2：CCK8试验评价纳米药物对人小梁网细胞(HTM)和猪房角丛状细胞(AAP)的毒性。其中，图2a-2c为0.15mg/mL和0.3mg/mL纳米药物在HTM中孵育6h,12h和24h的细胞存活率；图2d-2f为0.15mg/mL和0.3mg/mL纳米药物在AAP中孵育6h,12h和24h的细胞存活率。
图3：图3a和图3b分别为NOS3 KO小鼠眼表局部分别滴HOS和HOS-JR后的眼压变化。
图4：猪眼房角丛状(AAP)细胞给予HOS-JR处理24h后细胞通透性(TEER)检测。
图5：HOS-JR处理对小梁网收缩性的影响。
图6：HOS-JR在野生型小鼠局部滴眼后，房水外流组织中sGC的表达。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行。
本发明实施例中所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。使用的主要试剂包括十六烷基三甲基氯化铵溶液(25wt.％水溶液)、三乙醇胺、原硅酸四乙酯、双[3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基]四硫化物、氢氧化铵、O2-(2,4-二硝基苯基)1-[((4-乙氧基羰基)哌嗪-1-基]重氮-1-1,2-二醇酯、氨溶液(28wt.％水溶液)、二甲基亚砜、氯化钠、异硫氰酸荧光素，主要采购自sigma公司。
本发明中使用的缩写具有本领域常规含义，例如以下缩写的含义如下：
Figure BDA0002928782020000041
Figure BDA0002928782020000051
在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语和说明：
JS-K是一种一氧化氮药物前体，其化学结构如下式所示，
Figure BDA0002928782020000052
本发明中也以JR表示JS-K。
纳米药物载体(Nanoscale Drug Carriers)是一种属于纳米级微观范畴的亚微粒药物载体输送系统。将药物包封于亚微粒中，可以调节释药的速度，增加生物膜的透过性、改变在体内的分布、提高生物利用度等。
纳米粒(nanoparticle,NP)又称毫微粒，是大小在10-1000nm之间的固态胶体颗粒，一般由天然高分子物质或合成高分子物质构成，可作为传导或输送药物的载体。由于材料和制备工艺的差异，可以形成纳米球(nanosphere)与纳米囊(nanocapsule)，两者统称为纳米粒。
纳米药物是指将药物负载在纳米药物载体上形成的药物，或指溶解或分散有药物的各种纳米粒。响应型NO纳米药物指对还原剂响应产生NO的纳米药物。
施莱姆氏管(Schlemm管)是围绕前房角一周的的环管状房水排出通道，内壁仅有一层内皮细胞与小梁网相隔，外侧壁有25～35条集液管，房水经此处流入巩膜内静脉(房水静脉)，最后流入睫状前静脉。
“真空灌注”法工艺参见文献：Fan W,Lu N,Huang P,et al.Glucose-responsivesequential generation of hydrogen peroxide and nitric oxide for synergisticcancer starving-like/gas therapy[J].Angewandte Chemie,2017,129(5):1249-1253.
细胞毒性评价方法参见文献：Hu C,Sun J,Zhang Y,Lei Y,Sun X,Deng Y.LocalDelivery and Sustained-Release of Nitric Oxide Donor Loaded in MesoporousSilica Particles for Efficient Treatment of Primary Open-Angle Glaucoma.AdvHealthc Mater 2018；7(23):e1801047.
高眼压小鼠模型-NOS3基因敲除(NOS3 KO)小鼠的获得参见文献：Lei Y,Zhang X,Song M,Wu J,Sun X,Aqueous humor outflow physiology in NOS3 knockout mice,Invest Ophthalmol Vis Sci,2015；56:4891–4898.
