CN111281908A - 一种抗湿疹的中药提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗湿疹的中药提取物及其制备方法和应用。所述制备方法包括如下步骤：(1)将原料肉苁蓉和人参用茯苓菌进行微生物转化；(2)将步骤(1)所得的微生物转化物质用醇的水溶液提取，得到所述中药提取物。所述制备方法操作步骤简单，提供中药的合理配伍以及微生物转化，所得中药组合物毒副作用较小，且能够有效地阻断CaN‑NF‑AT通路，并抑制IL‑8表达水平，达到治疗湿疹等炎症和自身免疫性疾病的目的。

Description

一种抗湿疹的中药提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于中药制备领域，具体涉及一种中药提取物及其制备方法和应用，尤其涉及一种抗湿疹的中药提取物及其制备方法和应用。
背景技术
钙调磷酸酶(caleineurin，CaN)又称蛋白磷酸酶2B(PP2B)，属丝/苏氨酸蛋白磷酸酶家族成员，是迄今发现的唯一受Ca2+/钙调素(CaM)调节的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶，CaN能够使底物脱磷酸。在T细胞中，Ca2+内流，细胞内Ca2+浓度增加，Ca2+同CaM与CaN结合，激活CaN，活化的CaN使其底物NF-AT脱磷酸，入核，引起IL-2等一些列细胞因子的表达。CaN-NF-AT通路在T细胞活化中起着调节枢纽的作用。
钙调神经磷酸酶抑制剂(CNIs)目前是临床上最有效的免疫抑制剂药物，可用于器官移植，控制移植物排斥反应、自身免疫性疾病(如RA、CD、银屑病等)的治疗，特别是其近年来用于湿疹，并取得良好治疗效果。钙调磷酸酶抑制剂作为一种免疫抑制剂，分为外源性抑制剂和内源性蛋白质抑制剂。外源性抑制剂主要有环孢素、他克莫司等，内源性蛋白质抑制剂主要有Cain、FKBP38等。
目前，临床应用最多的是子囊霉素衍生物环孢素A、他克莫司和匹美克莫司，都具有相似的理化性质、作用机制和作用效果，但其毒副作用(如肾毒性，高血糖等)成为该类抑制剂应用的重要障碍。因此，以CaN-NF-AT通路为作用靶标寻找更加安全有效的抑制剂对治疗皮肤炎症具有重要意义。
皮肤屏障的破坏可能是基因或者是环境因素引起。在外源性特应性皮炎的初始阶段，破坏的皮肤屏障使得过敏原能够进入皮肤，并且受损的角质细胞能够产生细胞因子(例如TSLP、IL-25、IL-33)。研究表明，特应性皮炎患者的血浆中可以检测到白介素8(IL-8)，并且重度特应性皮炎患者的浓度大于轻度及中度患者，经改善后的特应性皮炎患者血浆中IL-8浓度下降。而TLR3配体poly(I:C)是IL-8，IL-6和TNFα分泌最有效的刺激物，poly(I:C)也可以通过和TLR3受体结合能够诱导NHEKs细胞表达TSLP。已有证据表明促炎因子和Th2细胞因子能够协同诱导IL-8的蛋白表达水平。通过抑制IL-8的表达，能够有效抑制湿疹的临床症状。
中药作为我国的传统用药，在临床上中药在湿疹等炎症和自身免疫性疾病的治疗中具有较好的效果。现代研究发现，某些中药单体成分能直接与CaN结合并抑制其活性，如槲皮素、山奈酚、酚醛棉酚等；同时，某些中药有效成分能在细胞水平有效抑制CaN-NF-AT通路的活化，抑制Th1和Th2型细胞因子的表达，抑制T细胞的活化，如虫草素、杜鹃素、非瑟酮等。
因此，开发一种以CaN-NF-AT通路为作用靶标，毒副作用较小的新型中药复合物对于治疗湿疹具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗湿疹的中药提取物及其制备方法和应用，所述中药提取物能够阻断CaN-NF-AT通路，达到治疗湿疹的目的，且毒副作用较小。
为达此目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种抗湿疹的中药提取物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将原料肉苁蓉和人参用茯苓菌进行微生物转化，得到微生物转化物质；
