CN117214328A - 一种甘氨胆酸有关物质的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物分析领域，该方法用于甘氨胆酸中有关物质的检测。鉴于甘氨胆酸及其杂质具有极性差异大，无紫外吸收的特点，为了对甘氨胆酸有关物质进行全面控制，本发明将甘氨胆酸有关物质按极性分为两组：①胆酸及其类似物的中等极性杂质，这些组分为甘氨胆酸中的主要杂质，其检测手段涉及了高效液相色谱和蒸发光散射检测器串联方法。②甘氨酸和甘氨酸乙酯的大极性杂质，其检测手段涉及了柱前衍生的高效液相色谱方法。两种方法互相补充，能够快速、准确对甘氨胆酸的有关物质进行全面控制，满足研发和生产的需求。
Description
技术领域
本发明属于药物分析领域，涉及甘氨胆酸有关物质检测的高效液相色谱分析方法。
背景技术
甘氨胆酸作为药用辅料，主要作为难溶性药物注射给药载体，在注射剂领域有着广泛应用，其结构式如下：
甘氨胆酸的制备路线是以胆酸和甘氨酸乙酯为起始物料，经缩合形成中间体甘氨胆酸乙酯，再水解、酸化得到甘氨胆酸。甘氨胆酸中主要的工艺杂质包括起始物料胆酸和甘氨酸乙酯，中间体甘氨胆酸乙酯，反应副产物为甘氨鹅去氧胆酸、甘氨去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸乙酯、甘氨去氧胆酸乙酯和胆酸乙酯以及降解杂质胆酸和甘氨酸，其中胆酸既是工艺杂质，又是降解杂质，相关杂质结构如下所示。
目前，甘氨胆酸作为药用辅料未收载于任何药典，而且经报道的甘氨胆酸有关物质控制手段多集中于薄层色谱法，该方法比较局限，只能针对特定杂质进行限度检查，不能准确定量。甘氨胆酸作为注射剂药品的常用载体，其质量直接影响其药品的质量和安全性。因此，对于甘氨胆酸的有关物质检测就显得尤为重要，为此，本申请自行建立了一套可以全面检测甘氨胆酸中有关物质的分析方法。
发明内容
1.解决的技术问题
甘氨胆酸及其杂质极性差异大，无紫外吸收，为了对甘氨胆酸有关物质进行全面控制，本发明将甘氨胆酸有关物质按极性分为两组：①胆酸及其类似物的中等极性杂质，这些组分为甘氨胆酸中的主要杂质，其检测手段涉及了高效液相色谱和蒸发光散射检测器串联方法。②甘氨酸和甘氨胆酸乙酯的大极性杂质，其检测手段涉及了柱前衍生的高效液相色谱方法。两种方法互相补充，能够快速、准确对甘氨胆酸的有关物质进行全面控制，满足研发和生产的需求。
2.技术方案
本申请提供了一种检测含有胆酸及其类似物的甘氨胆酸有关物质分析方法，其特征在于包括如下步骤：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱，柱长为150～250mm；
柱温：25～35℃；流速：0.9～1.1mL/min；进样量40～60μL；
ELSD检测器：漂移管温度：87～107℃；气体流速：2.4～2.8L/min；
流动相组成：流动相A：0.05～0.15％甲酸溶液，流动相B：乙腈；
采用梯度洗脱，程序如下：
供试品溶液：取甘氨胆酸供试品，用乙腈水溶解并稀释成一定浓度的溶液，作为供试品溶液。
对照品系列溶液：取甘氨胆酸及其有关物质对照品适量，用乙腈水溶解并稀释成系列浓度的溶液，作为对照品系列溶液。
所述甘氨胆酸有关物质分别是胆酸，甘氨胆酸乙酯、胆酸乙酯、甘氨去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、甘氨去氧胆酸乙酯和甘氨鹅去氧胆酸乙酯。
测定法：取上述供试品溶液和对照品系列溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品溶液中各组分浓度的对数值与相应峰面积的对数值计算线性回归方程，按标准曲线法计算供试品溶液中各有关物质的含量。
本发明的分析方法为通用的高效液相色谱法，该方法简单，容易操作，能够实现多种杂质的有效分离，所有组分最小分离度在1.5以上，方法灵敏度和准确度高，可以准确定量甘氨胆酸中除甘氨酸和甘氨酸乙酯外其余杂质的含量，能够满足研发和生产的需求。
本申请又提供了一种柱前衍生法测定甘氨胆酸中甘氨酸和甘氨酸乙酯的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱，柱长为150～250mm；
柱温：25～35℃；流速：0.9～1.1mL/min；进样量5～50μL；
检测波长：260～270nm；
