CN117205127A

CN117205127A - 白花前胡活性成分的提取方法及应用

Info

Publication number: CN117205127A
Application number: CN202311414231.2A
Authority: CN
Inventors: 刘忠; 陈剑晖; 王浩宇; 徐加明
Original assignee: Shenzhen Yusu Biotechnology Co ltd; Jinan University
Current assignee: Shenzhen Yusu Biotechnology Co ltd; Jinan University
Priority date: 2023-10-27
Filing date: 2023-10-27
Publication date: 2023-12-12

Abstract

本发明提供白花前胡活性成分的提取方法及应用，提取方法包括:将白花前胡根粉以95％乙醇渗漉提取，再浓缩至浸膏，水溶后上样D101大孔树脂柱，依次以水，40％，60％，95％乙醇及丙酮洗脱，弃去水液，收集40％乙醇和60％乙醇洗脱部分，浓缩至浸膏后依次进行硅胶柱色谱和ODS柱色谱层析，分离获得白花前胡活性成分。本发明通过对白花前胡活性成分进行研究，证实其中的白花前胡甲素、白花前胡丁素和白花前胡E素具有促进炎症相关基因表达的作用，还能有效抑制透明质酸酶活性，含有较好的组胺含量，有明显的抗敏舒缓功效，因而具有开发成抗敏舒缓化妆品的前景，如抗敏舒缓爽肤水、抗敏舒缓修复霜等。

Description

白花前胡活性成分的提取方法及应用

技术领域

本发明涉及化妆品技术领域，具体涉及白花前胡活性成分的提取方法及应用。

背景技术

近年来随着化妆品消费量的快速提升，以及气候变暖、环境污染、工作生活压力增大等多种因素，致使很多消费者皮肤角质层纷纷受损，皮肤屏障功能遭到破坏，轻则会产生干痒、刺痛、红肿、泛红等皮肤症状，重则会因炎症因子产生机体性破坏，诱发一系列炎症疾病，难以治愈，皮肤健康状况越来越备受关注，使用“绿色”、“安全”、且具有抗敏舒缓功效的纯天然化妆品原料是有效缓解这些皮肤状况的首要选择。

白花前胡(Peucedanum praeruptorum Dunn)又叫鸡脚前胡、官前胡、山独活等，是中药前胡的一种。白花前胡是生活中比较常见的中药材，它的用药部位主要是白花前胡的根部，在解热、祛痰、治感冒咳嗽、支气管炎及疖肿具有很好的效果，其化学成分主要为香豆素类及挥发油类、菲醌类、有机酸、甾醇类等有机化合物。。

本发明进一步研究了白花前胡中的白花前胡甲素、白花前胡丁素和白花前胡素E这三种活性成分在美容方面的功效，证实白花前胡提取物可有效缓解干痒、刺痛、红肿、泛红等皮肤症状，修护皮肤的屏障功能，使皮肤恢复健康状态。

发明内容

本发明的目的在于提供白花前胡活性成分的提取方法及应用，证实白花前胡活性成分中的白花前胡甲素、白花前胡丁素和白花前胡E素具有抗敏、舒缓功效，具有开发成抗敏舒缓作用产品的良好前景。

为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：

第一方面，本发明提供白花前胡活性成分的提取方法，包括:将白花前胡根粉以95％乙醇渗漉提取，再浓缩至浸膏，水溶后上样D101大孔树脂柱，依次以水，40％，60％，95％乙醇及丙酮洗脱，弃去水液，收集40％乙醇和60％乙醇洗脱部分，浓缩至浸膏后依次进行硅胶柱色谱和ODS柱色谱层析，分离获得白花前胡活性成分。

优选地，所述白花前胡活性成分至少包括白花前胡甲素、白花前胡丁素、白花前胡素E中的至少一种。

第二方面，本发明提供所述的提取方法获得的白花前胡活性成分在制备美容组合物上的应用。

第三方面，本发明提供一种美容组合物，包括白花前胡活性成分，所述白花前胡活性成分在所述美容组合物中的质量含量为1～10％，优选为2.5～10％；所述白花前胡活性成分至少包括白花前胡甲素、白花前胡丁素、白花前胡素E中的至少一种。

