CN117209581A - 一种溪荪gai蛋白在植物矮化中的应用 - Google Patents
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种溪荪GAI蛋白在植物矮化中的应用。所述的溪荪GAI蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该基因在拟南芥中过表达之后能够使转基因拟南芥的植株矮化，对拟南芥株高产生了影响。本发明通过系统研究，提出了溪荪GAI蛋白在调控植物株高的生物学功能，作为一个优秀的基因资源，为园林植物矮化培育提供了一种新途径。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种溪荪GAI蛋白在植物矮化中的应用。
背景技术
溪荪(Iris sanguinea Donn ex Hornem.)是鸢尾科鸢尾属植物，其花型优美、花色艳丽，具有极高的观赏价值，广受人们喜爱，因此多应用于东北地区园林绿化中。目前对于溪荪的研究主要集中在抗逆性、繁殖技术及花色调控等方面。鸢尾属植物作为多年生草本植物，常用作观花和地被植物，但部分鸢尾属植物花后植株较高会出现倒伏现象使其观赏效果受到影响，植株矮化育种非常必要，为满足园林应用对鸢尾属植物株高的要求，开展基因工程株高育种十分必要。
植株高度作为观赏植物最明显的表型之一，有时通过株高的改变来提升植物观赏及应用价值。大量报道表明株高受到体内遗传机制和体外环境的双重调节。目前已知赤霉素(GA)是影响植物株高的主要植物激素之一，与GA相关的多个基因已被证实可以对多种植物的株高产生影响。例如：玉米(Zea mays)矮化突变体anther ear1(an1)和dwarf5(d5)形成是由于GA合成途径前期步骤存在缺陷；在水稻(Oryza sativa)中GA信号转导相关基因突变同样会导致植株出现矮化表型。
DELLA蛋白是GA信号传导途径中一个关键的负调控因子。GA通过诱导DELLA蛋白的泛素化和降解，解除DELLA蛋白的抑制，促进GA反应基因的表达。从溪荪转录组中选择GA信号转导相关的一个基因GAI，目前对于GAI基因的功能研究尚不深入，尚未有研究表明溪荪转录因子IsGAI与溪荪的植株矮化相关。
发明内容
本发明的目的在于提供一种溪荪GAI蛋白在植物矮化中的应用，本发明为园林植物植株矮化提供了一种新途径，对探究溪荪GAI蛋白的功能，揭示植物植株矮化形成机理具有重要意义，并为拟南芥植株的分子育种提供了重要参考。
本发明的目的之一在于提供一种溪荪GAI基因。
本发明的目的之二在于提供如所述溪荪GAI基因相关的生物材料。
本发明的目的之三在于获得含有溪荪GAI基因的拟南芥转化植株。
本发明的目的之四在于提供一种燕子花GAI蛋白在植株矮化中的应用。
本发明的目的将通过以下技术方案实现：
一种溪荪GAI蛋白，其特征在于，所述的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的溪荪GAI基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的溪荪GAI基因相关的生物材料，其特征在于，包括如下(A1)至(A3)中的任一种：
(A1)含有溪荪GAI基因的植物表达载体；
(A2)含有(A1)所述的植物表达载体的生物工程菌；
(A3)含有(A1)所述的植物表达载体的转基因植物。
所述的与溪荪GAI基因相关的生物材料，其特征在于：
所述的植物表达载体为GV1300-GFP。
所述的与溪荪GAI基因相关的生物材料，其特征在于：
所述生物工程菌为根癌农杆菌GV3101(唯地，中国)。
任一项所述的与溪荪GAI基因相关的生物材料在植物植株矮化中的应用；
所述的植物植株矮化的应用，其特征在于：
(B1)向受体植物导入上述溪荪GAI基因，得到转基因植物；
(B2)将上述溪荪GAI基因在受体植物中过量表达；
所述的将植物表达载体导入受体植物中的方法，其特征在于：
将含有溪荪GAI基因的植物表达载体通过花序侵染法转化植物组织，并将转化的植物组织培育成植株。
根据本发明的技术方案，其特征在于。所述受体植物为拟南芥。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明从溪荪的基部叶片中克隆出GAI基因，构建了GV1300-GAI-GFP植物表达载体，通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101，采用花序侵染法将GV1300-GAI-GFP植物表达载体转化拟南芥，结果发现GAI基因在拟南芥中过表达使得拟南芥植株矮化。
