CN117186108A - 布鲁顿酪氨酸激酶降解剂 - Google Patents

布鲁顿酪氨酸激酶降解剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中取代基如说明书中所定义；涉及所述化合物制备中的中间体；涉及包含所述化合物的药物组合物；并且涉及所述化合物在疾病治疗中的用途。

Description

布鲁顿酪氨酸激酶降解剂
本申请为2019年3月25日提交的申请号为PCT/IB2019/052392、发明名称为“3-羟基-N-(3-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)吡咯烷-1-甲酰胺衍生物”的国际申请的分案申请，该国际申请于2020年9月24日进入中国国家阶段，申请号为201980021794.0。
技术领域
本发明涉及3-羟基-N-(3-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)吡咯烷-1-甲酰胺衍生物、涉及它们的制备、涉及包含它们的药物组合物以及涉及它们在治疗由布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase)介导的病症、疾病和障碍中的用途。
背景技术
布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)是B细胞受体(BCR)信号传导的关键节点，并且是癌症中的重要靶标。许多癌症和淋巴瘤表达BTK并依赖于BTK功能，并且肿瘤浸润性B细胞中的BCR信号传导也与实体癌的促肿瘤微环境有关(J.A.Burger和A.Wiestner,Nat Rev Cancer[癌症自然评论]2018,18,148)。使用抑制剂，特别是通过半胱氨酸-481不可逆地结合BTK的抑制剂对BTK进行药理学阻断是一种既定策略，其中BTK是分子依鲁替尼的主要靶标(J.A.Burger和J.J.Buggy,Leukemia and Lymphoma[白血病和淋巴瘤]2013,54,2385)，该分子适用于治疗多种癌症(C-S Lee等人,J.Oncol.Pharm.Practice[肿瘤学药学实践杂志]2016,22,92-104.V.Kaur&A.Swami,Ann.Hematol.2017,96,1175)，以及也是分子阿卡替尼的主要靶标，该分子适用于治疗至少接受过一种在先的治疗的套细胞淋巴瘤患者(Wang M等人,Lancet[柳叶刀]2018,391,期号10121,659-667)。
BTK在自身免疫疾病中也起着至关重要的作用。缺乏BTK的小鼠在类风湿性关节炎(L.Jansson和R.Holmdahl,Clinical and experimental immunology[临床与实验免疫学]1993,94,459；L.E.Nyhoff等人,Arthritis Rheumatol.[关节炎与风湿病]2016,68,1856)、系统性红斑狼疮(Steinberg,B.J.等人,J.Clin.Invest.[临床研究杂志]1982,70,587-597)以及过敏性疾病和过敏反应(Hata,D.等人,J.Exp.Med.[实验医学杂志]1998,187,1235-1247)的标准临床前模型中受到保护，因此对BTK进行药理学阻断可能对免疫障碍的治疗有用。
鉴于上述情况，BTK的调节剂可用于治疗增生性障碍(例如癌症)和免疫(例如自身免疫)障碍。
仍然需要新的药物来治疗BTK依赖性疾病，特别是那些对现有药物有抗药性或应答差的药物。
被设计用于通过诱导其降解来减少或去除BTK蛋白的分子(以下称为“BTK降解剂”)可以有效治疗一系列BTK介导的疾病，例如增生性障碍(例如癌症)和免疫障碍。此外，BTK降解剂在对不可逆的BTK抑制剂(与BTK共价结合)具有抗性的情况下可以是有效的。抗性可以通过例如半胱氨酸-481突变成丝氨酸(或其他氨基酸取代)而产生。
BTK降解剂的潜在适应症包括但不限于造血源性癌症，例如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、移植后淋巴组织增生性障碍、毛细胞白血病、组织细胞性和树突状肿瘤以及B细胞肿瘤，如慢性淋巴细胞白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、华氏巨球蛋白血症、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、里氏综合征、和前体B淋巴母细胞淋巴瘤、原发性和继发性的多发性骨髓瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾脏边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、淋巴结外边缘区B细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、和急性成淋巴细胞性白血病。
BTK降解剂的潜在适应症还包括但不限于自身免疫障碍，例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、过敏性疾病、过敏反应和炎性病症。此外，BTK降解剂的潜在适应症包括慢性移植物抗宿主病(cGvHD)和免疫球蛋白轻链淀粉样变性(AL)。
作为潜在的治疗方法，诱导蛋白质靶标降解的原理已在例如C.M.Crews,2018,J.Med.Chem.[药物化学杂志],61(2),403-404及其引用的参考文献中进行描述。在WO2016/169989的第12页中描述了掺入依鲁替尼亚结构作为BTK结合部分的BTK降解剂分子，并且该分子掺入了E3连接酶IAP结合部分，用于将靶蛋白募集到E3泛素连接酶IAP进行降解。两种其他BTK降解剂分子(其掺入两个结构上不同的部分作为BTK结合组分)描述于Huang等人,2018,Cell Chemical Biology[细胞化学生物学]25,88-99中。该出版物中描述的分子掺入免疫调节性酰亚胺药物(IMiD)部分(泊马度胺)，用于将BTK募集到包含小脑蛋白(CRBN)的E3连接酶复合物中，用于泛素化和随后的降解。在Huang等人中也描述了基于混杂的激酶粘合剂的分子(TL12-186)，该粘合剂降解包括BTK在内的多个靶标，并且据报道还降解包括锌指DNA结合蛋白IKZF1(Ikaros)在内的某些非激酶靶标。已知IKZF1和相关蛋白IKZF3(Aiolos)被泊马度胺和来那度胺降解(J.等人2014,Science[科学]343,301-305；Petzold等人,Nature[自然]2016,532,127-130；Bjorklund等人,2015,BloodCancer Journal[血液癌症杂志],5,e354；Lu等人,2014,Science[科学],343,305-309；Gandhi等人,2014,Br.J.Haematol.[英国血液学杂志]164,811-821)。
发明内容
本发明提供了如下文所定义的具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。具有式(I)的化合物是BTK降解剂，并且因此潜在地可用于治疗由BTK介导的病症、疾病和障碍。
在本发明的一个方面，提供了具有式(I)的化合物，
其中：
R1是异丁基；
R1a是H；
R2是H或F；
R2a是H或F；
R6是H或F；
R7选自H、F、Cl、-CH3、-OCH3、和-OCH2CH3；
X1是具有式(A)或(B)的基团：
或其中，
*X1a选自*-(CH2)1-3-和*-CH2C(CH3)2-，其中该*表示该X1a基团与式(I)中的苯基环的附接点；
*X1b选自*-O-、*-OCH2-和*-CH2O-，其中该*表示该X1b基团与式(I)中的苯基环的附接点；
X2a选自式(C)、(D)、(E)、(F)和(G)：
其中**表示与X1a的附接点；
X2b选自式(E1)和(F1)：
其中**表示与X1b的附接点；
X5是CH或N；
X6是CH或N；
R3是H或-CH3；
R4是H或-CH2OH；
R5是H或-CH2OH；
Z不存在或是*-(CH2)2-3NH-，其中*表示式(C)中的Z与N原子的附接点；
Z1选自*-O-、*-C(O)-、*-(CH2)1-3-、*-(CH2)2O-和*-CH2CH(CH2OH)O-，其中*表示式(E)和式(E1)中的Z1与X5的附接点；
Z2a不存在或是-NH(CH2)4-**；
Z2b是-(CH2)3-4NH(CH2)2-**；
Z3不存在或是**-(CH2)4NH-，其中Z2a和Z3并非同时不存在；以及其中Z2a、Z2b和Z3中的每个中的**表示与式(F)和(F1)中的相应N原子的附接点；
q是0或1；并且
n和p独立地是0或1；并且
其中(i)当式(E)或式(E1)中的Z1是*-O-时，则X5和X6不是N，并且(ii)当式(E)或式(E1)中的Z1是*-(CH2)2-O-或*-CH2CH(CH2OH)O-时，则X6不是N；
或其药学上可接受的盐。
本发明涉及新颖的具有式(I)的3-羟基-N-(3-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)吡咯烷-1-甲酰胺化合物，其导致布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)降解。这些化合物被设计用于通过将BTK(包括BTK突变体，特别是赋予对BTK抑制剂特别是不可逆BTK抑制剂如依鲁替尼的抗药性的BTK突变体)募集到E3连接酶来诱导BTK降解，从而促使BTK泛素化以及其随后被蛋白酶体降解。本发明的化合物包含与新颖的配体结合的新颖的BTK结合结构域部分，该新颖的配体与E3连接酶小脑蛋白(CRBN)结合。
因此，本发明的化合物因此可能潜在地可用于治疗一系列疾病和障碍，包括增生性和自身免疫疾病，特别是由BTK介导的障碍和疾病，包括其中已经产生抗性的那些，例如通过半胱氨酸-481突变为丝氨酸(或其他氨基酸取代)。本发明的化合物还可以显示出对BTK降解的选择性(相较于其他蛋白，特别是其他酪氨酸激酶蛋白和/或(非酪氨酸激酶)IKZF蛋白家族，如IKZF1和/或IKZF3，已显示它们被IMiD(例如沙利度胺、来那度胺和泊马度胺)以及由上文提到的蛋白质降解分子TL12-186降解)。本发明的化合物还可相对于其他脱靶蛋白质如离子通道和G蛋白偶联受体(GPCR)表现出激酶选择性和/或选择性。
因此认为具有式(I)的化合物，包括其药学上可接受的盐，适用于治疗由BTK介导的病症、疾病和障碍，尤其是增殖性病症、疾病和障碍例如癌症，特别是造血系统癌症，包括B细胞肿瘤，如慢性淋巴细胞白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、华氏巨球蛋白血症、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、里氏综合征、和前体B淋巴母细胞淋巴瘤、原发性和继发性的多发性骨髓瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾脏边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、淋巴结外边缘区B细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、和急性成淋巴细胞性白血病。
在另一方面，本发明提供了具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，用于在治疗、预防或改善BTK介导的病症、疾病或障碍的方法中使用。
在另一方面，本发明提供如下组合物，这些组合物包含(例如治疗有效量的)具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的载体。
在另一方面，本发明提供如下组合，该组合包含(例如治疗有效量的)具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐以及一种或多种治疗活性剂。
具体实施方式
本文描述了本发明的各种实施例。应认识到，每个实施例中指定的特征可以与其他指定特征组合以提供本发明的另外的实施例。本文还描述了本发明的各种(列举的)实施例。
取代基的定义可应用于具有式(I)、(I’)、(I”)、(I”’)、(Ia)、(Ib)、和(Ic)的化合物(如果适用)。
取代基的定义可应用于最终产物以及相应的中间体。
本发明因此提供具有式(I)的化合物：
其中：
R1是异丁基；
R1a是H；
R2是H或F；
R2a是H或F；
R6是H或F；
R7选自H、F、Cl、-CH3、-OCH3、和-OCH2CH3；
X1是具有式(A)或(B)的基团：
或其中，
*X1a选自*-(CH2)1-3-和*-CH2C(CH3)2-，其中该*表示该X1a基团与式(I)中的苯基环的附接点；
*X1b选自*-O-、*-OCH2-和*-CH2O-，其中该*表示该X1b基团与式(I)中的苯基环的附接点；
X2a选自式(C)、(D)、(E)、(F)和(G)：
其中**表示与X1a的附接点；
X2b选自式(E1)和(F1)：
其中**表示与X1b的附接点；
X5是CH或N；
X6是CH或N；
R3是H或-CH3；
R4是H或-CH2OH；
R5是H或-CH2OH；
Z不存在或是*-(CH2)2-3NH-，其中*表示式(C)中的Z与N原子的附接点；
Z1选自*-O-、*-C(O)-、*-(CH2)1-3-、*-(CH2)2O-和*-CH2CH(CH2OH)O-，其中*表示式(E)和式(E1)中的Z1与X5的附接点；
Z2a不存在或是-NH(CH2)4-**；
Z2b是-(CH2)3-4NH(CH2)2-**；
Z3不存在或是**-(CH2)4NH-，其中Z2a和Z3并非同时不存在；以及其中Z2a、Z2b和Z3中的每个中的**表示与式(F)和(F1)中的相应N原子的附接点；
q是0或1；并且
n和p独立地是0或1；并且
其中(i)当式(E)或式(E1)中的Z1是*-O-时，则X5和X6不是N，并且(ii)当式(E)或式(E1)中的Z1是*-(CH2)2-O-或*-CH2CH(CH2OH)O-时，则X6不是N；
或其药学上可接受的盐。
具有式(I)的化合物可以由式(Ia)表示：
其中，R2、R2a、X1、R6和R7是如针对具有式(I)的化合物所定义的。
除非另有指明，否则术语“本发明的化合物”是指具有式(I)的化合物、具有其子式(Ia)、(Ib)和(Ic)的化合物及示例化合物、及其盐，以及所有的立体异构体(包括非对映异构体和对映异构体)、旋转异构体、互变异构体(包括式(I’)和(I”))和同位素标记的化合物(包括氘取代物，例如具有式(I”’)的化合物)以及固有形成的部分。
除非另有说明，否则本发明中使用的表达具有以下含义：
如本文所使用的，术语-(CH2)1-3-是指(特别是)仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链双基团，该基团中不含有不饱和，具有从1至3个碳原子，并且通过单键附接至各末端处的分子的其余部分。在此类基团的特定位置附接至分子其余部分的末端可以用指示符号*或**表示。掺入类似术语例如-(CH2)2O-、-(CH2)2-3NH-、-(CH2)3-4NH(CH2)2-和-(CH2)4NH-的基团应据此理解。
列举的实施例：
实施例1.一种具有式(I)或(Ia)的化合物或其药学上可接受的盐，如上所述。
实施例2.根据实施例1所述的化合物，其具有式(1b)：
实施例3.根据实施例1所述的化合物，其具有式(1c)：
实施例4.根据实施例1至3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2是H并且R2a是F。
实施例5.根据实施例1至3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2是F并且R2a是H。
实施例6.根据实施例1至5中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R6是H。
实施例7.根据实施例1至6中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R7选自-OCH3和-OCH2CH3。
实施例8.根据实施例7所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R7是-OCH3。
实施例9.根据实施例1至8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中*X1a是*-(CH2)1-3-。
实施例10.根据实施例9所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中*X1a选自*-CH2-和*-(CH2)2-。
实施例11.根据实施例1至10中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中X2a选自式(C)和(E)：
实施例12.根据实施例1至8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中*X1b选自*-O-、*-OCH2-、和*-CH2O-。
