CN117224452B - 含有植物芽提取物的温和护肤组合物及其在守护皮肤屏障上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有植物芽提取物的温和护肤组合物及其在守护皮肤屏障上的应用，组合物按质量百分比计，包括以下组分：欧洲水青冈芽提取物0.1‑10%、欧洲赤松芽提取物0.1‑10%、果胶0.05‑5%和基料75‑99.75%。本技术方案中，欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物和果胶联合使用后，能够在平衡肌肤微生物菌群、舒缓肌肤和保湿的同时，还能降低化妆品或护肤品中的防腐剂、香精致敏源、美白剂等刺激性成分的刺激性，同时还能协同如烟酰胺等美白剂，提高美白功效。本发明还公开了上述含植物芽提取物的护肤组合物在降低皮肤刺激性和提高美白功效上的应用。
Description
技术领域
本发明涉及化妆品以及日化用品的技术领域，更具体地，涉及一种含有植物芽提取物的温和护肤组合物及其在守护皮肤屏障上的应用。
背景技术
随着社会的进步和生活水平的提高，人们对于个人形象和美容的关注度不断增加，化妆品成为了人们日常生活中不可或缺的一部分。
但化妆品中用到的成分包括防腐剂、芳香剂以及美白剂（烟酰胺等）等，都存在着对皮肤产生刺激性的风险。
防腐剂是指对微生物的生长具有持续的抑制作用的物质。防腐剂的重要特点是能在不同情况下抑制腐败作用，特别是在一般灭菌作用不充分时仍具有持续性的防腐抑菌效果。在化妆品产品中如果对微生物的抑制能力不够，导致化妆品污染甚至腐坏，对皮肤的影响反而会大于防腐剂本身的副作用；但化学防腐剂存在不同程度的毒副作用，用量大时会对皮肤有刺激性风险。
研究证实目前最易引起化妆品过敏的成分是香精。护肤品中所含的少量香精对健康皮肤一般不会产生副作用，但对敏感肌并不友好。香精中含有的香精致敏源可能会引起皮肤的过敏反应，对于敏感皮肤而言，刺激性风险更高。
烟酰胺是烟酸（维生素B3）的酰胺形式，在细胞中，烟酰胺被用于合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NDA）与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）。NAD+与NADP+是多种酶促氧化还原反应的辅酶。烟酰胺能下调从黑素细胞到角化细胞的黑素小体转运，而不会抑制酪氨酸酶活性或细胞增殖，从而影响皮肤色素沉着，它还能干扰角化细胞和黑素细胞之间的细胞信号通道，减少黑素生成；另一方面，烟酰胺能作用于已经产生的黑色素，减少其向表层细胞转移。烟酰胺用作美白成分时，使用浓度在2%-5%时，证明对治疗黄褐斑和紫外线造成的色素沉着过度有一定功效。虽然烟酰胺的护肤效果是肯定的，但是它可能会带来副作用，如皮肤潮红、皮肤刺痛及灼热感。
发明内容
本发明旨在克服上述现有技术的至少一种缺陷（不足），提供一种含有植物芽提取物的温和护肤组合物及其在守护皮肤屏障上的应用，用于解决护肤组合物中的原料对皮肤刺激性的问题。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是：
一种含有植物芽提取物的温和护肤组合物，按质量百分比计，包括以下组分：欧洲水青冈芽提取物0.1-10%、欧洲赤松芽提取物0.1-10%、果胶0.05-5%和基料75-99.75%。
目前，欧洲水青冈芽提取物在化妆品和日化产品中的功效主要是保湿、抗氧化。据研究表明，其对角质层细胞的活性有很好的促进作用，有活肤作用，结合它的抗氧化性，可作为抗氧化剂用于抗衰产品中，并有保湿效果。欧洲赤松芽提取物来源于欧洲赤松的芽部，在化妆品配方中具有调理肌肤的功效，主要表现为抑制皮肤分泌过多的油脂，让肌肤水油平衡。
而本技术方案中，通过大量的试验研究发现欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物和果胶联合使用后，能够在平衡肌肤微生物菌群、舒缓肌肤的同时，还能降低化妆品或护肤品中的防腐剂、香精致敏源、美白剂等刺激性成分的刺激性，同时还能协同如烟酰胺等美白剂，提高美白功效。
作为优选的方案，所述欧洲水青冈芽提取物的质量百分比为0.5-5%、所述欧洲赤松芽提取物的质量百分比为0.5-5%、所述果胶的质量百分比为0.1-1%。
作为优选的方案，所述欧洲水青冈芽提取物的质量百分比为0.5-2%、所述欧洲赤松芽提取物的质量百分比为0.5-1%、所述果胶的质量百分比为0.1-1%。