AAP细胞获取方法参见文献：Lei Y,Overby DR,Read AT,Stamer WD,EthierCR.Anew method for selection of angular aqueous plexus cells from porcineeyes:a model for Schlemm's canal endothelium.InvestOphthalmol Vis Sci 2010；51:5744-5750。AAP细胞功能类似于人的schlemm管内皮细胞。
TEER检测方法参见文献：1)Lei Y,Stamer WD,Wu J,Sun X,eNOS-relatedmechanotransduction changes in aged porcine angular aqueous plexus cells,Invest Ophthalmol Vis Sci,2014；55:8402–8408.2)Lei Y,Stamer WD,Wu J,Sun X,Oxidative stress impact on barrier function of porcine angular aqueous plexuscell monolayers,Invest Ophthalmol Vis Sci 2013；54:4827-4835.
小梁网细胞收缩性检测参见文献：Dismuke W M,Liang J,Overby D R,etal.Concentration-related effects of nitric oxide and endothelin-1on humantrabecular meshwork cell contractility[J].Experimental eye research,2014,120:28-35.
实施例1：纳米药物HOS-JR的制备
(a)实心二氧化硅纳米颗粒(MS)的制备：95℃水浴中2g十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)的水溶液与0.1g三乙醇胺(TEA)搅拌均匀后，滴加1mL正硅酸四乙酯(TEOS)，反应1h。
(b)介孔有机硅包被的实心纳米颗粒(MS@MOS)的制备：上述溶液中加入双-[r-(三乙氧基硅)丙基]-四硫化物(BTES)和TEOS的混合硅源，反应4h，得到MS@MOS。
(c)HOS的制备：上述产物离心，乙醇洗涤后分散于100mL乙醇与10mL浓盐酸(37％)的混合溶液中，加热至78℃反应12h，以除去模板CTAC。重复上述步骤3次。洗涤后再次分散在20mL水中。取1mL上述溶液加0.4mL氨水在95℃反应3h，选择性刻蚀MS内核，最终得到HOS。
(d)HOS-JR(负载JS-K的HOS)的制备：然后通过采用“真空灌注”法，将10mg HOS分散到1mL含5mg JS-K(记作JR)的DMSO溶液中。然后在超声处理下将1mL水滴加到溶液中超声10分钟。通过离心，最后产物溶于水中，获得HOS-JR。
合成HOS-JR的过程如图1a所示，采用“真空灌注”法，将10mg HOS分散到1mL含5mgJS-K的DMSO溶液中获得HOS-JR。如图1b和图1c电镜照片显示HOS包载JS-K后仍然保持良好的分散性。动态光散射(DLS)测量了纳米载体和纳米药物载体的尺寸，如图1d和图1e所示，HOS和HOS-JR的平均水解粒径为71.2nm和74.7nm，多分散指数(PDI)值分别为0.097和0.152。
实施例2：细胞毒性评价
HOS-JR纳米药物通过到达调控眼压的靶细胞小梁网细胞和Schlemm管内皮细胞中发挥作用，因此首先评价HOS-JR对HTM细胞存活率的影响。HTM细胞以每孔5000个细胞的密度接种到96孔细胞培养板中。在37℃孵育过夜后，将细胞用PBS洗涤，然后向其中加入100ul含不同浓度(0.15和0.3mg/mL)的药物的新鲜细胞培养基，孵育6h、12h和24h。在每个时间点到达后，加入10ul CCK-8溶液(10％)继续孵育1小时。使用酶标仪测量450nm处的吸光度，实验中设置空白组(不接种细胞)，对照组(细胞加不含药物的培养基)和实验组(细胞加含药物的培养基)，据此计算实验组的细胞活性。
