CN117187342A - 一种基于质谱检测肠道内单个细菌代谢物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于质谱检测肠道内单个细菌代谢物的方法,包括:在无菌小鼠中定殖单种细菌,将无菌鼠肠道内的微生物制备细菌悬液,在毛细管中注入溶液,推出毛细管中的溶液覆盖单个细菌,对单个细菌的代谢物进行提取,向毛细管施加电压,通过质谱检测肠道内细菌的代谢物。本发明提供的方法无需进行裂解、色谱分离等繁琐的前处理过程,即可实现对肠道样本中单个微生物的代谢组检测,与目前的肠道内容物整体质谱分析相比,具有将细菌代谢组与宿主细胞、食物来源代谢物相区分的能力,能够检测细菌群体中每个细菌个体独特的代谢组差异,且可与体外培养的细菌代谢物相区分,具有高精度、快速、非靶向等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,尤其涉及一种基于质谱检测肠道内单个细菌代谢物的方法。
背景技术
细菌(Bacteria),是一类细胞结构简单、细胞壁坚韧、以二等分裂方式繁殖和水生性较强的原核微生物,是自然界中分布最广、数量和种类最多、与人类关系极为密切的一类微生物。
细菌在生物体内和体外均能生长,由于生长环境不同,产生的代谢产物也会有所不同。人体肠道中共生着数目庞大的微生物群落,肠道内总细菌含量可达1014。据报道,血清中约有三分之一的代谢物由细菌产生,或经细菌修饰。众多肠道菌来源的代谢物,不仅参与了细菌自身代谢和群体感应,也对宿主的免疫具有调节作用。因此,对肠道微生物来源的代谢物进行检测,与体外生长的微生物代谢物进行区分,对于细菌代谢以及细菌与宿主免疫相互关系的研究至关重要。
目前,对于肠道内容物中代谢物检测的方法与检测其他组织样本类似,需要包括裂解、淬灭、有机溶剂萃取等前处理,这种方法只能对肠道内容物这一整体进行检测,无法把肠腔内代谢物和细菌内部代谢物进行区分,无法区分这些代谢物是完全由宿主产生,还是由细菌产生或修饰。同时,这一方法只能检测菌群这一整体在组间的代谢差异,无法明确每个细菌个体的代谢差异性。此外,复杂的前处理过程可能导致部分不稳定代谢物的降解,不利于获得细菌精准的、实时的代谢数据。
为了对肠道细菌有更加全面的了解,研究人员开发了许多方法对肠道中单个细菌的代谢进行分析,如常见的荧光显色法。该方法灵敏度极高,可以对肠道中单个细菌的代谢物进行荧光成像分析。然而,荧光的方式需要知道细菌的信息从而制备特异性分子对细菌进行靶向标记,所以荧光的方式无法对未知细菌的代谢进行分析。且荧光的方式只能靶向标记某一类的代谢物,无法全面的对细菌所有代谢物进行分析,从而使得细菌代谢信息获取不完全,无法得到广泛准确的结果。
质谱,是一种用于测量分析物的质量和电荷,并根据质荷比实现代谢物分析的技术。由于其无需标记、能够对样品中所有代谢物进行非靶向、快速分析的优点,被广泛应用于生物样品的代谢分析。然而,由于肠道中除了细菌还存在大量的粪便等干扰,这些干扰中也存在大量的代谢物,这些干扰代谢物会掩盖细菌代谢物,影响对单个细菌的代谢检测与判断;且单个细菌体积极小、代谢物含量极低,这些问题给质谱分析肠道菌群中单个细菌带来巨大的挑战。因此,有别于肠道内容物整体的质谱检测,对肠道内单个细菌分别进行质谱检测,有助于区分微生物群落中的每个个体的代谢差异,有助于将细菌内部代谢产物与肠道环境中的宿主、饮食来源代谢物进行区分,对研究细菌代谢有重要意义。
发明内容
针对上述存在的技术问题,本发明能够提供一种基于质谱检测肠道内单个细菌代谢物的方法,以期至少部分地解决上述技术问题。
为了解决上述技术问题,本发明提供的技术方案如下:
