CN116068081A - 一种检测氟尿嘧啶注射液中氟乙醛的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测氟尿嘧啶注射液中氟乙醛的方法，使用二硝基苯肼溶液衍生处理样品，采用高效液相色谱仪测定，色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填料，采用紫外检测器，检测波长350‑360nm；流动相A为pH值为2.5的磷酸盐缓冲液，流动相B为乙腈；进样量为18μL‑22μL，流速0.9‑1.1mL/min；梯度洗脱。本发明的方法操作简便，专属性良好；灵敏度高，检测限浓度可达1.21ng/ml，定量限12.1ng/ml向供试品中添加已知浓度的氟乙醛溶液，加标回收率81.4％，方法准确度良好；该方法适用于氟尿嘧啶注射液中痕量氟乙醛杂质的定量检测。
Description
技术领域
本发明属于氟尿嘧啶注射液技术领域，尤其涉及一种检测氟尿嘧啶注射液中氟乙醛的方法。
背景技术
药品在临床使用过程中产生的不良反应除了与主成分的药理活性有关，与杂质的影响也密不可分，为保证临床用药安全，必须严格控制药品中的杂质。氟尿嘧啶注射液作为一种抗癌药，主要用于治疗消化道肿瘤，或较大剂量氟尿嘧啶治疗绒毛膜上皮癌。亦常用于治疗乳腺癌、卵巢癌、肺癌、宫颈癌、膀胱癌及皮肤癌等。氟尿嘧啶注射液的主要水解降解途径包括两条不同的降解路线，其中路线一降解最终生成5-羟基尿嘧啶；降解路线2的最终降解产物为尿素和氟乙醛。
氟乙醛是一种基因毒性杂质，必须加以研究并严格控制以确保其临床用药的安全性。参考ICH协调指南M7《评估和控制药物中DNA反应性(致突变)杂质以限度潜在的致癌风险的行业指南》中依据氟尿嘧啶注射液临床最大日剂量经计算，氟尿嘧啶注射液中氟乙醛的限度需要严格控制在约8ppm以内。
目前，2020年版英国药典给出了一种采用高效液相色谱仪(HPLC)检测杂质B的有关物质方法和一种薄层色谱法检测尿素。上述两种方法均无法满足氟尿嘧啶注射液中痕量氟乙醛的检测需求，目前尚无氟尿嘧啶注射液中痕量氟乙醛定量检测方法报道，因此，急需一种高灵敏度的氟乙醛检测方法满足氟尿嘧啶注射液中痕量氟乙醛的检测需求，确保氟尿嘧啶注射液的临床用药安全。
发明内容
本发明的目的为：提供一种检测氟尿嘧啶注射液中氟乙醛的方法。可以实现氟尿嘧啶注射液中痕量氟乙醛的检测，且灵敏度高。
本发明的发明构思：
本发明利用氟乙醛与二硝基苯肼衍生生成腙，产物带有强紫外吸收基团(芳基和-NO2)，通过高效液相色谱测试其中腙的含量从而测定氟乙醛的含量。
本发明的技术方案为：一种检测氟尿嘧啶注射液中氟乙醛的方法，包括以下步骤：
步骤一，衍生液的制备
配制pH值为4.5-5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液；将所述乙酸-乙酸钠缓冲液与二硝基苯肼溶液混合即得衍生液；
步骤二，供试样品溶液制备与测试
精密量取待测氟尿嘧啶注射液和所述衍生液置于同一量瓶中,加乙酸调pH值为3.0-3.5，封口，进行衍生反应；
所述衍生反应的条件如下：30-60℃反应20min－60min，冷却至室温，用所述乙酸-乙酸钠缓冲液定容；
采用反相高效液相色谱法检测所述供试样品溶液中的氟乙醛，色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填料，采用紫外检测器，检测波长350-360nm；流动相A为pH值为2.5的磷酸盐缓冲液，所述流动相B为乙腈；进样量为18μL-22μL，流速0.9-1.1mL/min；梯度洗脱。
本发明的检测氟尿嘧啶注射液中氟乙醛的方法，其发明构思是；通过衍生反应，将氟乙醛与2,4-二硝基苯肼发生缩合，得到带有强紫外吸收基团的腙，从而用于氟尿嘧啶注射液中痕量氟乙醛的定量检测。基于以上发明构思，本发明探索衍生反应发生的条件，经实验直接将氟乙醛与2,4-二硝基苯肼混合，并不能发生衍生反应，无法得到能被紫色外吸收的基团腙。在考虑改变反应条件，用乙酸调节衍生体系的酸碱度时，结果随着酸的加入，开始不断析出氟尿嘧啶沉淀；继续加乙酸过至乙酸加入量约与氟尿嘧啶注射液体积的1/2时，氟尿嘧啶析出后又重新溶解，测定此时溶液pH值显示约为3.2。本发明的方法，通过先配制pH值为4.5-5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液，然后加入2,4-二硝基苯肼混合制成衍生液，从而使得样品在衍生反应过程中保持相对的酸碱稳定性，同时，在供试样品溶液中加入乙酸，以保证衍生反应的顺利进行，得到可以用于准确指示出痕量氟乙醛的腙。氟乙醛衍生产物在波长224nm、355nm下紫外吸收较强，为提高检测的灵敏度的同时减少低波长下其它有紫外吸收物质的干扰，因此选择355nm作为检测波长。所述紫外检测器为DAD或VWD检测器。
