CN116869867B

CN116869867B - 一种具有ppar激动的天然油脂组合物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN116869867B
Application number: CN202311004793.XA
Authority: CN
Inventors: 丁小兰; 薛绘; 陶红; 王君仪
Original assignee: Hangzhou Lanjiang Cosmetics Co ltd
Current assignee: Hangzhou Lanjiang Cosmetics Co ltd
Priority date: 2023-08-10
Filing date: 2023-08-10
Publication date: 2024-05-07
Anticipated expiration: 2043-08-10
Also published as: CN116869867A

Abstract

一种具有PPAR激动的天然油脂组合物及其制备方法和用途，属于医药和护肤品技术领域。含有重量百分含量的以下组分：鳄梨油不皂化物0.1%‑0.5%、灵芝孢子油0.1%‑5%、海檀木籽油0.1%‑5%，还含有向日葵籽油不皂化物0.1%‑0.5%。上述一种具有PPAR激动的天然油脂组合物及用途，具有以下有益效果：1）该天然油脂组合物，相较于常规天然来源配体，可显著激活PPARα及PPARγ基因及蛋白表达，且无细胞毒性、安全性好；2）该天然油脂组合物，可改善表皮组织形态，提高屏障修护相关蛋白表达，促进屏障脂质自生成；3）该天然油脂组合物，在人体皮肤屏障受损处局部施用具有增强皮肤屏障修护的作用。

Description

一种具有PPAR激动的天然油脂组合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药和护肤品技术领域，具体为一种具有PPAR激动的天然油脂组合物及其制备方法和用途。

背景技术

皮肤是覆盖于人体表面的最大器官，承担着抵御外界有害环境、保护机体健康的重要使命，其结构的完整和功能正常对人体健康的维持极其关键。近年，随着外界自然环境变化及过度追求功效护肤理念的影响，越来越多的消费者出现一定的皮肤屏障受损。皮肤屏障受损会导致皮肤出现灼热、刺痛、瘙痒、脱屑、紧绷和容易泛红等症状，长期持续进而演变为敏感肌肤，甚至诱发特异性皮炎等炎症性皮肤疾病。皮肤屏障损伤与皮肤脂质组成和屏障结构蛋白有着密切关系，皮肤脂质的成分含量、结构以及脂质代谢相关酶活性和表达水平异常都可导致皮肤屏障功能受损。

过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）是核受体超家族成员，在调控皮肤脂质代谢合成、炎症反应、屏障修护的过程中发挥重要作用。因此，PPAR逐渐成为治疗一些皮肤病的潜在靶点。PPAR分为3种亚型：PPARα，PPARβ/δ和PPARγ，在人类皮肤组织中3种PPAR亚型均表达。AmJClinDermatol.2008;9(1):15-31.及中国皮肤性病学杂志:1-10.研究指出在炎症性皮肤病中，包括过度增殖性银屑病表皮和特应性皮炎患者的皮肤，PPARα和PPARγ的表达均降低，其中参与特应性皮炎调节的主要是PPARα和PPARγ两种亚型。在炎症和屏障损伤的皮肤中，激活PPARα、PPARγ能够改善表皮结构和功能，抑制炎症细胞因子的表达，联合激活表皮PPARα、PPARγ靶点可改善皮肤屏障修护功能。其中，PPARα主要参与皮肤动态平衡的调整：如控制角质细胞增殖、分化，修复表皮屏障，提供抗炎活性。研究表明激活PPARα可增加皮肤中β-半乳糖苷酶和类固醇硫酸酯酶的活性，减少经表皮水分散失。JInvestDermatol.2000Sep;115(3):353-60.研究显示局部应用PPARα激动剂可增加表皮棘层/颗粒层结构蛋白的表达，加速表皮屏障功能的恢复。此外，PPARγ在皮肤中的生理学功能可归纳为：参与皮下脂肪的形成与分布、抑制表皮细胞的异常增生、促进表皮细胞终末分化、促进皮肤屏障形成。JInvestDermatol,2007,127（7）:1728⁃1735.临床研究发现，应用PPARγ激动剂可以改善皮肤炎症，使丝聚蛋白（FLG）和兜甲蛋白（LOR）表达恢复正常，从而有效修复皮肤屏障。大量研究表明，PPARγ能够直接抑制角质形成细胞的异常增殖，促进其终末期分化而发挥屏障保护功能。

近年来，在皮肤领域，许多研究机构致力于PPARα、PPARγ激动剂的开发，期望其能更高效地调控脂质代谢和修护皮肤屏障。然而，大部分合成配体都具有一定的刺激性及副作用，在皮肤应用中受到限制。来源于植物油脂的天然配体凭借自身安全性优势使得在实际使用中有着重要价值。目前，报道的天然来源配体主要为一些植物油脂的脂肪酸、脂肪酸衍生物，如亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸等。这类常见的不饱和脂肪酸虽然与PPARα、PPARγ有着亲和力，但是效能较为微弱。因此，寻找并开发出具有高效激动PPARα、PPARγ的天然配体在增强皮肤屏障修护中具有应用前景及价值。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种具有PPAR激动的天然油脂组合物及用途的技术方案，该油脂组合可通过激活调控PPARα、PPARγ双靶点，调节脂质代谢、屏障修复相关蛋白表达、表皮分化，进而改善表皮脂质及结构，激发原生皮肤屏障自我修复的能力，最终达到增强皮肤屏障修护的作用，同时具有天然植物来源、安全性高、无刺激性、高效能的优势，易应用于医药或护肤品外用局部制剂中。

所述的一种具有PPAR激动的天然油脂组合物，其特征在于含有重量百分含量的以下组分：鳄梨油不皂化物0.1%-0.5%、灵芝孢子油0.1%-5%、海檀木籽油0.1%-5%。

