CN117191902A - 一种基于铜纳米花和eATRP反应级联信号放大的通用病毒电化学检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于铜纳米花和eATRP反应级联信号放大的通用病毒电化学检测方法，其检测原理为：合成功能化磁性颗粒及杂化铜纳米花分别用作病毒特异序列的识别和信号标签。目标病毒存在时，通过磁性分离可以将信号标签杂化铜纳米花引入反应体系，进一步通过抗坏血酸AA还原生成亚铜离子，结合原子转移自由基聚合eATRP反应，可实现电信号分子甲基丙烯酸二茂铁FMMA在核酸探针Sp修饰的金电极表面的聚合，产生级联放大电化学信号，经方波伏安法测定电流强度，绘制电流强度与目标病毒浓度的标准曲线，实现病毒浓度的定量。该方法特异性好，灵敏性高，通过更换目标病毒特异性序列以及相应探针可进行各种病毒的通用检测。
Description
技术领域
一种基于铜纳米花和eATRP反应级联信号放大的通用病毒电化学检测方法，属于生命科学技术领域。
背景技术
大多数疾病都是由病毒引起的，病毒传染病给全球各地人们的生命健康都造成了严重的危害。
目前，广泛应用于检测病毒的方法分为两大类，即血清学检测和核酸检测。基于免疫球蛋白(IgM/IgG)的主流血清学检测(试纸条)快速、简便且无需设备，但但由于患者被感染后需要几天到几周的时间才能产生任何可检测到的抗体，而难以进行早期诊断。分子诊断可以实现早期诊断，分子诊断检测包括聚合酶链反应(PCR)、环介导的等温扩增(LAMP)和重组酶聚合酶扩增(RPA)。PCR被认定为检测病毒的“金标准”，但该技术依赖于昂贵的试剂和精密的仪器，并且步骤复杂且耗时。LAMP相较于PCR检测速度更快，但其假阴性率(FNR)较高。RPA在低温下扩增核酸的速度比LAMP更快，但需要几种酶的参与，在成本和可操作性方面仍然存在一些不足。因此，迫切需要高效、准确、成本低的检测工具用于诊断病毒。
为了实现病毒的高灵敏度检测，研究者们已经设计出多种智能信号放大策略，如铜纳米花材料凭借良好的蛋白质稳定性和巨大的比表面积的优势在信号放大方面得到了广泛的关注。将铜纳米花催化的化学反应与适当的放大策略相关联，如等温放大、链位移放大、滚圈放大和基于聚合物的放大等，可构建一个级联放大信号的检测体系，其中，基于聚合物的扩增策略成本低、简单、高效，在检测过程中表现突出。
发明内容
针对当前检测技术的不足，本发明的目的在于通过构建一种基于铜纳米花和eATRP反应级联信号放大的通用病毒电化学检测方法，通过铜纳米花、点击化学和eATRP反应的巧妙集成，构建一个级联放大检测信号的电化学生物传感器，有望实现对目标样品中病毒的超灵敏检测。
本发明的技术方案为：
一种基于铜纳米花和eATRP反应级联信号放大的通用病毒电化学检测方法，包括以下步骤：
(1)杂化铜纳米花的制备
将链霉素亲和素SA(20μL，5mg/mL)和CuSO4溶液(6.7μL，120mM)添加到磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液(1mL，30mM，pH＝7.4)中。25℃孵育72h，10000rpm离心10min。然后，用超纯水洗涤得到的沉淀物两次，以去除未结合的成分。随后，将收集到的沉淀物在1mL的超纯水中重悬，并在真空下进行冻干。然后，将30μL 100μM Cp 1与100μL 1mg/mL SA-Cu3(PO4)2HNFs在PBS中混合。37℃孵育2h，1000rpm离心20min。离心后用PBS洗涤2次，最后用100μLPBS重悬，得Cp 1-Cu3(PO4)2HNFs。
(2)功能化磁性颗粒的合成
将10μL Cp 2-MBs，10μL Cp 1-Cu3(PO4)2HNFs和10μL(1μM)RdRP_SARSr-P2混合摇晃60min，磁性分离洗涤。
(3)Sp修饰的金电极的制备
将10μL 1μM的Sp滴加到干净的金电极上，在37℃下孵育1.5h，然后，将金电极用TE缓冲溶液冲洗两次并用氮气吹干。用2mM的MCH溶液封闭电极0.Sh并再次用TE缓冲液冲洗两次并用氮气吹干。
(4)基于铜纳米花和eATRP反应的级联信号放大
将信号标签杂化铜纳米花引入反应体系，加入50μL 0.5μM的抗血坏酸溶液反应30min，使铜纳米花表面附着的铜离子还原为亚铜离子，加入50μL PBIB溶液使其终浓度为4mM，紧接着加入0.9mL N-二甲基甲酰胺溶液，50μL 10mM FMMA，50μL 10mM CuBr2/Me6TREN，0.5mL 1.0M KBr，3.5mL 0.1M六氟磷酸钾KPF6，在恒电位-0.53V条件下进行eATRP反应。
(5)电化学检测
将进行上述(5)后所得的金电极放入1M LiClO4溶液中并用方波伏安法检测LiClO4中二茂铁的氧化还原电流，其设置为：初始电位0V，终止电位0.6V，电位增量4.0mV，脉冲幅值25mV。
附图说明
图1为检测体系的病毒核酸检测结果图。
图2为不同浓度病毒核酸的检测结果图：(A)不同浓度SARS-CoV-2的检测的方波伏安图，(B)SARS-CoV-2与对应电流强度的线性关系图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1.病毒核酸检测实验