优选地，色谱柱规格为4.6mm×250mm或4.6mm×150mm，填料直径5μm，所述色谱柱柱温为25-35℃，所述流动相的流速为0.9-1.1mL/min。
优选地，所述色谱柱柱温为30℃，所述流动相流速为1.0mL/min。
优选地，所述流动相A为pH值为2.5的磷酸盐缓冲液。
优选地，所述检测波长为355nm，进样量为20μL，流速1.0mL/min。
优选地，所述二硝基苯肼溶液为2,3-二硝基苯肼的乙腈溶液或2,4-二硝基苯肼的乙腈溶液。
优选地，所述梯度洗脱程序为：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 60 | 40 |
| 15 | 20 | 80 |
| 20 | 20 | 80 |
| 21 | 60 | 40 |
| 30 | 60 | 40 |
。
本发明的检测氟尿嘧啶注射液中氟乙醛的方法，在等度(pH值至2.5磷酸盐缓冲液)-乙腈(体积比50％－50％)条件下，30分钟时间洗脱，还有物质未被洗脱出来。将有机相比例提高至60％时，氟乙醛衍生产物与前一个峰分不开。使用梯度洗脱，在梯度洗脱下，既能保证所有物质都能被洗脱出来，也能满足分离度要求，同时还缩短了分析时间。
优选地，所述梯度洗脱程序为：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 58 | 42 |
| 15 | 20 | 80 |
| 20 | 20 | 80 |
| 21 | 58 | 42 |
| 30 | 58 | 42 |
。
优选地，所述梯度洗脱程序为：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 62 | 38 |
| 15 | 20 | 80 |
| 20 | 20 | 80 |
| 21 | 62 | 38 |
| 30 | 62 | 38 |
。
本发明的有益效果为：
本发明的方法操作简便，试剂易得，检测使用的HPLC-UV仪器在药品企业研制企业普及度高。该方法通过系统的方法学验证研究，结果显示方法专属性良好；灵敏度高，检测限浓度可达1.21ng/ml，定量限12.1ng/ml向供试品中添加已知浓度的氟乙醛溶液，加标回收率81.4％，方法准确度良好。综上，该方法适用于氟尿嘧啶注射液中痕量氟乙醛杂质的定量检测。
附图说明
图1为实施例1中的溶解溶剂的色谱图。
图2为实施例1中的空白溶液的色谱图。
图3为实施例1中的灵敏度溶液的色谱图。
图4为实施例1中的系统适用性溶液的色谱图。
图5-9为实施例2中的系统精密度(实施例3中定量限)的色谱图。
图10-12为实施例3中的检测限测试的色谱图。
图13-图18为实施例4中的加标回收率测试的色谱图。
图19为实施例5中的供试样品的色谱图。
图20为实施例6中的供试样品的色谱图。
图21为实施例7中的供试样品的色谱图。
图22为对比例2中的供试样品的色谱图。
图23为对比例3中的供试样品的色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做详细说明。
实施例1专属性验证
配制灵敏度溶液：精密量取氟乙醛对照品溶液3ml，置10ml量瓶中，pH值为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液定容至刻度，摇匀。
配制系统适用性溶液：
精密量取氟尿嘧啶注射液2ml、乙酸1ml、0.2ml氟乙醛贮备液及0.4ml衍生液，置同一20ml量瓶中，封口，水浴锅40℃反应40min，冷却至室温，用溶解溶剂定容至刻度，摇匀，平行配制三份。
配制空白溶剂：
量取1ml乙酸与0.4ml衍生液，置20ml量瓶中，封口，水浴锅40℃反应40min，冷却至室温，用溶解溶剂定容至刻度，摇匀。
配制溶解溶剂：
取三水乙酸钠1.09g，加水溶解稀释至500ml，加入0.25ml冰醋酸，混匀，超声脱气，pH值约5.0。标记为乙酸-乙酸钠缓冲液，即为溶解溶剂。
精密量取上述各溶液20μL，注入液相色谱仪。
色谱条件：
进样程序：
溶解溶剂和空白溶液不干扰待测物的测定。灵敏度溶液中氟乙醛衍生产物S/N为44.0。系统适用性溶液中氟乙醛衍生产物峰与相邻峰的分离度为3.72；氟乙醛衍生产物峰理论板数为67473，本方法的系统适用性良好。色谱图见图1－图4。
实施例2系统精密度
步骤一：精密量取氟乙醛对照品溶液3ml，置10ml量瓶中，pH值为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液定容至刻度，摇匀。
步骤二：按照和实施例相同的色谱条件和进样程序，连续5次进样，氟乙醛衍生产物峰面积的RSD(％)为1.8，系统精密度良好，图5－图9为色谱图，具体结果如下表：