所述的一种具有PPAR激动的天然油脂组合物，其特征在于还含有重量百分含量的向日葵籽油不皂化物0.1%-0.5%。

所述的一种具有PPAR激动的天然油脂组合物，其特征在于含有：鳄梨油不皂化物0.125%-0.4%、灵芝孢子油0.6%-4%、海檀木籽油0.7%-4%；优选鳄梨油不皂化物0.15%-0.3%、灵芝孢子油1%-3%、海檀木籽油1%-3%；更优选鳄梨油不皂化物0.2%-0.25%、灵芝孢子油2%-2.5%、海檀木籽油2%-2.5%。

所述的一种具有PPAR激动的天然油脂组合物，其特征在于：所述鳄梨油不皂化物选用分子蒸馏技术制备的不皂化物含量≥30%的鳄梨油不皂化物。

所述的一种具有PPAR激动的天然油脂组合物，其特征在于：所述灵芝孢子油选用超临界CO₂萃取技术制备的总三萜含量≥30%的灵芝孢子油。

所述的一种具有PPAR激动的天然油脂组合物，其特征在于：所述海檀木籽油选用冷压萃取技术制备的西门尼酸含量≥20%的海檀木籽油。

所述的一种具有PPAR激动的天然油脂组合物的制备方法，其特征在于：将各油脂加入至辛酸/癸酸甘油三酯中，搅拌至完全溶解，即得天然油脂组合物。

所述的一种具有PPAR激动的天然油脂组合物在制备改善皮肤表皮组织结构、提高屏障修复相关蛋白含量、增强皮肤屏障修护的护肤品或医药制剂中的应用。

所述的一种具有PPAR激动的天然油脂组合物，其特征在于：所述向日葵籽油不皂化物选用分子蒸馏技术精制浓缩的富含不皂化物甾醇＞3.5%的向日葵籽油不皂化物。

所述的一种具有PPAR激动的天然油脂组合物，其特征在于含有：向日葵籽油不皂化物0.15%-0.4%，向日葵籽油不皂化物0.2%-0.35%，更优选向日葵籽油不皂化物0.5%-0.3%。

本发明各原料均可从市场上直接购得。

上述一种具有PPAR激动的天然油脂组合物及用途，具有以下有益效果：

1）该天然油脂组合物，相较于常规天然来源配体，可显著激活PPARα及PPARγ基因及蛋白表达，且无细胞毒性、安全性好；

2）该天然油脂组合物，可改善表皮组织形态，提高屏障修护相关蛋白表达，促进屏障脂质自生成；

3）该天然油脂组合物，在人体皮肤屏障受损处局部施用具有增强皮肤屏障修护的作用。

附图说明

图1为不同油脂对角质形成细胞HaCaT细胞活力的影响；

图2为不同油脂在双荧光素酶报告基因中对PPARα的相对激活倍数；

图3为不同油脂在双荧光素酶报告基因中对PPARγ的相对激活倍数；

图4为角质形成细胞HaCaT中PPARα蛋白免疫荧光图（实施例2）；

图5为角质形成细胞HaCaT中PPARγ蛋白免疫荧光图（实施例2）；

图6为角质形成细胞HaCaT中PPARα、PPARγ蛋白相对表达量（实施例2）；

图7为本发明油脂组合物施用24小时后在3D仿皮模型中对组织形态影响的H&E染色图（实施例5）；

图8为本发明油脂组合物施用24小时后在3D仿皮模型中对表皮活细胞层厚度的测量（实施例5）；

图9为本发明油脂组合物施用24小时后3D仿皮模型中丝聚蛋白（FLG）相对IOD平均值（实施例5）；

图10为本发明油脂组合物施用24小时后3D仿皮模型中内披蛋白（IVL）相对IOD平均值（实施例5）；

图11为本发明油脂组合物施用24小时后3D仿皮模型中兜甲蛋白（LOR）相对IOD平均值（实施例5）；

图12为本发明油脂组合物施用24小时后3D仿皮模型中桥粒芯糖蛋白1（DSG1）相对IOD平均值（实施例5）；

图13为本发明油脂组合物施用24小时后3D仿皮模型中紧密连接蛋白（Claudin1）相对IOD平均值（实施例5）；

图14为本发明油脂组合物施用24小时后3D仿皮模型中紧密连接蛋白（Occludin）相对IOD平均值（实施例5）；

图15为本发明油脂组合物施用24小时后3D仿皮模型中谷氨酰胺转胺酶（TGM1）相对IOD平均值（实施例5）；

图16为本发明油脂组合物施用24小时后3D仿皮模型屏障脂质中不同长链神经酰胺含量的变化（实施例5）；

图17是本发明油脂组合物施用24小时后3D仿皮模型屏障脂质中不同神经酰胺亚型含量的变化（实施例5）；

图18是本发明油脂组合物施用3天、7天后相较皮肤损伤后的角质层含水量变化率（实施例2、5）；

图19是本发明油脂组合物施用3天、7天后相较皮肤损伤后的经表皮水分流失变化率（实施例2、5）。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

将鳄梨油不皂化物0.125%、灵芝孢子油0.5%、海檀木籽油0.5%、向日葵籽油不皂化物0.125%加入至辛酸/癸酸甘油三酯中，搅拌至完全溶解，即得天然油脂组合物（1.25%组合物）。

实施例2

将鳄梨油不皂化物0.125%、灵芝孢子油1%、海檀木籽油0.75%、向日葵籽油不皂化物0.125%加入至辛酸/癸酸甘油三酯中，搅拌至完全溶解，即得天然油脂组合物（2%组合物）。

实施例3

将鳄梨油不皂化物0.25%、灵芝孢子油1.0%、海檀木籽油1.0%、向日葵籽油不皂化物0.25%加入至辛酸/癸酸甘油三酯中，搅拌至完全溶解，即得天然油脂组合物（2.5%组合物）。

实施例4

将鳄梨油不皂化物0.25%、灵芝孢子油1.25%、海檀木籽油1.25%、向日葵籽油不皂化物0.25%加入至辛酸/癸酸甘油三酯中，搅拌至完全溶解，即得天然油脂组合物（3%组合物）。