(2)将步骤(1)所得的微生物转化物质用醇的水溶液提取，得到所述中药提取物。
本发明中以肉苁蓉和人参作为制备原料，经过茯苓菌的生物转化，通过中药合理的复方配伍，制备得到的中药组合物能够有效地阻断CaN-NF-AT通路，并抑制IL-8表达水平，达到治疗湿疹等炎症和自身免疫性疾病的目的。同时，所得中药组合物能够克服了西药制剂的安全性问题。
作为本发明优选的技术方案，步骤(1)所述肉苁蓉与人参的质量比为1:(0.5-2)，例如可以是1:0.5、1:0.8、1:1、1:1.2、1:1.4、1:1.6、1:1.8或1:2等。
优选地，步骤(1)中所述用茯苓菌进行微生物转化的具体操作为：将茯苓菌通过液态发酵培养获得茯苓菌种培养液，而后接种经过预处理的肉苁蓉和人参，继续混合发酵。
本发明中，所述的微生物转化是指通过微生物细胞将复杂的底物进行结构修饰，也就是利用微生物代谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物特定部位(基团)进行的催化反应。
作为本发明优选的技术方案，所述肉苁蓉和人参的预处理方法为：将所述肉苁蓉和人参粉碎后与水混合，灭菌。
优选地，所述肉苁蓉粉碎后的粒径为10-60目，例如可以是10目、15目、20目、25目、30目、35目、40目、45目、50目、55目或60目等。
优选地，所述人参粉碎后的粒径为10-60目，例如可以是10目、15目、20目、25目、30目、35目、40目、45目、50目、55目或60目等。
优选地，所述水的质量与所述肉苁蓉和人参总质量的比值为(1-3):1，例如可以是1:1、1.2:1、1.4:1、1.6:1、1.8:1、2:1、2.2:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.8:1或3:1等。
本发明中，所述水的用量较为重要，若水的质量大于原料肉苁蓉与人参质量的3倍，则稀释倍数较大，在后续进行发酵以及提取之后所得到的有效成分较少，无法实现较好的抗湿疹的效果。
优选地，所述灭菌的温度为120-130℃，例如可以是120℃、121℃、122℃、123℃、124℃、125℃、126℃、127℃、128℃、129℃或130℃等。
优选地，所述灭菌的时间为30-90min，例如可以是30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min、65min、70min、75min、80min、85min或90min等。
作为本发明优选的技术方案，所述肉苁蓉和人参的接种量为所述茯苓菌种培养液质量的5％-10％，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％或10％等。
优选地，所述混合发酵的温度为20-30℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等。
优选地，所述混合发酵的时间为48-96h，例如可以是48h、50h、55h、60h、65h、70h、75h、80h、85h、90h、94h或96h等。
作为本发明优选的技术方案，所述茯苓菌的液态发酵培养的温度为15-30℃，例如可以是15℃、16℃、18℃、20℃、22℃、25℃、28℃或30℃等。
优选地，所述液态发酵培养的时间为24-48h，例如可以是24h、25h、28h、30h、32h、34h、36h、40h、42h、44h、46h或48h等。
本发明中，所述的液态菌种培养的培养基均为本领域常规使用的培养基。例如，可以使用如下配方的培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨5-10g，磷酸二氢钾1g，蒸馏水1000mL；所述培养基的配置步骤为：先洗净将马铃薯去皮，再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸20～30分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，加5-10g蛋白胨，20g葡萄糖，1g磷酸二氢钾，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，用氢氧化钠或盐酸，调节pH至5-7，灭菌即可。