实施例13.根据实施例12所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中*X1b是*-O-。
实施例14.根据实施例1至8或实施例12或实施例13中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中X2b是式(E1)：
实施例15.根据实施例1至14中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R4是H。
实施例16.根据实施例1至15中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R5是H。
实施例17.根据实施例1至16中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中q是1。
实施例18.根据实施例1至17中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中n和p均为1。
实施例19.根据实施例1至18中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Z不存在。
实施例20.根据实施例1至19中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中X6是CH。
实施例21.根据实施例1至20中任一项所述的具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中Z1选自*-O-、*-(CH2)1-3-、和*-(CH2)2O-。
实施例22.根据实施例21所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Z1选自*-O-、*-CH2-、*-(CH2)2-、和*-(CH2)2O-。
实施例23.根据实施例22所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Z1选自*-O-、*-CH2-、和*-(CH2)2O-。
实施例24.根据实施例1至8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中X1选自
其中*表示式(I)、式(Ia)、式(Ib)或式(Ic)中与苯基环的附接点；
或其药学上可接受的盐。
实施例25.根据实施例24所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中X1选自：
其中*表示式(I)、式(Ia)、式(Ib)或式(Ic)中与苯基环附接的原子。
实施例26.根据实施例24或实施例25所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R4是H。
实施例27.根据实施例24至26中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R5是H。
实施例28.根据实施例24至27中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中n、p和q各自为1。
实施例29.根据实施例24至28中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Z不存在。
实施例30.根据实施例24至29中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中X6是CH。
实施例31.根据实施例24至30中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Z1选自*-O-、*-(CH2)1-3-、和*-(CH2)2O-。
实施例32.根据实施例31所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Z1选自*-O-、*-CH2-、*-(CH2)2-、和*-(CH2)2O-。
实施例33.根据实施例32所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Z1选自*-O-、*-CH2-、和*-(CH2)2O-。
实施例34.根据实施例1至8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，
X1选自：
其中*表示式(I)、式(Ia)、式(Ib)或式(Ic)中与苯基环附接的原子。
实施例35.根据实施例34所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中X1选自：
其中*表示式(I)或(Ia)中与苯基环附接的原子。
实施例36.一种具有式(I)的化合物，其中所述化合物是：
(3S,4R)-N-(3-(6-(4-((9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((4-(2-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-(2-(1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)乙基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(顺式-外消旋)-N-(3-(6-(4-(((1-(2-(1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)乙基)哌啶-4-基)氧基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
反式-外消旋-N-(3-(6-(4-((9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4R)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((4-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)哌啶-1-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(顺式-外消旋-N-(3-(6-(4-((4-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)甲基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3S,4R)-N-(3-(6-(4-((4-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)甲基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)甲基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((4-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)甲基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(4-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)哌啶-1-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)甲基)哌啶-4-基)甲氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-乙氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-6-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(顺式-外消旋)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3S,4R)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-(2-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3S,4R)-N-(3-(6-(4-(((1-(2-(1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)乙基)哌啶-4-基)氧基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(((1-(2-(1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)乙基)哌啶-4-基)氧基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、或
(顺式-外消旋)-N-(3-(6-(4-((9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
或其药学上可接受的盐。
实施例37.一种具有式(I)的化合物，其中所述化合物是
(3R,4R)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)甲基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(4-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)哌啶-1-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-6-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(顺式-外消旋)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、或
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-(2-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，
或其药学上可接受的盐。
实施例38.化合物(3R,4R)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，
或其药学上可接受的盐。
实施例39.化合物(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)甲基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，
或其药学上可接受的盐。
实施例40.化合物(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(4-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)哌啶-1-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，
或其药学上可接受的盐。
实施例41.化合物(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，
或其药学上可接受的盐。
实施例42.化合物(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-6-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，
或其药学上可接受的盐。
实施例43.化合物(顺式-外消旋)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，
或其药学上可接受的盐。
实施例44.化合物(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-(2-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，
或其药学上可接受的盐。
取决于起始材料和程序的选择，化合物能以一种可能的立体异构体形式或作为其混合物(例如作为纯的光学异构体或作为立体异构体混合物，如外消旋体和非对映异构体混合物)存在，这取决于不对称碳原子的数目。本发明意在包括所有此类可能的立体异构体，包括外消旋混合物、非对映异构体混合物和光学纯的形式。光学活性(R)-和(S)-立体异构体可以使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术拆分。如果化合物含有双键，则取代基可以是E或Z构型。如果化合物含有二取代的环烷基，则环烷基取代基可以具有顺式或反式构型。所有互变异构形式也包括在内。
具有式(I)、(Ia)、(Ib)、或(Ic)的化合物能以各种互变异构形式存在。本发明包括具有式(I)、(Ia)、(Ib)、或(Ic)的化合物的所有互变异构形式。例如，具有式(I)的化合物可以根据式(I’)和(I”)的互变异构形式存在，因此：
其中R1、R1a、R2、R2a、X1、R6、和R7是如根据式(I)、(Ia)、(Ib)、或(Ic)所定义的。
如本文所使用的，术语“盐(salt或salts)”是指本发明化合物的酸加成盐或碱加成盐。“盐”特别地包括“药学上可接受的盐”。
术语“药学上可接受的盐”是指保留本发明化合物的生物有效性和特性，并且通常不是生物学上或其他方面不希望的盐。由于氨基和/或羧基或与其类似的基团的存在，本发明的化合物能够形成酸盐和/或碱盐。
本发明的药学上可接受的盐可以通过常规的化学方法从碱或酸部分合成。通常，此类盐可以通过将这些化合物的游离酸形式与化学计算量的适当碱反应来制备或者通过将这些化合物的游离碱形式与化学计算量的适当酸反应来制备。此类反应通常在水或有机溶剂或两者的混合物中进行。通常，在可行的情况下，希望使用非水性介质，如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇、乙腈或四氢呋喃。另外的合适的盐的列表可见于例如：“Remington'sPharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]”,第20版,马克出版公司(Mack PublishingCompany),宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton,Pa.),(1985)中；以及Stahl和Wermuth的“Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use[药用盐手册：特性、选择和使用]”(威利-VCH出版社(Wiley-VCH),韦因海姆德国,2002)中。
当在同一分子中存在碱性基团和酸性基团两者时，本发明的化合物还可以形成内盐，例如两性离子分子。
由于本发明的化合物包含至少一个碱性基团例如氨基基团，因此这些化合物特别适用于形成酸加成盐。
可以用无机酸和有机酸形成药学上可接受的酸加成盐。
可以衍生出盐的无机酸包括，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。
可以衍生出盐的有机酸包括例如乙酸、丙酸、乙醇酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、磺基水杨酸等。
可以用无机碱和有机碱形成药学上可接受的碱加成盐。
可以衍生出盐的无机碱包括，例如铵盐和来自元素周期表第I至XII列的金属。在某些实施例中，盐衍生自钠、钾、铵、钙、镁、铁、银、锌和铜；特别合适的盐包括铵盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。
可以衍生出盐的有机碱包括，例如伯胺、仲胺和叔胺；经取代的胺(包括天然存在的经取代的胺)；环胺；碱性离子交换树脂等。某些有机胺包括异丙胺、苄星青霉素(benzathine)、胆碱盐、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺、哌嗪和氨丁三醇。
在另一个方面，本发明提供了呈以下形式的本发明的化合物：乙酸盐、抗坏血酸盐、己二酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、溴化物/氢溴酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、樟脑磺酸盐、癸酸盐、氯化物/盐酸盐、氯茶碱盐(chlortheophyllonate)、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、谷氨酸盐、戊二酸盐、乙醇酸盐、马尿酸盐、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘甲酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、十八烷酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、癸二酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、磺基水杨酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、三苯乙酸盐(trifenatate)、三氟乙酸盐或昔萘酸盐形式。