实施例5

将鳄梨油不皂化物0.25%、灵芝孢子油2%、海檀木籽油1.5%、向日葵籽油不皂化物0.25%加入至辛酸/癸酸甘油三酯中，搅拌至完全溶解，即得天然油脂组合物（4%组合物）。

实施例6

将鳄梨油不皂化物0.5%、灵芝孢子油2%、海檀木籽油2%、向日葵籽油不皂化物0.5%加入至辛酸/癸酸甘油三酯中，搅拌至完全溶解，即得天然油脂组合物（5%组合物）。

实施例7

将鳄梨油不皂化物0.25%、灵芝孢子油1%、海檀木籽油0.75%加入至辛酸/癸酸甘油三酯中，搅拌至完全溶解，即得天然油脂组合物。

实施例8

将鳄梨油不皂化物0.5%、灵芝孢子油2.5%、海檀木籽油2%加入至辛酸/癸酸甘油三酯中，搅拌至完全溶解，即得天然油脂组合物。

实施例9

将鳄梨油不皂化物0.2%、灵芝孢子油3%、海檀木籽油5%、向日葵籽油不皂化物0.5%加入至辛酸/癸酸甘油三酯中，搅拌至完全溶解，即得天然油脂组合物。

实施例10

将鳄梨油不皂化物0.5%、灵芝孢子油4%、海檀木籽油4%、向日葵籽油不皂化物0.5%加入至辛酸/癸酸甘油三酯中，搅拌至完全溶解，即得天然油脂组合物。

实施例11

将鳄梨油不皂化物0.3%、灵芝孢子油5%、海檀木籽油3%、向日葵籽油不皂化物0.1%加入至辛酸/癸酸甘油三酯中，搅拌至完全溶解，即得天然油脂组合物。

上述天然油脂组合物在制备改善皮肤表皮组织、提高屏障修复相关蛋白含量、增强皮肤屏障修护的护肤品或医药制剂中可以广泛应用。

以下通过相应的实验进一步证明本发明的有益效果。

实验一：

前期通过高通量基因测序研究探索验证含有特殊成分或富含某种珍稀不饱和脂肪酸的天然植物油脂，发现下述鳄梨油不皂化物、灵芝孢子油、海檀木籽油、向日葵籽油不皂化物的油脂具有激活PPAR的潜在优异活性。

鳄梨油不皂化物：不皂化物是指油脂皂化时，与碱不起作用的，不溶于水但溶于醚的物质。不皂化物最重要组成部分是角鲨烯、生育酚、甾醇等。大部分植物油中约含1％的不皂化物。不皂化物其实具有相当强的生物活性，制备油脂中不皂化物或者提炼油脂中不皂化物可以开发食品、保健食品及药品等。其中，鳄梨油不皂化物主要是使用鳄梨油作为原料，通过提取工艺处理从其中制得富含呋喃类脂的不皂化物，主要以十七碳二烯基呋喃为代表的鳄梨呋喃，已经用于制备治疗关节炎或/和牙周炎的药物，该类药物可以减少结缔组织的损伤、用于治疗或减轻与结缔组织损伤相关的炎症，如关节炎，类风湿关节炎，牙周炎等。通过我们的早期计算机辅助模拟蛋白-配体分子对接研究发现，以十七碳二烯基呋喃为代表的鳄梨呋喃与PPARα、PPARγ具有良好的分子间相互作用。因此，通过选用分子蒸馏技术制备不皂化物含量≥30%的鳄梨油为具有PPAR激动的天然油脂不皂化物。

灵芝孢子油：灵芝孢子是灵芝（Ganodermalucidum(Curtis)P.Karst.）的种子，在灵芝生长成熟期从灵芝菌盖背面弹射出来，具有灵芝的全部遗传活性物质。通过物理机械进行破壁的灵芝孢子中含有大量的三萜类化合物及脂肪酸等，均为亲脂性的碳氢化合物和类脂有机化合物，在超临界CO₂流体中有较佳溶解性。通过使用超临界CO₂萃取技术可从破壁灵芝孢子粉中提取灵芝孢子油，通常每10g灵芝孢子粉能萃取出1g灵芝孢子油，是灵芝孢子有效成分的集合体。其药理作用有抗肿瘤、保肝、降血糖、降血脂，防治白血病等。一般认为灵芝孢子油的药理作用与其含有丰富的不饱和脂肪酸特别是油酸、亚油酸有密切的关系。然而，其中富集的珍稀灵芝三萜，主要包括灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C、灵芝酸D、灵芝酸G以及灵芝酸H等，具有更强的药理活性，诸如研究报道的降血脂、降血压、护肝、调节肝功能等作用。通过我们的早期计算机辅助模拟蛋白-配体分子对接研究发现，各类灵芝酸与PPARα、PPARγ具有良好的分子间相互作用。因此，通过选用超临界CO₂萃取技术制备总三萜含量≥30%的灵芝孢子油为具有PPAR激动的天然油脂。

海檀木籽油：海檀木（XimeniaamericanaL.）是一种以17世纪西班牙僧侣弗朗西斯科·希梅内斯命名的灌木，隶属于木犀科，生长在贫瘠的土壤中的常绿乔木，其果肉呈橙色，带有酸味和杏仁味。其果实中含有一个奶油色种子，大而富含天然的油脂。将新鲜的海檀木果仁投入到压油机器中，通过机械压榨，获取海檀木籽油，该油以其较粘稠的特性,带来拉丝的流动性,非常适合提供持久的屏障保护和丰富的缓冲后感。此外，该油中除常见不饱和脂肪酸外，可富集到天然珍稀脂肪酸西门尼酸。西门尼酸是一种天然的十八碳共轭烯炔酸,其特殊的烯炔共轭结构赋予它许多生物活性,如抗细菌、抗真菌、杀蚴虫及抗炎等活性。通过我们的早期计算机辅助模拟蛋白-配体分子对接研究发现，西门木炔酸与PPARα、PPARγ具有良好的分子间相互作用。因此，通过选用冷压萃取技术（在冷压过程中，温度不超过60°C）制备西门尼酸含量≥20%的海檀木籽油为具有PPAR激动的天然油脂。