流动相组成：流动相A：0.05～0.15％磷酸溶液，流动相B：乙腈；
采用梯度洗脱，程序如下：
空白衍生溶液：以水和乙腈的混合液为溶剂，精密加入一定浓度的碳酸钾溶液和氯甲酸-9-笏基甲酯溶液，于特定条件下反应。
甘氨酸和甘氨酸乙酯衍生溶液：取一定量的甘氨酸和/或甘氨酸乙酯，以水和乙腈的混合液为溶剂，精密加入一定浓度的碳酸钾溶液和氯甲酸-9-笏基甲酯溶液，于特定条件下反应。
供试品衍生溶液：取甘氨胆酸，以水和乙腈的混合液为溶剂，精密加入一定浓度的碳酸钾溶液和氯甲酸-9-笏基甲酯溶液，于特定条件下反应。
测定法：取上述供试品溶液、甘氨酸和甘氨酸乙酯衍生溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以甘氨酸和甘氨酸乙酯衍生溶液中衍生物峰面积计算供试品溶液中甘氨酸和甘氨酸乙酯的含量。
本发明的分析方法涉及柱前衍生，以氯甲酸-9-笏基甲酯作为衍生试剂，反应条件温和，反应迅速，且方法的专属性、灵敏度、线性范围和准确度均良好，可以准确测定甘氨胆酸中甘氨酸和甘氨酸乙酯的含量。
附图说明
附图1：实施例1中系统适用性溶液的高效液相色谱图
附图2：实施例1中灵敏度溶液的高效液相色谱图
附图3：实施例1中对照品溶液(0.5％浓度点)的高效液相色谱图
附图4：实施例2中空白衍生溶液的高效液相色谱图
附图5：实施例2中对照品衍生溶液的高效液相色谱图
附图6：实施例2中供试品衍生溶液的高效液相色谱图
具体实施方式
下面将通过实施例的方式进一步阐述本发明，实施例仅用于说明本申请，但并不因此将本发明限制在实施例中。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
液相色谱条件：
仪器：高效液相色谱仪配置蒸发光散射检测器；
色谱柱：Agilent Poroshell 120EC-C18(4.6mm×150mm，4μm)；
流动相：流动相A：0.1％甲酸溶液，流动相B：乙腈；
采用梯度洗脱方式，洗脱条件：
流速：1.0mL/min；
柱温：30℃；
漂移管温度：97℃；
气体流速：2.6L/min；
进样量：50μL。
溶液配制：
供试品溶液：取1批或多批甘氨胆酸50mg，置10mL量瓶中，用35％乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。
各组分贮备液：取甘氨胆酸、胆酸，甘氨胆酸乙酯，甘氨鹅去氧胆酸、甘氨去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸乙酯、甘氨去氧胆酸乙酯和胆酸乙酯各20mg，置不同20mL量瓶中，其中甘氨去氧胆酸用乙醇，其余组分用60％乙腈超声溶解并稀释至刻度，摇匀。
系统适用性溶液：称取甘氨胆酸50mg，置10mL量瓶中，用35％乙腈溶解，精密加入上述组分的贮备液各100μL于其中，用35％乙腈稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：精密量取上述各组分贮备液适量，置适宜的量瓶中，用35％乙腈稀释至刻度，摇匀，具体配制过程如下表所示。
系统适用性试验：取系统适用性溶液50μL，注入液相色谱仪，出峰顺序依次为甘氨胆酸，胆酸，甘氨胆酸乙酯，甘氨鹅去氧胆酸、甘氨去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸乙酯、甘氨去氧胆酸乙酯和胆酸乙酯，分离度最小值为甘氨胆酸乙酯与胆酸的1.742，满足基线分离要求。
灵敏度试验：取0.05％对照品溶液50μL，注入液相色谱仪，各组分峰S/N如下表所示。
响应最低组分为甘氨鹅去氧胆酸的13.97，大于10，能够达到方法灵敏度要求。
线性与范围试验：精密量取0.05％～2.0％对照品溶液各50μL，注入液相色谱仪，以对照品溶液中各组分浓度的对数值与相应峰面积的对数值计算线性回归方程，线性方程相关系数R2均不小于0.9900，线性结果如下表。
各组分在相应的线性范围内，浓度的对数值与相应峰面积的对数值呈显著线性关系。
精密度试验：取甘氨胆酸50mg，置10mL量瓶中，用35％乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，平行配制6份。取各溶液50μL，注入液相色谱仪，记录色谱图；按标准曲线法计算各杂质含量，结果如下表所示，6份样品测定结果基本一致，本法精密度良好。