作为本发明优选的技术方案，步骤(2)所述提取的方法为渗漉法。
渗漉法是将适度粉碎的药材置渗漉筒中，由上部不断添加溶剂，溶剂渗过药材层向下流动过程中浸出药材成分的方法。
渗漉属于动态浸出方法，溶剂利用率高，有效成分浸出完全，可直接收集浸出液。适用于贵重药材、毒性药材及高浓度制剂；也可用于有效成分含量较低的药材提取。该法常用不同浓度的乙醇或白酒做溶剂，故应防止溶剂的挥发损失。
优选地，步骤(2)所述醇的水溶液与所述微生物转化物质的质量比为(15-30):1，例如可以是15:1、16:1、18:1、20:1、22:1、24:1、25:1、26:1、28:1或30:1等。
优选地，所述醇的水溶液为乙醇水溶液。
优选地，所述乙醇水溶液中乙醇的质量浓度为50-95％，例如可以是50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％等。
优选地，步骤(2)所述提取的温度为60-80℃，例如可以是60℃、62℃、64℃、65℃、66℃、68℃、70℃、72℃、74℃、75℃、76℃、78℃或80℃等。
优选地，步骤(2)所述提取的时间为2-12h，例如可以是2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h或12h等。
作为本发明优选的技术方案，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将肉苁蓉和人参粉碎至10-60目后混合，加入1-3倍重量的水，于120-130℃下灭菌30-90分钟，得到预处理的肉苁蓉和人参；
(2)将步骤(1)得到的预处理的肉苁蓉和人参接种至茯苓菌种培养液中，接种量为所述茯苓菌种培养液的5-10％，而后在20-30℃下继续发酵48-96h得到微生物转化物质；
(3)向步骤(2)所述的微生物转化物质中加入15-30倍量的质量分数为50-95％乙醇水溶液，在60-80℃下采用渗漉法提取2-12h，收集滤液，浓缩干燥后得到所述中药提取物。
第二方面，本发明提供一种利用如第一方面所述的制备方法制备得到的中药提取物。
第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的中药提取物在制备抗湿疹的药物或化妆品中的应用。
第四方面，本发明还提供一种去湿疹凝胶，所述去湿疹凝胶包含如第二方面所述的中药提取物。
优选地，所述去湿疹凝胶还包括皮肤调理剂、pH调节剂、保湿剂、增溶剂或防腐剂中任意一种或至少两种的组合。
本发明中，所述去湿疹凝胶按质量百分比计包括1～3％的第一方面所述的中药提取物、3～8％丙二醇、0.2～0.6％卡波U21、0.05～0.15％透明质酸钠、0.01～0.05％乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、氢氧化钠(调节pH至5.5-6.0)、0.1～1％苯甲酸钠和0.01～0.1％PEG40氢化蓖麻油，余量为去离子水，去湿疹凝胶的制备可按本领域常规方法进行制备。
本发明中，所述去湿疹凝胶按质量百分比计包括2％的第一方面所述的中药提取物、5％丙二醇、0.4％卡波U21、0.1％透明质酸钠、0.05％乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、氢氧化钠(调节pH至5.5-6.0)、0.5％苯甲酸钠和0.05％PEG40氢化蓖麻油，余量为去离子水。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明中，肉苁蓉和人参经过茯苓菌的生物转化后，从中提取得到了能够有效阻断CaN-NF-AT通路、抑制IL-8表达的中药组合物，实现治疗湿疹等炎症的目的。同时，所用中药具有来源广、成本低和毒性低的特点，复方配伍合理，其治疗效果不亚于西药疗效，且解决了西药制剂的安全性问题，适合用于舒缓及抗过敏类化妆品中。