结果如图2所示：图2a-图2c分别表示0.15mg/mL和0.3mg/mL的纳米药物孵育6h、12h和24h对小梁网细胞存活率的影响。结果表明不同浓度的药物作用6h，1 2h直至24h均不会显著影响HTM细胞的存活率。人Schlemm管内皮细胞的分离和培养技术难度高，因此，我们选择使用猪的房角丛状细胞(AAP)，其功能类似Schlemm管内皮细胞，采用和HTM相同的实验方法，结果表明不同浓度的药物作用6h，12h直至24h均不会显著影响AAP细胞的存活率。
实施例3：药理学实验
眼压的测量均在相同时间段，小鼠清醒状态下，使用芬兰动物专用眼压计(型号：tonolab)眼压计测量。测量眼压时，左手轻抓小鼠耳后颈部皮肤，使小鼠放松的趴在笼盖上，右手持眼压计测量眼压。测量三次，取其平均值作为一次眼压测量值。动物实验中均按照美国国立卫生研究院的临床中心动物保健和使用委员会通过的动物使用和保健制度进行实验操作。实验中使用了一种高眼压小鼠模型-NOS3基因敲除(NOS3 KO)小鼠。NOS3 KO小鼠缺乏NOS3基因，因此导致产生NO的内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白的表达缺失。研究表明给予外源性NO供体，可以显著降低NOS3 KO小鼠的高眼压。为了使小鼠熟悉和习惯眼压测量，在药理学实验前1周，小鼠会被多次测量眼压。在药理学实验开始前一到两天，首先测量小鼠的基础眼压。药理学实验方案均为右眼滴药(1滴，2μL/滴)，左眼滴PBS(1滴，2μL/滴)。采用的纳米药物为：HOS：15mg/mL；HOS-JR:15mg/mL。滴药前以及滴药后5，24，48和56小时使用tonolab眼压计测量小鼠双眼眼压。
实验结果见图3，图3a和图3b分别表示HOS和HOS-JR对小鼠眼压的作用，结果表明HOS不影响小鼠的眼压。与对照眼比较，HOS-JR显著降低NOS3 KO小鼠的眼压，5h开始产生降压作用，作用持续48h，56h眼压恢复到基础眼压水平。n＝5，*P<0.05,Mean±SEM。
实施例4：纳米药物的作用机制
为了进一步分析HOS-JR降眼压的作用机制，我们首先分析了它对房水外流通路中的两种关键细胞HTM和AAP细胞的功能的影响。
AAP细胞的跨膜电阻反应了细胞对房水的通透性。用WPI EVOM跨膜电阻仪进行细胞跨膜电阻的测量。首先测量没有种植细胞的Transwell的跨膜电阻，记录空白电阻值。然后将细胞以1x104/cm2的密度种在Transwell底膜上，待细胞完全融合后(约8天)，将细胞用含0.15mg/mL HOS，0.15mg/mL HOS-JR的细胞培养基处理，细胞处理前以及处理24小时后进行细胞跨膜电阻的测量。将参考电极放置在Transwell底部，测试电极放在细胞所附着的膜上，直接进行读数。实验分组为空白组，HOS处理组，HOS-JR处理组。结果如图4所示，与未进行药物处理的细胞比较，HOS-JR药物处理组在24h显著降低了电阻，增加了细胞通透性(22±4.9Ω*cm2 VS 39±1.8Ω*cm2，n＝4,P<0.05,mean±SD)。
HTM的收缩功能可以反应细胞对房水外流产生的阻力。使用细胞收缩检测试剂盒，按照说明书将小梁细胞和胶原混合物按比例接种到胶原蛋白包被的24孔细胞培养板上，在细胞培养箱中进行30分钟聚合反应。之后加入完全培养基，放入培养箱继续培养48小时。之后把凝胶从培养板壁上分离出来，凝胶从壁上剥离之前和之后的8、9和10小时拍照。然后将细胞用含0.15mg/mL HOS，0.15mg/mL HOS-JR的细胞培养基处理，并在5小时后对凝胶拍照。实验分组为空白组，HOS处理组，HOS-JR处理组。使用ImageJ软件测量凝胶的面积。结果如图5所示，我们把小梁网细胞和凝胶依比例混合，培养48小时后，沿着孔板壁，将凝胶从壁上剥离，拍照观察凝胶面积的变化。结果发现在8小时后，凝胶面积已经稳定，不再收缩(如图5a所示)。10小时后，在培养皿中加入HOS-JR，继续培养5小时，与未进行药物处理的对照组比较，用HOS-JR处理的凝胶面积显著增大了26％(n＝3,P<0.05,mean±SD,如图5b所示)。
