CN1172165A - d-生物素的发酵生产 - Google Patents
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Abstract
一种生产d-生物素的方法,该方法包括培养一种库特氏菌属并且对生物素抗代谢物有抗性以及能够于有氧条件下在培养基中生产d-生物素的微生物,以及从发酵液中分离所得到的d-生物素。优选的微生物为库特氏菌538—KA26,538—17H4,538—51F9,538—2A13(分别为DSMNo.10609,10608,10610,10607),它们也是新的并且这些代表本发明的更进一步的方面。这样生产的d-生物素对于动物,植物以及微生物的营养来讲是一种必需的维生素,并且可作为一种重要的药物或食品添加剂。通过本发明的方法能以特别高的产率生产该物质。
Description
本发明涉及一种经发酵生产d-生物素的方法。
对于动物、植物以及微生物的营养来讲,d-生物素是一种必需的维生素,并且它可作为-种重要的药物或食品添加剂。本发明能够实现经发酵高产率生产d-生物素。
已有许多关于d-生物素发酵生产的研究。对生物素抗代谢物有抗性的芽孢杆菌属菌株[参见日本专利公报(公开)No.152495/1983]以及对生物素抗代谢物有抗性的沙雷氏菌属菌株(日本专利公开号27980/1990)分别能够生产0.6-4.0毫克/升以及4.3--22毫克/升的d-生物素。但是,通过属于对生物素抗代谢物有抗性的库特氏菌属微生物生产d-生物素却未曾有过报道。
本发明可以实现大量d-生物素的积累。现已发现属于库特氏菌属并且对生物素抗代谢物[例如酸霉素(以下称作ACM),5-(2-噻吩基)-戊酸(TVA),α-甲基脱硫生物素(MeDTB),2-甲基ACM,氨基丁酸霉素,双降生物素醇(bisnorbiotinol)及其混合物]具有抗性的微生物能够在培养液中积累大量的d--生物素,并且该d--生物素可以较高的纯度从中回收。事实上,由本发明生产的d-生物素的产率可能比用已知的采用属于芽孢杆菌属或沙雷氏菌属的菌株的方法所达到的产率高出大约5-200倍。因此,本发明提供了一种生产d-生物素的方法,该方法包括培养库特氏菌属的微生物,该微生物对生物素抗代谢物具有抗性并且可以在培养基中于有氧的条件下生产d-生物素,以及从发酵液中分离所生成的d-生物素。
通过胚芽乳杆菌 ATCC 8014 [Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,56,95--98(1994)]用浊度法能够分析培养液中积累的d-生物素的含量[微生物方法杂志,6,237-245(1987)]。
依照本发明可以利用的微生物包括所有产生d-生物素的库特氏菌属微生物[参见伯杰氏系统分类细菌学手册,第九版,第二卷,1255页(1984)],其对生物素抗代谢物(诸如上述物质)具有抗性。通过采用诱变剂,例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(下文称作NTG),甲磺酸乙脂,吖啶橙,紫外线或X-射线处理作为亲本菌株的属于库特氏菌属的菌株可以有效地获得上述微生物。
任何一种属于库特氏菌属的菌株都可以作为亲本菌株来制备用于本发明的微生物。库特氏菌属的微生物可以从自然资源中分离或者从培养物保藏中心购买。对于本发明,优选使用库特氏菌538-6(DSM No.9454)。通过分离属于库特氏菌属并且对生物素抗代谢物(诸如上述物质)具有抗性的微生物可以得到能够生产大量d-生物素的微生物。例如,如下文所述分离出一种生产大量d-生物素的库特氏菌538-6(DSM No.9454)的突变体。(1)一种能够生产大量d-生物素、具有ACM抗性的突变体的分离