(2)本发明提供的中药组合物相对毒性较小，其相对毒性不超过2.6％，且能够显著抑制钙调磷酸通路，其对通路的抑制率为25.32～71.12％，较优条件下可达65.33～71.12％，最高可达71.12％，使用所述中药组合物制备得到的去湿疹凝胶对湿疹患者具有较好的治疗效果，其治疗总有效率可达90％。
附图说明
图1为不同剂量的PMA和A23187处理K562细胞后NFAT报告基因的荧光强度lum值的柱状图。
图2为实施例1～8和对比实施例1～5提供的不同中药提取物对CaN-NF-AT通路的抑制率柱状图。
图3为实施例1～8和对比实施例1～5提供的不同中药提取物的非特异性相对细胞毒性柱状图。
图4为NHEK与各浓度样品、诱导剂共同孵育24h后培养基中的IL-8浓度柱状图。
具体实施方式
为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制，在不脱离前后所述宗旨的范围下，实施都包含在本发明的技术范围内。
以下实施例中，所述茯苓菌、肉苁蓉和人参均可由常规渠道和厂商购得；所述渗漉法采用的仪器设备为上海晟薇科技有限公司实用新型提取浓缩设备。
实施例1
本实施例提供一种中药提取物及其制备方法。所述方法包括如下步骤：
(1)将肉苁蓉、人参以重量配比为1:1粉碎混合后，加1倍重量的水，126℃灭菌30分钟；
(2)接种茯苓菌种培养液重量的5％，20℃发酵48h；
(3)将上述发酵过的中药组合，加入15倍量的50％乙醇，60℃渗漉法提取2h，收集滤液；低温减压浓缩干燥即得中药提取物。
实施例2
本实施例提供一种中药提取物及其制备方法。所述方法包括如下步骤：
(1)将肉苁蓉、人参以重量配比为1:2粉碎混合后，加2倍重量的水，126℃灭菌60分钟；
(2)接种茯苓菌种培养液重量的7％，25℃发酵72h；
(3)将上述发酵过的中药组合，加入20倍量的75％乙醇，70℃渗漉法提取6h，收集滤液；低温减压浓缩干燥即得中药提取物。
实施例3
本实施例提供一种中药提取物及其制备方法。所述方法包括如下步骤：
(1)将肉苁蓉、人参以重量配比为2:1粉碎混合后，加3倍重量的水，126℃灭菌90min；
(2)接种茯苓菌种培养液重量的10％，30℃发酵96h；
(3)将上述发酵过的中药组合，加入30倍量的95％乙醇，80℃渗漉法提取12h，收集滤液；低温减压浓缩干燥即得中药提取物。
实施例4
本实施例提供一种中药提取物及其制备方法。所述方法包括如下步骤：
(1)将肉苁蓉、人参以重量配比为1:1粉碎混合后，加4倍重量的水，126℃灭菌20分钟；
(2)接种茯苓菌种培养液重量的3％，10℃发酵24h；
(3)将上述发酵过的中药组合，加入10倍量的40％乙醇，50℃渗漉法提取1h，收集滤液；低温减压浓缩干燥即得中药提取物。
实施例5
本实施例提供一种中药提取物及其制备方法。所述方法包括如下步骤：
(1)将肉苁蓉、人参以重量配比为1:2粉碎混合后，加5倍重量的水，126℃灭菌120分钟；
(2)接种茯苓菌种培养液重量的15％，40℃发酵120h；
(3)加入50倍量的98％乙醇，90℃渗漉法提取24h，收集滤液；低温减压浓缩干燥即得抗湿疹中药复方提取物。
实施例6
本实施例提供一种中药提取物及其制备方法。所述方法包括如下步骤：
(1)将肉苁蓉、人参以重量配比为2:1粉碎混合后，加6倍重量的水，126℃灭菌150分钟；
(2)接种茯苓菌种培养液重量的20％，10℃发酵48h；
(3)将上述发酵过的中药组合，加入30倍量的30％乙醇，50℃渗漉法提取18h，收集滤液；低温减压浓缩干燥即得抗湿疹中药复方提取物。
实施例7
与实施例1的区别在于肉苁蓉与人参以重量配比为3:1粉碎混合，且肉苁蓉与人参的总重量与实施例1保持一致，其余步骤与实施例1相同。
实施例8
与实施例1的区别在于肉苁蓉与人参以重量配比为1:3粉碎混合，且肉苁蓉与人参的总重量与实施例1保持一致，其余步骤与实施例1相同。
对比实施例1
本对比实施例提供一种肉苁蓉提取物，其制备方法与实施例1的区别在于，将原料由肉苁蓉和人参替换为单一的肉苁蓉，且肉苁蓉的重量与实施例1中肉苁蓉和人参的总重量保持一致，其余制备条件也与实施例1保持一致。
对比实施例2
本对比实施例提供一种人参提取物，其制备方法与实施例1的区别在于，将原料由肉苁蓉和人参替换为单一的人参，且人参的重量与实施例1中肉苁蓉和人参的总重量保持一致，其余制备条件也与实施例1保持一致。