本文给出的任何式还旨在表示化合物的未标记形式以及同位素标记形式。同位素标记的化合物具有由本文给出的式表示的结构，除了一个或多个原子被具有所选原子质量或质量数的原子代替。可以掺入本发明化合物中的同位素包括例如氢的同位素。
在本发明的另一个方面，提供了具有式(I”’)的化合物：
其中R1、R1a、R2、R2a、R6是如针对式(I)或(Ia)所定义的，R7是-C(R10)3，-OC(R10)3或-OC(R10)2C(R10)3，并且X1选自：
其中每个R8、R9和R10在每次出现时独立地选自H或氘，并且符号#表示所示的被H取代的位置，这些位置可以在每次出现时独立地被H或氘取代。
掺入某些同位素，特别是氘(即2H或D)可提供更高代谢稳定性导致的某些治疗优势，例如增加的体内半衰期或减少的剂量要求或治疗指数或耐受性的改善。应理解，在此上下文中的氘被认为是具有式(I)和(Ia)的化合物的取代基。氘的浓度可以由同位素富集因子来定义。如本文所使用的术语“同位素富集因子”意指指定同位素的同位素丰度与天然丰度之间的比率。如果本发明化合物中的取代基指示氘，则此类化合物具有针对每个指定的氘原子的同位素富集因子为至少3500(在每个指定的氘原子上52.5％氘掺入)、至少4000(60％氘掺入)、至少4500(67.5％氘掺入)、至少5000(75％氘掺入)、至少5500(82.5％氘掺入)、至少6000(90％氘掺入)、至少6333.3(95％氘掺入)、至少6466.7(97％氘掺入)、至少6600(99％氘掺入)或至少6633.3(99.5％氘掺入)。应当理解，术语“同位素富集因子”可以与针对氘所描述的相同方式应用于任何同位素。
可以掺入本发明的化合物的同位素的其他实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，例如分别是3H、11C、13C、14C、15N、18F、31P、32P、35S、36Cl、和125I。因此，应当理解，本发明包括掺入任何上述同位素中一种或多种的化合物，包括例如放射性同位素，例如3H和14C，或其中掺入非放射性同位素例如2H和13C的那些。此类同位素标记的化合物可用于代谢研究(用14C)、反应动力学研究(用例如2H或3H)、检测或成像技术(例如正电子发射断层扫描(PET)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)，包括药物或底物组织分布测定)，或用于患者的放射性治疗。特别地，18F标记的化合物对于PET或SPECT研究可能是特别理想的。同位素标记的具有式(I)的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与所附实例中所述的那些类似的方法，使用适当的同位素标记的试剂代替未标记的先前使用的试剂来制备。
如本文所使用的，术语“药物组合物”是指呈适用于口服或肠胃外施用的形式的本发明化合物或其药学上可接受的盐以及至少一种药学上可接受的载体。
如本文所使用的，术语“药学上可接受的载体”是指可用于制备或使用药物组合物的物质，并且包括例如合适的稀释剂、溶剂、分散介质、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂、等渗剂、缓冲剂、乳化剂、吸收延迟剂、盐、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、润湿剂、甜味剂、矫味剂、染料以及它们的组合，如本领域技术人员已知的(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],第18版马克出版公司(Mack PrintingCompany),1990,第1289至1329页)。
本发明化合物的术语“治疗有效量”是指将引起受试者的生物学或医学反应(例如酶或蛋白质活性的降低或抑制)或改善症状，减轻病症，减慢或延迟疾病进展，或预防疾病等的本发明化合物的量。在一个实施例中，术语“治疗有效量”是指本发明的化合物的如下量，当施用于受试者时该量有效地(1)至少部分缓解、预防和/或改善(i)通过BTK介导的、或(ii)与BTK活性相关的、或(iii)以BTK的活性(正常或异常)为特征的病症或障碍或疾病：或(2)降低或抑制BTK的活性；或(3)减少或抑制BTK的表达。例如，可以通过降解BTK来减少BTK的数量来实现这些效果。在另一个实施例中，术语“治疗有效量”是指本发明化合物的如下量，所述量当被施用至细胞、或组织、或非细胞生物材料、或介质时有效地至少部分降低或抑制BTK活性；或至少部分降低或抑制BTK的表达，例如通过降解BTK。
如本文所使用的，术语“受试者”是指灵长类动物(例如，人(男性或女性))、狗、兔、豚鼠、猪、大鼠和小鼠。在某些实施例中，受试者是灵长类动物。在实施例中，受试者是人。
如本文所使用的，术语“抑制(inhibition或inhibiting)”是指减少或抑制给定的病症、症状或障碍、或疾病，或在生物活性或过程的基线活性方面的显著降低。
如本文所使用的，术语“降解(degrades、degrading或degradation)”是指细胞蛋白酶体系统将靶蛋白例如BTK部分或全部降解至降低或消除BTK的生物学活性(特别是异常活性)的程度。降解可以通过介导E3连接酶，特别是包含蛋白质小脑蛋白的E3连接酶复合物来实现。如本文所使用的，术语“调节BTK活性(modulation of BTK activity或modulatingBTK activity)”是指改变，尤其是降低、抑制或消除BTK活性。这可以通过降解BTK来实现。可以通过将用本发明的化合物处理后剩余的BTK的量与用本发明的化合物处理之前测得的存在的初始BTK的量或水平进行比较来测量降解的BTK的量。在实施例中，与初始水平相比，至少约30％的BTK被降解。在实施例中，与初始水平相比，至少约40％的BTK被降解。在实施例中，与初始水平相比，至少约50％的BTK被降解。在实施例中，与初始水平相比，至少约60％的BTK被降解。在实施例中，与初始水平相比，至少约70％的BTK被降解。在实施例中，与初始水平相比，至少约80％的BTK被降解。在实施例中，与初始水平相比，至少约90％的BTK被降解。在实施例中，与初始水平相比，至少约95％的BTK被降解。在实施例中，与初始水平相比，超过95％的BTK被降解。在实施例中，与初始水平相比，至少约99％的BTK被降解。
在实施例中，与初始水平相比，BTK的降解量为从约30％至约99％。在实施例中，与初始水平相比，BTK的降解量为从约40％至约99％。在实施例中，与初始水平相比，BTK的降解量为从约50％至约99％。在实施例中，与初始水平相比，BTK的降解量为从约60％至约99％。在实施例中，与初始水平相比，BTK的降解量为从约70％至约99％。在实施例中，与初始水平相比，BTK的降解量为从约80％至约99％。在实施例中，与初始水平相比，BTK的降解量为从约90％至约99％。在实施例中，与初始水平相比，BTK的降解量为从约95％至约99％。在实施例中，与初始水平相比，BTK的降解量为从约90％至约95％。
如本文所使用的，术语“对BTK的选择性”是指，例如，本发明的化合物优先于另一种或多种蛋白质降解BTK，或相较于其更大程度上降解BTK。
如本文所使用的，术语任何疾病或障碍的“治疗(treat、treating或treatment)”是指缓解或减轻疾病或障碍(即，减慢或阻止疾病或其至少一种临床症状的发展)；或者减轻或改善与这些疾病或障碍相关联的至少一种物理参数或生物标志物，包括针对患者可能无法辨别的那些物理参数或生物标志物。
如本文所使用的，术语任何疾病或障碍的“预防(prevent，preventing或prevention)”是指疾病或障碍的预防性治疗；或延迟疾病或障碍的发作或进展
如本文所使用的，如果受试者将在生物学上、在医学上或在生活质量上从治疗中受益，则此类受试者是“需要”此类治疗的。
如本文所使用的，术语“一个/种(a，an)”，“所述/该(the)”以及在本发明的上下文中使用的类似术语(特别是在权利要求的上下文中)应被解释为涵盖单数和复数两者，本文中除非另外指示或与上下文明显相矛盾。
在本文描述的所有方法能够以任何合适的顺序进行，除非本文另外说明或另外与上下文明显矛盾。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(如“例如(such as或forexample)”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对另外要求保护的本发明范围做出限制。
本发明的一种或多种化合物的任何非对称原子(例如，碳等)可以以外消旋或对映异构体富集的形式存在，例如(R)-、(S)-或(R,S)-构型。在某些实施例中，每个非对称原子在(R)-或(S)-构型中具有至少50％对映异构体过量、至少60％对映异构体过量、至少70％对映异构体过量、至少80％对映异构体过量、至少90％对映异构体过量、至少95％对映异构体过量、或至少99％对映异构体过量。如果可能，在具有不饱和双键的原子上的取代基可以以顺式-(Z)-或反式-(E)-形式存在。
因此，如本文所使用的，本发明的化合物可以呈可能的立体异构体、旋转异构体、阻转异构体、互变异构体或其混合物之一的形式，例如，作为基本上纯的几何(顺式或反式)立体异构体、非对映异构体、光学异构体(对映体)、外消旋体或其混合物。
任何所得立体异构体混合物可以基于组分的物理化学差异例如通过色谱法和/或分级结晶被分离成纯的或基本上纯的几何或光学异构体、非对映异构体、外消旋体。
可以通过已知方法将任何所得的本发明化合物或中间体的外消旋体拆分成旋光对映体，例如通过将用光学活性酸或碱获得的其非对映异构体盐进行分离，并释放出光学活性的酸性或碱性化合物。特别地，因此可以采用碱性部分将本发明的化合物拆分成其光学对映体，例如通过用光学活性酸形成的盐的分级结晶，所述光学活性酸例如酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、二乙酰基酒石酸、二-O,O'-对甲苯酰基酒石酸、扁桃酸、苹果酸或樟脑-10-磺酸。本发明的外消旋化合物或外消旋中间体还可以通过手性色谱法(例如，使用手性吸附剂的高压液相色谱法(HPLC))拆分。
本申请的化合物可以使用可商购获得的起始材料、文献中已知的化合物，或由容易制备的中间体，通过采用本领域技术人员已知的、或根据本文的传授内容对熟练化学家将显而易见的标准合成方法和程序，以有机合成领域技术人员熟知的多种方法制备。对于所有实例，根据如例如在Protective Groups in Organic Synthesis[有机合成中的保护基团],第3版,约翰威利父子出版社:纽约,1999或Protecting Groups[保护基团],第3版,Thieme出版社,斯图加特,2004中描述的标准课本知识，可以应用潜在的替代性正交保护基团策略。本领域技术人员将认识到本文披露的化合物中是否存在立体中心。
可以根据以下方案合成本发明的化合物。可以以各种方式组装化合物，使用相关的反应程序以模块化的方式建立最终分子，以允许不同的反应顺序。
几种反应类型对于制备这些化合物特别有用。本发明的所有化合物均含有酰胺官能团，该酰胺官能团通常是在溶剂(例如DMF或DMA)中使用偶联剂(例如HATU或HBTU)和碱(例如DIPEA或NMM)，通过胺和羧酸之间的酰胺偶联反应形成的。或者，可以首先将羧酸转化为其五氟苯酚酯。这允许随后在碱例如TEA的存在下在溶剂例如DMF中与胺容易地反应以形成酰胺。含有碳-氮键的本发明化合物通常可以使用从胺和醛或酮开始的还原胺化反应来制备。在如THF和MeOH的溶剂混合物中，使用如NaBH3CN、ZnCl2和TEA的条件进行反应。碳-氮键也可以通过胺与合适的含有离去基团的反应伴侣，通常在碱(例如TEA)存在下在溶剂(例如THF)中进行亲核取代反应而形成，该离去基团例如烷基卤代物或甲磺酸烷基酯。含有醚的化合物也可以通过亲核取代反应来制备，在这种情况下，是通过使醇与含有离去基团的合适的伴侣(例如苄基卤化物)在碱(例如TEA)存在下在溶剂(例如THF)中反应。制备含有醚的本发明化合物的另一种通常有用的方法是光延反应(Mitsunobu reaction)。在该反应中，苯酚和另一种醇在膦(例如三苯基膦)和偶氮二羧酸酯(例如偶氮二羧酸二乙酯或偶氮二甲酸二异丙酯)的存在下在溶剂(例如THF)中反应。用于合成本发明化合物的另一种高度有用的反应是钯(Pd)催化的将两个芳族基团连接在一起的交叉偶联反应。特别有用的是在溶剂混合物(例如二噁烷/水)中使用催化剂(例如PdCl2(dppf))和碱(例如Na2CO3或Cs2CO3)在芳香族卤化物与芳香族硼酸或酯之间进行铃木偶联反应。
具体而言，可以如方案1所示制备具有式(I)的化合物，其中R1、R1a、R2、R2a、X1、R6、R7、X1a和X2a如先前所定义。M定义为H或保护基团，例如-SO2Ph或-SEM，并且LG定义为离去基团，例如甲磺酸酯(OMs)。
因此，可以在溶剂(例如DMF或DMA)中使用偶联剂(例如HATU)和碱(例如DIPEA或NMM)，通过胺和羧酸之间的酰胺偶联形成，从具有式(II)的化合物和具有式(III)的化合物制备具有式(I)的化合物。可替代地，可以通过在溶剂如DMF中用TEA处理，通过具有式(II)的胺与酸的五氟苯基酯(IIIa)之间的酰胺偶联来制备具有式(I)的化合物。具有式(II)的化合物可以由具有式(IV)的化合物制备。对于其中M是保护基团例如-SO2Ph的具有式(IV)化合物，可以在溶剂混合物(例如DMSO、THF和水)中使用碱(例如NaOH)来完成脱保护，当M为-SEM保护基团时，可利用在溶剂如DCM中使用酸如TFA进行的脱保护，并可能与随后的胺脱保护步骤结合。在溶剂例如DCM中使用酸(例如TFA)进一步对叔丁氧基羰基(Boc)基团进行脱保护，得到具有式(II)的化合物。
方案1
具有式(IV)的化合物可以通过在溶剂混合物(例如DMF和ACN)中使用碱(例如K2CO3)，例如在亲核取代反应中，使具有式(V)的化合物与具有式(VI)的化合物反应来提供。可替代地，具有式(IV)的化合物可以通过在溶剂混合物(例如THF和MeOH)中，在使用NaBH3CN、ZnCl2和TEA的条件下，例如在还原胺化反应中，使具有式(VII)的化合物与具有式(VI)的化合物反应来提供。
可以根据方案2制备具有式(V)的化合物，其中R1、R1a、R2、R2a、X1a、M和LG如先前所定义。基团-B(ORx)2定义了硼酸或硼酸酯官能团(包括环状硼酸酯，例如频哪醇硼酸酯)。因此，Pd催化的偶联，例如在溶剂混合物(例如二噁烷/水)中使用催化剂(例如PdCl2(dppf))和碱(例如Cs2CO3)在具有式(VIII)的化合物和具有式(IX)的化合物之间进行铃木反应，然后在第二步中将与X1a连接的醇官能团转化为离去基团LG，例如在溶剂(如THF)中使用Ms2O和TEA进行甲磺酰化，得到具有式(V)的化合物。具有式(VIII)的化合物可以通过Pd催化的偶联来制备，例如在溶剂混合物(例如二噁烷/水)中使用催化剂(例如PdCl2(dppf))和碱(例如Cs2CO3)在具有式(X)的化合物与具有式(XI)的化合物之间进行铃木反应。
方案2
通过类比，可以根据方案3制备具有式(VII)的化合物，其中R1、R1a、R2、R2a、M、LG和-B(ORx)2如先前所定义。
因此，Pd催化的偶联，例如在溶剂混合物(例如二噁烷/水)中使用催化剂(例如PdCl2(dppf))和碱(例如Cs2CO3)在具有式(XII)的化合物与具有式(IX)的化合物之间进行铃木反应，得到具有式(VII)的化合物。具有式(XII)的化合物还可以通过Pd催化的偶联来制备，例如在溶剂混合物(例如二噁烷/水)中使用催化剂(例如PdCl2(dppf))和碱(例如Cs2CO3)在具有式(X)的化合物与具有式(XIII)的化合物之间进行铃木反应。
方案3
具有式(II)的化合物也可以根据方案4制备。因此，当M为H时，在溶剂混合物(例如THF和MeOH)中，使用条件(例如NaBH3CN、ZnCl2和TEA)，使具有式(XIV)和(XV)的化合物之间进行还原胺化，然后在溶剂(例如DCM)中，用酸(例如TFA)对胺进行脱保护，得到具有式(II)的化合物。从具有式(VII)的化合物开始，通过相似序列制备具有式(XIV)的化合物，其在溶剂混合物(例如THF和MeOH)中，使用条件(例如NaBH3CN、ZnCl2和TEA)，可与N-(叔丁氧基羰基)哌嗪进行还原胺化，然后在溶剂例如DCM中，用酸(例如TFA)对胺进行脱保护，以得到(XIV)。
方案4
