CN117224674A - 光热纳米药物及其制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种光热纳米药物及其制备方法、应用。光热纳米药物的制备方法包括如下步骤:将CDM‑PEG‑PAsp(ICG‑co‑His)溶解,充入CO,反应,制备第一纳米载体;将所述第一纳米载体与Ab‑PEG‑PAsp(ICG‑co‑His)和PEG20k‑PEG‑PAsp(ICG‑co‑His)于溶剂中混合,制备第一混合溶液;将多聚‑L‑赖氨酸溶液和氨水溶液混合,制备第二混合溶液;将所述第一混合溶液和所述第二混合溶液混合,制备光热纳米药物。
Description
技术领域
本申请涉及生物医用材料技术领域,特别是涉及一种光热纳米药物及其制备方法、应用。
背景技术
近年来发展迅速的免疫治疗手段可以通过阻断CTLA-4、PD-1/PD-L1通路,重新激活免疫系统对肿瘤细胞进行清除。其中,PD-1抗体Nivolumab、Pembrolizumab等和PD-L1抗体Atezolizumab等免疫检查点抑制已经被FDA批准在临床上用于黑色素瘤、非小细胞肺癌、霍奇性淋巴癌等多种癌症的治疗。
光热肿瘤疫苗,即光触发的光热纳米药物,采用体内可降解、生物相容性良好的高分子材料来包载肿瘤免疫治疗药物和光热治疗、光动力学治疗药物,形成纳米尺度的药物粒子并进行功能化修饰,避免光热治疗药、光敏剂和免疫治疗抗体等药物在体内输送中被降解和清除,将其靶向输送到肿瘤部位,提高肿瘤局部药物浓度,同时降低免疫治疗副作用;光热治疗和光动力学治疗能引起肿瘤细胞免疫原性死亡,激活肿瘤内免疫细胞,协同提高抗肿瘤治疗效果。构建肿瘤微环境多重刺激响应性的多功能纳米载体,联合输送光热治疗药物、光疗试剂和免疫治疗药物(PD-1抗体等)组合“光热肿瘤疫苗”,通过肿瘤靶向药物传递和瘤内分级定向输送,杀死肿瘤细胞并激活免疫应答,实现协同、精准治疗。
然而,目前所开发的光热纳米药物并没有起到良好的治疗肿瘤疾病的效果。
发明内容
基于此,本申请提供了一种能够增强肿瘤疾病治疗效果的光热纳米药物及其制备方法、应用。
本申请一实施例提供了一种光热纳米药物的制备方法,包括如下步骤:
将CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His)溶解,充入CO,反应,制备第一纳米载体;
将所述第一纳米载体与Ab-PEG-PAsp(ICG-co-His)和PEG20k-PEG-PAsp(ICG-co-His)于溶剂中混合,制备第一混合溶液;
将多聚-L-赖氨酸溶液和氨水溶液混合,制备第二混合溶液;
将所述第一混合溶液和所述第二混合溶液混合,制备光热纳米药物;
所述CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His)的结构式为:
;
所述Ab-PEG-PAsp(ICG-co-His)的结构式为:
;
所述PEG20k-PEG-PAsp(ICG-co-His)的结构式为:
。
在其中一个实施例中,所述CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His)的制备包括如下步骤:
将天冬氨酸环内酸酐与氨基聚乙二醇混合,反应,制备PEG-PBLA;
向所述PEG-PBLA中加入乙二胺和组氨酸,反应,制备PEG-PAsp(EDA-co-His);
向所述PEG-PAsp(EDA-co-His) 加入靛青绿羧酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺,反应,制备PEG-PAsp(ICG-co-His);
将所述PEG-PAsp(ICG-co-His)和3-(4-甲基-2,5二氧基-2,5二氢呋喃-3-基)丙酰氯混合,反应,制备所述CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His);
所述PEG-PBLA的结构式为:
;
所述PEG-PAsp(EDA-co-His)的结构式为:
;
所述PEG-PAsp(ICG-co-His)的结构式为:
。
在其中一个实施例中,在制备所述PEG-PBLA的过程中,反应条件包括:温度为30℃~40℃,时间为1.5天~2.5天。
在其中一个实施例中,在制备所述PEG-PAsp(EDA-co-His)的过程中,反应条件包括:温度为30℃~40℃,时间为10h~14h。
在其中一个实施例中,在制备所述PEG-PAsp(ICG-co-His)的过程中,反应条件包括:温度为室温,时间为1h~2h。
在其中一个实施例中,在制备所述CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His)的过程中,反应条件包括:温度为室温,时间为4h~6h。
在其中一个实施例中,所述Ab-PEG-PAsp(ICG-co-His)的制备包括如下步骤:
将所述CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His)与Ab-NH2混合,反应,制备所述Ab-PEG-PAsp(ICG-co-His);
所述Ab-NH2为具有末端氨基的抗体。
在其中一个实施例中,所述PEG20k-PEG-PAsp(ICG-co-His)的制备包括如下步骤:
将所述CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His)与PEG20K混合,反应,制备所述PEG20k-PEG-PAsp(ICG-co-His)。
本申请一实施例还提供了一种光热纳米药物,如上述任一实施例中所述的制备方法制备得到。
本申请一实施例还提供了上述一实施例中所述的光热纳米药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本申请提供了一种光热纳米药物,通过将CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His) 、Ab-PEG-PAsp(ICG-co-His)和PEG20k-PEG-PAsp(ICG-co-His)三者复合制备得到,三个聚合物原料中均共价连接有光热试剂ICG,且Ab-PEG-PAsp(ICG-co-His)连接有免疫检查点抗体Ab-NH2,PEG20k-PEG-PAsp(ICG-co-His)中含有长链PEG,三者复合后,长链PEG可将光热试剂ICG和抗体Ab-NH2包裹遮蔽,在长链PEG的遮蔽保护下,上述光热纳米药物可以通过EPR作用安全地靶向递送抗体和光光热试剂到肿瘤部位,在肿瘤胞外酸性环境中将PEG遮蔽层卸除,同时暴露和释放免疫检查点抗体于肿瘤微环境,纳米药物进一步被肿瘤细胞内吞,在近红外激光作用下,ICG高效产生热量,高温杀伤肿瘤细胞,同时介导免疫原性细胞死亡(ICD),诱导肿瘤组织产生系列免疫反应,促进T淋巴细胞的浸润,增强肿瘤局部的免疫检查点阻断治疗,协同实现强效抗肿瘤治疗,同时能够产生免疫记忆效应,有效抑制肿瘤复发与转移。
具体实施方式
为了便于理解本申请,下面将结合实施例对本申请进行更全面的描述。但是,本申请可以以许多不同的形式来实现,并不限于本申请所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义,本申请所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本申请。本申请所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本申请中,以开放式描述的技术特征中,包括所列举特征组成的封闭式技术方案,也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本申请一实施例提供了一种光热纳米药物的制备方法,包括如下步骤S110~步骤S140。
步骤S110: 将CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His)溶解,充入CO,反应,制备第一纳米载体。
CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His)的结构式为:
。
步骤S120:将第一纳米载体与Ab-PEG-PAsp(ICG-co-His)和PEG20k-PEG-PAsp(ICG-co-His)于溶剂中混合,制备第一混合溶液。
Ab-PEG-PAsp(ICG-co-His)的结构式为:
。
PEG20k-PEG-PAsp(ICG-co-His)的结构式为:
。
步骤S130:将多聚-L-赖氨酸溶液和氨水溶液混合,制备第二混合溶液。
步骤S140:将第一混合溶液和第二混合溶液混合,制备光热纳米药物。
本申请提供了一种光热纳米药物,通过将CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His) 、Ab-PEG-PAsp(ICG-co-His)和PEG20k-PEG-PAsp(ICG-co-His)三者复合制备得到,三个聚合物原料中均共价连接有光热试剂ICG,且Ab-PEG-PAsp(ICG-co-His)连接有免疫检查点抗体Ab-NH2,PEG20k-PEG-PAsp(ICG-co-His)中含有长链PEG,三者复合后,长链PEG可将光热试剂ICG和抗体Ab-NH2包裹遮蔽,在长链PEG的遮蔽保护下,上述光热纳米药物可以通过EPR作用安全地靶向递送抗体和光光热试剂到肿瘤部位,在肿瘤胞外酸性环境中将PEG遮蔽层卸除,同时暴露和释放免疫检查点抗体于肿瘤微环境,纳米药物进一步被肿瘤细胞内吞,在近红外激光作用下,ICG高效产生热量,高温杀伤肿瘤细胞,同时介导免疫原性细胞死亡(ICD),诱导肿瘤组织产生系列免疫反应,促进T淋巴细胞的浸润,增强肿瘤局部的免疫检查点阻断治疗,协同实现强效抗肿瘤治疗,同时能够产生免疫记忆效应,有效抑制肿瘤复发与转移。