对比实施例3
本对比实施例提供一种中药提取物，与实施例1的区别仅在于不接种茯苓菌，其余制备条件与实施例1保持一致。
对比实施例4
本对比实施例提供一种人参提取物，其制备方法与实施例1的区别在于，将原料由肉苁蓉和人参替换为单一的人参，且人参的重量与实施例1中肉苁蓉和人参的总重量保持一致，且不接种茯苓菌，具体步骤为：
(1)将人参粉碎后，加1倍重量的水，126℃灭菌30分钟；
(2)加入15倍量的50％乙醇，采用渗漉法在60℃提取2h，收集滤液；低温减压浓缩干燥即得人参提取物。
对比实施例5
本对比实施例提供一种茯苓发酵提取物，其制备方法与实施例1的区别在于不加入肉苁蓉和人参，具体操作步骤为：
(1)茯苓菌种培养液加3倍的无菌水，20℃发酵48h；
(2)加入15倍量的50％乙醇，采用渗漉法在60℃提取2h，收集滤液；低温减压浓缩干燥即得茯苓发酵提取物。
效果实施例1
本效果实施例使用实施例1-8和对比实施例1-5进行钙调磷酸酶(CaN)-NF-AT通路抑制实验。
一、检测方法：
1.钙调磷酸酶(CaN)-NF-AT通路阻断剂的筛选
1.1待测样品
所有提取物用70％的乙醇溶解，用去离子水稀释，检测时取10μL加入测定管，待测提取物的终浓度为0.2mg/mL。
1.2 CaN酶活性检测
采用Enzo life Scienceg公司的CaN活性检测试剂盒，按试剂盒的说明书进行。取小离心管，加入25μL CaM工作液，5μL CaN工作液，10μL 50μM待测化合物工作液，对照管加入10μL 0.5％DMSO水溶液，混匀，30℃孵育10分钟，每管再加入10μL底物工作液，混匀，30℃孵育60分钟，加入100μL显色剂，混匀，静止30分钟，每孔取135μL转移到96孔板，620nm处测定吸光度。
1.3蛋白激酶CPKC激活剂(PMA)和通路刺激剂(A23187)最适浓度的确定
为了确定刺激CaN-NF-AT通路活化所需要的刺激剂PMA和A23187的最适浓度，采用PMA浓度梯度2.5、5、10、20、40ng/mL；A23187浓度0.125、0.25、0.5、1、2μM，每个浓度系列设4复孔，刺激18h后，检测各实验组荧光强度lum值(反映细胞内反应钙调磷酸酶通路活化水平)。
1.4测定方法
采用从美国affimatrix公司购买了稳定转染NFAT报告基因的细胞系NFAT K562Reporter Stable Cell Line，以PMA和A23187刺激K562细胞，检测转录因子NFAT驱动的荧光素酶基因表达水平，反映CaN通路的活化水平。
稳定转染NFAT报告基因的K562细胞常规传代培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，实验采用生长健康、处于对数增长期的细胞，将上述细胞按2×105/孔接种于24孔细胞培养板，加入待测样品，孵育1小时，加入PMA(10ng/mL)和A23187(0.5μM)，刺激18h，收集细胞，采用荧光素酶检测试剂盒按说明书操作，测定荧光强度lum值。
2.中药提取物的细胞毒性检测
采用常规的CCK8法，具体包括如下步骤：
在96孔板中配置100μL的K562细胞悬液(1×105/孔)，将96孔板在培养箱预培养24小时(37℃，5％CO2)；加入10μL待测物质，将96孔板在培养箱中孵育24小时；向每孔加入10μLCCK8溶液，将96孔板在培养箱内孵育4小时；用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
二、实验结果
不同剂量的PMA和A23187对K562细胞NFAT报告基因表达的影响如表1和图1所示。
表1
Figure BDA0002445767950000131
由表1和图1可知，PMA和A23187能够剂量依赖性地刺激报告基因的表达，复孔间的荧光度值差别可以控制在合理范围。
因此，PMA的合适剂量为10ng/mL，A23187为0.5μM。
本发明与单味中药及不同比例配比中药相比，产品对CaN-NF-AT通路的抑制作用及非特异性细胞毒性结果如表2、图2以及图3所示。
表2