向日葵籽油不皂化物：向日葵籽油又名葵花籽油,是以葵花籽为原料,经过压榨等工艺制成的食用油,具有补充营养、调味、提供热量等功效。其中含有丰富的多不饱和脂肪酸,如亚油酸、油酸等。通过我们的早期计算机辅助模拟蛋白-配体分子对接研究发现，西门木炔酸与PPARα、PPARγ具有良好的分子间相互作用。因此，通过选用分子蒸馏技术精制浓缩制备富含不皂化物甾醇＞3.5%的向日葵籽油不皂化物具有PPAR激动的天然油脂。

油脂的安全性评价：

细胞存活率通常作为评价组分对于细胞毒性的指标，而CCK-8法可定细胞中活细胞数目，其优点是高灵敏度，无放射性。如图1所示，与空白对照组相比，浓度为0.125%-0.50%的鳄梨油不皂化物、向日葵籽油不皂化物，浓度为1.25%-5%的灵芝孢子油、海檀木籽油与人永生化角质形成细胞（HaCaT）细胞共培养24小时后，细胞存活率均在80%以上，说明在该浓度阈值内，基本不会对HaCaT细胞产生毒害作用。

综上所述，由海檀木籽油、鳄梨油不皂化物、灵芝孢子油、向日葵籽油不皂化物四种天然植物油脂对于角质形成细胞无细胞毒性。

油脂对PPARα、PPARγ基因转录的调控作用：

荧光素酶报告基因检测是以荧光素为底物来检测萤火虫荧光素酶（FireflyLuciferase）活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化荧光素氧化，在荧光素氧化的过程中，会发出生物荧光，可通过荧光测定仪设备测定氧化过程中释放的生物荧光，常应用于miRNA靶基因验证及启动子转录活性调控等方向研究。传统单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，而双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供一基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。一般情况下，海肾荧光素酶基因作为内参使用，将带有海肾荧光素酶基因的质粒与报告基因质粒共转染细胞；或是将两个报告基因构建到同一个质粒上，分别用不同的启动子启动其表达。计算结果时，将萤火虫荧光素酶的检测值比上海肾荧光素酶检测值，可减少内在变化因素对实验准确性的影响，使测试结果不受实验条件变化的干扰。

在双荧光素酶报告基因实验中，选择上述鳄梨油不皂化物、灵芝孢子油、海檀木籽油、向日葵籽油不皂化物四种油脂，常用油脂对照组分别为红花籽油、山茶籽油、角鲨烷、亚油酸、亚麻酸，阳性对照组分别为PPARα激动剂非诺贝特、PPARγ激动剂罗格列酮进行测试。

测试方法：

S1.质粒构建:从NCBI（美国国家生物技术信息中心）数据库筛选出人源PPARα和PPARγ序列，通过基因合成手段将人类PPPAR-α和PPAR-γ全长序列直接合成到所需的目的质粒pcDNA-3.1中，同时准备好PPRE-X3-TK-LUC和PRL-TK质粒用于后续双荧光素酶实验中萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的检测，所有质粒需用去内毒素质粒提取试剂盒提取后才能用于后续转染实验;

S2.脂质体转染:取对数生长期HEK293T细胞，用含血清不含双抗的培养基，按2×104个/孔接种于96孔板，于37℃、5%CO2的培养箱中孵育24h后，用Opti-MEM培养基分别稀释Lipofectamine3000和质粒DNA，之后将稀释好的质粒DNA加入到Lipofectamine3000中1:1混匀，孵育10-15分钟后，直接加到细胞中，6-8h后观察细胞状况，状态不佳需要换液，继续置于37℃、5%CO₂的培养箱中孵育24h；吸去培养基，在96孔板中加入不同浓度的样品，继续将细胞置于37℃、5%CO₂的培养箱中孵育24h;

S3.测量萤火虫萤光素酶活性：从培养箱取出转染好的细胞，向每个孔中加入与培养液等体积的Dual-Glo®LuciferaseReagent并混匀。对于96孔板，通常是将75µL试剂添加到在75µL培养液中生长的细胞中。等待至少10分钟，待细胞充分裂解后，将所有样品转移至不透光的白板中，然后测量萤火虫发光；

S4.测量海肾萤光素酶活性：向每个孔中加入与原始培养液等体积的Dual-Glo®Stop&Glo®Reagent并混匀。Dual-Glo®Stop&Glo®Reagent应当在加入Dual-Glo®LuciferaseReagent后4小时之内加入孔板中，等待至少10分钟，然后测量海肾发光。检测多个板时，海肾发光应当使用与测量萤火虫发光相同的平板检测顺序；

S5.计算实验报告基因发光与内参（内对照）报告基因发光的比值，使用对照组的比值将各实验组的比值进行归一化。

测试结果：

如图2、3所示，所述PPARa、PPARγ激活倍数为样品组与空白组的表达量相比值，与空白对照组相比，0.125%、0.25%浓度的鳄梨油不皂化物分别具有显著激活PPARα（1.62倍，p＜0.01；1.75倍，p＜0.001）及PPARγ（2.25倍，p＜0.001；3.45倍，p＜0.001）表达的作用；0.8%、2%浓度的灵芝孢子油具有显著激活PPARα（1.24倍，p＜0.05；1.25倍，p＜0.01）及PPARγ（1.70倍，p＜0.001；1.98倍，p＜0.001）表达的作用；1.5%浓度的海檀木籽油具有显著激活PPARα表达（1.26倍，p＜0.05）及PPARγ表达（1.64倍，p＜0.01）的作用；0.25%浓度的向日葵籽油不皂化物具有显著激活PPARα表达（1.22倍，p＜0.05）的作用；红花籽油、山茶籽油、角鲨烷、亚麻酸、亚油酸均未有明显激活效果。与PPARα阳性对照组（非诺贝特）相比，除组合物外，样品中只有0.125%、0.25%浓度的鳄梨油不皂化物具有显著上调PPARα表达的作用。与PPARαγ阳性对照组（罗格列酮）相比，除组合物外，样品中只有0.25%浓度的鳄梨油不皂化物具有显著上调PPARγ表达的作用。由0.125%鳄梨油不皂化物、1%灵芝孢子油、0.75%海檀木籽油、0.125%向日葵籽油不皂化物组合的2%油脂组合物（实施例2）在激活PPARα和PPARγ表达方面表现出最为显著的作用（1.99倍，p＜0.001；3.84倍，p＜0.001）。采用本发明实施例1、实施例3-11进行同样的实验，也能达到本发明所述的有益效果。