离心收集在液体培养基中培养的库特氏菌538-6(DSM No.9454)细胞,洗涤该细胞并且将其悬浮在盐水中。按照下文所述的Adelberg方法[Biochem.Biophys.Res.Comm.,18,788(1965)]进行诱变。用含于100mM Tris-盐酸缓冲溶液(pH8.0)中的50-300微克/毫升NTG振荡处理该细胞。处理后,洗涤该细胞并且将其再次悬浮于盐水中。将洗涤过的细胞散布在不含d-生物素的合成培养基的琼脂平板上,该培养基在1000毫升蒸馏水中包含20克甘油,5克不含维生素的酪蛋白水解物(Difco),2克K2HPO4,1克KH2PO4,0.5克MgSO4·7H2O,0.01克FeSO4·7H2O,0.01克MnSO4·5H2O以及100微克的盐酸硫胺素(该培养基下文称作BM),附加100微克/毫升ACM。在培育后,将生长的大菌落接种在含有以胚芽乳杆菌ATCC 8014作为一种生物素指示菌株的分析平板上。在37℃下培养后,测量生长晕圈的直径,该直径依赖于d-生物素的量。从这一结果,得到了一个产生最大晕圈的菌落并命名为库特氏菌538-KA26。(2)一种能够生产大量d-生物素、具有ACM以及TVA抗性的突变体的分离
培养库特氏菌538-KA26,并且使用与上述(1)中类似的方法以NTG处理该细胞。在不含d-生物素的合成培养基中培养经处理的细胞,该培养基由在1000毫升蒸馏水中的20克甘油,3克(NH4)2SO4,2克K2HPO4,1克KH2PO4,0.5克MgSO4·7H2O,0.01克FeSO4·7H2O,0.01克MnSO4·5H2O以及100微克的盐酸硫胺素组成(该培养基下文称作MM),附加200微克/毫升ACM以及200微克/毫升TVA,随后以2至3天的间隔在含有200微克/毫升ACM以及200微克/毫升TVA的新鲜培养基中连续转移若干次。将得到的富集的培养物稀释并且散布在含有200微克/毫升ACM以及200微克/毫升TVA的MM琼脂平板上。在培育后,使用与上述(1)中类似的方法将生长的大菌落接种至含有胚芽乳杆菌ATCC 8014的分析平板上。培育后,测量生长晕圈的直径。结果得到了生成最大晕圈的菌落,并命名为库特氏菌538-17H4。(3)能够生产大量d-生物素、对ACM,TVA以及MeDTB有抗性的突变体的分离
培养库特氏菌538-17H4,并且使用与上述(1)中类似的方法以NTG处理该细胞。将处理过的细胞散布在含有100微克/毫升ACM的BM琼脂平板上。在培育后,将该菌落接种至生产培养基的琼脂块上,该培养基在平板上含有0.5微克/毫升d-脱硫生物素以及80微克/毫升MeDTB。在培育后,用紫外光照射该琼脂块,随后将其转移至含有胚芽乳杆菌ATCC8014的分析平板上。在培育后,测量生长晕圈的直径。结果得到了生成最大晕圈的菌落并命名为库特氏菌538-51F9。
按照上述段落中描述的类似的方法,进一步筛选出对150微克/毫升MeDTB有抗性的突变体。从该研究中,得到了比库特氏菌538-51F9生成更大的晕圈的菌落并命名为库特氏菌538-2A13。
在含有一种可同化碳源,一种可消化氮源,无机盐以及其它为该微生物生长所必需的营养物的培养基中,通过培养(培育)该微生物适当地实施本发明的方法。作为碳源,可以使用例如葡萄糖,果糖,淀粉,乳糖,麦芽糖,半乳糖,蔗糖,糊精,甘油或小米冻胶,优选甘油或葡萄糖。作为氮源,例如可以使用胨,大豆粉,玉米浆,肉类浸汁,硫酸铵,硝酸铵,脲或其混合物,优选胨。此外,作为痕量元素,可以使用钙,镁,锌,锰,钴,和铁的硫酸盐,盐酸盐或者磷酸盐,特别适于作无机盐的是磷酸二氢钾,硫酸镁,硫酸亚铁以及硫酸锰。而且如果需要的话,也可以加入常用的营养因子或者消沫剂,诸如动物油,植物油或者矿物油。培养基的pH值以大约5.0至9.0为宜,优选6.5至7.5。培养温度以大约10℃至40℃为宜,优选26℃至30℃。培养时间可能约为1至10天,优选2至7天,最优选的大约为2至4天(48至96小时)。在培养中,通气和搅拌通常会取得好的结果。
在培养后,可以从培养液中分离并纯化所生成的d-生物素。为此,通过利用d-生物素的各种性质,可以使用从培养液中提取某一产物的常用方法。因此,例如从培养液中除去细胞,在活性炭上吸附滤液中所需的物质随后洗脱并进一步用离子交换树脂纯化该物质。另一种方法是,将培养滤液直接加到离子交换树脂上,并且在洗脱后,从酒精和水的混合物中重结晶所需的产物。