具有式(IV)的化合物可以根据方案5，在溶剂混合物(例如二噁烷/水)中使用Pd催化的偶联，例如铃木反应，使用催化剂(例如PdCl2(dppf))和碱(例如Cs2CO3)通过与具有式(IX)的化合物反应从具有式(XVI)的化合物制备。反之具有式(XVI)的化合物也可以在溶剂混合物(例如二噁烷/水)中使用催化剂(例如PdCl2(dppf))和碱(例如Cs2CO3)，通过Pd催化的偶联，例如与具有式(X)的化合物进行铃木反应从具有式(XVII)的化合物制备。
方案5
具有式(XVII)的化合物可以如方案6所示通过在诸如二噁烷的溶剂中使用硼酸酯二聚体(例如双(频哪醇)二硼)，Pd催化剂如PdCl2(dppf)和诸如KOAc的碱从化合物(XVIII)开始通过卤素-硼交换反应制备。例如当式(XIX)中的Hal和LG均为溴时，在溶剂(如乙腈)中使用诸如K2CO3的碱，可以使用亲核取代反应从化合物(XIX)和(VI)获得其中Hal表示卤素的化合物(XVIII)。
式(XVIIIa)描述的化合物(XVIII)的特定子集可以由卤代苯基乙酸衍生物(XX)和具有式(VI)的化合物通过两步法进行合成，包括在溶剂(例如DMF或DMA)中使用偶联剂(例如HATU)和碱(例如DIPEA或NMM)进行酰胺偶联反应，然后在溶剂(例如THF)中在催化剂(例如ZrCl4)存在下添加格氏试剂(Grignard reagent)(例如MeMgBr)。化合物(XVIIIa)可通过卤素-硼交换以类似于针对化合物(XVIII)所述的转化方式转化为化合物(XVII)。
方案6
可以根据方案7，在溶剂混合物(例如THF和MeOH)中使用例如NaBH3CN、ZnCl2和TEA，使用还原胺化偶联，由具有式(XXI)的化合物和具有式(VIIa)的化合物(其中M＝H的化合物类型(VII)的具体实施例)制备具有式(I)的化合物。可替代地，具有式(I)的化合物可以通过在溶剂混合物(例如DMF和ACN)中使用碱(例如K2CO3)，在亲核取代反应中，使具有式(Va)的化合物(其中M＝H的化合物类型(V)的一个具体实施例)与具有式(XXI)的化合物反应来制备。
方案7
在溶剂如DMF或DMA中，使用偶联剂(例如HATU)和碱(例如DIPEA或NMM)通过酰胺偶联反应，由具有式(VI)的化合物和具有式(III)的化合物合成具有式(XXI)的化合物，然后在溶剂例如DCM中使用酸(例如TFA)使胺的叔丁氧羰基(Boc)基团脱保护。
其中Z不存在的具有式(I)的化合物可以通过在如THF和MeOH的溶剂混合物中，使用例如NaBH3CN、ZnCl2和TEA，在还原胺化偶联中使具有式(XXII)的化合物与具有式(XXIII)的化合物反应来制备，其中Z、R1、R1a、R2、R2a、X1a、R4、R5、R6、R7、n、p和q如先前所定义。通过类比，根据方案8，化合物(XXIV)和(XXIII)可以在相似的条件下反应以提供具有式(I)的化合物。
方案8
具有式(XVI)的化合物可以根据方案9，在溶剂混合物(例如二噁烷/水)中使用Pd催化的偶联，例如铃木反应，使用催化剂(例如PdCl2(dppf))和碱(例如Cs2CO3)，从具有式(X)的化合物和具有式(XXV)的化合物合成。
方案9
具有式(XXV)的化合物可以使用多种方法在前述反应条件下制备。例如，在方案10中，从常见的硼酸/酯起始材料(XXVIII)开始，使用具有结构(XXIX)的化合物进行光延反应，然后脱保护，得到具有式(XXVI)的中间体，该中间体随后可以与具有式(XXVII)的化合物进行亲核取代以提供具有式(XXV)的化合物。在某些情况下，(XXVIII)与具有式(XXX)的化合物进行光延反应可以直接得到(XXV)。
方案10
具有式(XXV)的化合物可以由常见的起始材料4-溴苄基溴(XXXI)合成。在这些情况下，如方案11所示，在溶剂(例如THF)中使用碱(例如叔丁醇钾)与化合物(XXX)进行亲核取代反应，然后使用上述条件进行卤素-硼交换可直接产生(XXV)。在其他情况下，与化合物(XXXII)进行亲核取代反应，然后进行卤素-硼交换和Boc脱保护，得到新的中间体(XXXIII)，该中间体可以在与前述那些相似的反应条件下在进一步的亲核取代反应中与类型(XXVII)的化合物反应，从而产生(XXV)。
方案11
对于本领域技术人员熟知的是，在产生相似的化合物的同时，反应序列的顺序经常可以改变。方案12显示了使用与已经描述的那些相似的方法来构建具有式(IV)的化合物的替代方法。因此，在溶剂混合物(例如二噁烷/水)中使用催化剂(例如PdCl2(dppf))和碱(例如Cs2CO3)，使用化合物(X)和(XXVIII)进行Pd催化的偶联，例如铃木反应生成中间体(XXXIV)，该中间体可以与具有式(XXXII)的化合物进行光延反应以提供中间体(XXXV)。然后化合物(XXXV)可以进一步进行铃木偶联，这次与具有式(IX)化合物和随后的脱保护序列，得到具有式(XXXVI)的化合物。具有式(XXXVI)的化合物可以与具有式(XXXVII)的化合物进行还原胺化，得到具有式(IV)的化合物。
方案12
具有式(XXXVI)的化合物还可以与具有式(XXXVIII)的化合物进行还原胺化，得到具有式(IV)的化合物。在这种情况下，如方案13所示，可以产生两种产物(其中Q为H或Q为CH2OH)。其中Q为H的化合物(IV)可以替代地使用掩蔽的醛(XXXIX)代替(XXXVIII)来制备。
方案13
方案14显示了提供具有式(IV)的化合物的更多方法。因此，具有式(XL)的中间体可以通过例如化合物(XXVIII)和(XXIX)之间的光延反应产生。可替代地，(XL)可以通过两步来制备，即，在具有式(XXXI)和(XXXII)的化合物之间进行亲核取代，然后进行卤素-硼交换反应。中间体(XL)在Pd催化的偶联反应中与具有式(X)的化合物反应得到具有式(XLI)的化合物，该化合物可以与具有式(IX)的化合物进行进一步Pd催化的偶联，然后脱保护得到具有式(XLII)的化合物。化合物(XLII)可以与具有式(XXXVII)的化合物进行还原胺化反应以提供(IV)。
方案14
具有式(I)的化合物可以如方案15中所示由具有式(XLIV)的中间体制备，该中间体本身可以通过与方案14中的化合物(XL)的直接类似方法来制备。因此，中间体(XLIV)衍生自与(XLIII)组合的(XXVIII)或(XXXI)。然后化合物(XLIV)经历两个Pd催化的偶联反应和脱保护序列以提供(XLV)。化合物(XLV)可以在还原胺化反应中与具有式(XLVI)的化合物反应，以提供(I)。使用与N-(2-羟基乙基)哌嗪的酰胺偶联反应，然后使用例如草酰氯和DMSO进行氧化反应如斯文氧化反应(Swern oxidation)，然后添加在溶剂(如DCM)中的TEA，从具有式(III)的化合物制备化合物(XLVI)。
方案15
具有式(III)的二氢尿嘧啶分子可通过在加热至约120℃的乙酸中使用尿素环化具有式(XLVII)的分子来制备。通常在约100℃的温度下，通过在丙烯酸中加热(方案16)，进而由相应的苯胺衍生物(XLVIII)合成化合物(XLVII)。
方案16
根据方案17，使用具有式(XLIX)和(L)的化合物之间的脲形成反应，通过用光气或等同物(如三光气)在低温(例如-20℃)下处理具有式(XLIX)的化合物，然后在溶剂(如THF或DCM)中添加具有式(L)的胺来制备具有式(IX)的化合物(其中R1、R1a、R2、R2a和-B(ORx)2如先前所定义)。
方案17
最后，具有式(L)的胺可以根据方案18，由受保护的吡咯烷(LIII)(其中PG被定义为保护基团，例如-Boc或-CBz(苄基氧基羰基))来制备。使用添加剂(如溴化Cu(I)二甲基硫醚络合物)在溶剂(如乙醚或THF)中添加格氏试剂，以立体选择性方式打开环氧化物以提供外消旋材料(LII)-描绘了相对立体化学。可以对该材料进行脱保护，以得到化合物(L)的反式异构体的外消旋混合物。可替代地，在脱保护之前进行手性分离而产生化合物(L)的各个反式对映异构体。也可以使用如4-硝基苯甲酸的试剂对化合物(LII)进行光延转化反应，以提供具有式(LI)的分子-描绘了相对立体化学。可以对材料(LI)进行脱保护，以得到化合物(L)的顺式异构体的外消旋混合物。可替代地，在脱保护之前进行手性分离而产生化合物(L)的各个顺式对映异构体。因此，(L)的所有对映异构体都可以通过该途径获得，并且本领域技术人员还应当理解，也可以从非外消旋的手性纯化合物(LIII)开始制备特定的对映异构体，从而在合成的早期阶段影响手性拆分。
方案18
实验部分详细提供了使用上述一般方法具体制备中间体和实例。
在另外的实施例中，提供了根据式(III)的化合物或其盐，
其中R6选自H和F；并且R7选自H、F、Cl、-CH3、-OCH3和-OCH2CH3。
在其他实施例中，提供了根据式(IIIa)的化合物或其盐，
其中R6选自H和F；并且R7选自H、F、Cl、-CH3、-OCH3和-OCH2CH3。在其他实施例中，提供了根据式(XXIa)的化合物或其盐，
其中R6选自H和F；并且R7选自H、F、Cl、-CH3、-OCH3和-OCH2CH3。在其他实施例中，提供了根据式(IX)的化合物或其盐，
其中R1、R1a、R2和R2a是如针对式(I)所定义的。
在另外的实施例中，提供了选自下组的化合物或其盐，该组由以下组成：3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酸：
五氟苯基3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酸酯：
1-(2-甲氧基-5-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-羰基)苯基)二氢嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮：
N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，特别是(顺式-外消旋)-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺或(反式-外消旋)-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺：
(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺：
(3S,4R)-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺：
(3R,4R)-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺：
这些实施例的化合物可用于制备本发明的化合物。
本发明进一步包括本发明方法的任何变型，其中将可在其任何阶段获得的中间体用作起始材料并且进行其余步骤，或其中起始材料在反应条件下原位形成，或其中将反应组分以其盐或光学纯的材料的形式使用。根据本领域技术人员通常已知的方法，本发明的化合物和中间体也可以彼此转化，例如通过还原、氧化和/或所得化合物的其他官能化和/或通过裂解任选存在的任何一种或多种保护基团或接头部分，并回收如此获得的化合物。
在另一方面，本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含本发明化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。
在另一方面，本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。
在另外的实施例中，组合物包含至少两种药学上可接受的载体，例如本文所述的那些。药物组合物可以配制用于特定的施用途径，例如口服施用、肠胃外施用(例如通过注射、输注、透皮或局部施用)，和直肠施用。局部施用也可以涉及吸入或鼻内应用。本发明的药物组合物能以固体形式(包括但不限于胶囊、片剂、丸剂、颗粒、粉末或栓剂)、或以液体形式(包括但不限于溶液、悬浮液或乳液)制成。片剂可以根据本领域已知的方法进行薄膜包衣或肠溶包衣。
通常，药物组合物是包含活性成分及以下中的一种或多种的片剂或明胶胶囊：
a)稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素和/或甘氨酸；
b)润滑剂，例如二氧化硅、滑石、硬酯酸、其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇；就片剂而言还包含
c)粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯基吡咯烷酮；如果希望，还包含
d)崩解剂，例如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐，或泡腾混合物；以及
e)吸附剂、着色剂、风味剂和甜味剂。
具有式(I)或(Ia)的化合物或其药学上可接受的盐表现出有价值的药理性质，例如调节BTK活性，例如通过充当BTK降解剂。这一点可以体外确定，例如在细胞中，通过使用如本文所述的过表达BTK或BTK C481S突变体融合蛋白的工程化细胞系，用于荧光读数，以及在表达内源性BTK的细胞系中。本发明化合物的药理作用也可以体内确定，例如，通过将本发明化合物施用至患有肿瘤例如TMD8肿瘤的动物(如小鼠)，并测量给药该化合物后肿瘤组织中BTK的减少和肿瘤体积的减小。因此，具有式(I)或(Ia)的化合物可用于治疗由BTK介导的疾病。
具有式(I)或(Ia)的化合物可用于研究由BTK介导的疾病，例如作为工具化合物。
游离形式或药学上可接受的盐形式的本发明化合物可用于预防或治疗癌症，例如选自实体瘤癌和造血系统癌症的癌症。
实体瘤癌的实例包括中枢神经系统癌症、脑癌、乳腺癌、头颈癌、肺癌；食管和食管胃连接部癌、胃癌、结直肠癌、直肠癌、肛门癌、肝胆癌、胰腺癌、非黑素瘤皮肤癌、黑素瘤、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、骨癌、神经内分泌癌、间皮瘤癌、睾丸癌、胸腺瘤和胸腺癌以及甲状腺癌。
造血系统癌症的实例包括B细胞肿瘤(包括罕见的B细胞恶性肿瘤)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、移植后淋巴组织增生性障碍、毛细胞白血病、组织细胞性和树突状肿瘤。
B细胞肿瘤的实例包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、华氏巨球蛋白血症、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、里氏综合征、和前体B淋巴母细胞淋巴瘤、原发性和继发性的多发性骨髓瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾脏边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、淋巴结外边缘区B细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、和急性成淋巴细胞性白血病。
在具体实施例中，癌症选自慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)和华氏巨球蛋白血症。
在另外的实施例中，癌症是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
在另一个实施例中，癌症是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
本发明的化合物可以特别地应用于治疗其中癌症(例如CLL、DLBCL、MCL、SLL和华氏巨球蛋白血症)已获得对依鲁替尼的抗性的受试者，例如在其中已经通过以下方式产生抗性的癌症中：半胱氨酸-481突变为丝氨酸(即突变C481S)。此类受试者可能例如已经用依鲁替尼治疗或正在继续用依鲁替尼治疗，并且其中受试者的应答降低或对依鲁替尼的治疗不再应答。因此，本发明的化合物可以有益地用于治疗对依鲁替尼具有抗药性的癌症，尤其是对依鲁替尼具有抗药性的CLL、DLBCL、MCL、SLL和华氏巨球蛋白血症，特别是对依鲁替尼具有抗药性的CLL。
在另一个实施例中，游离形式或药学上可接受的盐形式的本发明化合物可用于预防或治疗自身免疫障碍、炎性障碍、过敏性疾病、过敏反应、过敏性哮喘和气道疾病，以及用于移植。例如，游离形式或药学上可接受的盐形式的本发明化合物可用于预防或治疗哮喘；慢性阻塞性肺病(COPD)；移植排斥；其中抗体产生、抗原呈递、细胞因子产生或淋巴器官发生为异常或不期望的疾病；类风湿性关节炎；全身型幼年型特发性关节炎(SOJIA)；痛风；寻常天疱疮；特发性血小板减少症性紫癜；系统性红斑狼疮；多发性硬化症；重症肌无力；干燥综合征；自身免疫性溶血性贫血；抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关血管炎；冷球蛋白血症；血栓性血小板减少症性紫癜；慢性自身免疫性荨麻疹；过敏(特应性皮炎、接触性皮炎、过敏性鼻炎)；动脉粥样硬化；1型糖尿病；2型糖尿病；炎症性肠病；溃疡性结肠炎；克隆氏症；胰腺炎；肾小球肾炎；古德帕斯彻氏综合征；桥本氏甲状腺炎；格雷夫斯病；抗体介导的移植排斥(AMR)；移植物抗宿主疾病(GvHD)；慢性移植物抗宿主疾病(cGvHD)；B细胞介导的超急性；急性和慢性移植物排斥；血栓栓塞障碍；心肌梗塞；心绞痛；中风；缺血性障碍；肺栓塞；真性红细胞增多症；原发性血小板增多症；和髓样化生性骨髓纤维化。