作为优选的方案，所述基料包括保湿剂、润肤剂、乳化剂、乳化稳定剂、pH调节剂、螯合剂、增稠剂、抗氧化剂、美白剂、防腐剂、香精和去离子水中的一种或两种以上组合物。
作为优选的方案，所述保湿剂包括甘油，所述美白剂包括烟酰胺，所述防腐剂包括苯氧乙醇。除此之外，防腐剂还包括多元醇，具体包括己二醇、戊二醇、乙基己基甘油和辛二醇。
作为优选的方案，按质量百分比计，所述基料包括以下组分：甘油1-15%、苯氧乙醇0.1-1%，余量为去离子水。
作为优选的方案，按质量百分比计，包括以下组分：欧洲水青冈芽提取物1%、欧洲赤松芽提取物1%、果胶0.5%、甘油5%、苯氧乙醇1%，余量为去离子水。
作为优选的方案，所述基料还包括香精，所述香精含有的香精致敏源占护肤组合物0.01-0.1%质量百分比。
进一步地，所述香精致敏源包括戊基肉桂醛、戊基肉桂醛、戊基肉桂醇、茴香醇、苯甲醇、苯甲酸苄酯、肉桂酸苄酯、水杨酸苄酯、丁苯基甲基丙醛、肉桂醛、肉桂醇、柠檬醛、香茅醇、香豆素、丁香酚、金合欢醇、香叶醇、己基肉桂醛、羟基香茅醛、羟异己基-3-环己烯甲醛、异丁香酚、α-异甲基紫罗兰酮、苧烯、芳樟醇、辛炔酸甲酯、橡苔提取物或树苔提取物中的其中一种或两种以上。
作为优选的方案，所述基料还包括质量百分比为0.3-5%的烟酰胺。
进一步地，所述烟酰胺的质量百分比为0.5-3%。
一种含有植物芽提取物的温和护肤组合物的制备方法，包括上述的植物芽提取物，所述制备方法包括以下步骤：
S1：将去离子水、甘油加入乳化锅中，再加入果胶，在高速搅拌下，分散在水相中；对于甘油、果胶，配方中含有则加入，配方中无则不加入；
S2：加热水相至85-90℃，保温10min；
S3：待水相降温至45±5℃时，将苯氧乙醇、欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物加入水相中，搅拌均匀，过滤出料。
进一步地，步骤S3中，搅拌均匀后，待混合物降温至40±5℃时，取样检测，经检测合格后使用500目滤网过滤出料，得成品。
一种如上述的护肤组合物在降低皮肤刺激性和提高美白功效上的应用。
具体地，所述的护肤组合物可以降低防腐剂、香精致敏源、美白剂等刺激性成分的刺激性。
进一步地，所述防腐剂可以为苯氧乙醇，所述香精致敏源可以为戊基肉桂醛、戊基肉桂醛、戊基肉桂醇、茴香醇、苯甲醇、苯甲酸苄酯、肉桂酸苄酯、水杨酸苄酯、丁苯基甲基丙醛、肉桂醛、肉桂醇、柠檬醛、香茅醇、香豆素、丁香酚、金合欢醇、香叶醇、己基肉桂醛、羟基香茅醛、羟异己基-3-环己烯甲醛、异丁香酚、α-异甲基紫罗兰酮、苧烯、芳樟醇、辛炔酸甲酯、橡苔提取物或树苔提取物；所述美白剂可以为烟酰胺。
本发明公开了一种欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物和果胶复配组合物在制备降低防腐剂对皮肤刺激性、降低香精致敏源对皮肤刺激性、降低美白剂对皮肤刺激性、增强美白剂美白作用、平衡皮肤微生态、增加皮肤角质层含水量和/或舒缓皮肤发红、瘙痒、炎症的产品中的用途，且复配组合物中，欧洲水青冈芽提取物占0.1-10%质量百分比、欧洲赤松芽提取物占0.1-10%质量百分比、果胶占0.05-5%质量百分比。
进一步地，复配组合物还包括甘油；更进一步地，还包括苯氧乙醇。
进一步地，平衡皮肤微生态包括调节皮肤上丙酸杆菌属、不动杆菌属、棒状杆菌属、葡萄球菌属、拟杆菌属、普雷沃氏菌属、魏斯氏菌属、双歧杆菌属、乳酸杆菌属和/或水栖菌属菌群的相对丰度。
进一步地，防腐剂包括苯氧乙醇和多元醇；更进一步地，多元醇包括己二醇、戊二醇、乙基己基甘油和辛二醇。
进一步地，香精致敏源包括戊基肉桂醛、戊基肉桂醛、戊基肉桂醇、茴香醇、苯甲醇、苯甲酸苄酯、肉桂酸苄酯、水杨酸苄酯、丁苯基甲基丙醛、肉桂醛、肉桂醇、柠檬醛、香茅醇、香豆素、丁香酚、金合欢醇、香叶醇、己基肉桂醛、羟基香茅醛、羟异己基-3-环己烯甲醛、异丁香酚、α-异甲基紫罗兰酮、苧烯、芳樟醇、辛炔酸甲酯、橡苔提取物和树苔提取物中的一种或两种以上。
进一步地，美白剂包括烟酰胺。
本发明还公开了一种组合物，包含欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物和果胶，且欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物和果胶在组合物中的总质量百分比为0.25~25%；且欧洲水青冈芽提取物占0.1-10%质量百分比、欧洲赤松芽提取物占0.1-10%质量百分比、果胶占0.05-5%质量百分比。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明所公开的含植物芽提取物的护肤组合物中，含有欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物和果胶，欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物和果胶搭配使用，可以产生协同作用，在护肤组合物中可以调理肌肤，提高保湿效果，还可应用以平衡皮肤微生态、增加皮肤角质层含水量以及舒缓皮肤发红、瘙痒、炎症，降低护肤组合物中刺激性成分对皮肤的刺激性。基于该组合物可实现在制备相应产品中的用途，使功能性护肤组合物发挥更强大的功效，并且可协同烟酰胺，提高美白效果。