一种基于质谱检测肠道内单个细菌代谢物的方法,包括以下步骤:
步骤(1):在无菌小鼠中定殖单种细菌;
步骤(2):处死小鼠,取小鼠肠道;
步骤(3):灌洗步骤(2)中的小鼠肠道,冲洗出小鼠肠道中的细菌,得含有细菌的灌肠溶液;
步骤(4):将步骤(3)中的灌肠溶液过大孔径滤网,通过过滤的方式截留灌肠溶液中大于细菌的大颗粒干扰,使细菌通过滤网,获得减少大颗粒干扰的细菌溶液;
步骤(5):将步骤(4)获得的细菌溶液离心、收集菌体,用无菌溶液重悬;
步骤(6):将步骤(5)所得的细菌溶液滴加在载玻片上,将细菌固定在玻璃片上;
步骤(7):毛细管内注入溶液,在显微镜下推出溶液,使溶液刚好覆盖单个细菌,待细菌内的代谢物扩散到溶液中后吸回溶液;推出溶液的量以细菌的大小决定,以覆盖细菌的大小为宜,过多的溶液将会导致代谢物的稀释且萃取到细菌以外的干扰物质,过少的溶液将会使细菌代谢物释放不完全;
步骤(8):在步骤(7)的毛细管中施加电压,通过质谱检测单个细菌的代谢物信号。
优选地,所述步骤(1)之后还包括步骤(1a)无菌小鼠的定殖检测。
更进一步地,所述定殖检测是通过对小鼠粪便抽提DNA进行测序分析。
优选地,步骤(2)所述取小鼠肠道后可以对整个肠道的细菌进行取样,也可以将肠道分成不同肠段进行不同肠道部位细菌取样。
优选地,步骤(4)所述大孔径滤网的滤孔大小为10-70μm,根据细菌的大小选择滤孔大小,使细菌通过滤孔,颗粒干扰无法通过滤膜。
优选地,步骤(3)所述灌洗使用的溶液及步骤(5)所述无菌溶液选自水、PBS、生理盐水一类不影响细菌生存状态的溶液。
优选地,步骤(6)所述细菌固定在玻璃板上的方式包括但不限于直接干燥、静电吸附或共价结合。
优选地,步骤(7)所述毛细管的直径大小为0.22-5μm,根据细菌的大小选择毛细管直径大小。
优选地,步骤(7)所述溶液包括但不限于甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、氯仿、甲酸、乙酸或上述与水的混合溶液中的一种或两种以上。
优选地,步骤(8)所述施加电压为交流电压或直流电压,电压为2-5kV。
本发明具有以下有益效果:
(1)灵敏度高,通过滤网反复过滤的方式排除肠道中粪便等物质的代谢干扰;进一步控制提取溶液的体积,对肠道菌群中单个细菌的代谢物进行检测,得到不同肠段中细菌代谢差异及异质性信息,从而对菌群在肠道中的功能、发病机制等有更加全面的了解。
(2)非靶向分析,不同于荧光等分析方式,可以对肠道中细菌的代谢全谱进行分析,获取体内体外培养的代谢差异,以及肠道中不同肠段菌群的代谢差异,寻找潜在的生物标志物。
(3)获取准确的代谢物信息,对肠道菌群中活体单个细菌的代谢直接进行检测,无细菌裂解等可能使细菌代谢发生改变的前处理操作,可获得较为真实的代谢信息,更加准确的了解细菌的代谢状态。
(4)操作简单,通过灌洗、过滤的方式即可分选出肠道菌群中的单个细菌,从而对获取的活细菌直接进行代谢分析,无需如色谱分离、扩增等繁琐的前处理操作。
(5)使用范围广,不受细菌种类的影响,适用于所有肠道细菌的代谢检测,也可对未知细菌的代谢进行检测与分析。
附图说明
图1是本发明基于质谱检测不同肠段单个细菌内代谢物的方法流程图;
图2是定殖普通拟杆菌的无菌鼠粪便DNA测序结果;
图3是实施例2中大肠与小肠中细菌代谢变化火山图;
图4是实施例3普氏梭杆菌(Flavonifractor plautii)定殖的测序结果;
图5是实施例3中单菌各肠段定殖的聚类分析;
图6是实施例3中盲肠与大肠部位代谢物差异火山图;
图7是实施例3中盲肠与小肠后端代谢物差异的火山图;
图8是实施例3中盲肠与小肠前端代谢物差异的火山图;