优选地，所述白花前胡活性成分至少包括白花前胡甲素、白花前胡丁素、白花前胡素E中的至少两种；进一步优选地，所述白花前胡活性成分包括白花前胡丁素与花前胡甲素、白花前胡素E中的至少一种。

进一步优选地，所述美容组合中含有白花前胡甲素、白花前胡丁素和白花前胡素E，所述白花前胡甲素、所述白花前胡丁素和所述白花前胡素E的质量比为1～2:1～3:1～3。

第四方面，本发明提供所述的美容组合物在制备具有抗敏舒缓作用的产品上的应用。

优选地，所述具有抗敏舒缓作用的产品为化妆品、保健品或者药物。

第五方面，本发明提供具有抗敏舒缓作用的产品，包括所述的美容组合物。

本发明通过对白花前胡活性成分进行研究，证实其中的白花前胡甲素、白花前胡丁素和白花前胡E素具有促进炎症相关基因表达的作用，还能有效抑制透明质酸酶活性，含有较好的组胺含量，有明显的抗敏舒缓功效，因而具有开发成抗敏舒缓化妆品的前景，如抗敏舒缓爽肤水、抗敏舒缓修复霜等。

附图说明

图1是本发明实施例1-4和对比例1-5中不同浓度样品对Raw264.7细胞毒性的影响；

图2是本发明实施例1-4和对比例1-5中提取物样品与COX-2基因相对表达量的关系图；

图3是本发明实施例1-4和对比例1-5中提取物样品与IL-1α基因相对表达量的关系图；

图4是本发明实施例1-4和对比例1-5中提取物样品与NOS2基因相对表达量的关系图；

图5是本发明实施例1-4和对比例1-5中提取物样品与IL-1β基因相对表达量的关系图；

图6是本发明实施例1-4和对比例1-5中提取物样品与IL-6基因相对表达量的关系图；

图7是本发明实施例1-4和对比例1-5中提取物样品对透明质酸酶活性抑制的影响；

图8是本发明实施例1-4和对比例1-5中不同浓度样品对RBL-2H3细胞活性的影响；

图9是本发明实施例1-4和对比例1-5中不同浓度样品中组胺的含量关系图。

具体实施方式

在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

称取白花前胡根粉10kg,以95％乙醇渗漉提取，然后再浓缩至浸膏，以水溶解，上样D101大孔树脂柱，依次以水，40％，60％，95％乙醇及丙酮洗脱，弃去水液，收集40％乙醇和60％乙醇洗脱部分，浓缩至浸膏后依次进行硅胶柱色谱和ODS柱色谱层析，先后得到的化合物经鉴定分别为白花前胡甲素、白花前胡丁素、白花前胡素E等。

实施例1

为测定白花前胡中三种功效成分中不同成分比例的功效效果，将白花前胡甲素、白花前胡丁素和白花前胡E素按照不同添加比例进行混合，形成一种白花前胡素混合液，用于测定白花前胡的功效。

具体地，本实施例将白花前胡中提取出的白花前胡甲素、白花前胡丁素和白花前胡E素按照质量比1:3:2形成混合液，溶剂为DMEM完全培养基，活性成分在其中的浓度分别为10、30和20mg/L，共形成10mL混合液，并测其功效。

实施例2

本实施例将白花前胡中提取出的白花前胡甲素、白花前胡丁素和白花前胡E素按照比例1:2:3形成混合液，溶剂为DMEM完全培养基，前述活性成分在其中的浓度分别为10、20和30mg/L，共形成10mL混合液，并测其功效。

实施例3

本实施例将白花前胡中提取出的白花前胡甲素、白花前胡丁素和白花前胡E素按照比例2:3:1形成混合液，溶剂为DMEM完全培养基，前述活性成分在其中的浓度分别为20、30和10mg/L，共形成10mL混合液，并测其功效。

实施例4

本实施例将白花前胡中提取出的白花前胡甲素、白花前胡丁素和白花前胡E素按照比例1:1:1形成混合液，溶剂为DMEM完全培养基，前述活性成分在其中的浓度均为20mg/L，共形成10mL混合液，并测其功效。

对比例1

本对比例将白花前胡中提取出的白花前胡丁素和白花前胡E素按照比例1:2形成混合液，溶剂为DMEM完全培养基，前述活性成分在其中的浓度分别为20和40mg/L，共形成10mL混合液，并测其功效。