具体实施方式
为了让本领域的技术人员更好地理解本方案，下面结合具体实施例对本方案做进一步详细说明。实施例中所使用的工艺方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例提供一种含植物芽提取物的护肤组合物，其中，每100g该护肤组合物中，含有欧洲水青冈芽提取物1g、欧洲赤松芽提取物1g、果胶0.5g、甘油5g、苯氧乙醇1g，余量为去离子水。
实施例2
本实施例提供一种含植物芽提取物的护肤组合物，其中，每100g该护肤组合物中，含有欧洲水青冈芽提取物1g、欧洲赤松芽提取物1g、果胶0.5g、苯氧乙醇1g，余量为去离子水。
实施例3
本实施例提供一种含植物芽提取物的护肤组合物，其中，每100g该护肤组合物中，含有欧洲水青冈芽提取物0.1g、欧洲赤松芽提取物0.1g、果胶0.05g、甘油5g、苯氧乙醇1g，余量为去离子水。
实施例4
本实施例提供一种含植物芽提取物的护肤组合物，其中，每100g该护肤组合物中，含有欧洲水青冈芽提取物0.5g、欧洲赤松芽提取物0.5g、果胶0.1g、甘油5g、苯氧乙醇1g，余量为去离子水。
实施例5
本实施例提供一种含植物芽提取物的护肤组合物，其中，每100g该护肤组合物中，含有欧洲水青冈芽提取物2g、欧洲赤松芽提取物1g、果胶1g、甘油5g、苯氧乙醇1g，余量为去离子水。
实施例6
本实施例提供一种含植物芽提取物的护肤组合物，其中，每100g该护肤组合物中，含有欧洲水青冈芽提取物10g、欧洲赤松芽提取物10g、果胶5g、甘油5g、苯氧乙醇1g，余量为去离子水。
实施例7
如下表1所示，制备对比例1-4。
其中，对比例1与实施例1的不同之处在于：对比例1中没有添加欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物、果胶。
对比例2与实施例1的不同之处在于：对比例2中没有添加欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物。
对比例3与实施例1的不同之处在于：对比例3中没有添加欧洲赤松芽提取物、果胶。
对比例4与实施例1的不同之处在于：对比例4中没有添加欧洲水青冈芽提取物、果胶。
表1原料组份表
实施例8
本实施例与实施例1的不同之处在于，每100g该护肤组合物中，还含有烟酰胺3g，余量为去离子水。
实施例9
本实施例与实施例8的不同之处在于，省去了甘油组分，余量为去离子水。
实施例10
如下表2所示，制备对比例5-8。
其中，对比例5与实施例8的不同之处在于：对比例5中没有添加欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物、果胶。
对比例6与实施例8的不同之处在于：对比例6中没有添加欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物。
对比例7与实施例8的不同之处在于：对比例7中没有添加欧洲赤松芽提取物、果胶。
对比例8与实施例8的不同之处在于：对比例8中没有添加欧洲水青冈芽提取物、果胶。
表2原料组份表
实施例11
本实施例与实施例1的不同之处在于，每100g该护肤组合物中，还含有烟酰胺0.5g，余量为去离子水。
实施例12
本实施例与实施例11的不同之处在于，省去了甘油组分，余量为去离子水。
实施例13
如下表3所示，制备对比例9-12。
其中，对比例9与实施例11的不同之处在于：对比例9中没有添加欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物、果胶。
对比例10与实施例11的不同之处在于：对比例10中没有添加欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物。
对比例11与实施例11的不同之处在于：对比例11中没有添加欧洲赤松芽提取物、果胶。