综上所述，结果表明鳄梨油不皂化物、灵芝孢子油、海檀木籽油能够作为一种配体去激活PPARα和PPARγ的表达，向日葵籽油不皂化物能够作为一种配体去激活PPARα的表达，其中鳄梨油不皂化物在较低浓度就表现出最强活性。相比较单一低浓度鳄梨油不皂化物、灵芝孢子油、海檀木籽油、向日葵籽油不皂化物，由四种进行一定比例复配的油脂组合物具有协同增效的作用，可显著提升对PPARα和PPARγ的激活效果。

实验二：油脂组合物（实施例2）对PPARα、PPARγ蛋白表达的调控作用。

分子生物基础研究中，虽然基因是生物体内控制遗传信息的单位,与蛋白质之间的关系非常密切，但是通过单纯的基因表达分析只可帮助我们了解基因在不同组织和时期的表达模式。然而结合蛋白质表达分析可以从更直接的角度研究细胞功能和代谢调节等问题,在验证实际蛋白调控等方面具有重要的意义。蛋白免疫荧光技术可用于对特定的蛋白进行定位，也常用于评价不同实验组对蛋白表达的影响。因此，应用蛋白免疫荧光技术，通过特定抗体与样品中的特定分子结合,利用荧光标记物可以检测目标蛋白的分布变化、含量变化和相互关系等信息。

测试方法：分别设置样品组和空白对照组和阳性药物对照组进行对比实验，样品组为油脂组合物（20mg/mL）无血清DMEM培养基为空白对照，PPARα和PPARγ实验组对应的阳性药物对照分别为非诺贝特（10μM）和罗格列酮（10μM）。将人永生化角质形成细胞（HaCaT）细胞以1×10⁵个细胞/孔的速度接种到24孔组织培养板中，于37℃、5%CO₂的培养箱中孵育24h后，弃上清，PBS清洗两遍。将实验样品分别溶于含有新鲜DMEM培养液，每孔500μL，孵育24h。用PBS洗涤细胞两次，并在含有4%多聚甲醛的冰冷PBS中固定30min。用PBS清洗细胞两次、在含有0.5%TritonX-100的冰冷PBS中透化15min，并在37℃下在含有5%BSA和0.1%TritonX-100的PBS中再封闭30min，然后在PBS中漂洗。将固定细胞与抗PPARα或PPARγ（1:100）抗体在4℃下孵育16h。用含有0.5%Triton的PBS洗涤细胞三次，并在37℃下与异硫氰酸荧光素缀合的二抗IgG抗体在含有1%FBS和0.5%TritonX-100的磷酸盐缓冲液中以1:200孵育1h。用PBS洗涤三次后，用染细胞核专用的DAPI染色液染色。用PBS洗涤三次后，加入适量免疫荧光封片剂后进行显微荧光观察。使用ImageAnalysisSystem11软件进行定量分析，空白对照组的表达量设置为100，其他实验组进行归一化处理。数据表示为平均值±标准误差，组间比较使用单因素方差分析。

结果分析：通过免疫荧光来评价油脂组合物对HaCaT细胞中PPARα和PPARγ蛋白表达的影响。如图4、图5所示（Nucleus代表细胞核，PPARα、PPARγ代表PPARα、PPARγ蛋白，Merge代表前两者的叠加，罗格列酮代表阳性药物罗格列酮处理组，非诺贝特代表阳性药物非诺贝特处理组，油脂组合物代表实验测试样品处理组；比例尺为100µm），与空白对照组相比，油脂组合物与HaCaT细胞共培养24h后，PPARα和PPARγ蛋白的表达量显著提高，与阳性药物相比，PPARα和PPARγ蛋白的表达同样有显著提高。在HaCaT细胞中，与PPARα激动剂非诺贝特相比可显著提高PPARα蛋白的表达；与PPARγ激动剂罗格列酮相比可提高PPARγ蛋白的表达。通过软件对不同组别间的平均荧光强度进行定量分析，结果如图6所示。对于PPARα蛋白，与空白对照组相比，阳性药物非诺贝特处理组PPARα蛋白表达量提高到189.7%，油脂组合物处理组PPARα蛋白表达量提高到225.7%。与阳性药物相比，油脂组合物处理组PPARα蛋白的表达提高到119.0%。对于PPARγ蛋白，与空白对照组相比，罗格列酮处理组PPARγ蛋白表达量提高到160.5%，油脂组合物处理组PPARγ蛋白表达量提高到227.3%。与阳性药物相比，油脂组合物处理组PPARγ蛋白的表达提高到141.6%。

综上所述，在角质形成细胞HaCaT中，与空白对照组相比，油脂组合物（实施例2）可显著提高PPARα和PPARγ蛋白的表达。采用本发明实施例1、实施例3-11进行同样的实验，也能达到本发明所述的有益效果。