在其中一个实施例中,CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His)的制备包括如下步骤S210~步骤S240。
步骤S210:将天冬氨酸环内酸酐与氨基聚乙二醇混合,反应,制备PEG-PBLA。
PEG-PBLA的结构式为:
。
进一步地,在制备PEG-PBLA的过程中,反应条件包括:温度为30℃~40℃,时间为1.5天~2.5天。可以理解地,反应温度例如可以但不限于为31℃、33℃、35℃、38℃、40℃等等。优选地,反应温度为35℃。反应时间为1.5天、2天、2.5天。优选地,反应时间为2天。
进一步地,反应的溶剂为DMF以及CH2Cl2中的一种或多种。
进一步地,反应结束后,还包括如下步骤:
对反应产物进行减压浓缩除去溶剂。
进一步地,反应结束后,还包括如下步骤:
采用沉淀剂对反应产物进行沉淀,离心,收集下层沉淀,冻干。
更进一步地,沉淀剂例如可以但不限于是HCl等等。
更进一步地,离心的条件包括:转速为2500rpm~3500rpm,时间为3min~10min。
进一步地,反应式为:
。
进一步地,天冬氨酸环内酸酐与氨基聚乙二醇的当量比为1:1。
步骤S220:向PEG-PBLA中加入乙二胺和组氨酸,反应,制备PEG-PAsp(EDA-co-His) 。
PEG-PAsp(EDA-co-His)的结构式为:
。
进一步地,在制备PEG-PAsp(EDA-co-His)的过程中,反应条件包括:温度为30℃~40℃,时间为10h~14h。可以理解地,反应温度例如可以但不限于为31℃、33℃、35℃、38℃、40℃等等。优选地,反应温度为35℃。反应时间为10h、11h、12h、13h、14h。优选地,反应时间为12h。
进一步地,在反应的过程中,通入N2进行保护。
进一步地,反应结束加入HCl进行沉淀。
更进一步地,对沉淀物进行透析。
进一步地,反应式为:
。
步骤S230:向PEG-PAsp(EDA-co-His) 加入靛青绿羧酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺,反应,制备PEG-PAsp(ICG-co-His)。
PEG-PAsp(ICG-co-His)的结构式为:
。
进一步地,在制备PEG-PAsp(ICG-co-His)的过程中,反应条件包括:温度为室温,时间为1h~2h。可以理解地,反应时间例如可以但不限于为1h、1.5h、2h等等。
进一步地,反应式为:
。
步骤S240:将PEG-PAsp(ICG-co-His)和3-(4-甲基-2,5二氧基-2,5二氢呋喃-3-基)丙酰氯混合,反应,制备CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His)。
进一步地,在制备CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His)的过程中,反应条件包括:温度为室温,时间为4h~6h。进一步地,反应时间例如可以但不限于为4h、5h、6h等等,优选地,反应时间为5h。
进一步地,反应式为:
。
在其中一个实施例中,Ab-PEG-PAsp(ICG-co-His)的制备包括如下步骤:
将CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His)与Ab-NH2混合,反应,制备Ab-PEG-PAsp(ICG-co-His);
Ab-NH2为具有末端氨基的抗体。
进一步地,反应时间为1h~2h。
进一步地,反应温度为室温。
在其中一个实施例中,PEG20k-PEG-PAsp(ICG-co-His)的制备包括如下步骤:
将CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His)与PEG20K混合,反应,制备PEG20k-PEG-PAsp(ICG-co-His)。
进一步地,反应时间为1h~2h。
进一步地,反应温度为室温。
本申请一实施例还提供了一种光热纳米药物,如上述任一实施例中的制备方法制备得到。
本申请一实施例还提供了上述一实施例中的光热纳米药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
以下通过具体实施例对本申请的光热纳米药物及其制备方法、应用作进一步详细的说明。以下实施例较为具体,可以理解地,在其他实施例中,不限于此。在以下具体实施例中,所涉及的仪器、试剂、材料,若无特别说明,均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料,可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等,若无特别说明,均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