对比例12与实施例11的不同之处在于：对比例12中没有添加欧洲水青冈芽提取物、果胶。
表3原料组份表
上述实施例1-13中的护肤组合物的制备方法为：
S1：将去离子水、甘油加入乳化锅中，再加入果胶，在高速搅拌下，分散在水相中；对于甘油和果胶，配方中含有则加入，配方中没有则不加；
S2：加热水相至85-90℃，保温10min；
S3：待水相降温至45±5℃时，将苯氧乙醇、欧洲水青冈芽提取物（配方中含有则加入，配方中没有则不加）、欧洲赤松芽提取物（配方中含有则加入，配方中没有则不加）、烟酰胺（配方中含有则加入，配方中没有则不加）加入水相中，搅拌均匀，得混合物；
S4：待混合物降温至40±5℃时，取样检测，经检测合格后使用500目滤网过滤出料，得成品。
测试例1
本测试例对实施例1-7中的护肤组合物进行防腐剂刺激性测试。
（1）以苯氧乙醇为代表的防腐剂刺激性测试
其中，本测试例所采用的防腐剂为苯氧乙醇，苯氧乙醇为目前化妆品最常用的防腐剂，可作为防腐剂刺激源代表验证抗刺激组合物的功效。其中，实施例1、2、7中所构建的苯氧乙醇刺激模型，以1%苯氧乙醇为刺激源，筛选出对苯氧乙醇有不良反应的受试者15名进行试验。
具体测试方法为：
将15名受试者平均分为5组，每组3人。所有受试者左侧鼻唇沟部位都贴敷对比例1样品，5组受试者右侧鼻唇沟部位分别贴敷对比例2、对比例3、对比例4、实施例1、实施例2的样品，分别涂抹0.5ml，在涂抹2-8min，对刺痛、灼热感觉进行打分。分数为0-3分，其中0分代表无刺痛、灼热；1分代表轻度刺痛、灼热；2分代表中度刺痛、灼热；3分代表强刺痛、灼热。
测试结果如下表4所示：
表4苯氧乙醇刺激分数差值汇总表
结论：从上表4可以看出，含有果胶、欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物的护肤组合物可以降低苯氧乙醇对皮肤的刺激性。对于其他实施例3~6，基于同样的实验进行了验证，相较于对比例，也表现为弱刺激或无刺激，进一步表明含有果胶、欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物的护肤组合物可以降低苯氧乙醇对皮肤的刺激性。其中，又以实施例1的效果为最佳。
（2）以常见多元醇为代表的刺激性测试
为了验证果胶、欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物三者在降低防腐剂刺激性上的普适性，本测试例还展开有缓解多元醇防腐剂刺激性的测试，包括对己二醇、戊二醇、乙基己基甘油、辛二醇的刺激性缓解测试。即对于其他具有一定的防腐作用，但对皮肤有一定刺激性的多元醇，进行了相应的测试；
在缓解多元醇刺激试验中，依据如下表5制备实施例1’、2’和对比例1’~4’对应组合物。
表5原料组份表
上述组合物的制备方法为：
（1）清洗和消毒设备；
（2）将去离子水、甘油加入乳化锅，再加入果胶，在高速搅拌下，分散在水相中；步骤（2）中，甘油，有则加入，无则只加入离子水至乳化锅。
（3）加热水相至85~90℃，保温10min；
（4）降温至45℃，加入己二醇、戊二醇、乙基己基甘油、辛二醇、欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物，搅拌均匀；
（5）40℃取样检测合格后用500目滤网过滤出料。
对于在化妆品产品中，为了迎合无防腐概念，产品配方中会应用多元醇原料进行防腐，但是为了达到防腐效果，较高添加量的多元醇，会对皮肤产生相应的刺激性。其中使用到的多元醇包括戊二醇、己二醇、辛二醇、乙基己基甘油等。现构建多元醇刺激实验模型，筛选出对多元醇有不良反应的受试者15名进行测试，评估受试样品对多元醇作用于肌肤引起的灼热感和刺痛感的缓解效果。
将15名受试者平均分为5组，每组3人。所有受试者左侧鼻唇沟部位都贴敷对比例1’样品，五组受试者右侧鼻唇沟部位分别贴敷对比例2’、对比例3’、对比例4’、实施例1’、实施例2’样品，分别涂抹0.5ml，在涂抹2-8min，对刺痛、灼热感觉进行打分，分数为0-3分，其中0分代表无刺痛、灼热；1分代表轻度刺痛、灼热；2分代表中度刺痛、灼热；3分代表强刺痛、灼热。
护肤组合物降低多元醇皮肤刺激性测试数据如下表6所示：
表6多元醇刺激分数差值汇总表
结论：通过多元醇刺激性试验可得，对于含有果胶、欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物的实施例1’能够降低其中多元醇对皮肤的刺激性。