图9是实施例3中大肠与小肠后端代谢物差异的火山图;
图10是实施例3中大肠与小肠前端代谢物差异的火山图;
图11是实施例3中小肠前端与小肠后端代谢物差异的火山图;
图12是实施例4中结肠、盲肠、十二指肠、空肠及回肠五个不同肠段中细菌代谢分型图;
图13是实施例4中结肠、盲肠、十二指肠、空肠及回肠五个不同肠段中脯氨酸信号变化图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,并参照附图,对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
如图1所示,将普通拟杆菌定殖无菌小鼠进行活体单细菌代谢物检测,包括以下步骤:
(1)普通拟杆菌的体外培养
将100μL普通拟杆菌甘油菌接种到含维生素K1(100mL添加两只0.1mg的维生素溶液)和氯化血红素(100mL培养基中添加两只0.5mg的氯化血红素)的GAM肉汤培养基(Solarbio LA7310),体外培养48小时。
(2)无菌小鼠定殖
将无菌的C57/小鼠(雄,10-12周,购买自集萃药康)的运输装置与安全柜传递窗相连,采用二氧化氯消毒液消毒半小时,将鼠由传递窗转入实验台中。使用购买辐照消毒之后的饲料与粮食,高压之后的水,高压灭菌的金属笼盒,在外表面消毒后放入实验台中。每只小鼠灌胃普通拟杆菌0.8OD 100μL,随后将鼠放入独立笼盒,转出至安全柜。在独立笼盒中培养2周。
(3)无菌小鼠的定殖检测
定殖2周后,收集的小鼠粪便抽提DNA。小鼠粪便分别加入200μL SDS,200μL破碎珠,400μL DNA结合溶液PCR-A(AxyPrep AP-PCR-250),400μL酚氯仿,用组织破碎仪充分混匀,12000rpm离心 5min,转移上清液到制备管(AxyPrep试剂盒内提供)中,将制备管置于 2mL 离心管(AxyPrep试剂盒内提供)中,12000×g 离心 1 min,弃滤液。将制备管置回 2 mL离心管,加 700 μL Buffer W2(去盐液,试剂盒内提供),12000×g 离心 1 min,弃滤液。将制备管置于洁净的 1.5 mL 离心管(试剂盒内提供)中,在制备管膜中央加 25-30 μL去离子水,室温静置 1 min。12000×g 离心 1 min洗脱DNA,稀释至2ng/μL,获得粪便菌DNA。采用347qPCR引物,检测347定殖效果(表1)。委托通用生物公司,对粪菌DNA进行测序,检测是否有其他菌污染(图2)。
普通拟杆菌qPCR引物如下:
F:GATTGGCATCCACTCGCGTG;R:CGTGAGGTGTCGGCTTAAG。
16s引物如下:
27F:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG;342R:CTGCTGCSYCCCGTAG。
表1 普通拟杆菌定殖无菌小鼠的qPCR结果
模板-无菌鼠 | 模板-定殖鼠 | 模板-水 | |
引物-16s | 25.22 | 8.12 | 27.6 |
引物-普通拟杆菌 | 33.13 | 8.58 | 31.39 |
表1中,模板是指粪便DNA的来源,分别为无菌鼠来源、定殖普通拟杆菌鼠来源、以及用以稀释以上两组粪便DNA的水作为阴性对照。引物16s用以检测总的细菌丰度,引物普通拟杆菌用以检测普通拟杆菌的丰度。表中数值为CT值,数值越小,细菌含量越高。表1结果表明,普通拟杆菌成功定殖无菌鼠。
图1中,结果为单峰,证明定殖过程中并无其他菌污染。进一步将测序得到的序列结果与GenBank比对,该序列与普通拟杆菌的相似度达到99.52%,确认定殖的为普通拟杆菌。