Figure BDA0002445767950000132
Figure BDA0002445767950000141
由图2、图3可以看出，在没有增加实施例毒性的情况下，实施例1-3中制备得到的中药复方提取物能够显著抑制钙调磷酸通路，抑制率可达71.12％，显著优于对比实施例；由实施例1、7和8比较可知，所述肉苁蓉与人参以重量配比为1:1时，其抑制率较高，相对毒性较小；由实施例1与对比实施例1～3比较可知，在肉苁蓉、人参需要同时使用，且经过茯苓菌发酵之后，才能实现对钙调磷酸通路的抑制。
效果实施例2
本效果实施例使用实施例1-8和对比实施例1-5进行角质形成细胞湿疹模型IL-8表达水平抑制实验。
一、检测方法
1.1待测样品
所有提取物，先用75％乙醇溶解，配制成10mg/mL的提取液，然后用培养基稀释成提取液浓度为0.064μL/mL、0.128μL/mL、0.256μL/mL的工作液。
1.2样品对角质形成细胞湿疹模型的影响
原代角质形成细胞中加入样品溶液，以加入相同体积的培养基/溶剂作为阴性对照，每个样品设置3个浓度梯度，每个浓度设置3复孔，孵育1小时后，加入100μg/mL的Poly(I:C)和100ng/mL的IL-4，培养24小时，通过BCA蛋白定量法对孔中细胞的蛋白进行定量，通过ELISA法测定培养基上清液中白介素8(IL-8)的含量。
1.3BCA法定量细胞蛋白含量
细胞孔中每孔加入100μL RIPA裂解液，-80℃反复冻融使细胞彻底裂解；取20μL细胞裂解液加入新96孔板中，另设置标准孔和空白孔，每孔加入BCA工作液200μL，37℃放置30分钟，用酶标仪检测各孔在562nm处的吸光度。
1.4ELISA法检测培养基上清中IL-8含量
酶标板中设置标准孔、待测样品孔、空白孔，各加入相应标准品、待测样品以及标准品稀释液100μL，酶标板上覆膜，37℃孵育1小时；弃去液体，甩干；每孔加检测溶液A工作液100μL，覆膜，37℃孵育1小时；弃去孔内液体，每孔用300μL洗涤液洗涤3次；每孔加检测溶液B工作液100μL，覆膜，37℃孵育30分钟；弃去孔内液体，每孔用300μL洗涤液洗涤5次；每孔加TMB底物溶液90μL，覆膜，37℃避光显色20分钟；每孔加入终止液50μL；用酶标仪检测在450nm波长测量各孔的吸光度。
1.5数据处理
(1)BCA法蛋白定量的数据处理
以BSA蛋白标准品浓度与对应的OD值建立标准曲线，通过样品孔的OD值计算样品孔中蛋白质的含量。
(2)ELISA法对IL-8定量的数据处理
以标准品浓度与对应的OD值建立标准曲线，通过样品孔的OD值计算样品孔中待测指标的含量，并以BCA蛋白定量的结果进行校正，计算单位质量的蛋白质中IL-8的含量。各样品组与诱导组的指标含量进行单尾t检验，显著性水平α为0.05。
二、检测结果
角质形成细胞与各浓度样品、诱导剂一起孵育24小时后培养基中的IL-8浓度如图4所示。
由图4可见(图中每组柱状数据由作至右依次为0.064、0.128和0.256μL/mL提取液中IL-8的浓度)，诱导剂(Poly(I:C)[100ug/mL]，IL-4[100ng/mL])能极显著提高NHEK表达IL-8的水平(p<0.01)；各浓度的实施例可以显著降低因诱导剂而升高的IL-8水平，实施例对降低诱导剂而升高的IL-8水平显著优于对比实施例，且实施例在测试浓度范围内有一定的量效关系。
应用实施例
提供一种去湿疹凝胶及其制备方法，所述去湿疹凝胶按质量百分比计包含如下组分：
Figure BDA0002445767950000161
Figure BDA0002445767950000171
该去湿疹凝胶的制备按本领域常规制备，具体步骤为：
(1)按配比称量好上述物料，先把卡波U21分散在丙二醇中，然后加水分散；同时升温到60℃，分散完全后，加入透明质酸钠，继续分散；
(2)分散完成后，将A相所有组分分散到水中并同时升高温度到85℃，搅拌均匀；
(3)预先把D相增溶好，将A相冷却到45℃后，加入B相，搅拌均匀后，加入C、D相各组分；搅拌均匀后出料，pH控制为6.0。
临床效果验证：选取30例湿疹患者，年龄在18-50岁之间，无中药过敏史。患者使用上述凝胶涂抹皮肤，每6小时涂抹一次，使用3天。