进一步地，在上述测试例和下述测试例中，基于欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物和果胶和离子水，混合制备相应的基础组合物，其中，欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物和果胶在组合物中的总质量百分比为0.25~25%；且欧洲水青冈芽提取物占0.1-2%质量百分比、欧洲赤松芽提取物占0.1-1%质量百分比、果胶占0.05-5%质量百分比。然后基于相应的基础组合物进行防腐剂皮肤刺激实验以及下述香精刺激性测试等所有测试，进一步验证了该三者联合的用途，至少可以降低防腐剂对皮肤刺激性、降低香精致敏源对皮肤刺激性、降低美白剂对皮肤刺激性、增强美白剂美白作用、平衡皮肤微生态、增加皮肤角质层含水量和/或舒缓皮肤发红、瘙痒、炎症。
测试例2
本测试例对实施例1、实施例2和实施例7中的护肤组合物进行香精刺激性测试。
测试方法如下：
（1）组织培养Phenion®3D 全厚度重组人皮肤模型（德国汉高）
Phenion®3D皮肤模型可以显示出人类自然皮肤的典型形态和生长特点。它的形成基于一种特殊的真皮胶原基质，这种基质上接种了皮肤生长关键的人纤维原细胞，几天后形成与活体相当的真皮。人角质细胞被接种于这种人工培育的真皮上表面，在气液界面形成一个多层的、角质化的表层。由此产生的全厚度皮肤模型显示了表皮细胞层的自然组织学序列，与人体表皮相似，其结构为位于真皮上的基底层，基底角质细胞层，之后是角质蝶骨层和颗粒层，最后被角质层覆盖。全厚度皮肤模型的一个特点是具有有活性的人工真皮，使得对真皮-表皮过渡区的分析成为可能。
此外，全厚度皮肤模型产生的所有分化标志物如细胞角蛋白-1/10、丝聚蛋白、谷氨酰胺转氨酶、层粘连蛋白、弹性蛋白和纤维连接蛋白均与天然人类皮肤所产生的相似，从培养液的上清液中提取的全厚度皮肤模型产生和分泌的具有代表性的炎症标志物(白细胞介素和细胞因子)可用于炎症反应研究。此外，细胞活性和细胞死亡也可以用这个模型进行分析。
本研究使用重组新生儿3D全厚度皮肤模型，通过设计3D婴童皮肤模型，让模型在结构、形态、组织环境和生理特证上高度接近与新生儿的皮肤，可以实现新生儿皮肤的生理与反应性，是研究表皮和真皮相互作用的理想模型，本次实验通过检测白介素6或白介素8的含量，表征致敏源对于婴童皮肤刺激性的高低。
（2）制备测试样品：将表7中的26种香精致敏源用橄榄油稀释至1%浓度，备用；并采用100%纯度的橄榄油作为对照。
（3）分别使用同等质量（本测试过程中涂抹量为30mg）的实施例1、实施例2和实施例7中的护肤组合物涂抹于3D皮肤模型上，再在处理位置分别涂抹同等质量（本测试过程中涂抹量为30mg）步骤（2）中的26种香精致敏源以及100%纯度的橄榄油，24H后测量涂抹位置上由于26种香精致敏源以及100%纯度的橄榄油引起的白介素6含量。
（4）实验结果如下表7所示。
表7实施例1、实施例2和实施例7的护肤组合物前处理的3D皮肤模型对26种香精致敏源及100%纯度橄榄油引起的白介素6含量对比
（5）结论：通过表7中的白介素6含量比对，可以看出，实施例1、2中含有的欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物、果胶的组合物能明显降低26种香精致敏源引起的白介素6表达量，降低皮肤炎症程度，减少香精致敏源导致的刺激性。
同理，本测试例还对实施例3-6中的护肤组合物进行了香精刺激性测试，实验结果同样显示本测试例3-6中的护肤组合物相对于实施例7（即对比例1~4）的护肤组合物，可以明显降低26种香精致敏源引起的白介素6表达量。
测试例3
本测试例对实施例1、2和实施例7（即对比例1~4）中的护肤组合物进行护肤效果上的测试。主要包括皮肤中菌群结构属物种相对丰度情况测定、角质层含水量测定、肌肤舒缓功效的测定。
一、皮肤中菌群结构属物种相对丰度的测试方法为：
（1）筛选18名年龄在18-45岁之间的受试者进行测试，所有受试者的皮肤类型均有发炎反应的倾向性。
（2）对18名受试者进行随机分为6组，每组3人，进行符合医学研究伦理原则的双盲随机临床研究。
（3）每组的受试者每天早晚在面部分别使用对比例1、2、3、4以及实施例1、2中的护肤组合物，每次使用0.5ml。在当天开始测试前D0和测试后的第28天D28，分别测试皮肤微生物群落（通过皮肤非侵入性地采集皮肤贴片，对18个皮肤样本微生物进行16SrRNA测序，分析菌群结构、多样性及基因功能）、皮肤角质层含水量以及面部皮肤红斑数量和面积数值平均值。