实施例1
光热纳米药物的制备方法:
步骤一:制备PEG-PBLA
将天冬氨酸环内酸酐(12mmol,1eq)溶于DMF(20mL)及CH2Cl2(50mL)中,随后加入氨基聚乙二醇2000 (PEG2000-NH2,12mmol,1eq),加毕,继续于35℃下搅拌2天,进行聚合反应,以PEG2000-NH2引发天冬氨酸环内酸酐开环聚合。
反应结束,将反应液减压浓缩除去CH2Cl2,随后缓慢加入20mL 0.1 N HCl用于沉淀聚合物,离心(3000rpm,5min)后弃上清,将剩余残渣冻干水分,制备得到PEG-PBLA。
步骤二:制备PEG-PAsp(EDA-co-His)
取步骤一制备得到的PEG-PBLA(74.8μmol,1eq)溶于DMSO(5mL)中,随后加入EDA和His(7.9mmol,150eq),加毕转入装有磁力搅拌器的烘干压力管中(如果反应混合物固化,则加入0.5mL CH3CN),充入氮气,于35℃反应12h,将反应液滴加到冷的1 N HCl溶液(20mL)中,在0.01 N HCI溶液中透析3次(Spectra/ Por;MWCO: 1000Da),冻干,制备得到PEG-PAsp(EDA-co-His)。
步骤三:制备PEG-PAsp(ICG-co-His)
将75mL乙醇和9mL靛青绿羧酸(ICG-COOH)混合加入步骤二制备得到的PEG-PAsp(EDA-co-His)中进行酰胺化反应将亲水性光热试剂ICG接枝到聚合物侧链,室温下搅拌10min后,在反应物料中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC,100eq)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS,100eq)回流搅拌1-2h。将反应产物冷却到室温左右,然后过滤,将所得滤液在减压下浓缩,向减压浓缩所得残渣中加入10%钯碳1.0g、10%铂碳0.5g、36%盐酸15mL、乙醇80mL,在氢气气氛下搅拌,停止吸收氢气后,过滤反应产物,减压浓缩所得滤液,用己烷洗涤残渣,制备得到PEG-PAsp(ICG-co-His)。
步骤四:制备CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His)
将步骤三制备得到的PEG-PAsp(ICG-co-His)和3-(4-甲基-2,5二氧基-2,5二氢呋喃-3-基)丙酰氯等当量各8mol依次溶解于无水四氢呋喃(25mL)中,室温搅拌5h,使pH6.5敏感的1,1-环丙烷二甲酸二甲酯(CDM)基团接枝PEG中,将产物在四氢呋喃中重结晶,制备得到CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His)。
步骤五:制备Ab-PEG-PAsp(ICG-co-His)
将步骤四制备得到的CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His)加入装有60mL蒸馏水的150mL圆底烧瓶中,在室温下搅拌,然后加入Ab-NH2 (2 mmol,1eq),在室温下继续搅拌1-2h。经薄层层析法监测反应完成后,真空过滤收集沉淀产物,于室温下干燥。最后,使用甲醇/乙酸乙酯进行结晶,制备得到Ab-PEG-PAsp(ICG-co-His)。
步骤六:制备PEG20k-PEG-PAsp(ICG-co-His)
将步骤四制备得到的CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His)加入装有60mL蒸馏水的150mL圆底烧瓶中,在室温下搅拌,然后加入PEG20K(2mmo1,1eq),在室温下继续搅拌1-2h。经薄层层析法监测反应完成后,真空过滤收集沉淀产物,于室温下干燥。最后,使用甲醇/乙酸乙酯进行结晶,制备得到PEG20k-PEG-PAsp(ICG-co-His)。
步骤七:制备光热纳米药物
(1)将步骤四制备得到的CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His)溶解于DMF溶液中(m:m=1:500),将反应液转移到高压反应釜中充入CO,高温反应,离心洗涤得到自组装纳米,即第一纳米载体。
(2)将步骤(1)制备得到的第一纳米载体、步骤五制备得到的Ab-PEG-PAsp(ICG-co-His)、步骤六制备得到的PEG20k-PEG-PAsp(ICG-co-His)和四氢呋喃(m:m:m:m=1:10:10:500)混合,超声10 min使溶液混合均匀,制备得到第一混合溶液,第一混合溶液的总浓度为1000ppm。
(3)用超纯水配制浓度为lmg/mL的多聚-L-赖氨酸(PLL)溶液以及pH=9的氨水溶液。取 320μL PLL 溶液于20mL玻璃瓶中,加入7680μL pH=9氨水溶液,超声20 s 使其混合均匀,制备得到PLL浓度为0.032mg/mL的第二混合溶液。