实验三：评估油脂组合物（实施例5）在皮肤3D仿皮模型中对表皮组织学、屏障修复相关蛋白、屏障脂质神经酰胺含量的影响。

采用体外替代方法逐渐成为医药化妆品功效活性和安全性评价的重要手段。其中3D仿皮模型可以作为人体“皮肤”的替代，用来做基础研究，用于化妆品、化学品、医疗器械、保健食品等行业的安全性和功效性评估。3D表皮模型EpiKutis®是以中国人皮肤组织分离出的角质形成细胞为种子细胞，使用精细调节的无血清培养基促使细胞在体外发育成复层化结构的表皮仿皮模型。其具有高度类似于天然皮肤的复层化结构、生理及代谢功能，在组织学结构上与人皮肤结构高度相似，含有角质层、颗粒层、棘层和基底层，广泛用于皮肤屏障修复等领域的检测。本试验中，基于皮肤接触刺激性因素时，会导致皮肤屏障发生临床型的急性损伤，导致皮肤干燥，出现屏障损伤现象。利用常用表面活性剂十二烷基硫酸钠溶液（SLS）模拟刺激性类皮肤损伤，通过样品处理后组织活力、组织形态、屏障脂质含量变化以及屏障相关蛋白指标来评价油脂组合物的屏障修护效果。

测试设计方案：将3D表皮模型EpiKutis®在培养箱中复苏好。以不做任何处理的模型作为空白对照，以单独施用0.1%浓度SLS作为阴性对照，以0.1%SLS联合50μMPPAR激动剂（WY14643）阳性药物作为阳性对照，以0.1%SLS联合4%油脂组合物作为样品组，每组多个平行(组织切片染色实验中为3个平行/组、屏障修护相关蛋白表达实验中为3个平行/各蛋白/组、屏障神经酰胺含量实验中3个平行/组)。施用结束后在培养箱（37℃，5%CO₂）中培养24h。方案如表2所示。

1）油脂组合物（实施例5）在3D仿皮模型中对组织活力、组织形态的影响：

组织形态是经过苏木精-伊红（H&E）染色后的组织微观生理学结构分析。通过模型组织学形态，可以直观了解不同处理条件下皮肤结构的变化情况，屏障弱化的模型很明显的能够看出角质层比较薄，因此可以通过组织活力、表皮厚度的变化来评价样品的屏障提升功能。取不同样品处理的3组平行3D表皮样品经中性缓冲甲醛溶液过夜固定，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，切片厚度3～5μm，常规HE染色，光镜观察（40X倍镜）。

测试结果：如图7（图中箭头所指为活细胞层，圆圈所指为空泡）、图8及表3所示，与空白对照组相比，阴性对照组的活细胞层受损，活细胞数减少，有空泡现象出现，平均表皮活细胞层厚度显著下降（p＜0.001），说明实验SLS刺激模型有效；与阴性对照组相比，阳性对照组的活细胞层受损现象明显改善，平均表皮活细胞层厚度显著升高（p＜0.01），说明本次测试阳性对照有效；与阴性对照组相比，油脂组合物组（实施例5）的活细胞层受损现象明显改善，平均表皮活细胞层厚度显著升高（p＜0.01），提高19.27%，说明对表皮组织形态有明显改善作用。

2）油脂组合物（实施例5）在3D仿皮模型中对屏障修复相关蛋白的影响：

在皮肤屏障形成过程中，角质层内各细胞膜间广泛交联，形成由丝聚蛋白(FLG)、内披蛋白(IVL)、兜甲蛋白(LOR)为主要成分的角质细胞角化包膜（CE），与角质层共同成为皮肤屏障的“砖块”结构。表皮中的谷氨酰胺转胺酶1（TGM1）参与角质包膜形成。此外，桥粒是表皮机械完整性中重要的细胞间的链接点之一，其中桥粒芯糖蛋白1(DSG1)是桥粒的跨膜糖蛋白，角质细胞通过角质桥粒增强稳定性，有利于减少机械性损伤。角质层外，表皮细胞紧密连接（TJ）也是对皮肤屏障完整性必不可少的结构。TJ主要由Claudins、Occludin蛋白等组成。这些TJ蛋白的膜表达量与屏障的物理防御功能关系密切，多种TJ蛋白交互连接，形成TJ复合体，蛋白质复合物将细胞彼此连接或将细胞与细胞外基质连接。通过蛋白免疫荧光染色法对不同样品处理的3组平行3D表皮样品用4%的多聚甲醛进行固定处理,固定24h后,进行FLG、IVL、LOR、DSG1、Claudin1、Occludin、TGM1蛋白的免疫荧光检测，显微镜下拍照观察，采集图片并分析相对IOD平均值（图像中每个像素的灰度值的平均值）。测试结果：

FLG蛋白是形成CE和维持细胞间凝聚力的基础，其分解可产生丙氨酸、吡咯烷酮羧酸和咪唑丙烯酸等亲水性氨基酸，这些天然保湿因子(NMFs)在维持角质层的水合作用和表面pH值起着关键作用。如图9，与空白对照组相比，阴性对照组的FLG蛋白含量显著下降（p＜0.01），说明本次测试刺激条件有效；与阴性对照组相比，FLG蛋白含量显著升高（p＜0.01），说明本次测试阳性对照有效；与阴性对照组相比，油脂组合物组（实施例5）的FLG蛋白含量升高157.14%（p＜0.01）。

IVL蛋白主要表达于棘细胞层上部与颗粒层，是角质形成细胞分化的标志性蛋白，位于CE的外层，与含有-OH的神经酰胺共价结合，由此将脂质基质和角化细胞连接起来而发挥作用。如图10，与空白对照组相比，阴性对照组的IVL蛋白含量显著下降（p＜0.01），说明本次测试刺激条件有效；与阴性对照组相比，IVL蛋白含量显著升高（p＜0.01），说明本次测试阳性对照有效；与阴性对照组相比，油脂组合物组（实施例5）的FLG蛋白含量升高31.25%。