(2)转基因拟南芥植株矮化，说明溪荪GAI基因具有调控植物株高的功能。
(3)本发明提供的溪荪GAI基因可以作为一个优良的基因资源，可广泛应用到鸢尾属或其他花卉植物的遗传育种领域，对于观赏植物育种具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1显示为本发明中转溪荪GAI基因拟南芥的PCR鉴定电泳图，其中M为DL2000Maker，泳道1为GV1300-GAI-GFP重组质粒，泳道2-13为12个转基因拟南芥株系，泳道14为野生型拟南芥。
图2显示为本发明中野生型与转基因拟南芥的表型图，其中WT为野生型拟南芥，空载为转空载拟南芥，OE为转基因拟南芥。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种溪荪GAI蛋白在植物矮化中的应用。
实施例中相关培养基配制方法如下：
LB液体培养基(100mL)：0.5g酵母提取物+1g胰蛋白胨+1g氯化钠
LB固体培养基(100mL)：0.5g酵母提取物+1g胰蛋白胨+1g氯化钠+1.5g琼脂
YEP液体培养基(100mL)：1g酵母提取物+1g胰蛋白胨+0.5g氯化钠
YEP固体培养基(100mL)：1g酵母提取物+1g胰蛋白胨+0.5g氯化钠+1.5g琼脂
本实施例具体试验方案如下：
实施例1基因克隆
用于溪荪GAI基因克隆的特异性引物序列如下：
GAI-F1：5’-ATCAATCAGCCCATGAAGCGGGAGCAT-3’
GAI-R1：5’-TTAAACCGGTCCGGATTACTCAGTGGT-3’
以溪荪叶片cDNA为模板，配制50μL的PCR反应体系，其中包括2μL模板cDNA，25μL 2×PCR buffer for KOD FX，10μL 2mM dNTPs，上下游引物各1μL，1μL KOD FX和10μLddH2O，加样操作在冰上进行，加完之后混匀并离心。
PCR反应程序为：95℃5min；95℃30s，58℃45s，72℃90s，循环35次；72℃10min。
经PCR扩增，得到扩增产物；扩增产物连接到克隆载体pEASY-Blunt-Zero(全式金，中国)上，转化大肠杆菌DH5α并涂布在含有100mg/L Amp抗性的LB固体上，在37℃培养箱中倒置培养10-12h，挑取单克隆菌株进行菌液PCR鉴定，将阳性克隆在含有100mg/L Amp抗性的LB液体培养基中扩大培养10mL，之后送至生物公司测序。
获得溪荪GAI基因的核苷酸序列如下所示：
ATGAAGCGGGAGCATCAAGAGTCCACTTCTGCCGGCGGCGGCTTCCAGCCGACGCCGACGAT GGCCAAAAGAAAGCTAGAAGAGGACAGCCAGGACGCCGGAGTCGACGAGCTGCTCGCTACGCTCGGATACAAGGTCCGGTCCTCCGACATGGCCGACGTAGCTCAGAAGCTGGAGCAGCTGGACATGGCCATGGCCATGGGGGGGACCACCAACGTCATCGGCCACGACGACGCCATCCTCTCCCACCTGGCTCACGACACCGTCCACTACAACCCCTCCGATCTCTCCACCTGGCTCGAGAACATGCTCTCCGAGATCAACGCCCCTCCCCTCCCACTTCCTCCTCCCCCCACCCCCACCCCCACTTTCCAATTTAATTCATCTCCGGATCCGAGAAAGAAGATGAGGACATCCCCATCCTCATCCTCATCCTCACTCCAACCACCACCAATTCCTATGGTGGTTGCAGACCCTCAGGAAACCGGGGTACTTCTAGTCCACACTCTCATGGCGTGCGCGGAGTCGATCGAGCAAGGGAACCACGCCGCCGCCGGCTCGCTGCTGAAGCAGGTCCCCTTCCTCGCCGCGTCGCAGGCCGGCGCGATGCGGAAGGTCGCCGGCTACTTCGCCGAGGCGCTCGGCCGCCGTATCTACAACTCCGATCTAGACTCCACCTGCTTCTCCTCCTTCTCCGACGTCCTCCAGATGCACTTCTACGAGAGCTGCCCCTACCTCAAATTCGCCCACTTCACCGCCAACCAAGCCATCCTCGACTCCTTCTCCGGCTGCCGCAAGGTCCACGTGATCGACTTCGGCGTGAAGCAGGGGATGCAGTGGCCCGCGCTGATGCAGGCGCTGGCGCTCCGTCCGGGCGGGCCCCCTTCGTTCCGCCTGACCGGCATCGGCCCAGACAGCTCCGTCGACGCGCTGCGGCAGGTCGGGCCGAAGCTGGCCCAGCTGGCCGACACGATCCACATCGAGTTCGAGTACCGCGGGCTCGTCGTCAATTCACTGGCCGATCTGGAGCCGTCGTCTCTTCTCGGACTAGGCGAGGAGGACGAGGCGGTCGCGGTGAACTCGGTGTTGGAGCTGCACAGGCTGCTGGCTCAAGATTCGGCGGTAGAGAAGGCGTTGGATGCTGTCAGGGCGATCAAGCCGACGATCTTTACGATGGTGGAGCAGGAGGCGAACCACAATGCCGGGAGGTTCTCGGAGCGGTTCAATGAGGCGCTGCATTACTACTCGACGATGTTCGACTCGATCGAAGGAGGAGGGAGCGAGGAGGAGGAGGAGCAGGTGATGACGGAGATGTACTTGGGGCGGGAGATATGCAATGTGGTGGCGTGCGAGGGGATGGAGAGGACGGAGAGGCACGAGACGGCGGCGCAGTGGAAGGGGAGGATGGTGCGGGCCGGGTTCGAGCCGGTGTGTCTCGGCTCGAACGCGTTCAAGCAGGCGAGCATGCTGCTCGCACTCTTCGCCGGCGGGGACGGGTACAGAGTGGAGGAGAAGGACGGGTGCTTGACGCTTGGGTGGCACGCTAGGCCGCTGATCGCCACGTCGGCGTGGCGGCTGGCCGACCACTGA
溪荪GAI基因的ORF区包含1590个碱基，编码529个氨基酸，氨基酸序列如下所示：
MKREHQESTSAGGGFQPTPTMAKRKLEEDSQDAGVDELLATLGYKVRSSDMADVAQKLEQLDM AMAMGGTTNVIGHDDAILSHLAHDTVHYNPSDLSTWLENMLSEINAPPLPLPPPPTPTPTFQFNSSPDPRKKMRTSPSSSSSSLQPPPIPMVVADPQETGVLLVHTLMACAESIEQGNHAAAGSLLKQVPFLAASQAGAMRKVAGYFAEALGRRIYNSDLDSTCFSSFSDVLQMHFYESCPYLKFAHFTANQAILDSFSGCRKVHVIDFGVKQGMQWPALMQALALRPGGPPSFRLTGIGPDSSVDALRQVGPKLAQLADTIHIEFEYRGLVVNSLADLEPSSLLGLGEEDEAVAVNSVLELHRLLAQDSAVEKALDAVRAIKPTIFTMVEQEANHNAGRFSERFNEALHYYSTMFDSIEGGGSEEEEEQVMTEMYLGREICNVVACEGMERTERHETAAQWKGRMVRAGFEPVCLGSNAFKQASMLLALFAGGDGYRVEEKDGCLTLGWHARPLIATSAWRLADH
实施例2植物表达载体构建
(1)利用同源重组的方法，设计分别带有Sal I和BamH I酶切位点的载体同源臂引物，以连接克隆载体的GAI质粒为模板，扩增带有GV1300载体同源臂的溪荪GAI基因，回收目的片段。载体同源臂引物(下划线部分为Sal I和BamH I酶切位点)序列如下：
GAI-F2：5’-TTGATACATATGCCCGTCGACATGAAGCGGGAGCATCAAGAG-3’
GAI-R2：5’-CCCTTGCTCACCATGGATCCGTGGTCGGCCAGCCGCCAC-3’
(2)用Sal I和BamH I限制性内切酶酶切表达载体GV1300-GFP质粒，回收载体片段，将线性化载体与加了载体同源臂的GAI基因片段连接，转化大肠杆菌感受态DH5α并涂布在含有100mg/L Amp抗性的LB固体上，在37℃培养箱中倒置培养10-12h，挑取单克隆菌株进行菌液PCR鉴定，验证引物序列如下：
GV1300-F1：5’-AACTTGTGGCCGTTTACGTCG-3’
GV1300-R1：5’-TTTGGAGAGAACACGGGGGAC-3’
将阳性克隆在含有100mg/L Amp抗性的LB液体培养基中扩大培养10mL，之后送至生物公司测序。载体构建采用ClonExpress IIOne Step Cloning Kit(诺唯赞，中国)同源重组试剂盒，按照说明书进行。
实例3遗传转化拟南芥