对比例2

本对比例将白花前胡中提取出的白花前胡丁素和白花前胡E素按照比例2:1形成混合液，溶剂为DMEM完全培养基，前述活性成分在其中的浓度分别为40和20mg/L，共形成10mL混合液，并测其功效。

对比例3

本对比例只测白花前胡中提取出的白花前胡甲素的功效，同样，溶剂为DMEM完全培养基，活性成分在其中的浓度分别为60mg/L，共形成10mL混合液。

对比例4

本对比例只测白花前胡中提取出的白花前胡丁素的功效，同样，溶剂为DMEM完全培养基，活性成分在其中的浓度分别为60mg/L，共形成10mL混合液。

对比例5

本对比例只测白花前胡中提取出的白花前胡E素的功效，同样，溶剂为DMEM完全培养基，活性成分在其中的浓度分别为60mg/L，共形成10mL混合液。

功效测试

对实施例1-4以及对比例1-5进行如下功效测试，具体如下：

S1，RAW264.7小鼠巨噬细胞外基质安全浓度测定；

1.实验试剂

RAW264.7小鼠巨噬细胞为实验室冻存，复苏后使用。

测试样品为白花前胡提取物，包括白花前胡甲素、白花前胡丁素和白花前胡E素。

各种化学试剂为常规试剂。

2.实验方法

(1)细胞培养

将RAW264.7小鼠巨噬细胞用含有10％胎牛血清和1％双抗的DMEM完全培养基在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养，待细胞长满培养瓶瓶底后，消化、传代。

(2)作用浓度选择

采用CCK-8法筛选出对RAW264.7小鼠巨噬细胞无明显增殖抑制作用的浓度，方法为：

取对数生长期的RAW264.7小鼠巨噬细胞，消化后用用含有10％胎牛血清和1％双抗的DMEM完全培养基制成细胞悬液，细胞浓度为1×10⁶/mL，接种于96孔板，每孔100μL，在37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养。适应性培养24h后，药物组更换为含有不同总的终浓度白花前胡甲素、白花前胡丁素和白花前胡E素的DMEM完全培养基培养，同时设置不加药培养的细胞为空白对照组。继续培养6h后每孔加入10μL CCK-8溶液孵育2h，测定各孔450nm和630nm波长下OD值，根据计算公式计算不同药物浓度对细胞的活率。每个浓度3个复孔。

(3)实验结果

受检样品对RAW264.7小鼠巨噬细胞活率：

＝(As450-As630)/(A₀450-A₀630)×100％

注：As为实验组波长值，A₀为空白组波长值

根据结果筛选出受检样品的安全浓度，进行后续实验。

进一步地，下表1为不同浓度样品对Raw264.7细胞毒性的影响对比

表1 Raw264.7细胞毒性结果

由表1及图1可知，本发明实施例1-4及对比例1-5中的所测定的5％体积分数浓度下促进作用最强，在10％体积分数浓度下，对RAW264.7细胞活率促进作用略有下降，在所测浓度范围内对Raw264.7细胞的毒性极小或无毒性，并且实施例的结果整体优于对比例的结果。此外，单纯从对比例1-5的结果来看，活性成分中含有白花前胡丁素的对比例较比不含有白花前胡丁素的对比例效果更好。

S2，LPS诱导RAW264.7细胞炎症相关基因表达量；

具体地，取对数生长期的RAW264.7小鼠巨噬细胞，消化后用含有10％胎牛血清和1％双抗的DMEM完全培养基制成细胞悬液，细胞浓度为1×10⁶/mL，接种于6孔板，每孔2mL，在37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养。适应性培养16h后，药物组更换为安全浓度下含有白花前胡甲素、白花前胡丁素和白花前胡E素的DMEM完全培养基培养，同时设置浓度为160μM的DXM储存液为阳性对照，两组不加药培养的细胞一组为空白对照组，一组为模型组；各组每孔加入1mL，孵育1h后向模型组、样品组和阳性对照每孔加入1mL浓度为800ng/mL LPS工作液，空白对照组加入1mL基础培养基。继续孵育6h。