实施例3检测限和定量限的检测
步骤一，衍生液的制备
配制乙酸-乙酸钠缓冲液：配制pH值为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液；将所述乙酸-乙酸钠缓冲液与0.6mg/mL的2,4-二硝基苯肼溶液等体积混合即得衍生液；
步骤二，
配制氟乙醛贮备液：精密称定氟乙醛溶液适量，稀释成浓度为4.15μg/mL的溶液。
配制氟乙醛对照品溶液：精密量取氟乙醛贮备液0.2ml，置20ml量瓶中，再量取10％乙酸溶液0.24ml与0.4ml衍生液，置同一20ml量瓶中，封口，水浴锅40℃反应40min，冷却至室温，用pH值为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液容至刻度，摇匀，平行配制两份。
配制定量限溶液：精密量取氟乙醛对照品溶液3ml，置10ml量瓶中，pH值为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液定容至刻度，摇匀。
配制检测限溶液：
精密量取定量限溶液1ml，置10ml量瓶中，pH值为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液定容至刻度，摇匀。
步骤三，精密量取步骤二所得的定量限溶液20μL，注入液相色谱仪，定量限浓度为12.1ng/ml。色谱图为图5-图9。
步骤四，精密量取步骤二所得的检测限溶液20μL，注入液相色谱仪，检测限为1.21ng/mL。色谱图为图10-图12。
实施例4
加标回收率的测定：
配制供试品溶液：精密量取氟尿嘧啶注射液2ml、乙酸1ml及0.4ml实施例1所配的衍生液，置同一20ml量瓶中，封口，水浴锅40℃反应40min，冷却至室温，用pH值为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液定容至刻度，摇匀，平行配制两份。
配制加标供试品：精密量取氟尿嘧啶注射液2ml、乙酸1ml、0.2ml实施例1所配的氟乙醛贮备液及0.4ml实施例1所配的衍生液，置同一20ml量瓶中，封口，水浴锅40℃反应40min，冷却至室温，用pH值为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液定容至刻度，摇匀，平行配制三份。
精密量取上述各溶液20μL，注入液相色谱仪，以测得理与原有量差与加入时的比值，计算回收率，测量回收率值分别为80.6％、81.4％、82.2％，平均值为81.4％。色谱图为图13-图18。
实施例5
检测一份氟尿嘧啶注射液中的氟乙醛，方法如下：
步骤一，衍生液的制备
配制乙酸-乙酸钠缓冲液：配制pH值为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液；将所述乙酸-乙酸钠缓冲液与0.6mg/mL的2,4-二硝基苯肼溶液等体积混合即得衍生液；
步骤二，供试样品溶液制备
精密量取待测氟尿嘧啶注射液2ml、乙酸1ml及0.4ml衍生液，置同一20ml量瓶中，封口。置于水浴锅40℃反应40min，冷却至室温，用所述pH值为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液定容，摇匀，平行配制两份，进行衍生反应。
步骤三，采用反相高效液相色谱法分别测试供试样品溶液，条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填料，色谱柱规格为4.6mm×250mm，填料直径5μm，色谱柱柱温为30℃，所述流动相的流速为1.0mL/min。
采用DAD紫外检测器，检测波长355nm；流动相A为pH2.5的磷酸盐缓冲液,流动相B为乙腈；进样量为20μL，流速1.0mL/min；梯度洗脱，洗脱程序如下：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 60 | 40 |
| 15 | 20 | 80 |
| 20 | 20 | 80 |
| 21 | 60 | 40 |
| 30 | 60 | 40 |
。
图19为本实施例所测供试样品的色谱图。氟乙醛衍生物出峰时间为11.830min。氟尿嘧啶注射液中氟乙醛含量为3.3ppm。
实施例6
采用和实施例1相同的供试样品进行测试，不同之处在于:所用的配制乙酸-乙酸钠缓冲液pH值为5.5，柱温为35℃，进样量为18μL，流速为0.9mL/min，另外梯度洗脱的程序如下：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 58 | 42 |
| 15 | 20 | 80 |