按照本发明所使用的微生物包括所有对ACM,TVA,MeDTB,2-甲基ACM,氨基丁酸霉素,双降生物素醇或者其混合物有抗性、属于库特氏菌属并且能够生产d-生物素的菌株。在库特氏菌属菌株中,特别优选的菌株为库特氏菌538-KA26,库特氏菌538-17H4,库特氏菌538-51F9,库特氏菌538-2A13,它们于1996年3月26日保藏在德国Braunschweig的DSM(Deutsch Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH),且保藏号分别为DSM 10609,10608,10610,以及10607。这些优选的菌株也是新的,并且本身也包含在本发明当中。
通过以下实施例将对本发明更详细地加以解释。但是,应当明确本发明不限于那些具体的实施例。
实施例1
取生长在含有1%肉汤(Kyokutoh Seiyaku Co.Ltd.,日本)的琼脂培养基(下文称作NB)上的一菌环量库特氏菌538-6(DSM No.9454)接种至含有50毫升NB的500毫升烧瓶内,随后于28℃下在旋转摇床上(180转/分钟)摇动该烧瓶。在培养13.5小时后,在7500转/分钟下离心分离10分钟以收集培养液中的细胞,将该细胞用无菌盐水洗涤两次并悬浮在20毫升无菌水中。于28℃下用往返振动(285rpm)培养试管30分钟,该试管中含有5毫升由含于pH值为8.0的100mM Tris-盐酸缓冲液中的50-300微克/毫升NTG以及每毫升1×107个细胞组成的反应混合物。用5毫升无菌盐水洗涤该细胞两次并且将其悬浮在5毫升盐水中。细胞悬浮物在无菌盐水中依次稀释至10-1-10-7,并且散布到含有100微克/毫升ACM的BM琼脂上。在28℃下培育3天后,通过如下所述的含有胚芽乳杆菌ATCC 8014的琼脂平板方法测定生长的每个菌落的d-生物素的产率。用牙签将七百五十个菌落转移至含有胚芽乳杆菌ATCC 8014的分析平板上。在37℃下培育过夜,测量生长晕圈的直径,该直径依赖于d-生物素的量。结果得到了生成最大晕圈的库特氏菌538-KA26(DSM No.10609)。
将生长在含有100微克/毫升ACM的BM琼脂上的一菌环量库特氏菌538-KA26细胞接种至含有5毫升生产培养基的试管中,该生产培养基由2%甘油,4%胨(Nippou Seiyaku Co.Ltd.,日本),0.1%KH2PO4,0.05%MgSO4·7H2O,0.001%FeSO4·7H2O以及0.001%MnSO4·5H2O组成。随后于28℃下在往返摇床(285转/分钟)上摇荡该试管。在培育3天后,通过如下所述的借助胚芽乳杆菌ATCC 8014的浊度法分析培养液上清液中d-生物素的含量。将上清液与d-生物素的标准溶液(0-10毫克/升)在蒸馏水中稀释至1.25×10-3。将50微升稀释的溶液以及5毫升蒸馏水按该次序加入试管。在120℃下高压灭菌10分钟后,向试管中加入5毫升含有胚芽乳杆菌ATCC 8014的用于d-生物素分析的培养基,随后于37℃下以直立的状态培育该试管。在培育21小时后,通过加入5毫升0.2N盐酸使细胞停止生长,随后在660纳米下测量样品的浊度。通过将该样品的浊度与胚芽乳杆菌ATCC 8014的标准生长曲线相比较来测定样品中d-生物素的量。结果经3天培养的培养液上清液含有d-生物素3.9毫克/升。库特氏菌538-KA26(DSM N0.10609)生产出比亲本菌株库特氏菌538-6(DSM No.9454)高出约3900倍的生物素。
实施例2
按照如实施例1中所述的类似方法,用NTG处理菌株538-KA 26(DSM No.10609)的细胞,并且如下文所述富集对ACM与TVA有抗性的细胞。将在NTG处理后经洗涤的细胞接种至含有5毫升BM培养基(该培养基包含100微克/毫升ACM)的试管中,并且于28℃下在往返摇床(285转/分钟)上摇荡该试管。在过夜培育后,将该培养液接种至含有5毫升MM(该培养基包含200微克/毫升ACM与200微克/毫升TVA)的试管中,并使其浊度在600纳米下大约为0.03。在28℃下摇荡该试管,并且允许其内含物增长至培养物变混浊为止。这一富集过程以2或3天的间隔在含有新鲜的MM培养基(该培养基含有200微克/毫升ACM与200微克/毫升TVA)的试管中进行重复。重复3次之后,在盐水中稀释该培养物,并且将其散布到相同培养基的琼脂上。于28℃下培育3至4天后,在含有胚芽乳杆菌ATCC 8014的分析平板上的650个菌落中测定d-生物素的产率。结果得到了生成最大晕圈的库特氏菌538-17H4(DSM No.10608)。