进一步地，6h后，将6孔细胞培养板从培养箱中取出，参照《TRNzol Universal总RNA提取试剂》说明书提取细胞RNA。再取合成DNA酶，按照比例与RNA产物混匀，利用PCR仪进行cDNA合成。cDNA具体操作流程如表2所示。

表2 cDNA操作流程

进一步地，用1％的琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物验证，确认相关基因是否存在或表达。

进一步地，将cDNA用RNase-Free ddH2O稀释10倍作为模板使用，取相关表达基因上、下引物。

炎症相关基因COX-2、IL-1α、NOS2、IL-1β、IL-6

COX-2上游引物：ATTCCAAACCAGCAGACTCATA(SEQ_1)，下游引物：CTTGAGTTTGAAGTGGTAACCG(SEQ_2)；

IL-1α上游引物：CGCTTGAGTCGGCAAAGAAAT(SEQ_3)，下游引物：AGATGGTCAATGGCAGAACTGT(SEQ_4)；

上游引物：

IL-1β上游引物：GAACTGTGAACTGTGAACTGT(SEQ_5)，下游引物：CAAGTGCAAGGCTATGACCA(SEQ_6)；

IL-6上游引物：ATGGGCCTAATTGGCCGGAT(SEQ_7)，下游引物：CCATTGCACAACTCTTTTCTCA(SEQ_8)；

内参基因GAPDH上游引物：TGCACCACCAACTGCTTAGC(SEQ_9)，下游引物：GGCATGGACTGTGGTCATGAG(SEQ_10)；

将酶液、上引物、下引物按5μL:0.5μL:0.5μL进行混合，再在96孔板中依次加入4μLcDNA和6μL预混液，按照下表3步骤进行qPCR反应。

表3 qPCR反应流程

5.qPCR实验结果

数据处理公式(采用2^-ΔΔCT法)：

A＝2^(Cq_内参-Cq_基因)：其中A代表空白对照的基因表达量，Cq为原始数值。

B＝2^(Cq_内参-Cq_基因)；其中B代表检测样品的基因表达量，Cq为原始数值。

样品基因相对表达量＝B平均值/A平均值*100％

以受检样品为横坐标，基因相对表达量为纵坐标，采用数据处理软件(prism)进行数据分析，得图并得出标准偏差，具体试验结果参见图2-6。

根据结果得出，实施例1中的基因表达量最高，从对比例中可看出，三种成分混合的功效比单一成分或其两种成分的基因表达量高，根据实施例1中的比例混合的混合液有显著的抗敏抗敏功效。

S3，透明质酸酶活性抑制实验；

1.实验试剂

分析纯(Tris)，0.1mol/L HCl，NaOH，牛血清白蛋白，透明质酸钠，透明质酸酶，氯化钠，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，醋酸钠，乙酸等常规试剂。

2.实验方法

将所测样品按2倍稀释倍数稀释6个浓度，待测。准备96孔板，将测试样品分为有酶反应的实验组和无酶的空白对照组。将加入各浓度样品40μL，同时设置缓冲液40μL为空白对照，40μL 10mg/mL甘草酸二钾溶液为阳性对照，实验组加入20μL酶溶液，室温振荡10min后，同时加入20μL透明质酸溶液，室温孵育45min，加入酸性白蛋白溶液200μL后室温孵育10min以上，混匀置于酶标仪中检测OD₆₀₀。

进一步地，透明质酸酶活性抑制率计算公式：

抑制率％＝A(实验组)/A(空白对照)×100％

3.实验结果如图7，由图可知，根据实施例1混合的白花前胡甲素、白花前胡丁素和白花前胡E素混合液抑制率高，抑制效果最显著，其实施例和对比例也表明其成分都能有效抑制透明质酸酶的活性，对比例1相对于其他对比例能更有效抑制透明质酸酶活性，从结果可表明，白花前胡甲素、白花前胡丁素和白花前胡E素具有明显抑制透明质酸酶活性的作用，能有效起到抗过敏、舒缓的功效。

S4，组胺抑制实验；

1.实验试剂

RBL-2H3细胞、RBL-2H3细胞专用培养基、台氏液。

各种化学试剂为常规试剂。

2.实验方法

(1)细胞培养

将RBL-2H3细胞用RBL-2H3细胞专用培养基在37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养，待细胞长满培养瓶瓶底后，消化、传代。