| 20 | 20 | 80 |
| 21 | 58 | 42 |
| 30 | 58 | 42 |
。
图20为本实施例所测供试样品的色谱图。氟乙醛衍生物出峰时间为11.880min。氟尿嘧啶注射液中氟乙醛含量为3.4ppm。
实施例7
采用和实施例1相同的供试样品进行测试，不同之处在于柱温为25℃,进样量为22μL，流速为1.1mL/min,另外梯度洗脱的程序如下：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 62 | 38 |
| 15 | 20 | 80 |
| 20 | 20 | 80 |
| 21 | 62 | 38 |
| 30 | 62 | 38 |
。
图21为本实施例所测供试样品的色谱图。氟乙醛衍生物出峰时间为11.760min。氟尿嘧啶注射液中氟乙醛含量为3.3ppm。
对比例1
采用和实施例1所用的氟尿嘧啶注射液测试其中的氟乙醛，不同之处在于：
步骤一供试样品溶液制备
精密量取氟尿嘧啶注射液2ml及1ml乙酸，置同一20ml量瓶中，封口。置于水浴锅40℃反应40min，冷却至室温，用pH值为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液定容，摇匀，平行配制两份，进行衍生反应。
其余步骤与实施例1完全相同。结果发现，洗脱没有出现腙的特征峰。
对比例2
采用和实施例1相同的供试样品进行测试，不同之处在于采用等度洗脱，流动相为流动相A和流动相B的等体积混合液，图22为本实施例所测供试样品的色谱图。结果发现，腙的特征峰与前峰的分离度为2.18，与后峰的分离度为3.49，但有色谱峰没有洗脱出来。
对比例3
采用和实施例1相同的供试样品进行测试，不同之处在于采用等度洗脱，流动相为流动相A体积占比为40％和流动相B的体积占比为60％的混合液，图23为本实施例所测供试样品的色谱图。结果发现，腙的特征峰与前峰的无法分开，与后峰的分离度为4.28。
在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外以上所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。另外以上仅为本发明的部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (9)
1.一种检测氟尿嘧啶注射液中氟乙醛的方法，其特征在于，使用二硝基苯肼溶液衍生处理样品，采用高效液相色谱仪测定，包括以下步骤：
步骤一，衍生液的制备
配制pH值为4.5-5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液；将所述乙酸-乙酸钠缓冲液与二硝基苯肼溶液混合即得衍生液；
步骤二，供试样品溶液制备与测试
精密量取待测氟尿嘧啶注射液和所述衍生液置于同一量瓶中，加乙酸调pH值为3.0-3.5，封口，进行衍生反应；
所述衍生反应的条件如下：30-50℃反应20min－60min，冷却至室温，用所述乙酸-乙酸钠缓冲液定容；
采用反相高效液相色谱法检测所述供试样品溶液中的氟乙醛，色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填料，采用紫外检测器，检测波长350-360nm；流动相A为pH值为2.5的磷酸盐缓冲液，流动相B为乙腈；进样量为18μL-22μL，流速0.9-1.1mL/min；梯度洗脱。
2.如权利要求1所述的检测氟尿嘧啶注射液中氟乙醛的方法，其特征在于，色谱柱规格为4.6mm×250mm或4.6mm×150mm，填料直径5μm，所述色谱柱柱温为25-35℃，流动相的流速为0.9-1.1mL/min。
3.如权利要求2所述的检测氟尿嘧啶注射液中氟乙醛的方法，其特征在于，所述色谱柱柱温为30℃，所述流动相流速为1.0mL/min。
4.如权利要求1所述的检测氟尿嘧啶注射液中氟乙醛的方法，其特征在于，所述流动相A为pH值为2.5的磷酸盐缓冲液。
5.如权利要求1所述的检测氟尿嘧啶注射液中氟乙醛的方法，其特征在于，所述检测波长为355nm，进样量为20μL，流速1.0mL/min。
6.如权利要求1所述的检测氟尿嘧啶注射液中氟乙醛的方法，其特征在于，所述二硝基苯肼溶液为2,3-二硝基苯肼的乙腈溶液或2,4-二硝基苯肼的乙腈溶液。
7.如权利要求1所述的检测氟尿嘧啶注射液中氟乙醛的方法，其特征在于，所梯度洗脱程序为：
。
8.如权利要求1所述的检测氟尿嘧啶注射液中氟乙醛的方法，其特征在于，所梯度洗脱程序为：
。
9.如权利要求1所述的检测氟尿嘧啶注射液中氟乙醛的方法，其特征在于，所梯度洗脱程序为：
。
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