将生长在含有100微克/毫升ACM的BM琼脂上的一菌环量库特氏菌538-17H4(DSM No.10608)接种至含有5毫升BM培养基(该培养基含有500微克/毫升ACM)的试管中,并且随后在28℃下摇荡该试管。经过夜培育后,将1毫升培养液转移至含有50毫升生产培养基的烧瓶中,该生产培养基由4%甘油,4.5%胨,0.1%KH2PO4,0.05%MgSO4·7H2O,0.05%FeSO4·7H2O,0.001%MnSO4·5H2O以及一滴消沫剂CA-115(Nippon Yushi Co.Ltd.,日本)组成,并且随后于28℃下摇荡该烧瓶。在培养72小时后,通过含有胚芽乳杆菌ATCC 8014的浊度法分析培养液的上清液中d-生物素的含量。结果,该上清液中含有d-生物素26.3毫克/升。库特氏菌538-17H4(DSMNo.10608)生产的生物素是亲本菌株库特氏菌538-KA26(DSM No.10609)生产的6.7倍。
实施例3
从库特氏菌538-17H4(DSM No.10608)的培养液中回收d-生物素。在每-个纯化步骤中d-生物素的浓度通过含有胚芽乳杆菌ATCC8014的浊度法测定。将1升72小时的培养液(该培养液相对于胚芽乳杆菌ATCC 8014而言,d-生物素的活性为25.7毫克/升)在7500转/分钟下离心分离10分钟。将该上清液加入填充有380毫升活性炭(Wako纯化学工业有限公司,日本)的柱(3.6×42厘米)中。用500毫升去离子水洗涤后,再用500毫升乙醇氨(ethanolic ammonia)溶液(该溶液由474毫升50%的乙醇与26毫升25%的氨组成)使该柱展开。在减压下,将300毫升相对于胚芽乳杆菌ATCC 8014而言d-生物素的活性为82.1毫克/升的洗脱液浓缩至50毫升。将该浓缩液加入以190毫升Dowex1×4(甲酸盐型,100-200目,Dow化学有限公司,美国)填充的柱(2.6×38厘米)中。并且随后用200毫升0.05M的甲酸洗涤该柱。用250毫升0.1M的甲酸为起始缓冲溶液展开该柱,随后继续使用250毫升0.1M和250毫升0.35M甲酸的线性梯度展开该柱。在减压下将160毫升洗脱液(该洗脱液相对于胚芽乳杆菌ATCC 8014而言,d-生物素的活性为144.8毫克/升)浓缩,得到17.6毫克的白色粉末。从乙醇与水的混合物中结晶该粉末,得到15.1毫克熔点为232℃的白色针状结晶。该样品的熔点,在T.L.C.(溶剂系统:乙酸乙酯/甲醇=10/1,Kieselgel60 F254,E.Merck)上的Rf值,红外光谱以及NMR光谱与标准的d-生物素的相应值相符。
实施例4
按照实施例1中所述的类似方法,用NTG处理库特氏菌538-17H4(DSM No.10608)细胞,随后采用如下所述的方法筛选对MeDTB有抗性的突变体。在含有100微克/毫升ACM的BM培养基中于28℃下过夜培养处理过的细胞后,在无菌盐水中连续稀释该培养物为10-1-10-7,并且将其散布至含有80微克/毫升ACM的BM琼脂上。在28℃下培育2至3天后,将19,500个菌落接种至生产培养基(该生产培养基在平板上由2%甘油,2%胨,0.1%KH2PO4,0.05%MgSO4·7H2O,0.05%FeSO4·7H2O,0.001%MnSO4·5H2O以及1.5%琼脂组成,补充有0.5微克/毫升d-脱硫生物素以及80微克/毫升MeDTB)的琼脂块上。于28℃下培育2天后,琼脂块用紫外光照射2小时,随后将其转移到胚芽乳杆菌ATCC 8014的分析平板上。于37℃下培育分析平板19小时,随后测量晕圈的直径。结果得到生成最大晕圈的库特氏菌538-51F9(DSM No.10610)。
将生长在含有100微克/毫升ACM的BM琼脂上的库特氏菌538-51F9(DSM No.10610)于28℃下在含有5毫升BM培养基(该培养基含有500微克/毫升ACM)的试管中培养。在过夜培养后,经离心分离收集该细胞并且将其悬浮在10%的甘油溶液中。将1毫升的细胞悬浮液转移至含有50毫升生产培养基[该生产培养基由6%甘油,5.5%胨,0.1%KH2PO4,0.05%MgSO4·7H2O,0.05%FeSO4·7H2O,0.001%MnSO4·5H2O以及一滴消沫剂CA-115组成(该培养基下文称作FM1)l的烧瓶中,随后于28℃下培养该烧瓶。培养72小时后,用含有胚芽乳杆菌ATCC 8014的浊度法分析培养液的上清液中d-生物素的含量。结果,上清液含有d-生物素41.5毫克/升。库特氏菌538-51F9(DSM No.10610)生产的生物素为其亲本菌株库特氏菌538-17H4(DSM No.10608)生产的1.6倍。