16SrRNA测序是指对环境样本16S ribosomal RNA的基因（即16SrDNA）高变区进行PCR扩增及高通量测序的一种技术，可对特定环境下细菌和古菌的微生物种类和丰度进行有效鉴定。16S序列由9个高变区组成(V1-V9)，中间穿插着保守区，是最常用的细菌分类标准。通过提取环境样品的DNA，并扩增其中16SrDNA基因；通过检测16SrRNA基因序列变异和丰度，反映环境样本中细菌的分类和丰度。16S序列可以用来鉴定绝大多数细菌。基于Illumina Miseq测序平台，可以一次性完成多个样本的平行测序，提供环境样本物种分类、物种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。通过16S第三区(V3)及第四区(V4)进行测序，共长约为459bp，可识别大部分人体微生物种类(准确度达到属一级别)。
16S rRNA测序标准操作流程：
(1)采用QIAamp DNA提取试剂盒进行抽提，并对抽提的DNA进行检测；
(2)采用荧光分光光度计检测DNA的浓度，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量；
(3)调整DNA溶液浓度，DNA工作液保存于4℃，储存液保存于-20℃；
(4)针对样本16S rRNA gene的V3-V4区进行PCR扩增；
(5)胶回收纯化：针对目标条带进行割胶回收，得到纯化的样本；
(6)各样本定量：利用Qubit荧光定量仪对各个样品定量；
(7)采用标准的IlluminaTruSeq DNA文库制备实验流程(IlluminaTruSeq DNASample Preparation Guide)构建上机文库；使用IlluminaMiSeq PE300进行上机测序。
细菌16S多样性研究中，目前主要按照序列97%的相似性进行OTU聚类。
OTU（Operational Taxonomic Units）是在系统发生学研究或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系，种，属，分组等）设置的同一标志。
在生物信息分析中，一般来说，测序得到的每一条序列来自一个菌株。要了解一个样品测序结果中的菌种、菌属等数目信息，就需要对序列进行归类操作（cluster）。通过归类操作，将序列按照彼此的相似性分归为许多小组，一个小组就是一个OTU。
为了得到每个OTU对应的物种分类信息，采用RDP classifier贝叶斯算法对97％相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并分别在各个分类学水平：domain(域)，kingdom(界)，phylum(门)，class(纲)，order(目)，family(科)，genus(属)，species(种)统计各样本的群落组成。
根据97％的相似度对所有序列进行OTU(Operational Taxonomic Units)划分并进行生物信息统计分析。根据分类学分析结果，可以得知一个或多个样品在各分类水平上的分类学比对情况。现通过菌群结构属物种相对丰度变化来展示数据。
其中，健康的面部皮肤中菌群结构属物种相对丰度情况如下表8所示
表8 健康的面部皮肤中菌群结构属物种相对丰度情况
（4）测试结果如下表9所示
表96组受试者在使用实施例1、2和实施例6中护肤组合物后的菌群结构属物种丰度情况（平均值）
（5）结论：从测试结果可以看出，实施例1、2的受试者在28天后，菌群结构属物种的平均值更接近健康的面部皮肤中菌群结构属物种，说明含有果胶、欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物的护肤组合物可以使受损肌肤紊乱微生物菌群状态恢复到与健康皮肤接近的较为稳定平衡的皮肤微生态菌群状态。
二、角质层含水量的测定方法如下：
（1）筛选18名年龄在18-45岁之间的受试者进行测试，所有受试者的皮肤类型均有发炎反应的倾向性。
（2）对18名受试者进行随机分为6组，每组3人，进行符合医学研究伦理原则的双盲随机临床研究。
（3）每组的受试者每天早晚在面部分别使用对比例1、2、3、4以及实施例1、2中的护肤组合物，每次使用0.5ml。在当天开始测试前D0和测试后的第28天D28，使用皮肤水分测试仪Corneometer CM825测量皮肤的水分含量变化。
其中，皮肤水分的测量基于国际公认的Corneometer法，即电容法。测量是基于水和其他物质完全不同的介电常数。皮肤是弱导电介质，其导电系数会随着皮肤的含水量增加，因此，测试探头作用于皮肤时，根据皮肤的水分含量测量电容器显示电容的变化。其中，数值越大代表角质层含水量越高，单位C.U.