一、拟南芥的培养
在超净工作台中，将适量野生型拟南芥种子(哥伦比亚型Col-0)置于1.5mL离心管，加入0.8％的次氯酸钠溶液(西陇)消毒杀菌10min，无菌水振荡清洗5次。用移液器将消毒后的野生型拟南芥种子均匀点播在1/2MS固体培养基上，置于4℃冰箱黑暗条件下春化2-3d，随后置于植物培养室中培养。7d后将已萌发的拟南芥幼苗移栽入装有栽培基质(泥炭土：蛭石：珍珠岩按6:2:1混合并经高温高压灭菌处理)的花盆中，置于植物培养室继续培养3周，待拟南芥抽花葶并产生较多花苞时准备进行遗传转化。植物培养室环境条件为：16h光照/8h黑暗，20-22℃。
二、生物工程菌的制备
(1)转化农杆菌，农杆菌感受态为GV3101(唯地，中国)，转化步骤参照说明书。
(2)在转化平板上挑取单菌落至10mL含有50mg/L Kana和50mg/L Rif的YEP液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养12-14h；
(3)吸取1mL菌液加入到50mL含有50mg/L Kana和50mg/L Rif的YEP(或者LB)液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养，直至OD600达到0.6-0.8；
(4)将培养好的菌液5000rpm离心10min，弃去上清液，在无菌状态下用等体积(50mL)的含有5％蔗糖和3％silwet-77的侵染液(pH5.8)重悬菌体，重悬液置于冰上，待侵染拟南芥用。
三、侵染拟南芥
(1)预培养：取待转化的拟南芥植株，以花苞露白为标准，将已开放的花朵去除。
(2)侵染：将待转化的拟南芥花葶浸泡在侵染液中1min，随后用不透光黑色塑料袋罩光24h后揭开，在植物培养室中培养，同时设置未经农杆菌侵染的拟南芥作为阴性对照；
(3)提取转基因拟南芥植株的DNA，采用GAI同源臂引物进行PCR鉴定，获得转基因阳性拟南芥植株。
四、结果与分析
转基因阳性拟南芥植株的鉴定
对获得的12株转基因拟南芥植株进行DNA的提取，用同源臂引物(GAI-F2和GAI-R2)进行PCR鉴定，其中野生型拟南芥为阴性对照，GV1300-GAI-GFP重组质粒为阳性对照，结果有11个转基因拟南芥株系含有目的条带，1个转基因拟南芥株系不含有目的条带，这说明GAI基因已经成功插入到11个含有目的片段的拟南芥基因组中(图1)。
转基因阳性拟南芥植株的株高表型观察
通过对野生型拟南芥、转空载体拟南芥和转基因拟南芥植株的株高进行对比观察发现(图2)，野生型拟南芥及转空载体拟南芥株高无显著差异，相较于对照，过表达IsGAI基因拟南芥植株高度显著降低，3个转基因株系的植株高度与转空载体拟南芥相比分别减少27.73％、22.49％、18.56％，表明IsGAI基因过表达能够对拟南芥株高的增长起抑制作用。
Claims (9)
1.一种溪荪GAI蛋白，其特征在于，所述的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
2.与权利要求1所述的溪荪GAI基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。
3.与权利要求1所述的溪荪GAI基因相关的生物材料，其特征在于，包括如下(A1)至(A3)中的任一种：
(A1)含有溪荪GAI基因的植物表达载体；
(A2)含有(A1)所述的植物表达载体的生物工程菌；
(A3)含有(A1)所述的植物表达载体的转基因植物。
4.根据权利要求3所述的与溪荪GAI基因相关的生物材料，其特征在于：
所述的植物表达载体为GV1300-GFP。
5.根据权利要求3所述的与溪荪GAI基因相关的生物材料，其特征在于：
所述生物工程菌为根癌农杆菌GV3101。
6.权利要求3～5任一项所述的与溪荪GAI基因相关的生物材料在调控植物株高矮化中的应用。
7.根据权利要求5所述的调控植物株高矮化的方法，其特征在于：
(B1)向受体植物中导入上述溪荪GAI基因，得到转基因植物；
(B2)将上述溪荪GAI基因在受体植物中过量表达。
8.根据权利要求7所述的将植物表达载体导入受体植物中的方法，其特征在于：
将含有溪荪GAI基因的植物表达载体通过农杆菌介导的方法转化植物组织，并将转化的植物组织培育成植株。
9.根据权利要求3所述生物材料或权利要求6所述的用途或权利要求7任一项所述的方法，其特征在于：
所述受体植物为拟南芥。
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