实施例2
液相色谱条件：
仪器：高效液相色谱仪配置紫外或二极管阵列检测器；
色谱柱：ACE Excel C18-PFP(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相：流动相A：0.1％磷酸溶液，流动相B：乙腈；
采用梯度洗脱方式，洗脱条件：
流速：1.0mL/min；
柱温：30℃；
波长：265nm；
进样量：10μL。
溶液配制：
衍生试剂：称取氯甲酸-9-笏基甲酯约250mg，置100mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。
碳酸钾溶液①：取碳酸钾1.5g，置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
碳酸钾溶液②：取碳酸钾30mg，置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
甘氨酸和甘氨酸乙酯贮备液：取甘氨酸约20mg，甘氨酸乙酯盐酸盐约13.5mg，精密称定，置同一200mL量瓶中，用水超声溶解并稀释至刻度，摇匀。
空白衍生溶液：精密量取水4mL，置10mL量瓶中，加入碳酸钾溶液①1mL，乙腈3mL，混匀，加入衍生试剂1mL，用乙腈稀释至刻度，摇匀，25℃反应1h。
对照品衍生溶液：精密量取甘氨酸和甘氨酸乙酯贮备液1.0mL，置10mL量瓶中，加入水2mL，碳酸钾溶液②2mL，乙腈3mL，混匀，加入衍生试剂1mL，用乙腈稀释至刻度，摇匀，25℃反应1h。
供试品衍生溶液：取本品约50mg，精密称定，置10mL量瓶中，加入水4mL，碳酸钾溶液①1mL，乙腈3mL，混匀，超声使溶解，放冷，加入衍生试剂1mL，用乙腈稀释至刻度，摇匀，25℃反应1h。
专属性试验：取甘氨酸或甘氨酸乙酯进行单独衍生，并与空白衍生溶液进行对比，甘氨酸衍生物峰在10.727min处出峰，甘氨酸乙酯衍生物峰在16.457min处出峰，同时空白衍生溶液均不在这两个位置出峰，结果表明方法专属性良好。
灵敏度试验：配制每1mL中含有甘氨酸2μg，甘氨酸乙酯1μg的混合衍生溶液，取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。甘氨酸衍生物峰的信噪比为1347.87，甘氨酸乙酯衍生物峰的信噪比为466.41，结果表明方法灵敏度良好。
线性与范围试验：取甘氨酸和甘氨酸乙酯贮备液配制成一系列浓度，均加入适量的水，碳酸钾溶液②2mL，乙腈3mL，混匀，加入衍生试剂1mL，用乙腈稀释至刻度，摇匀，25℃反应1h，均相当于对照品浓度的20％，50％，100％，150％和200％，取上述溶液各10μL，注入液相色谱仪，以各组分浓度和对应衍生物峰面积进行线性回归，线性方程相关系数R2均不小于0.9900，线性结果如下，结果表明线性关系良好。
准确度试验：将一定浓度的甘氨酸和甘氨酸乙酯加入供试品溶液中，均加入适量的水，碳酸钾溶液①1mL，乙腈3mL，混匀，超声使溶解，放冷，加入衍生试剂1mL，用乙腈稀释至刻度，摇匀，25℃反应1h，各组分加入量均相当于对照品浓度的20％，50％，100％，150％和200％的加标溶液，取上述溶液10μL，注入液相色谱仪。按外标法计算各加标溶液中甘氨酸和甘氨酸乙酯的测得量，以(测得量-本底量)/加入量×100％计算各浓度点下的回收率。结果如下表，各浓度点下回收率均在90.0％～110.0％之间，结果表明方法准确度良好。
Claims (9)
1.一种检测含有胆酸及其类似物的甘氨胆酸有关物质分析方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)色谱条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱，柱长为150～250mm；
柱温：25～35℃；流速：0.9～1.1mL/min；进样量40～60μL；
ELSD检测器：漂移管温度：87～107℃；气体流速：2.4～2.8L/min；
流动相组成：流动相A：0.05～0.15％甲酸溶液，流动相B：乙腈；
采用梯度洗脱，程序如下：
(2)供试品溶液：取甘氨胆酸供试品，用乙腈水溶解并稀释成一定浓度的溶液，作为供试品溶液。