LOR蛋白作为CE的主要成分，约占70%的含量，对皮肤屏障起加固作用，其含量的降低是皮肤屏障功能弱化的主要因素。如图11，与空白对照组相比，阴性对照组的LOR蛋白含量显著下降（p＜0.01），说明本次测试刺激条件有效；与阴性对照组相比，LOR蛋白含量显著升高（p＜0.01），说明本次测试阳性对照有效；与阴性对照组相比，油脂组合物组（实施例5）的LOR蛋白含量显著升高84.78%（p＜0.01）。

DSG1蛋白是Ca2+依赖型的黏附蛋白桥粒钙黏蛋白的一种，其分布在最外围角质层的角膜细胞上，其跨越角质化包膜进入角质细胞之间富含脂质的细胞间隙，并通过与相邻细胞上的蛋白质以顺势结合的方式提供凝聚力。如图12，与空白对照组相比，阴性对照组的DSG1蛋白含量显著下降（p＜0.01），说明本次测试刺激条件有效；与阴性对照组相比，DSG1蛋白含量显著升高（p＜0.01），说明本次测试阳性对照有效；与阴性对照组相比，油脂组合物组（实施例5）的DSG1蛋白含量显著升高54.93%（p＜0.01）。

Claudins蛋白是TJ的主要功能蛋白，对于维持皮肤屏障、TJ完整和表皮渗透功能正常具有重要作用，Claudin1的表达在特异性皮炎患者的临床特征中具有剂量依赖效应，皮肤屏障功能和皮肤形态变化随Claudin1蛋白表达水平的降低而呈指数下降。如图13，与空白对照组相比，阴性对照组的Claudin1蛋白含量显著下降（p＜0.01），说明本次测试刺激条件有效；与阴性对照组相比，Claudin1蛋白含量显著升高（p＜0.01），说明本次测试阳性对照有效；与阴性对照组相比，油脂组合物组（实施例5）的Claudin1蛋白含量显著升高115.91%（p＜0.01）。

Occludin蛋白也是TJ中的重要的组成成分，通过occludin使细胞间的空隙封闭，形成机体渗透屏障，保持细胞两侧的物质差异，维持皮肤屏障功能。如图14,与空白对照组相比，阴性对照组的Occludin蛋白含量显著下降（p＜0.01），说明本次测试刺激条件有效；与阴性对照组相比，Occludin蛋白含量显著升高（p＜0.01），说明本次测试阳性对照有效；与阴性对照组相比，油脂组合物组（实施例5）的Occludin蛋白含量升高37.14%。

TGM1编码与膜相连的钙依赖性硫醇酶，具有转移氨基酸到蛋白质的谷氨酸残基上形成异肽键的能力，参与角质蛋白膜套过程中ε-(γ谷氨酰）赖氨酸交联的形成，是角质形成细胞终末分化组成蛋白膜套的关键步骤，同时也参与细胞间粘附、细胞受体的信号传导，以及细胞的增殖，是皮肤屏障功能的物质基础。研究表明，TGM1缺失可能导致板层状鱼鳞病。如图15,与空白对照组相比，阴性对照组的TGM1蛋白含量显著下降（p＜0.01），说明本次测试刺激条件有效；与阴性对照组相比，TGM1蛋白含量显著升高（p＜0.01），说明本次测试阳性对照有效；与阴性对照组相比，油脂组合物组（实施例5）的Claudin1蛋白含量显著升高161.11%（p＜0.01）。采用本发明实施例1-4、实施例6-11进行同样的实验，也能达到本发明所述的有益效果。

3）油脂组合物（实施例5）在3D仿皮模型中对屏障脂质神经酰胺含量的影响：

皮肤屏障损伤与皮肤脂质组成有密切关系，皮肤脂质成分含量、组成结构异常可导致皮肤屏障功能受损。其中神经酰胺（CER）是主要脂质成分，总脂质占比达到50%。CER由一个脂肪酸链通过酰胺连接到鞘氨醇链。CER亚类及碳链长度的改变影响皮肤正常屏障功能。研究发现，CER链长变短加剧皮肤表面水分流失，对屏障功能的影响远大于CER亚类的变化所造成的影响，是评价皮肤屏障功能的一个重要指标。通过速液相色谱-串联四极杆质谱仪 ( Agilent 1200 SL Series RRLC/6410B Triple QuardMS,Sigma) 对不同样品处理的3组平行3D表皮样品进行定性、定量测定。

如图16，在长碳链CER含量方面，与阴性对照组相比，油脂组合物组中长碳链C63、C65、C66、C67、C68、C69、C70、C71含量分别上升11.29%、30.00%、4.84%、36.99%、4.57%、33.96%、6.42%、35.29%，其中尤其 C68、 C70相对占比显著上升（p＜0.05）。如图17，在12个CER亚类含量方面，与阴性对照组相比，油脂组合物组中E0H、EOP、NDS、NH含量分别上升73.42%、18.06%、22.74%、12.15%。综上所述，油脂组合物可提高受损角质层中长链CER的含量，改善CER亚型组分分布。

人体临床验证：油脂组合物（实施例2、实施例5）在人体皮肤中增强皮肤屏障修护的效果分析：

测试共招募16名健康受试者，年龄在25-38岁之间，排除标准包括在过去7天内有任何皮肤病、糖尿病、非甾体抗炎药摄入、功效护肤品应用。本测试选择毛囊密度相对较低、且受日常活动影响较小的前臂内侧作为测试部位，采用皮肤斑贴试验法诱导皮肤屏障损伤。皮肤接触刺激性因素时，会导致皮肤屏障发生临床型的急性屏障损伤，导致皮肤干燥，出现经表皮水分流失值（TEWL）升高、角质层水分含量下降等现象。本测试利用常用表面活性剂SLS模拟刺激性类皮肤损伤，通过不同样品处理后屏障修复相关指标（TEWL、角质层水分含量）来评价待测物的增强修护屏障的效果。