在另一个实施例中，游离形式或药学上可接受的盐形式的本发明化合物可用于预防或治疗免疫球蛋白轻链淀粉样变性(AL)。
在另外的方面，本发明提供了本发明的化合物或其药学上可接受的盐在疗法中的用途。在实施例中，本发明提供了本发明的化合物或其药学上可接受的盐在预防或治疗由BTK介导的疾病中的用途。在另一个实施例中，本发明提供了本发明的化合物或其药学上可接受的盐在预防或治疗癌症中的用途。在另外的实施例中，癌症是造血系统癌症。在另外的实施例中，该造血系统癌症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)和华氏巨球蛋白血症，特别是CLL或DLBCL。
在实施例中，化合物是(3R,4R)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
在实施例中，化合物是(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)甲基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
在实施例中，化合物是(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(4-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)哌啶-1-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
在实施例中，化合物是(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
在实施例中，化合物是(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-6-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
在实施例中，化合物是(顺式-外消旋)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
在实施例中，化合物是(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-(2-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
在另外的方面，本发明提供了本发明的化合物或其药学上可接受的盐，用于在疗法中使用。在实施例中，本发明提供了本发明的化合物或其药学上可接受的盐，用于在预防或治疗由BTK介导的疾病中使用。在实施例中，本发明提供了本发明的化合物或其药学上可接受的盐，用于在预防或治疗癌症中使用。在另外的实施例中，癌症是造血系统癌症。在另外的实施例中，该造血系统癌症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)和华氏巨球蛋白血症，特别是CLL或DLBCL。
在实施例中，化合物是(3R,4R)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
在实施例中，化合物是(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)甲基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
在实施例中，化合物是(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(4-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)哌啶-1-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
在实施例中，化合物是(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
在实施例中，化合物是(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-6-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
在实施例中，化合物是(顺式-外消旋)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
在实施例中，化合物是(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-(2-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
在另外的方面，本发明提供一种治疗由BTK介导的疾病的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗上可接受的量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐。在实施例中，本发明提供一种治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗上可接受的量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐。在另外的实施例中，癌症是造血系统癌症。在另外的实施例中，该造血系统癌症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)和华氏巨球蛋白血症，特别是CLL或DLBCL。
在实施例中，化合物是(3R,4R)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
在实施例中，化合物是(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)甲基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
在实施例中，化合物是(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(4-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)哌啶-1-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
在实施例中，化合物是(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
在实施例中，化合物是(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-6-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
在实施例中，化合物是(顺式-外消旋)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
在实施例中，化合物是(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-(2-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
在另外的方面，本发明提供了本发明的化合物或其药学上可接受的盐用于制造药物的用途。在实施例中，本发明提供了本发明的化合物或其药学上可接受的盐用于制造药物、用于预防或治疗由BTK介导的疾病的用途。在实施例中，本发明提供了本发明的化合物或其药学上可接受的盐用于制造药物、用于预防或治疗癌症的用途。在另外的实施例中，癌症是造血系统癌症。在另外的实施例中，该造血系统癌症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)和华氏巨球蛋白血症，特别是CLL或DLBCL。
在实施例中，化合物是(3R,4R)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
在实施例中，化合物是(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)甲基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
在实施例中，化合物是(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(4-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)哌啶-1-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
在实施例中，化合物是(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
在实施例中，化合物是(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-6-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
在实施例中，化合物是(顺式-外消旋)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
在实施例中，化合物是(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-(2-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
对于约50-70kg的受试者，本发明的药物组合物或组合可以呈约1-1000mg一种或多种活性成分，或约1-500mg或约1-250mg或约1-150mg或约0.5-100mg或约1-50mg活性成分的单位剂量。化合物、药物组合物、或其组合的治疗有效剂量取决于受试者的物种，体重、年龄和个体状况，所治疗的障碍或疾病或其严重性。具有普通技能的医师、临床医生或兽医可以容易地确定预防、治疗或抑制障碍或疾病的进展所必需的每种活性成分的有效量。
使用有利的哺乳动物，例如小鼠、大鼠、狗、猴或其分离的器官、组织和制剂，可以在体外和体内试验中证明上述剂量特性。本发明化合物能以溶液(例如水溶液)的形式体外应用，和例如以悬浮液或以水溶液的形式肠内、肠胃外(有利地，静脉内)体内应用。体外剂量的范围可以在约10-6摩尔浓度与10-10摩尔浓度之间。根据施用途径，体内治疗有效量的范围可以在约0.1-500mg/kg之间、或在约1-100mg/kg之间。
本发明化合物可以与一种或多种其他治疗剂同时施用或者在其之前或之后施用。本发明化合物可以通过与其他药剂相同或不同的施用途径分开施用，或在相同的药物组合物中一起施用。治疗剂是例如化学化合物、肽、抗体、抗体片段或核酸，当将该治疗剂与本发明的化合物组合施用至患者时，该治疗剂具有治疗活性或增强治疗活性。
在一个实施例中，本发明提供了包含本发明的化合物和至少一种其他的治疗剂的产品，作为组合制剂用于在疗法中同时的、分开的或顺序的使用。在一个实施例中，该疗法是治疗由BTK介导的疾病或病症。在另一个实施例中，该疗法是治疗本文所述的癌症。作为组合制剂提供的产品包括组合物，该组合物包含具有本发明的化合物和一起在相同的药物组合物中的一种或多种其他治疗剂，或具有本发明的化合物和呈分开形式(例如，呈试剂盒的形式)的一种或多种其他治疗剂。
在一个实施例中，本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含本发明的化合物和另一种或多种治疗剂。在另一个实施例中，本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的本发明的化合物和另一种或多种治疗剂。
任选地，药物组合物可以包含如上所述的药学上可接受的载体。
在一个实施例中，本发明提供了试剂盒，该试剂盒包含两种或多种分开的药物组合物，其中至少一种药物组合物含有本发明的化合物。在一个实施例中，试剂盒包含用于单独地保留所述组合物的装置，例如容器、分开的瓶、或分开的箔袋。这样的试剂盒的实例是泡罩包装，如通常用于包装片剂、胶囊等。
本发明的试剂盒可以用于施用不同剂型(例如，口服和肠胃外)，用于以不同剂量间隔施用单独的组合物，或用于相对彼此滴定单独的组合物。为了有助于依从性，本发明的试剂盒通常包含施用指导。
在本发明的组合疗法中，本发明的化合物和其他治疗剂可以由相同或不同的制造商生产和/或配制。此外，可以将本发明化合物和另一种治疗剂一起形成组合疗法：(i)在将组合产物释放给医师之前(例如，在包含本发明的化合物和其他治疗剂的试剂盒的情况下)；(ii)在施用前不久由医师本人(或在医师指导下)进行；(iii)在患者自身中，例如在依序施用本发明的化合物和其他治疗剂期间进行。
因此，本发明还提供了另一种治疗剂用于治疗由BTK介导的疾病或病症的用途，其中该另一种治疗剂与本发明的化合物一起施用。
本发明还提供了在治疗由BTK介导的疾病或病症的方法中使用的本发明的化合物，其中该本发明的化合物与另一种治疗剂一起施用。
本发明还提供了在治疗由BTK介导的疾病或病症的方法中使用的另一种治疗剂，其中该另一种治疗剂与本发明的化合物一起施用。
本发明还提供本发明的化合物用于治疗由BTK介导的疾病或病症的用途，其中患者先前(例如在24小时内)已经用另一种治疗剂治疗。
本发明还提供了另一种治疗剂用于治疗由BTK介导的疾病或病症的用途，其中患者先前(例如在24小时内)已经用本发明的化合物治疗。
本发明还提供了另一种治疗剂用于治疗癌症的用途，其中该另一种治疗剂与本发明的化合物一起施用。
本发明还提供了在治疗癌症的方法中使用的本发明的化合物，其中该本发明的化合物与另一种治疗剂一起施用。
本发明还提供了在治疗癌症的方法中使用的另一种治疗剂，其中该另一种治疗剂与本发明的化合物一起施用。
本发明还提供了本发明的化合物用于治疗癌症的用途，其中患者先前(例如在24小时内)已经用另一种治疗剂治疗。
本发明还提供了另一种治疗剂用于治疗癌症的用途，其中患者先前(例如在24小时内)已经用本发明的化合物治疗。
在一个实施例中，其他治疗剂选自：
凋亡调节剂、抗CD20抗体、抗CD22抗体、PI3K抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、免疫检查点剂、CART治疗剂、免疫调节剂、靶向CD20和CD3的双特异性抗体、抗体-药物偶联物(ADC)、蛋白酶体抑制剂、表观遗传修饰剂、抗CD38 mAb、抗SLAMF7剂、XPO1抑制剂和其他药剂(例如化学治疗剂)。
在实施例中，凋亡调节剂选自Bcl2抑制剂(例如抗霉素、奥巴妥拉、维奈托克乙基-2-氨基-6-环戊基-4-(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代乙基)-4H-色酮-3-甲酸酯(HA14-1)、奥利默森(G3139，)、Bak BH3肽、(-)-棉酚(AT-101，BL-193)、那维托克莱克斯(Navitoclax)(ABT-263))、Mcl1抑制剂(例如AMG176、S63845、AZD5991、MIK665)和MDM2/p53抑制剂(例如NVP-HDM201、NVP-CGM-097、ALRN-6924、依达奴林(idasanutlin)、AMG232和DS-3032B)。
在实施例中，抗CD20抗体选自利妥昔单抗、奥比妥单抗(obinutuzumab)、奥法木单抗、奥瑞珠单抗、和ublituximab。
在实施例中，抗CD22抗体选自奥英妥珠单抗、依帕珠单抗(epratuzumab)、贝妥莫单抗(bectumomab)和莫塞妥莫单抗(moxetumomab)。
在实施例中，PI3K抑制剂选自度维利司(duvelisib)、甲苯磺酸厄布利塞(umbralisib tosylate)、INCB050465、甲磺酸apilimod(LAM-002)、盐酸库潘尼西(copanlisib hydrochloride)特那利司、匹替利司(pictilisib)(GDC0941)、sonolisib(PX866)、匹雷利司(pilaralisib)(SAR 245408或XL 147)、阿培利司(BYL719)和leniolisib(CDZ173)。
在实施例中，酪氨酸激酶抑制剂选自BTK抑制剂(例如依鲁替尼、阿卡替尼、泽布替尼(BGB-3111)、替卢替尼(tirabrutinib)(ONO-4059)、ARQ531、CC-292(AVL-292)、CT-1530、DTRMWXHS-12、GDC-0853、M7583、和维卡布瑞替尼(SNS-062))、SYK抑制剂(例如entospletinib(GS9973)、福他替尼(fostamatinib)和HMPL-523)、SYK/JAK抑制剂舍拉替尼(cerdulatinib)(PRT062070)、SYK/FLT抑制剂例如TAK-659、FLT3抑制剂例如FF-10101、FLT3/BTK抑制剂(CG806)、JAK抑制剂(例如itacitanib、INCB052793、BMS911543、fedratinib、WP-1066、NS-018和鲁索替尼)、盐酸埃洛替尼利尼法尼(ABT869)、苹果酸舒尼替尼博舒替尼达沙替尼帕唑帕尼索拉非尼Zactima(ZD6474)、伊马替尼或甲磺酸伊马替尼(和)和托扎舍替(VX680或MK-0457)。