疗效评定
显著效果：湿疹、红肿消退，局部皮肤恢复正常。
有效：内渗出液明显减少，红肿、湿疹开始消退，局部皮肤基本恢复正常。
无效：局部皮肤症状无明显改善。治疗结果如表3所示：
表3
治疗结果 病例数(例) 比率
显著效果 14 46.7％
有效 13 43.3％
无效 3 10％
总计 30 100％
经使用上述凝胶涂抹30例湿疹患者皮肤后，有显著效果的有14例，有效的有13例，无效的有3例，总有效率达到90％。
综上所述，本发明提供的中药组合物的制备方法简单，原料来源广泛，且毒性较小。同时，实施例和对比实施例证明该中药复合提取物对湿疹有显著的临床效果。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种抗湿疹的中药提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将原料肉苁蓉和人参用茯苓菌进行微生物转化，得到微生物转化物质；
(2)将步骤(1)所得的微生物转化物质用醇的水溶液提取，得到所述中药提取物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述肉苁蓉与人参的质量比为1:(0.5-2)；
优选地，步骤(1)中所述用茯苓菌进行微生物转化的具体操作为：将茯苓菌通过液态发酵培养获得茯苓菌种培养液，而后接种经过预处理的肉苁蓉和人参，继续混合发酵。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述肉苁蓉和人参的预处理方法为：将所述肉苁蓉和人参粉碎后与水混合，灭菌；
优选地，所述肉苁蓉粉碎后的粒径为10-60目；
优选地，所述人参粉碎后的粒径为10-60目；
优选地，所述水的质量与所述肉苁蓉和人参总质量的比值为(1-3):1；
优选地，所述灭菌的温度为120-130℃；
优选地，所述灭菌的时间为30-90min。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述肉苁蓉和人参的接种量为所述茯苓菌种培养液质量的5％-10％；
优选地，所述混合发酵的温度为20-30℃；
优选地，所述混合发酵的时间为48-96h。
5.根据权利要求2-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述茯苓菌的液态发酵培养的温度为15-30℃；
优选地，所述液态发酵培养的时间为24-48h。
6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述提取的方法为渗漉法；
优选地，步骤(2)所述醇的水溶液与所述微生物转化物质的质量比为(15-30):1；
优选地，所述醇的水溶液为乙醇水溶液；
优选地，所述乙醇水溶液中乙醇的质量浓度为50-95％；
优选地，步骤(2)所述提取的温度为60-80℃；
优选地，步骤(2)所述提取的时间为2-12h。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将肉苁蓉和人参粉碎至10-60目后混合，加入1-3倍重量的水，于120-130℃下灭菌30-90min，得到预处理的肉苁蓉和人参；
(2)将步骤(1)得到的预处理的肉苁蓉和人参接种至茯苓菌种培养液中，接种量为所述茯苓菌种培养液的5-10％，而后在20-30℃下继续发酵48-96h得到微生物转化物质；
(3)向步骤(2)所述的微生物转化物质中加入15-30倍量的质量分数为50-95％乙醇水溶液，在60-80℃下采用渗漉法提取2-12h，收集滤液，浓缩干燥后得到所述中药提取物。
8.利用如权利要求1-7任一项所述的制备方法制备得到的中药提取物。
9.如权利要求8所述的中药提取物在制备抗湿疹的药物或化妆品中的应用。
10.一种去湿疹凝胶，其特征在于，所述去湿疹凝胶包含如权利要求8所述的中药提取物；
优选地，所述去湿疹凝胶还包括皮肤调理剂、pH调节剂、保湿剂、增溶剂或防腐剂中任意一种或至少两种的组合。
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