实施例5
从库特氏菌538-51F9(DSM No.10610)得到一种对MeDTB抗性更强的突变体。按照如实施例1所述的类似方式,用NTG处理库特氏菌538-51F9(DSM No.10610)的细胞,随后按照实施例4中所述的类似方法(除了琼脂块中MeDTB的浓度以外)筛选对150微克/毫升MeDTB有抗性的突变体。结果,这样得到了生成最大晕圈的库特氏菌538-2A13(DSM No.10607)。
按照实施例4中类似的方法,于28℃下在含有50毫升FM1培养基的烧瓶中培养库特氏菌538-2A13(DSM No.10607)。在培养24小时后,加进5毫升含有40%甘油与20%胨的无菌培养基,并且继续培养。在培养120小时后,用含有胚芽乳杆菌ATCC 8014的浊度法分析培养液的上清液中d-生物素的含量。结果,上清液含有d-生物素126毫克/升。库特氏菌538-2A13(DSM No.10607)生产的生物素大约为其亲本菌株库特氏菌538-51F9(DSM No.10610)生产的3倍。
下面的表1总结出迄今得到的突变体的d-生物素的产率。表1从库特氏菌538-6(DSM No.9454)得到的突变体的d-生物素产率
ACM:酸霉素;TVA:5-(2-噻吩基)-戊酸;MeDTB:α-甲基脱硫生物素
实施例号 | 微生物 | 对抗代谢物的抗性 | 生产的d-生物素(毫克/升) |
对照菌株 | 库特氏菌538-6(DSM No.9454) | <0.001 | |
1 | 库特氏菌538-KA26(DSM No.10609) | ACM | 3.9 |
2 | 库特氏菌538-17H4(DSM No.10608) | ACM.TVA | 26.3 |
4 | 库特氏菌538-51F9(DSM No.10610) | ACM,TVA,80微克/毫升MeDTB | 41.5 |
5 | 库特氏菌属538-2A13(DSM No.10607) | ACM,TVA,150微克/毫升MeDTB | 126 |
Claims (6)
1.一种生产d-生物素的方法,该方法包括培养一种属于库特氏菌属的微生物,该微生物对生物素抗代谢物具有抗性并且在有氧条件下能够在培养基中生产d-生物素,以及从发酵液中分离所得到的d-生物素。
2.按照权利要求1的方法,其中生物素抗代谢物为酸霉素,5-(2-噻吩基)-戊酸,α-甲基脱硫生物素,2-甲基酸霉素,氨基丁酸霉素,双降生物素醇或其混合物。
3.按照权利要求1或2的方法,其中所述培养在含有一种可同化碳源,一种可消化氮源,无机盐以及其它为该微生物的生长所必需的营养物的培养基中进行,该培养基的pH值为大约5.0至大约9.0,在有氧条件下且温度大约为10℃至40℃培养约1至10天。
4.按照权利要求1,2或3的方法,其中所述培养在含有以甘油或葡萄糖作为碳源,以胨作为氮源,以诸如磷酸二氢钾,硫酸镁,硫酸亚铁以及硫酸锰作为少量无机盐的培养基中进行,该培养基的pH值为6.5至7.5,在有氧条件下且温度为26℃至30℃时培养约48至96小时。
5.按照权利要求1至5中的任何一种方法,其中所述微生物选自库特氏菌538-KA26(DSM No.10609),库特氏菌538-17H4(DSM No.10608),库特氏菌538-51F9(DSM No.10610)以及库特氏菌538-2A13(DSM No.10607)。
6.库特氏菌538-KA26(DSM No.10609),库特氏菌538-17H4(DSM No.10608),库特氏菌538-51F9(DSM No.10610)以及库特氏菌538-2A13(DSM No.10607)。
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