（4）测试结果如下表10所示
表106组受试者在使用前D0和使用后的第28天D28的电容变化（平均值）
（5）结论：从以上测试结果可以看出，实施例1的受试者在28天后，皮肤的电容变化最大，且数值最大，且实施例1的测量结果与对比例1（空白对照组）的测量结果相比，具有极显著差异（p小于0.01）。说明了实施例1的护肤组合物可以有效提高皮肤角质层的含水量，具有统计学意义。
三、肌肤舒缓功效的测定方法为：
（1）筛选18名年龄在18-45岁之间的受试者进行测试，所有受试者的皮肤类型均有发炎反应的倾向性。
（2）对18名受试者进行随机分为6组，每组3人，进行符合医学研究伦理原则的双盲随机临床研究。
（3）每组的受试者每天早晚在面部分别使用对比例1、2、3、4以及实施例1、2中的护肤组合物，每次使用0.5ml。在当天开始测试前D0和测试后的第28天D28，进行以下A和B操作：
A. 使用VISIA-CR拍摄皮肤中相同选区的图像，并通过Image Pro Plus软件皮肤综合分析模块中的色斑分析，得到D0和D28天时，同一选区（AOI选区，半径3.5cm）的红色区域面积占比变化。通过比较使用前后的皮肤红色区面积占比变化，可反应产品的舒缓功效。
B. 通过皮肤血红素测试仪Mexameter MX 18测试同一选区中的血红素（EI）值。血红素EI值表征皮肤中血红素含量，当Mexameter MX 18测得的数值越低，提示该位置皮肤血红素含量越低。通过比较使用前后的皮肤血红素值变化，可反映产品的舒缓效果。
（4）测试结果如下表11和表12所示
表11 同一选区中皮肤红色区面积占比变化
表12 同一选区中皮肤血红素值变化
（5）结论：从上述结果可以看出，实施例1、2的受试者在28天后，皮肤红色区面积占比和皮肤血红素EI值明显下降，说明实施例1、2的含果胶、欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物的护肤组合物具有舒缓肌肤的效果。且实施例1、2的结果相对与对比例1（空白对照组）的结果相比，具有显著差异（p＜0.01），具有统计学意义。
同理，本测试例还对实施例3~6中的护肤组合物进行了与上述过程相同的护肤效果测试，实验结果同样显示本测试例3~6中的护肤组合物相对于实施例7的护肤组合物，护肤功效明显提高。
测试例4
本测试例对实施例8~10中的护肤组合物进行烟酰胺刺激性的测试。
测试方法为：
（1）筛选15名对烟酰胺具有不良反应（包括皮肤潮红、瘙痒、灼热感、刺痛感）的受试者进行试验。
（2）将15名受试者随机分为5组，每组3人。每组受试者在脸上分别涂抹对比例6、7、8和实施例8、9的样品，涂抹0.5ml，在涂抹2-8min后，通过自评对刺痛、灼热感觉进行打分；通过医生评分，评定皮肤潮红分数。其中分数为0-3分。
皮肤刺痛评分：0分代表无刺痛；1分代表轻度刺痛；2分代表中度刺痛；3分代表强刺痛。
皮肤灼热评分：0分代表无灼热；1分代表轻度灼热；2分代表中度灼热；3分代表强灼热。
皮肤潮红评分：0分代表无潮红；1分代表轻度潮红；2分代表中度潮红；3分代表强潮红。
（3）测试结果如下表13所示
表13烟酰胺刺激试验评分表
（4）结论：从上表可以看出，实施例8、9中含有的果胶、欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物，能够降低烟酰胺对皮肤的刺激性。
测试例5
本测试例对实施例11~13中的护肤组合物进行美白功效的测试。
测试方法如下：
（1）筛选18名年龄在18-45岁之间，面部肤色较为暗淡的受试者进行测试，18名受试者随机分成6组，每组3人，每组受试者在脸上分别涂抹对比例9、10、11、12以及实施例11、12的样品，每天早晚涂抹分别涂抹0.5ml。在当天开始测试前D0和测试后的第28天D28，分别对面部皮肤的黑色素、色素数据采集和面部图像分析进行测试。
利用皮肤色差测试探头及多功能皮肤测试系统(CL400和MPA6，德国CK)和皮肤红黑色素测试仪及测试探头(Mexameter MX18，德国CK公司)评测受试者分别使用对比例9、10、11、12以及实施例11、12的样品前后皮肤明亮度(亮度)和皮肤黑色素含量的变化，从而确定各样品的美白效果。
皮肤黑色素含量MI值：基于光谱吸收的原理(RGB)，通过测定特定波长的光照在人体皮肤上后的放射量来确定皮肤中黑色素的含量。仪器的测量范围是0~999，测量数值越高，说明皮肤中黑色素含量越高。
测试结果：△MI＝Tn- T0
式中，
Tn——受试区域的黑色素含量随时间变化数值；
T0——受试区域的黑色素含量起始值。
T0、Tn表征单位面积黑色素；其数值越大，肤色越暗淡。