在实施例中，免疫检查点剂是抗PD-1剂、抗PD-L1剂，其选自派姆单抗、纳武单抗、替雷利珠单抗、阿特珠单抗、艾匹利木单抗、塞米普利单抗、TLR4激动剂、CCR4 mAb莫加利珠单抗和CD47 mAb融合蛋白(TTI-621)。
在实施例中，CART疗法选自CD19、BCMACART、CD20、CD79b、CD22、CD30。
在实施例中，免疫调节剂选自来那度胺沙利度胺avadomide(CC-122)和泊马度胺
在实施例中，靶向CD20和CD3的双特异性抗体选自REGN-1979、XmAb-13676、BTCT-4465-A、CD20-TCB、和8RG-6026。
在实施例中，ADC选自CD79 ADC维汀-珀拉妥珠单抗(polatuzumab vedotin)、CD30ADC维汀-布仑妥昔单抗(brentuximab vedotin)、CD25 ADC camidanlumab tesirine和CD19 ADC loncastuximab tesirine。
在实施例中，蛋白酶体抑制剂选自硼替佐米卡非佐米马里佐布(marizomib)(NPI-0052)、柠檬酸伊沙佐米(MLN-9708，)、delanzomib(CEP-18770)和奥波佐布(ONX-0912)。
在实施例中，表观遗传修饰剂例如HDAC和DNA甲基化抑制剂选自伏立诺他罗米地辛阿扎胞苷吡咯沙敏、斯皮鲁他汀A、麦普罗因(丙戊酸)、恩诺司他、和呱西他滨。
在实施例中，抗CD38 mAb选自达雷木单抗(Daratumumab)和Isatuximab。
在实施例中，抗SLAMF7剂是埃罗妥珠单抗。
在实施例中，XPO1抑制剂选自塞立奈索(Selinexor)和Eltanexor。
在实施例中，可与本发明化合物组合的其他药剂(例如一般化学治疗剂)选自阿那曲唑苯达莫司汀(bendamustine)比卡鲁胺硫酸博莱霉素白消安白消安注射液卡培他滨N4-戊氧羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂卡莫司汀苯丁酸氮芥顺铂克拉屈滨环磷酰胺(或)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷阿糖胞苷脂质体注射液达卡巴嗪更生霉素(放线菌素D、Cosmegan)、盐酸柔红霉素柠檬酸柔红霉素脂质体注射液地塞米松、多西他赛盐酸阿霉素表柔比星依托泊苷磷酸氟达拉滨5-氟尿嘧啶氟他胺替扎他滨(tezacitibine)、吉西他滨(双氟脱氧胞苷)、羟基脲伊达比星异环磷酰胺伊立替康L-天冬酰胺酶亚叶酸钙、美法仑6-巯嘌呤甲氨蝶呤米托蒽醌吉妥单抗(mylotarg)、紫杉醇白蛋白结合型紫杉醇phoenix(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他丁(pentostatin)、聚苯丙生(polifeprosan)20与卡莫司汀的植入物枸橼酸它莫西芬替尼泊苷6-硫代鸟嘌呤、噻替派、替拉扎明注射用盐酸托泊替康长春花碱长春新碱和长春瑞滨ROR mAb cirmtuzumab、双重PI3K/HDAC抑制剂(CUDC-907)、Bet抑制剂(INCB357643)、ALK抑制剂(克唑替尼)、EZH1/2抑制剂(DS-3201b)、MAPK抑制剂、Aplidin、Plitidepsin(eEF1A2抑制剂)、Wnt抑制剂、放射药物、独特型疫苗、乙二醇化非格司亭citoplurikin(IRX-2)。
在另外的实施例中，另一种治疗剂选自：
维奈托克、奥利默森(oblimersen)、那维托克莱克斯(navitoclax)、MIK665、NVP-HDM201、利妥昔单抗、奥比妥珠单抗、奥法木单抗、奥瑞珠单抗、ublituximab、奥英妥珠单抗、依帕珠单抗、贝妥莫单抗、莫塞妥莫单抗、度维利司、甲苯磺酸厄布利塞、INCB050465、leniolisib(CDZ173)、甲磺酸apilimod(LAM-002)、盐酸库潘尼西、特那利司、匹替利司、阿培利司、依鲁替尼、阿卡替尼、泽布替尼(BGB-3111)、替卢替尼(ONO-4059)、ARQ531、CC-292(AVL-292)、CT-1530、DTRMWXHS-12、GDC-0853、M7583、维卡布瑞替尼(SNS-062)、entospletinib(GS9973)、福他替尼、HMPL-523、舍拉替尼(PRT062070)、(TAK-659)、FF-10101、FLT3/BTK抑制剂(CG806)、itacitanib、INCB052793、BMS911543、fedratinib、WP-1066、NS-018、鲁索替尼派姆单抗、纳武单抗、替雷利珠单抗、阿特珠单抗、艾匹利木单抗、塞米普利单抗、TLR4激动剂、CCR4 mAb莫加利珠单抗、CD47 mAb融合蛋白(TTI-621)、CD19、BCMACART、CD20、CD79b、CD22、CD30、来那度胺、沙利度胺、avadomide、泊马度胺、XmAb-13676、CD79 ADC维汀-珀拉妥珠单抗、CD30 ADC维汀-布仑妥昔单抗、CD25 ADCcamidanlumab tesirine、CD19 ADC loncastuximab tesirine、卡非佐米、硼替佐米、伊沙佐米、马里佐布、奥波佐布、阿扎胞苷、罗米地辛、伏立诺他、呱西他滨、达雷木单抗、Isatuximab、埃罗妥珠单抗、塞立奈索、Eltanexor、氟达拉滨(Fludarabine)、卡莫司汀、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、苯达莫司汀、美法仑、克拉屈滨、达卡巴嗪、喷司他丁、长春新碱、依托泊苷、表柔比星、阿霉素、蒽环类药物和抗叶酸剂。
在另外的实施例中，另一种治疗剂选自Bcl2抑制剂和BTK抑制剂。
在另外的实施例中，另一种治疗剂选自维奈托克、依鲁替尼和阿卡替尼。
可以提供特定治疗益处的特定个体组合包括选自以下的化合物：
(3R,4R)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)甲基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(4-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)哌啶-1-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-6-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(顺式-外消旋)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、以及
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-(2-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，
或其药学上可接受的盐，与维奈托克组合。
可以提供特定治疗益处的其他特定个体组合包括选自以下的化合物：
(3R,4R)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)甲基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(4-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)哌啶-1-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-6-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(顺式-外消旋)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、以及
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-(2-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，
或其药学上可接受的盐，与依鲁替尼组合。
可以提供特定治疗益处的又其他特定个体组合包括选自以下的化合物：
(3R,4R)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)甲基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(4-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)哌啶-1-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-6-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、
(顺式-外消旋)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺、以及
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-(2-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺，
或其药学上可接受的盐，与阿卡替尼组合。
这些组合可以作为药物组合物提供，该组合物包含上述本发明的化合物或其药学上可接受的盐，以及维奈托克、依鲁替尼或阿卡替尼。
可替代地，这些组合可以作为上述本发明的化合物或其药学上可接受的盐的组合制剂提供，用于在疗法中与维奈托克、依鲁替尼或阿卡替尼同时、分开或依序使用。
这些组合，特别是与依鲁替尼组合，在治疗造血系统癌症，特别是CLL和DLBCL中可能特别有效。
本发明的化合物的活性可借由以下本文所述体外方法进行评估。
可以如以下实例中所述制备本发明的化合物。
实例
以下实例说明本发明，而不应被解释为对其的限制。温度以摄氏度给出。所使用的缩写是本领域常规的或以下列出的缩写。
用于合成本发明化合物的所有起始材料、结构单元、试剂、酸、碱、脱水剂、溶剂和催化剂是可商购获得的或可通过本领域普通技术人员已知的有机合成方法制备。此外，本发明的化合物可以通过本领域普通技术人员已知的有机合成方法生产，如以下实例所示。
缩写
ACN ACN
AcOH 乙酸
aq. 水性
BISPIN 双(频哪醇)二硼
Boc 叔丁基羧基
br 宽峰
CHX 环己烷
d 双重峰
DCM 二氯甲烷
dd 双双重峰
DEA 二乙胺
DEAD 偶氮二甲酸二乙酯
DIAD 偶氮二甲酸二异丙酯
DIPEA 二异丙基乙胺
DMA N,N-二甲基乙酰胺
DME 1,4-二甲氧基乙烷
DMEM 杜氏改良伊戈尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle'smedium)
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲亚砜
Et2O 二乙醚
EtOAc 乙酸乙酯
EtOH 乙醇
FCS 胎牛血清
h 小时
HATU 1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-
b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸酯
HBTU 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
HPLC 高压液相色谱法
HV 高真空
KOAc 乙酸钾
LC-MS 液相色谱法和质谱法
m 多重峰
m/z 质荷比
MeOH 甲醇
min 分钟
MS 质谱法
MsCl 甲磺酰氯
Ms2O 甲磺酸酐
NaOAc 乙酸钠
NaPyr. 丙酮酸钠
NEAA 非必需氨基酸
NMM N-甲基吗啉
NMR 核磁共振
PBS 磷酸盐缓冲盐水
PdCl2(dppf) [1,1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)
PdCl2(dppf)-CH2Cl2 [1,1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)-二
氯甲烷加合物
PdCl2(PPh3)2 双(三苯基膦)二氯化钯(II)
PG 保护基团
PPh3 三苯基膦
ppm 百万分率
rac 外消旋
RM 反应混合物
Rt 保留时间
RT 室温
s 单重峰
sat. 饱和
SFC 超临界流体色谱法
t 三重峰
TBME 叔丁基甲基醚
TEA 三乙胺
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
分析方法
通用条件：NMR：
NMR谱是在Bruker AVANCE 400MHz、500MHz或600MHz NMR光谱仪上使用ICON-NMR在TopSpin程序控制下记录的。除非另外指明，否则光谱在298K下测量，并相对于已知溶剂共振来参考。
LC-MS：
使用电喷雾方法、化学方法和电子轰击离子化方法在LC-MS、SFC-MS或GC-MS系统上从一系列以下配置的仪器中获取质谱：沃特世Acquity UPLC/SQD系统，使用光电二极管阵列检测器和单四极杆质量检测器，或使用带有G 6110系列质谱仪的安捷伦1200系统。[M+H]+是指化学物种的质子化分子离子。
沃特世Acquity UPLC/SQD系统：
方法A
方法B
方法C
方法D
安捷伦1200系统：
方法E
方法F
方法G
方法H
方法I
方法J
方法K
手性分析型HPLC：
用Shimadzu LC-20A分析型HPLC(使用光电二极管阵列检测器)产生手性分析型HPLC数据。
方法L
手性分析型SFC：
用沃特世Acquity UPC2系统(使用光电二极管阵列检测器)产生手性分析型SFC数据。
方法M柱Daicel Chiralpak AD-H，5μm，250x 4.6mm
制备型色谱法：
正相和反相快速色谱纯化已在CombiFlash Rf200或Rf+系统上进行。可替代地，已在Interchim Puriflash 4250系统或Biotage系统上进行反相色谱纯化。使用MeOH作为改性剂的，用带有沃特世2998光电二极管阵列检测器或沃特世MS单四极杆检测器的沃特世制备型SFC-100-MS系统，已经进行了超临界流体色谱(SFC)分离。通常，背压为120巴，流量为100g CO2/min，以及柱温为40℃。反相HPLC纯化已在带有沃特世2998光电二极管阵列检测器或沃特世MS单四极杆检测器的沃特世HPLC制备型系统上进行。
手性制备型色谱法：
方法1
方法2
固相萃取(SPE)筒：
对于除酸：PL-HCO3 MP SPE筒购自安捷伦StratosPhere-参考：PL-HCO3MP-树脂，1.8mmol/g，100A，150-300μm，500mg，6ml。
对于捕获和释放：SCX筒购自安捷伦-参考：HF Mega DE-SCX，2g，12ml。
中间体的合成
中间体1a
3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酸
步骤1：3-((2-羧乙基)氨基)-4-甲氧基苯甲酸
将3-氨基-4-甲氧基苯甲酸(5.0g，29.3mmol)悬浮于丙烯酸(8.05ml，117mmol)中。将所得的米色悬浮液搅拌至100℃。10min后，停止搅拌，并且将RM在100℃下放置3h。粗制RM无需进一步处理和进一步纯化即可直接用于下一步。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.56min，[M+H]+＝240.2。
步骤2：3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酸
向粗制RM 3-((2-羧乙基)氨基)-4-甲氧基苯甲酸(7.01g，29.3mmol)中添加AcOH(33ml)。将悬浮液加热至100℃并搅拌10min。然后，添加脲(11.00g，183mmol)，并且将所得的混合物在120℃下搅拌过夜。然后将所得的棕色溶液淬灭到冷水溶液(150ml)和浓缩的HCl(10ml)中。搅拌后，将所得的米色悬浮液在5℃的冰箱中储存过夜，然后过滤。将滤饼用水洗涤并干燥，以提供棕色固体。将该棕色固体用0.05M水性HCl消化并过滤。将滤饼用TBME(3x 25ml)洗涤并在40℃下在减压下干燥，以提供6.29g呈米色固体的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.48min，[M+H]+＝265.2。
中间体1b
五氟苯基3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酸酯