选取目标病毒核酸标准溶液进行检测结果验证，本实施例的检测方法包括的步骤同发明内容(1)-(5)。如图1所示，首先，在不添加目标病毒核酸(曲线b)下进行检测，此时电流强度较弱，而对比添加了目标病毒核酸(曲线a)时，能够发现电流明显增强，通过对比实验，充分证明了该电化学检测方法能够被成功应用于目标病毒核酸的快速检测。
实施例2.不同浓度病毒核酸的检测实验
选取浓度分别为0.1、1、10、100、1000nM的目标病毒核酸标准溶液进行检测，本实施例的检测方法包括的步骤同发明内容(1)-(5)。如图2(左)所示，随着溶液中目标病毒核酸浓度的不断升高，电极表面的电流不断增大。如图2(右)所示，根据不同浓度目标病毒核酸溶液产生的电流得到的线性结果图，该生物传感器的线性检测方程为：I＝1.22773+0.48718lgC(R2＝0.999)，检测范围为10-1nM到103nM，最低检测限为33.8pM。这表明本发明方法特异性好，灵敏性高，普遍适用于各种病毒的检测。
Claims (7)
1.一种基于铜纳米花和eATRP反应级联信号放大的通用病毒电化学检测方法，其特征是合成功能化磁性颗粒及杂化铜纳米花分别用作病毒特异序列的识别和信号标签，而后当目标病毒存在时，通过磁性分离可以将信号标签杂化铜纳米花引入反应体系，进一步通过抗坏血酸AA还原生成亚铜离子，结合原子转移自由基聚合eATRP反应，可实现电信号分子甲基丙烯酸二茂铁FMMA在核酸探针Sp修饰的金电极表面的聚合，产生级联放大电化学信号，经方波伏安法测定电流强度，绘制电流强度与目标病毒浓度的标准曲线，实现病毒浓度的定量；该方法以新型冠状病毒感染为模型分子，其中所述的病毒特异序列RdRP_SARSr-P2序列为：5′-CAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGC-3′，所述的杂化铜纳米花表面修饰的的SARS-CoV-2互补探针1即Cp1序列为：5′-biotin-CCCGCATCTCCTG-3′，所述的磁性颗粒表面修饰的核酸探针SARS-CoV-2互补探针2即Cp2序列为：5′-GTTCCACCTG-biotin-3′，所述的金电极表面修饰的SARS-CoV-2核酸探针Sp序列为：5′-SH-C6-GTGGGTAGG-N3-3′。
2.根据权利要求1所述的一种基于铜纳米花和eATRP反应级联信号放大的通用病毒电化学检测方法，其特征是制备杂化铜纳米花，制备过程是将链霉素亲和素SA和CuSO4溶液添加到PBS缓冲液中，25℃孵育并离心，用超纯水进一步处理后将所得的SA-Cu3(PO4)2HNFs与Cp 1在PBS中混合，37℃孵育并离心，再次经PBS处理后获得Cp1-Cu3(PO4)2HNFs。
3.根据权利要求1所述的一种基于铜纳米花和eATRP反应级联信号放大的通用病毒电化学检测方法，其特征是合成的功能化磁性颗粒及杂化铜纳米花分别用作病毒特异序列的识别和信号标签，而后当目标病毒存在时，通过磁性分离可以将信号标签杂化铜纳米花引入反应体系，其过程是合成功能化磁性颗粒Cp 2-MBs、权利要求2获得的Cp 1-Cu3(PO4)2HNFs和RdRP_SARSr-P2混合并磁性分离洗涤。
4.根据权利要求1所述的一种基于铜纳米花和eATRP反应级联信号放大的通用病毒电化学检测方法，其特征是核酸探针Sp修饰的金电极的制备，其过程是将溶于Tris-EDTA缓冲液的Sp滴加到干净的金电极上孵育，用TE缓冲溶液冲洗两次并用氮气吹干后，用MCH溶液封闭电极并再次用TE缓冲液冲洗两次并用氮气吹干。
5.根据权利要求1所述的一种基于铜纳米花和eATRP反应级联信号放大的通用病毒电化学检测方法，其特征是基于铜纳米花和eATRP反应级联信号放大过程，其具体过程是将信号标签杂化铜纳米花引入反应体系，加入AA使铜纳米花表面附着的铜离子还原为亚铜离子后，通过点击化学反应在修饰金电极界面加入eATRP反应的引发剂PBIB溶液，紧接着加入N-二甲基甲酰胺溶液，10mM FMMA，10mM CuBr2/Me6TREN，1M KBr，0.1M六氟磷酸钾KPF6，在恒电位-0.53V条件下进行eATRP反应。
6.根据权利要求1所述的一种基于铜纳米花和eATRP反应级联信号放大的通用病毒电化学检测方法，其特征是进行电极界面聚合分子的电化学测定，具体步骤是将进行权利要求5所得的金电极放入1M LiClO4溶液中，用方波伏安法测定氧化还原电流，其设置为：初始电位0V，终止电位0.6V，电位增量4.0mV，脉冲幅值25mV。
7.根据权利要求1所述的一种基于铜纳米花和eATRP反应级联信号放大的通用病毒电化学检测方法，其特征是该电化学检测以新型冠状病毒感染为模型分子进行研究，是一种通用的病毒检测方法，通过更换目标病毒特异性序列以及相应探针可实现其它病毒的通用检测。
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| PB01 | Publication | ||
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