(2)细胞活性试验

采用CCK-8法检测出受检样品对RBL-2H3细胞活性的影响，方法为：

取对数生长期的RBL-2H3细胞，消化后用RBL-2H3细胞专用培养基制成细胞悬液，细胞浓度为3×10⁵/mL，接种于96孔板，每孔100μL，在37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养。适应性培养24h后，药物组更换为含有不同浓度白花前胡甲素、白花前胡丁素和白花前胡E素的台氏液培养，同时设置不加药培养的细胞为空白对照组，50μM地塞米松为阳性对照。继续培养45min后每孔加入10μL CCK-8溶液，测定各孔450nm和630nm波长下OD值，根据计算公式计算不同药物浓度对细胞的活率。每个浓度3个复孔。

(3)细胞组胺释放量试验

取对数生长期的RBL-2H3细胞，消化后用RBL-2H3细胞专用培养基制成细胞悬液，细胞浓度为3×10⁵/mL，接种于96孔板，每孔100μL，在37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养。适应性培养24h后，药物组更换为含有不同浓度白花前胡甲素、白花前胡丁素和白花前胡E素的样品和，Compound 48/80的台氏液进行孵育，45min后吸取上清，用ELISA试剂盒定量检测上清中组胺的含量，得出受检样品对组胺释放量的影响。

3.实验结果如表4所示：

表4 RBL-2H3细胞活率

由表4和图8可知，本发明实施例1-4和对比例1-5中的白花前胡甲素、白花前胡丁素、白花前胡E素在一定浓度下(2.5％-5％)，对RBL-2H3细胞活率均有明显促进作用，在高浓度下有抑制性，说明其成分在一定浓度范围内对细胞增殖有明显促进作用，其中实施例1的细胞增殖促进作用最明显，三种混合液相对于单个成分或两个成分组成的混合液细胞活性更好。

由图9可知，本发明实施例1-4和对比例1-5中的都含有组胺成分，实施例1中的组胺成分最高，相对于其他实施例和对比例有更好的舒缓作用。

综上所述，以上结果表明，白花前胡甲素、白花前胡丁素和白花前胡E素具有促进炎症相关基因表达的作用，还能有效抑制透明质酸酶活性，含有较好的组胺含量，有明显的抗敏舒缓功效，因而具有开发成抗敏舒缓化妆品的前景，如抗敏舒缓爽肤水、抗敏舒缓修复霜等。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.白花前胡活性成分的提取方法，其特征在于，包括:将白花前胡根粉以95％乙醇渗漉提取，再浓缩至浸膏，水溶后上样D101大孔树脂柱，依次以水，40％，60％，95％乙醇及丙酮洗脱，弃去水液，收集40％乙醇和60％乙醇洗脱部分，浓缩至浸膏后依次进行硅胶柱色谱和ODS柱色谱层析，分离获得白花前胡活性成分。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述白花前胡活性成分至少包括白花前胡甲素、白花前胡丁素、白花前胡素E中的至少一种。

3.权利要求1或2所述的提取方法获得的白花前胡活性成分在制备美容组合物上的应用。

4.一种美容组合物，包括白花前胡活性成分，所述白花前胡活性成分在所述美容组合物中的质量含量为1～10％，优选为2.5～10％；所述白花前胡活性成分至少包括白花前胡甲素、白花前胡丁素、白花前胡素E中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的美容组合物，其特征在于：所述白花前胡活性成分至少包括白花前胡甲素、白花前胡丁素、白花前胡素E中的至少两种；优选地，所述白花前胡活性成分包括白花前胡丁素与花前胡甲素、白花前胡素E中的至少一种。

6.根据权利要求4或5所述的美容组合物，其特征在于：所述美容组合中含有白花前胡甲素、白花前胡丁素和白花前胡素E，所述白花前胡甲素、所述白花前胡丁素和所述白花前胡素E的质量比为1～2:1～3:1～3。

7.权利要求4～6任一项所述的美容组合物在制备具有抗敏舒缓作用的产品上的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述具有抗敏舒缓作用的产品为化妆品、保健品或者药物。

9.具有抗敏舒缓作用的产品，包括权利要求4～6任一项所述的美容组合物。