NO降眼压的作用是通过激活其受体sGC，因此我们检测眼压降低后小鼠房水外流组织中sGC的表达，分别测量sGC蛋白和mRNA的表达。小鼠眼表滴HOS-JR5小时后，取小鼠的房水外流组织，通过Western Blot分析sGC蛋白的表达。结果表明，与对照组比较，光密度分析表明HOS-JR显著增加了sGC蛋白的表达(n＝3,*P<0.05,mean±SD，如图6a和6b所示)；qPCR分析表明sGC的mRNA表达升高，但没有达到统计学意义(n＝3,P>0.05,mean±SD，如图6c所示)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本请所附权利要求书。

Claims (7)

1.一种响应型NO纳米药物，其特征在于：以空心介孔有机硅纳米颗粒作为载体材料，该载体材料负载JS-K；所述空心介孔有机硅纳米颗粒的直径为45.4±5.2nm，空腔尺寸为33.4±5.2nm，孔尺寸为3-4.5nm；所述的JS-K装载在所述空心介孔有机硅纳米颗粒的空腔中，其装载量为所述空心介孔有机硅纳米颗粒的质量百分比的3-8％。
2.权利要求1所述的响应型NO纳米药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)实心二氧化硅纳米颗粒的制备：将十六烷基三甲基氯化铵、水与三乙醇胺混合，搅拌均匀后，滴加正硅酸四乙酯，反应得到实心二氧化硅纳米颗粒溶液；
(b介孔有机硅包被的实心纳米颗粒的制备：将步骤(a)所获得的实心二氧化硅纳米颗粒溶液中加入双-[r-(三乙氧基硅)丙基]-四硫化物和正硅酸四乙酯的混合硅源，充分反应后，得到介孔有机硅包被的实心纳米颗粒的悬浊液；
(c)空心介孔有机硅纳米颗粒的制备：将步骤(b)中得到的介孔有机硅包被的实心纳米颗粒的悬浊液离心，得到的固体以乙醇洗涤后分散于浓盐酸的乙醇溶液中，加热反应除去作为模板的十六烷基三甲基氯化铵；再使用氨水选择性刻蚀实心二氧化硅纳米颗粒内核，得到空心介孔有机硅纳米颗粒；
(d)HOS-JR的制备：
采用“真空灌注”法，将步骤(c)得到的空心介孔有机硅纳米颗粒分散到JS-K的DMSO溶液中；然后在超声处理下将水滴加到溶液中；通过离心，最后产物溶于水中，获得HOS-JR。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，十六烷基三甲基氯化铵、水三乙醇胺和正硅酸四乙酯的体积比为(1.8-2.0):(20-25):(0.06-0.1):(0.8-1.0)；所述反应的温度为95摄氏度，所述反应的时间为1-2小时。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述实心二氧化硅纳米颗粒溶液、双-[r-(三乙氧基硅)丙基]-四硫化物和正硅酸四乙酯的体积比为2:1:-1:1。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(c)中，所述浓盐酸在乙醇溶液中的质量百分数是5-15％。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(d)中，所述空心介孔有机硅纳米颗粒和JS-K的质量比为1:1-4:1，所述JS-K在DMSO溶液中的浓度为5-10g/L,所述DMSO和水的体积比为1:1，所述超声的时间为5-15分钟。
7.根据权利要求1所述的响应型NO纳米药物在制备治疗眼部疾病的药物中的用途；所述眼部疾病为青光眼或高眼压症。
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