测试方法：所有受试者在诱导屏障损伤前、诱导屏障损伤后、施用各样品3天、施用各样品7天，分别采集受试部位TEWL及角质层水分含量，通过比较施用样品2%油脂组合物（实施例2）、4%油脂组合物（实施例5）前后皮肤屏障指标的变化与安慰剂、阳性药物组（醋酸地塞米松乳膏）之间的差异。将25μL十二烷基硫酸钠溶液（1%浓度SLS）加入直径8mm带滤纸片的斑试器小室中，共5个圆形测试区域， 24小时后移除斑试器，对受试部位不做任何处理后3天进行TEWL值和皮肤角质层含水量的测量。基线测量完毕后，受试区域连续7日，每日施用2次样品、安慰剂与阳性对照药物，在每个测试区域（面积为2cm×2cm，每个测试区域间隔1cm以上）使用移液枪移取相同体积13μL的样品，佩戴指套以相同手法与力度涂抹于测试区域。每个受试者的施用位置随机设置，确保在统计学上达到平均。在每个测试日被要求在恒温恒湿（室温21℃±1℃，相对湿度50%±10%）环境适应30分钟。用皮肤经表皮水分流失值测试仪Tewameter®（TMHex，CK，德国）测量TEWL值，该方法依据菲克扩散定律；用皮肤水分含量测试仪Corneometer®（CM825，CK，德国）测量皮肤角质层水分含量，该方法的测试原理为电容法，基于水的介电常数（81）和其他物质介电常数（大部分＜7）的显著差异，当水分含量发生变化时，皮肤的电容值也随之变化。每个受试区域分别重复测量3次，取平均值。所有数据采用夏皮洛-威尔克（Shapiro-Wilk）检验其正态分布性，目标样品与对照之间的采用配对T-test或秩和Wilcoxon配对检验，所有检验均为双侧，且α=0.05。

测试结果：在基线，各试验区域的皮肤角质层水分含量平均值在29.5-31.6之间、TEWL平均值8.1-8.7之间，通过敷贴1%的SLS溶液24小时并移除斑试器且不对试验区域做任何处理，三天后，试验区域的水分含量下降至27.1-29.0之间，TEWL值显著上升至13.1-13.71之间（p＜0.001）。如表4，整体数据表明皮肤斑贴试验法成功诱导屏障损伤。

表4：16名受试者在诱导屏障损伤前、诱导屏障损伤后、施用各样品3天、施用各样品7天的平均皮肤角质层含水量及平均TEWL值。

皮肤角质层含水量变化率对比结果：如图18所示，受试区域每日施用2次活性物、安慰剂与阳性对照组3天后，4%油脂组合物（实施例5）与SLS损伤后水分含量的差值变化率（1.8%）相较于安慰剂组与SLS损伤后水分含量的差值变化率（-12.6%）有显著改善（p＜0.05）；施用7天后，4%植物油组合与SLS损伤后水分含量的差值变化率（21.7%）相较于安慰剂组与SLS损伤后水分含量的差值变化率（-2.0%）有显著改善（p＜0.05）、相较于空白组与SLS损伤后水分含量的差值变化率（-1.2%）也有显著改善（p＜0.05）。

TEWL值变化率对比结果：如图19所示，受试区域每日施用2次活性物、安慰剂与阳性对照组3天后，4%植物油组合（实施例5）与SLS损伤后TEWL值的差值变化率（-19.6%）相较于安慰剂组与SLS损伤后TEWL值的差值变化率（-12.6%）有显著改善（p＜0.05）；施用7天后，4%植物油组合（实施例5）与SLS损伤后TEWL值的差值变化率（-27.4%）相较于空白组与SLS损伤后TEWL值的差值变化率（-18%）有显著改善（p＜0.05）、同时2%植物油组合（实施例2）与SLS损伤后TEWL值的差值变化率（-29.5%）相较于安慰剂组与SLS损伤后TEWL值的差值变化率（-19.8%）也有显著改善（p＜0.05）。

综上所述，基于在人体皮肤建立皮肤损伤模型的条件下，4%浓度的油脂组合物在施用3天后显著提升角质层含水量、降低TEWL值，具有皮肤屏障修护的作用；2%、4%浓度的油脂组合物（实施例2、实施例5）在施用7天后同样显著提升角质层含水量、降低TEWL值，具有显著地增强皮肤屏障修护的作用。采用本发明实施例1、实施例3-4、实施例6-11进行同样的实验，也能达到本发明所述的有益效果。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修过、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其同等物体限定。

Claims

1.一种具有过氧化物酶体增殖物激活受体激动作用的天然油脂组合物，其特征在于含有重量百分含量的以下组分：鳄梨油不皂化物0.125%-0.5%、灵芝孢子油0.5%-5%、海檀木籽油0.5%-5%、向日葵籽油不皂化物0.125%-0.5%；

所述鳄梨油不皂化物选用分子蒸馏技术制备的不皂化物含量≥30%的鳄梨油不皂化物；所述灵芝孢子油选用超临界CO₂萃取技术制备的总三萜含量≥30%的灵芝孢子油；所述海檀木籽油选用冷压萃取技术制备的西门尼酸含量≥20%的海檀木籽油；所述向日葵籽油不皂化物选用分子蒸馏技术精制浓缩的富含不皂化物甾醇＞3.5%的向日葵籽油不皂化物。

2.如权利要求1所述的一种具有过氧化物酶体增殖物激活受体激动作用的天然油脂组合物，其特征在于含有：鳄梨油不皂化物0.15%-0.3%、灵芝孢子油1%-3%、海檀木籽油1%-3%，向日葵籽油不皂化物0.2%-0.35%。

3.如权利要求1所述的一种具有过氧化物酶体增殖物激活受体激动作用的天然油脂组合物的制备方法，其特征在于：将各组分加入至辛酸/癸酸甘油三酯中，搅拌至完全溶解，即得天然油脂组合物。

4.如权利要求1所述的一种具有过氧化物酶体增殖物激活受体激动作用的天然油脂组合物在制备改善皮肤表皮组织结构、提高屏障修复相关蛋白含量、增强皮肤屏障修护的护肤品或医药制剂中的应用。