(3)对照品系列溶液：取甘氨胆酸及其有关物质对照品适量，用乙腈水溶解并稀释成系列浓度的溶液，作为对照品系列溶液。
所述甘氨胆酸有关物质分别是胆酸，甘氨胆酸乙酯、胆酸乙酯、甘氨去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、甘氨去氧胆酸乙酯和甘氨鹅去氧胆酸乙酯。
(4)测定法：取上述供试品溶液和对照品系列溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品溶液中各组分浓度的对数值与相应峰面积的对数值计算线性回归方程，按标准曲线法计算供试品溶液中各有关物质的含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，柱长150mm，颗粒度为4μm；漂移管温度：97℃；气体流速：2.6L/min；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；进样量50μL；流动相A：0.1％甲酸溶液；洗脱程序如下：
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述的供试品浓度为5mg/mL，溶剂为35％乙腈。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中对照品系列溶液中各组分浓度为2.5、5、10、25和50μg/mL。
5.一种柱前衍生法测定甘氨胆酸中甘氨酸和甘氨酸乙酯的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)色谱条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱，柱长为150～250mm；
柱温：25～35℃；流速：0.9～1.1mL/min；进样量5～50μL；
检测波长：260～270nm；
流动相组成：流动相A：0.05～0.15％磷酸溶液，流动相B：乙腈；
采用梯度洗脱，程序如下：
(2)空白衍生溶液
以水和乙腈的混合液为溶剂，精密加入一定浓度的碳酸钾溶液和氯甲酸-9-笏基甲酯溶液，于特定条件下反应。
(3)甘氨酸和甘氨酸乙酯衍生溶液
取一定量的甘氨酸和/或甘氨酸乙酯，以水和乙腈的混合液为溶剂，精密加入一定浓度的碳酸钾溶液和氯甲酸-9-笏基甲酯溶液，于特定条件下反应。
(4)供试品衍生溶液
取甘氨胆酸，以水和乙腈的混合液为溶剂，精密加入一定浓度的碳酸钾溶液和氯甲酸-9-笏基甲酯溶液，于特定条件下反应。
(5)测定法：取上述供试品溶液、甘氨酸和甘氨酸乙酯衍生溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以甘氨酸和甘氨酸乙酯衍生溶液中衍生物峰面积计算供试品溶液中甘氨酸和甘氨酸乙酯的含量。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，柱长250mm，颗粒度为5μm；波长：265nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；进样量10μL；流动相A：0.1％磷酸溶液；洗脱程序如下：
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述乙腈和水的比例为4:6～6:4之间，碳酸钾溶液浓度为14～16mg/mL，氯甲酸-9-笏基甲酯溶液浓度为2～3mg/mL，反应温度在15～40℃，反应时间0.5h～2h。
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述乙腈和水的比例为4:6～6:4之间，甘氨酸和甘氨酸乙酯的浓度在1～20μg/mL，酸钾溶液浓度为0.2～0.4mg/mL，氯甲酸-9-笏基甲酯溶液浓度为2～3mg/mL反应温度在15～40℃，反应时间0.5h～2h。
9.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述乙腈和水的比例为4:6～6:4之间，供试品浓度为5mg/mL，碳酸钾溶液浓度为14～16mg/mL，氯甲酸-9-笏基甲酯溶液浓度为2～3mg/mL反应温度在15～40℃，反应时间0.5h～2h。
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