(4)普通拟杆菌单菌悬液的制备
采用颈椎脱臼法牺牲小鼠,剪开小鼠腹腔,取出小鼠整根大肠。采用无菌灌胃针和无菌注射器冲洗肠道,将内容物收集到50mL离心管中。采用40μm的滤膜过滤肠道内容物,除去食物残渣。随后离心机3000rpm离心10min收集菌体。用无菌PBS重悬。
(5)小鼠肠道中细菌的定位
将步骤(4)中获得的细菌溶液滴在多聚赖氨酸载玻片上,静置30min,使细菌吸附固定在多聚赖氨酸载玻片上,去离子水冲洗,室温下干燥多聚赖氨酸载玻片,在显微镜下观察玻璃片上的细菌。
(6)毛细管制备
使用P1000拉针仪,拉制尖端直径为5μm毛细管。
(7)提取单个活细菌代谢物
在步骤(6)中拉制好的毛细管中注入去离子水(含1%甲酸)溶液。将毛细管固定于微操平台上,显微镜下将毛细管定位接触细菌,注射泵推出毛细管中的溶液,使推出的溶液覆盖细菌,待细菌内的代谢物扩散到溶液中后,吸回溶液。
(8)单细菌代谢物质谱分析
将步骤(7)中含有细菌代谢物的毛细管置于质谱入口前端,施加3kV交流电压,采集单个细菌质谱图,所得肠道内普通拟杆菌代谢检测结果如表2所示。表2是采用单菌质谱检测到的丰度最高的前200个代谢物在细菌中的相对含量,1-6代表六个不同的细菌(6次重复),前两列分别为代谢物名称和质荷比(m/z),其余数字代表单个细菌中检测到的该代谢物的相对含量。
表2 单菌质谱对肠道中普通拟杆菌的代谢物检测结果
实施例2
小鼠大肠与小肠两个不同肠段中单个细菌代谢产物检测与分析,包括以下步骤:
(1)大肠与小肠中细菌的分离:
参考实施例1的步骤1-3,将屎肠球菌(Enterococcus faecium)定殖到无菌小鼠。处死小鼠,取出小鼠的肠道。将小鼠肠道在大肠与小肠交汇处剪成两段,分别获取小鼠的大肠肠段及小肠肠段。分别用无菌的PBS冲洗肠道内容物,将大肠肠段及小肠肠段内容物分别收集到2个无菌50mL离心管。用40μm的滤膜过滤,除去食物残渣。滤液3000rpm离心10分钟,收集各肠段细菌,用无菌PBS重悬为细菌悬液。
(2)细菌的定位:
将步骤(1)中获得的大肠肠段及小肠肠段的细菌溶液分别滴在两块多聚赖氨酸载玻片上,静置30min,使细菌吸附固定在多聚赖氨酸载玻片上,去离子水冲洗,室温下干燥多聚赖氨酸载玻片,在显微镜下观察玻璃片上的大肠肠段及小肠肠段细菌。
(3)毛细管制备:
使用P1000拉针仪,拉制尖端直径为1μm毛细管。
(4)不同肠段单个细菌的代谢物提取:
在步骤(3)中拉制好的毛细管中注入去离子水(含1%乙醇)溶液。将毛细管固定于微操平台上,显微镜下将毛细管定位接触细菌,注射泵推出毛细管中的溶液,使推出的溶液覆盖细菌,细菌内的代谢物扩散到溶液中,吸回溶液。对大肠肠段及小肠肠段固定的细菌进行相同的代谢物提取步骤。
(5)质谱分析:
将步骤(4)中含有细菌代谢物的毛细管置于质谱入口前端,施加电压,分别采集大肠肠段及小肠肠段中单个细菌的代谢物。
(6)不同肠段单个细菌代谢分析
根据步骤(5)中测得的大肠肠段及小肠肠段中单个细菌的代谢物,对大肠肠段及小肠肠段的细菌代谢物进行分析,代谢物的变化倍数及显著性差异如图3所示,可以看出大肠肠段中的细菌代谢物与小肠肠段中的细菌代谢物具有明显的差异。其中,小肠肠段中鞘氨醇、甲基黄嘌呤以及尿嘧啶的信号明显高于大肠肠段中的细菌;而大肠肠段中色氨酸、谷氨酸、赖氨酸等信号明显高于小肠肠段中细菌的信号。因此,这些代谢物都可以作为潜在的标志物来指示细菌所处的肠段。
实施例3:单一细菌定殖无菌鼠后肠道各段细菌代谢差异分析
(1)参考实施例1的步骤1-3,将普氏梭杆菌(Flavonifractor plautii)定殖到无菌小鼠,定殖结果如图4,表明定殖过程中并无其他菌污染。