皮肤明亮度L*值：明亮度L*值用于表征白平衡，L*值越大，颜色越偏向白色，反之，颜色越偏向黑色。
测试结果：△L*＝tn- t0
式中，
tn——受试区域明亮度随时间变化数值；
t0——受试区域明亮度的起始值。
（2）测试结果如下表14和表15所示
表14 皮肤黑色素MI值平均值测试结果表
表15皮肤明亮度L*平均值测试结果表
（3）结论：从以上表14和表15可以看出，实施例11、12中含有的果胶、欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物，可以协同烟酰胺，提高美白功效。
同理，本测试例还对实施例8、9中的护肤组合物进行了美白功效的测试，同样显示果胶、欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物，可以协同烟酰胺，提高美白功效。
测试例6
本测试例对实施例11中的护肤组合物进行人体斑贴测试。
测试仪器：基本设备及试剂、斑试器、低敏胶布、记号笔
受试物：实施例11组合物
阴性对照：空白对照
试验方法：选用合格的斑试器材，以封闭型斑贴试验方法，将受试物实施例11组合物约0.020ml-0.025ml置于斑试器内，外用低致敏胶带贴敷于受试者背部，24小时后去除受试物，分别于去除后0.5h、24、48小时观察皮肤反应，按《化妆品安全技术规范》（2015年版）中皮肤反应分级标准记录其结果。
（1）皮肤封闭型斑贴试验皮肤反应分级标准
表16反应分级标准对照表
（2）结果
表17斑贴试验结果表
人体皮肤斑贴试验结果显示，30人中0例出现皮肤不良反应。
该测试例测试表明，通过皮肤黑色素MI值、皮肤明亮度L*值分析，使用含果胶、欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物的实施例11，早晚使用28天后，具有协同增效美白功效且温和无刺激。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种降低皮肤刺激性和/或提高美白功效的温和护肤组合物，其特征在于，按质量百分比计，包括以下组分：欧洲水青冈芽提取物1-10%、欧洲赤松芽提取物1-10%、果胶0.5-5%和基料75-97.5%。
2.根据权利要求1所述降低皮肤刺激性和/或提高美白功效的温和护肤组合物，其特征在于，所述欧洲水青冈芽提取物的质量百分比为1-5%、所述欧洲赤松芽提取物的质量百分比为1-5%、所述果胶的质量百分比为0.5-1%。
3.根据权利要求1或2所述降低皮肤刺激性和/或提高美白功效的温和护肤组合物，其特征在于，所述基料包括保湿剂、润肤剂、乳化剂、乳化稳定剂、pH调节剂、螯合剂、增稠剂、抗氧化剂、美白剂、防腐剂、香精和去离子水中的一种或两种以上组合物。
4.根据权利要求3所述降低皮肤刺激性和/或提高美白功效的温和护肤组合物，其特征在于，所述保湿剂包括甘油；所述防腐剂包括苯氧乙醇；
按质量百分比计，所述基料包括以下组分：甘油1-15%、苯氧乙醇0.1-1%，余量为去离子水。
5.根据权利要求4所述降低皮肤刺激性和/或提高美白功效的温和护肤组合物，其特征在于，按质量百分比计，包括以下组分：欧洲水青冈芽提取物1%、欧洲赤松芽提取物1%、果胶0.5%、甘油5%、苯氧乙醇1%，余量为去离子水。
6.根据权利要求4或5所述降低皮肤刺激性和/或提高美白功效的温和护肤组合物，其特征在于，所述基料还包括香精，所述香精含有的香精致敏源占护肤组合物0.01-0.1%质量百分比。
7.根据权利要求4或5所述降低皮肤刺激性和/或提高美白功效的温和护肤组合物，其特征在于，所述基料还包括质量百分比为0.3-5%的烟酰胺。
8.欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物和果胶复配组合物在制备降低防腐剂对皮肤刺激性、降低香精致敏源对皮肤刺激性、降低美白剂对皮肤刺激性、增强美白剂美白作用、平衡皮肤微生态和/或增加皮肤角质层含水量的产品中的用途，且复配组合物中，欧洲水青冈芽提取物占1-10%质量百分比、欧洲赤松芽提取物占1-10%质量百分比、果胶占0.5-5%质量百分比。
9.欧洲水青冈芽提取物、欧洲赤松芽提取物和果胶复配组合物在制备舒缓皮肤发红、瘙痒、炎症的产品中的用途，且复配组合物中，欧洲水青冈芽提取物占1-10%质量百分比、欧洲赤松芽提取物占1-10%质量百分比、果胶占0.5-5%质量百分比。
Priority Applications (1)
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