向250ml圆底烧瓶中添加(3-(2,4)-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酸(中间体1a)(28g，106mmol)、五氟苯基2,2,2-三氟乙酸酯(36g，127mmol)和DMF(50ml)。然后，在0℃下添加DIPEA(76ml，424mmol)，并将RM在RT下搅拌2h，然后用水(300ml)稀释。将混合物用EtOAc(2x250ml)萃取，将合并的有机层用盐水(2x 10ml)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过硅胶色谱法(用在石油醚中的10％-30％EtOAc洗脱)纯化粗制混合物，提供40g呈白色固体的标题化合物。
LC-MS(方法E)：Rt＝1.51min，[M+H]+＝432。
中间体1c3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-乙氧基苯甲酸
3-氨基-4-乙氧基苯甲酸(2.7g，14.90mmol)悬浮于丙烯酸(4.09ml，59.6mmol)中并将RM在110℃下搅拌1h。添加脲(5.37g，89mmol)和AcOH(18ml)并将RM在130℃下搅拌2h。将RM用水淬灭，用HCl(37％)的水性浓缩溶液酸化并用EtOAc萃取。将有机相合并且蒸发。添加水，将混合物过滤并将固体用水和EtOAc洗涤，产生呈固体的标题化合物(1.1g)。
方法A：Rt＝0.56min；[M+H]+＝279.1。
中间体2
4-氯-6-碘-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶
步骤1：4-氯-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶
在置于氩气下的火焰干燥的烧瓶中，将在矿物油(1.563g，39.1mmol)中的氢化钠(60％)添加到DMF(60ml)中，并将所得的混合物冷却至0℃。经10min，缓慢添加6-氯-7-脱氮杂嘌呤(deazapurine)(4g，26.0mmol)在DMF(20ml)中的溶液。将反应搅拌10min直至停止产生氢。然后，添加苯磺酰氯(3.36ml，26.0mmol)，并将反应在RT下搅拌1h。然后，添加水，并且将所得的沉淀物过滤并在减压下干燥，以提供7.418g呈浅灰色固体的标题化合物。
LC-MS(方法C)：Rt＝1.01min，[M+H]+＝294.1/296.0。
步骤2：4-氯-6-碘-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶
经15min，向在-78℃下的在氩气气氛下的4-氯-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶在干燥的THF(80ml)中的搅拌溶液中添加在CHX(5.22ml，7.83mmol)中的二异丙基氨基锂单-THF(1.5M)。1h后，经15min滴加碘(1.987g，7.83mmol)在THF(20ml)中的溶液。将所得的溶液搅拌3h。然后，添加水(2ml)，并且将混合物温热至RT。将混合物用DCM稀释，将橙色有机层用盐水(2x)洗涤，经Na2SO4干燥，并蒸发至干。将所得的橙棕色固体与ACN一起研磨，以提供1.513g呈米色固体的标题化合物。
LC-MS(方法C)：Rt＝1.12min，[M+H]+＝419.9/421.9。
中间体3a4-(4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯甲醛
步骤1：(4-(4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)甲醇
在0-5℃下，向在氩气下的乙基4-(4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯甲酸酯(其可以根据公开的专利US 6140332，第45栏，实例30中所述的程序制备)(10.2g，33.8mmol)在100ml THF中的棕色悬浮液中缓慢添加氢化铝锂在THF(50.7ml，50.7mmol)中的溶液(1M)。在添加期间，将RM用THF(5ml)稀释。添加后，将RM在0℃下搅拌10min，并使其温热至RT。在RT下搅拌3h后，将RM在0℃下用水(50ml)和15％水性NaOH(50ml)淬灭(放热，有气体逸出)。将RM通过(过滤材料)过滤，用THF(250ml)洗涤，并且将滤液在减压下浓缩，以提供9.32g的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.78min，[M+H]+＝260.1/262.1。
步骤2：4-(4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯甲醛
将(4-(4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)甲醇(步骤1)(9.32g，32.7mmol)和二氧化锰(28.4g，327mmol)在THF(250ml)中的黑色悬浮液在RT下搅拌过夜。将另外批次的二氧化锰(8.52g，98mmol)添加至RM中，并在RT下再搅拌一晚上。将RM通过(过滤材料)过滤并用THF(400ml)洗涤。将所得的滤液浓缩，用THF稀释，通过再次过滤，并在减压下浓缩，以提供5.68g的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.88min，[M+H]+＝258.1/260.1。
中间体3b
4-(4-氯-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯甲醛
向经吹扫并在惰性气氛下维持的2l烧瓶中添加4-氯-6-碘-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(中间体2)(54g，129mmol)和4-甲酰基苯基硼酸(19g，129mmol)、Na2CO3(40g，370mmol)以及PdCl2(dppf)(9g，12.9mmol)。添加ACN(1200ml)和水(300ml)，并在N2下将RM在100℃下搅拌16h。将RM过滤并在真空下浓缩。将粗制混合物通过硅胶色谱法(用在DCM中的3％-9％MeOH洗脱)纯化，产生39g呈黄色固体的4-(4-氯-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯甲醛。
LC-MS(方法I)：Rt＝1.99min，[M+H]+＝398。
中间体4
叔丁基4-(2-氧代乙氧基)哌啶-1-甲酸酯
步骤1：叔丁基4-(烯丙氧基)哌啶-1-甲酸酯
在RT下，在氩气下，将在矿物油(964mg，24.10mmol)中的氢化纳(60％)逐滴添加到1-Boc-4-羟基哌啶(1000mg，4.82mmol)在无水THF(45ml)中的溶液中。继续搅拌30min。然后将烯丙基溴(0.500ml，5.78mmol)滴入混合物中，并将RM在RT下搅拌40h。然后将RM用水淬灭。将混合物用EtOAc萃取，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，以提供粗制化合物。通过快速硅胶色谱法(用在CHX中的0-20％EtOAc洗脱)纯化，提供1130mg呈无色液体的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝1.13min，[M-tBu+H]+＝186.1。
步骤2：叔丁基4-(2-氧代乙氧基)哌啶-1-甲酸酯
将叔丁基4-(烯丙氧基)哌啶-1-甲酸酯(1120mg，4.64mmol)在无水DCM(40ml)中的溶液在两颈烧瓶中冷却至-78℃。将臭氧在RM中鼓泡70min。然后将RM温热至RT，并添加PPh3聚合物结合(5g，16.00mmol)以破坏臭氧化物。将RM在RT下搅拌30min。然后将其经过滤并用DCM洗涤。将滤液蒸发至干，提供1147mg呈无色油状物的标题化合物。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.58(s,1H),4.21(s,2H),3.70-3.40(m,10H),3.01(s,6H),1.87-1.66(m,6H),1.38(dd,J＝2.6,1.2Hz,34H)。
中间体5
叔丁基4-(4-(4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)哌嗪-1-甲酸酯
将4-氯-6-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(3.60g，12.88mmol)、Cs2CO3(10.5g，32.2mmol)和4-(4-t-Boc-哌嗪并甲基)苯基硼酸(4.95g，15.46mmol)在二噁烷/水1:1(100ml)中的混合物用氩气脱气。然后添加PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(1.052g，1.288mmol)，并且将RM在100℃下搅拌4h。将RM冷却至RT，然后在EtOAc和水之间分配。分离各层，并将有机层中含有的沉淀物过滤，以提供2.18g呈棕色粉末的标题化合物。将所得的滤液用盐水洗涤，经MgSO4干燥并浓缩，以提供4.65g的粗产物。将粗产物在ACN/Et2O中研磨、过滤并在减压下干燥，以提供1.938g更多的呈米色固体的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.81min，[M+H]+＝428.2/430.2。
中间体6
(反式-外消旋)-叔丁基3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酸酯
在氩气下，在-30℃，向叔丁基6-氧杂-3-氮杂双环[3,1,0]己烷-3-甲酸酯(10g，52.9mmol)和溴化铜(I)-二甲基硫醚络合物(1.5g，7.30mmol)在THF(200ml)中的溶液中滴加在THF中的异丁基氯化镁(100ml，200mmol)(2M)。将所得的深色溶液在-15℃以下搅拌1h。然后将RM用10％水性NH4Cl淬灭，并变为蓝色。添加EtOAc，并且将混合物在RT下搅拌30min。然后分离各层，并且将水层用EtOAc(3x)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过快速硅胶色谱法(用在石油醚中的0-20％EtOAc洗脱)纯化粗产物，提供11.82g呈淡黄色油状物的标题化合物。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ3.96(q,J＝5.2Hz,1H),3.59(dd,J＝11.2,6.3Hz,2H),3.19(dd,J＝11.5,4.6Hz,1H),3.00(dd,J＝10.9,6.0Hz,1H),2.07(dp,J＝12.3,5.8Hz,1H),1.91(s,1H),1.60(dt,J＝13.2,6.6Hz,1H),1.43(d,J＝12.6Hz,13H),1.31(ddd,J＝13.5,8.3,5.3Hz,1H),1.13(ddd,J＝13.7,9.4,5.9Hz,1H),0.90(dd,J＝8.8,6.6Hz,6H)。
中间体7
(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
步骤1：(反式-外消旋)-苄基3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酸酯
在N2下，经20min，向苄基6-氧杂-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-甲酸酯(8.9g，40.6mmol)和溴化铜(I)-二甲基硫醚络合物(0.835g，4.06mmol)在THF(200ml)中的悬浮液中滴加在THF中的异丁基氯化镁(79ml，158mmol)(2M)，将温度保持在-15℃以下。将所得的深色溶液在-15℃以下搅拌1h。将RM用10％水性NH4Cl(放热)淬灭，并变为蓝色。添加EtOAc和水，并且将混合物在RT下搅拌30min。分离各层，并且将水层用EtOAc(2x)萃取。将合并的有机层用水(2x)和盐水(1x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，以提供10.62g的粗产物。通过快速硅胶色谱法(用在己烷中的0-50％EtOAc洗脱)纯化粗产物，提供5.67g的材料。通过快速硅胶色谱法(用在DCM中的0-30％MeOH(+10％NH4OH)洗脱)纯化材料，提供3.911g的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝1.05min，[M+H]+＝278.4。
步骤2：(3S,4R)-苄基3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酸酯和(3R,4S)-苄基3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酸酯
使用SFC(制备型方法1)手性分离(反式-外消旋)-苄基3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酸酯，提供呈无色油状物的单独的对映异构体；第1洗脱峰(峰1)给出1.64g的(3S,4R)-苄基3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酸酯和，并且第2洗脱峰(峰2)产生1.65g的(3R,4S)-苄基3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酸酯：
(3S,4R)-苄基3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酸酯：
SFC(方法M)：Rt＝2.51min。
LC-MS(方法A)：Rt＝1.06min，[M+H]+＝278.2。
(3R,4S)-苄基3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酸酯：
SFC(方法M)：Rt＝3.75min。
LC-MS(方法A)：Rt＝1.06min，[M+H]+＝278.2。
步骤3：(3R,4S)-4-异丁基吡咯烷-3-醇
将(3R,4S)-苄基3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酸酯(步骤2的第2洗脱峰)(1.65g，5.95mmol)在MeOH(20ml)中的溶液用10％碳载钯(0.4g，3.76mmol)处理，并且将RM置于25℃-30℃的0.1巴的氢气下。2h后，将RM通过(过滤材料)过滤并用MeOH洗涤。将滤液浓缩并在真空下干燥，以提供黄色油状物。将该油状物溶解于DCM中，并且添加在二噁烷中的HCl(2.231ml，8.92mmol)(4M)以形成盐酸盐。然后，添加Et2O，将形成的沉淀物过滤并在减压下干燥，以提供840mg呈HCl盐的标题化合物。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δppm 0.88(dd,J＝16.69,6.60Hz,6H)1.13(ddd,J＝13.66,8.99,6.33Hz,1H)1.25(ddd,J＝13.75,7.70,6.42Hz,1H)1.54-1.63(m,1H)2.06-2.13(m,1H)2.81(dq,J＝11.14,5.70Hz,1H)2.86-2.97(m,1H)3.19-3.27(m,1H)3.30-3.35(m,1H)3.97(q,J＝3.85Hz,1H)5.46(br s,1H)9.12-9.58(m,2H)。
步骤4：(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
在0℃以下，向5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯胺(可商购获得的；或可以根据公开的专利申请WO 2013/008095，第37页，中间体5中所述的程序制备)(1g，3.98mmol)和DIPEA(2.78ml，15.93mmol)在DCM(25ml)中的溶液中缓慢添加在甲苯(2.51ml，4.78mmol)中的光气20％。将所得的溶液在0℃下搅拌30min，然后在0℃下添加到(3R,4S)-4-异丁基吡咯烷-3-醇(步骤3)(0.787g，4.38mmol)在DCM(25ml)中的搅拌溶液中。将所得的混合物在0℃下搅拌45min。然后，将RM浓缩，用EtOAc/MeOH(9:1)稀释，用水(3x)和盐水(1x)洗涤。然后将有机层用MgSO4干燥并浓缩，以得到1.86g的粗产物。通过快速硅胶色谱法(用在己烷中的0-100％EtOAc(+5％EtOH)洗脱)纯化粗产物，提供1.455g的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝1.18min，[M+H]+＝421.4。