(2)各肠段细菌单菌悬液的制备
将定殖的无菌鼠脊椎脱臼法牺牲,剖开腹腔,取出小肠、盲肠、大肠。将小肠均分两端段,分别为小肠前端和后端。分别用无菌的PBS冲洗肠道内容物,将小肠前端、小肠后端、盲肠、大肠内容物收集到4个无菌50mL离心管。用40μm的滤膜过滤,除去食物残渣。滤液3000rpm离心10分钟,收集各肠段细菌,用无菌PBS重悬为细菌悬液。
(3)毛细管制备
使用P1000拉针仪,拉制尖端直径为3μm毛细管。
(4)提取单个活细菌代谢物
在步骤(3)中拉制好的毛细管中注入去离子水(含1%甲醇)溶液,将毛细管固定于微操平台上,显微镜下分别将毛细管定位接触制备好的小肠前端、小肠后端、盲肠、大肠细菌悬液中的细菌,注射泵推出毛细管中的溶液,使推出的溶液覆盖细菌,待细菌内的代谢物扩散到溶液中后,吸回溶液。
(5)不同肠段细菌代谢物质谱分析
将步骤(4)中装有细菌的毛细管置于质谱入口前端,施加3kV交流电压,采集质谱图,如图5-11,分析各肠段细菌代谢物差异。
图5中每个点为单个细菌,不同颜色代表不同肠段的细菌。距离远近代表细菌间代谢物差异大小。如图可见,同种细菌在大肠和小肠具有明显的代谢组区分。
图6是盲肠与大肠部位代谢物差异火山图;图中右侧为在盲肠中富集的代谢物,左侧为在大肠中富集的代谢物。例如,相较于大肠,尿刊酸、4-甲基戊醛等代谢物在盲肠细菌中富集。
图7是盲肠与小肠后端代谢物差异的火山图;图中右侧为在盲肠中富集的代谢物,左侧为在小肠后端中富集的代谢物。例如,相较于小肠后端,氨基丙酮、氧戊二酸、3-甲基戊二酰肉碱等代谢物在盲肠特异性富集。
图8是盲肠与小肠前端代谢物差异的火山图;例如,相较小肠前段,2-酮丁酸、亚精胺等物质在盲肠特异性富集。
图9是大肠与小肠后端代谢物差异的火山图;相较于小肠后端,吡哆胺、亚精胺在大肠中特异性富集。
图10是中大肠与小肠前端代谢物差异的火山图;相较小肠前端,氨基己二酸、氨基丙酮在大肠特异性富集。
图11是中小肠前端与小肠后端代谢物差异的火山图,相较于小肠后端,多巴醌、同型半胱氨酸在小肠前端特异性富集。
实施例4
小鼠结肠、盲肠、十二指肠、空肠及回肠五个不同肠段中单个细菌代谢的分别检测,包括以下步骤:
(1)结肠、盲肠、十二指肠、空肠及回肠五个不同肠段中细菌的分离:
参考实施例1的步骤1-3,将屎肠球菌(Enterococcus faecium)定殖到无菌小鼠。处死小鼠,取出小鼠的肠道。将小鼠肠道在不同肠段的交汇处剪断,分别获取小鼠的结肠、盲肠、十二指肠、空肠及回肠五个不同肠段。分别用无菌的PBS冲洗肠道内容物,将结肠、盲肠、十二指肠、空肠及回肠内容物分别收集到5个无菌50mL离心管。用40μm的滤膜过滤,除去食物残渣。滤液3000rpm离心10分钟,收集各肠段细菌,用无菌PBS重悬为细菌悬液。
(2)细菌的定位:
将步骤(1)中获得的五个不同肠段的细菌溶液分别滴在五块载玻片上,置于37℃中静置30min,使细菌溶液干燥在载玻片上,在显微镜下观察玻璃片上的不同肠段的细菌。
(3)毛细管制备:
使用P1000拉针仪,拉制尖端直径为1μm毛细管。
(4)不同肠段单个细菌的代谢物提取:
在步骤(3)中拉制好的毛细管中注入去离子水(含1%乙腈)溶液。将毛细管固定于微操平台上,显微镜下将毛细管定位接触细菌,注射泵推出毛细管中的溶液,使推出的溶液覆盖细菌,细菌内的代谢物扩散到溶液中,吸回溶液。对结肠、盲肠、十二指肠、空肠及回肠五个不同肠段固定的细菌进行相同的代谢物提取步骤。
(5)质谱分析:
将步骤(4)中含有细菌代谢物的毛细管置于质谱入口前端,施加电压,分别采集结肠、盲肠、十二指肠、空肠及回肠五个不同肠段中单个细菌的代谢物。
(6)不同肠段单个细菌代谢分析