(4)取步骤(2)制备得到的第一混合溶液200μL,在超声条件下迅速注入步骤(3)制备得到的第二混合溶液中,混合时间为60s,静置2h。
(5)将(4)的静置后的产物加入透析袋(MW=8000-14000)中,并置于超纯水中以除去THF溶液。每2h更换一次透析液,24h后将产物于超滤浓缩管(MW=100k kDa)中浓缩,去除未形成纳米颗粒的小分子。洗涤沉淀物后再离心收集,制备得到光热纳米药物,将光热纳米药物分散于超纯水中,置于4℃保存。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本申请的保护范围。因此,本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种光热纳米药物的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
将CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His)溶解,充入CO,反应,制备第一纳米载体;
将所述第一纳米载体与Ab-PEG-PAsp(ICG-co-His)和PEG20k-PEG-PAsp(ICG-co-His)于溶剂中混合,制备第一混合溶液;
将多聚-L-赖氨酸溶液和氨水溶液混合,制备第二混合溶液;
将所述第一混合溶液和所述第二混合溶液混合,制备光热纳米药物;
所述CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His)的结构式为:
;
所述Ab-PEG-PAsp(ICG-co-His)的结构式为:
;
所述PEG20k-PEG-PAsp(ICG-co-His)的结构式为:
。
2.根据权利要求1所述的光热纳米药物的制备方法,其特征在于,所述CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His)的制备包括如下步骤:
将天冬氨酸环内酸酐与氨基聚乙二醇混合,反应,制备PEG-PBLA;
向所述PEG-PBLA中加入乙二胺和组氨酸,反应,制备PEG-PAsp(EDA-co-His);
向所述PEG-PAsp(EDA-co-His) 加入靛青绿羧酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺,反应,制备PEG-PAsp(ICG-co-His);
将所述PEG-PAsp(ICG-co-His)和3-(4-甲基-2,5二氧基-2,5二氢呋喃-3-基)丙酰氯混合,反应,制备所述CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His);
所述PEG-PBLA的结构式为:
;
所述PEG-PAsp(EDA-co-His)的结构式为:
;
所述PEG-PAsp(ICG-co-His)的结构式为:
。
3.根据权利要求2所述的光热纳米药物的制备方法,其特征在于,在制备所述PEG-PBLA的过程中,反应条件包括:温度为30℃~40℃,时间为1.5天~2.5天。
4.根据权利要求2所述的光热纳米药物的制备方法,其特征在于,在制备所述PEG-PAsp(EDA-co-His)的过程中,反应条件包括:温度为30℃~40℃,时间为10h~14h。
5.根据权利要求2所述的光热纳米药物的制备方法,其特征在于,在制备所述PEG-PAsp(ICG-co-His)的过程中,反应条件包括:温度为室温,时间为1h~2h。
6.根据权利要求2所述的光热纳米药物的制备方法,其特征在于,在制备所述CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His)的过程中,反应条件包括:温度为室温,时间为4h~6h。
7.根据权利要求2所述的光热纳米药物的制备方法,其特征在于,所述Ab-PEG-PAsp(ICG-co-His)的制备包括如下步骤:
将所述CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His)与Ab-NH2混合,反应,制备所述Ab-PEG-PAsp(ICG-co-His);
所述Ab-NH2为具有末端氨基的抗体。
8.根据权利要求2所述的光热纳米药物的制备方法,其特征在于,所述PEG20k-PEG-PAsp(ICG-co-His)的制备包括如下步骤:
将所述CDM-PEG-PAsp(ICG-co-His)与PEG20K混合,反应,制备所述PEG20k-PEG-PAsp(ICG-co-His)。
9.一种光热纳米药物,其特征在于,如权利要求1~8任一项所述的制备方法制备得到。
10.权利要求9所述的光热纳米药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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