根据步骤(5)中测得的结肠、盲肠、十二指肠、空肠及回肠五个不同肠段中单个细菌的代谢物,对不同肠段的细菌进行降维与可视化分析,所得分型图如图12所示,可以看出不同肠段的细菌代谢存在差异。以代谢物脯氨酸为例,脯氨酸在五个不同肠段中的信号变化如图13所示,可以看到脯氨酸在不同肠段中信号具有差异。在五个不同肠段中,脯氨酸在结肠中的信号最高,空肠次之,在十二指肠、回肠和盲肠中的含量较低。因此,脯氨酸可以作为指示细菌在不同肠段中的潜在标志物。
以上所述实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进,均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种基于质谱检测肠道内单个细菌代谢物的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤(1):在无菌小鼠中定殖单种细菌;
步骤(2):处死小鼠,取小鼠肠道;
步骤(3):灌洗步骤(2)中小鼠肠道,冲洗出小鼠肠道中的细菌,得含有细菌的灌肠溶液;
步骤(4):将步骤(3)中的灌肠溶液过大孔径滤网;
步骤(5):将步骤(4)获得的细菌溶液离心、收集菌体,用无菌溶液重悬;
步骤(6):将步骤(5)所得的细菌溶液滴加在载玻片上,将细菌固定在玻璃片上;
步骤(7):毛细管内注入溶液,在显微镜下推出溶液,使溶液刚好覆盖单个细菌,待细菌内的代谢物扩散到溶液中后吸回溶液,完成对单个细菌代谢物的提取;
步骤(8):在步骤(7)的毛细管中施加电压,通过质谱检测单个细菌内的代谢物信号。
2.根据权利要求1所述的基于质谱检测肠道内单个细菌代谢物的方法,其特征在于:所述步骤(1)之后还包括步骤(1a)无菌小鼠的定殖检测。
3.根据权利要求2所述的基于质谱检测肠道内单个细菌代谢物的方法,其特征在于:所述定殖检测是通过对小鼠粪便抽提DNA进行测序分析。
4.根据权利要求1所述的基于质谱检测肠道内单个细菌代谢物的方法,其特征在于:步骤(2)所述取小鼠肠道后可以对整个肠道的细菌进行取样,也可以将肠道分成不同肠段进行不同肠道部位细菌取样。
5.根据权利要求1所述的基于质谱检测肠道内单个细菌代谢物的方法,其特征在于:步骤(4)所述大孔径滤网的滤孔大小为10-70μm。
6.根据权利要求1所述的基于质谱检测肠道内单个细菌代谢物的方法,其特征在于:步骤(3)所述灌洗所用溶液及步骤(5)所述无菌溶液选自水、PBS、生理盐水一类不影响细菌生存状态的溶液。
7.根据权利要求1所述的基于质谱检测肠道内单个细菌代谢物的方法,其特征在于:步骤(6)所述细菌固定在玻璃板上的方式包括但不限于直接干燥、静电吸附或共价结合。
8.根据权利要求1所述的基于质谱检测肠道内单个细菌代谢物的方法,其特征在于:步骤(7)所述毛细管的直径大小为0.22-5μm。
9.根据权利要求1所述的基于质谱检测肠道内单个细菌代谢物的方法,其特征在于:步骤(7)所述溶液包括但不限于甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、氯仿、甲酸、乙酸或上述与水的混合溶液中的一种或两种以上。
10.根据权利要求1所述的基于质谱检测肠道内单个细菌代谢物的方法,其特征在于:步骤(8)所述施加电压为交流电压或直流电压,电压为2-5kV。
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PB01 | Publication | ||
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