中间体8
(3S,4R)-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
步骤1和2：参见中间体7
步骤3：(3S,4R)-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
在0℃以下，向5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯胺(可商购获得的；或可以根据公开的专利申请WO 2013/008095，第37页，中间体5中所述的程序制备)(950mg，3.78mmol)和DIPEA(2.64ml，15.13mmol)在DCM(25ml)中的溶液中缓慢添加在甲苯(2.389ml，4.54mmol)中的光气20％。将所得的溶液在0℃下搅拌15min，然后在0℃下添加到(3S,4R)-4-异丁基吡咯烷-3-醇(748mg，4.16mmol)在DCM(25ml)中的搅拌溶液中。将所得的混合物在0℃下搅拌30min。然后将RM浓缩，用EtOAc/MeOH(9:1)稀释，用水(3x)和盐水(1x)洗涤。然后将有机层用MgSO4干燥并浓缩，以得到1.764g的粗产物。通过快速硅胶色谱法(用在己烷中的0-100％EtOAc(+5％EtOH)洗脱)纯化粗产物，提供1.38g呈白色泡沫的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝1.18min，[M+H]+＝421.4。
中间体9
(顺式-外消旋)-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
步骤1：顺式-外消旋-叔丁基3-异丁基-4-((4-硝基苯甲酰)氧基)吡咯烷-1-甲酸酯
在氩气下，在0℃下，经1h，向(反式-外消旋)-叔丁基3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酸酯(中间体6)(11.82g，43.2mmol)、4-硝基苯甲酸(11g，65.2mmol)和PPh3(18g，65.2mmol)在THF(250ml)中的溶液中滴加DIAD(13ml，65.5mmol)。将所得的橙色溶液缓慢温热至RT持续另外的3小时。将RM用水淬灭，并将THF部分蒸发。添加EtOAc，并且将混合物用EtOAc(3x)萃取。将合并的有机层用0.2M HCl和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并在减压下蒸发。通过快速硅胶色谱法(用在CHX中的0-15％EtOAc洗脱)纯化粗产物，提供16.43g呈淡黄色泡沫的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝1.41min，[M-tBu+H]+＝337.2。
步骤2：(顺式-外消旋)-叔丁基3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酸酯
向(顺式-外消旋)-叔丁基3-异丁基-4-((4-硝基苯甲酰)氧基)吡咯烷-1-甲酸酯(步骤1)(16.43g，41.9mmol)在MeOH/H2O 3:1(160ml)中的溶液中添加NaOH(3.35g，84mmol)。将RM在RT下搅拌1.5h。然后，使用1M水性HCl将RM调节至pH 6。将MeOH部分蒸发，然后添加EtOAc，并且将混合物在RT下搅拌30min。将混合物用EtOAc(3x)萃取，经MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩。将所得的白色残余物在DCM中研磨并过滤。通过快速硅胶色谱法(用在CHX中的从0-35％EtOAc洗脱)纯化所得的黄色滤液，提供材料，然后将该材料在DCM中研磨并过滤。将所得的滤液浓缩，以得到10.602g呈黄色油状物的标题化合物。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ4.26-4.15(m,1H),3.53(t,J＝9.1Hz,1H),3.44(d,J＝1.7Hz,2H),3.03(t,J＝10.7Hz,1H),2.86-2.21(m,1H),2.13(dqd,J＝11.4,7.9,3.8Hz,1H),1.59(dp,J＝13.3,6.7Hz,1H),1.43(d,J＝13.2Hz,24H),0.91(d,J＝6.6Hz,7H)。
步骤3：(顺式-外消旋)-4-异丁基吡咯烷-3-醇
在RT下，将(顺式-外消旋)-叔丁基3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酸酯(步骤2)(1.040g，4.06mmol)和在二噁烷(10ml)中的HCl(4M)的溶液搅拌过夜。将RM浓缩，然后与DCM共蒸发，并在减压下干燥，以提供770mg呈HCl盐呈灰白色固体的标题化合物。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.27(s,2H),5.46-5.17(m,1H),4.25-3.97(m,1H),3.26-3.11(m,3H),3.04(d,J＝12.1Hz,1H),2.72(t,J＝11.3Hz,1H),2.05(dt,J＝7.3,3.8Hz,1H),1.55(dq,J＝13.2,6.6Hz,1H),1.38(dt,J＝13.9,7.1Hz,1H),1.18(dt,J＝13.9,7.2Hz,1H),0.86(d,J＝6.3Hz,6H)。
步骤4：(顺式-外消旋)-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
在0℃下，将在甲苯(1.3ml，1.821mmol)中的光气15％滴入5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯胺(CAS1227210-37-8)(可商购获得的；或可以根据公开的专利申请WO 2013/008095，第37页，中间体5中所述的程序制备)(438mg，1.708mmol)和DIPEA(0.5ml，2.86mmol)在干燥的DCM(10ml)中的溶液。将RM在0℃下搅拌30min。然后在0℃下滴加(顺式-外消旋)-4-异丁基吡咯烷-3-醇(步骤3)(323mg，1.705mmol)和DIPEA(0.5ml，2.86mmol)在干燥的DCM(1ml)中的溶液。将所得的淡橙色溶液在0℃下搅拌2h。将混合物在DCM和饱和水性NaHCO3溶液之间分配。将有机层用饱和水性NH4Cl和盐水洗涤，经Na2SO4干燥并蒸发。通过快速硅胶色谱法(用在DCM中的0-15％MeOH洗脱)纯化粗制化合物，提供793mg的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝1.22min，[M+H]+＝421.4。
中间体10
(顺式-外消旋)-N-(5-氟-3-(6-(4-甲酰基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
将4-(4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯甲醛(中间体3a)(375mg，1.323mmol)、K2CO3(402mg，2.88mmol)和(顺式-外消旋)-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(中间体9)(701mg，1.151mmol)在二噁烷/水1:1(10ml)中的混合物用氩气脱气。然后，添加PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(94mg，0.115mmol)，并且将RM在100℃下搅拌1h。将RM在EtOAc和水之间分配。将有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥并在减压下浓缩。将粗产物在MeOH/二异丙酯中稀释、在4℃下冷却，并将悬浮液过滤，以提供190mg呈黄色固体的标题化合物。通过快速硅胶色谱法(用在DCM中的0-12.5％MeOH洗脱)纯化滤液，提供另外量(311mg)的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.98min，[M+H]+＝516.3。
中间体11
(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-(哌嗪-1-基甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
步骤1：叔丁基4-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)哌嗪-1-甲酸酯
将叔丁基4-(4-(4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)哌嗪-1-甲酸酯(中间体5)(500mg，1.110mmol)、K2CO3(384mg，2.78mmol)和(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(中间体7)(500mg，1.13mmol)在二噁烷/水1:1(10ml)中的混合物用氩气脱气。然后添加PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(91mg，0.111mmol)，并将RM在100℃下搅拌2h。将RM冷却至RT，然后在EtOAc和水之间分配。分离各层。将有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥并在减压下浓缩。通过快速硅胶色谱法(用在DCM中的0-40％DCM/MeOH/NH3(80:20:1)洗脱)纯化粗产物，提供514mg呈橙色固体的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.88min，[M+H]+＝686.5。
步骤2：(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-(哌嗪-1-基甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
将叔丁基4-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)哌嗪-1-甲酸酯(步骤1)(507mg，0.724mmol)和在二噁烷中的HCl(2ml，8.00mmol)(4M)在MeOH(2ml)中的褐色溶液在RT下搅拌2h。将RM浓缩并在减压下干燥，以提供509mg呈HCl盐的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.71min，[M+H]+＝586.5。
中间体12
(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-(哌啶-4-基氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
步骤1：叔丁基4-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯氧基)哌啶-1-甲酸酯
在氩气下，在0℃下，向4-羟基苯基硼酸频哪醇酯(1.030g，4.68mmol)、1-Boc-4-羟基哌啶(1.057g，5.15mmol)和PPh3(1.35g，5.15mmol)在THF(20ml)中的溶液中滴加DIAD(1ml，5.14mmol)。将所得的溶液在RT下搅拌3天。将RM在EtOAc和饱和水性NaHCO3溶液之间分配。将有机层分离，用盐水洗涤，经MgSO4干燥并在减压下浓缩。通过快速硅胶色谱法(用在CHX中的0-20％EtOAc洗脱)纯化粗产物，提供1.249g的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝1.48min，[M+H]+＝404.2。
步骤2：叔丁基4-(4-(4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯氧基)哌啶-1-甲酸酯
将4-氯-6-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(斯诺瓦托有限公司(Synnovator,Inc.)，CAS[876343-10-1])(855mg，3.06mmol)、Cs2CO3(2492mg，7.65mmol)和叔丁基4-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯氧基)哌啶-1-甲酸酯(步骤1)(1234mg，3.06mmol)在二噁烷/水1:1(30ml)中的混合物用氩气脱气。添加PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(250mg，0.306mmol)，并且将RM在100℃下搅拌3h。将RM冷却至RT，然后在EtOAc和饱和水性NaHCO3之间分配。分离各层，然后将有机层用盐水洗涤、经MgSO4干燥并在减压下浓缩。通过快速硅胶色谱法(用在CHX中的0-100％EtOAc洗脱)纯化粗产物，提供棕色残余物。然后将残余物用MeOH研磨，将所得的悬浮液过滤、用Et2O洗涤并在减压下干燥，以提供1.039g呈米色粉末的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝1.24min，[M+H]+＝429.3/431.2。
步骤3：叔丁基4-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯氧基)哌啶-1-甲酸酯
将叔丁基4-(4-(4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯氧基)哌啶-1-甲酸酯(步骤2)(295mg，0.420mmol)、K2CO3(145mg，1.049mmol)和(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(中间体7)(200mg，0.476mmol)在二噁烷/水1:1(4ml)中的混合物用氩气脱气。添加PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(34mg，0.042mmol)，并且将RM在100℃下搅拌1h。将RM冷却至RT，然后在EtOAc和水之间分配。分离各层，然后将有机层用盐水洗涤、经MgSO4干燥并在减压下浓缩。通过快速硅胶色谱法(用在DCM中的0-38％MeOH洗脱)纯化粗产物，提供303mg的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝1.22min，[M+H]+＝687.3。
步骤4：(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-(哌啶-4-基氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
将叔丁基4-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯氧基)哌啶-1-甲酸酯(步骤3)(303mg，0.393mmol)和在二噁烷中的HCl(2ml，8.00mmol)(4M)在MeOH(2ml)中的褐色溶液在RT下搅拌1h。然后，将RM在减压下浓缩。通过反相快速色谱法(在C18柱上，用在(水+0.1％TFA)中的2％-100％ACN洗脱)纯化粗产物，提供317mg呈橙色粉末呈TFA盐的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.76min，[M+H]+＝587.3。
中间体13
叔丁基9-(4-(4-氯-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯乙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯
步骤1：2-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)乙-1-醇
将2-(4-溴苯基)乙烷-1-醇(CAS 4654-39-1)(60g，300mmol)、BISPIN(84g，330mmol)、KOAc(90g，900mmol)和PdCl2(dppf)(6.6g，9mmol)在二噁烷(600ml)中的混合物在N2下在85℃下搅拌16h。然后，将RM冷却至RT并过滤。将所得的溶液在减压下浓缩。通过硅胶色谱法(用在石油醚中的0-30％EtOAc洗脱)纯化粗制残余物，提供100g呈无色油状物的标题化合物。
LC-MS(方法I)：Rt＝1.87min，[M+NH4]+＝266。
步骤2：4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯乙基甲磺酸酯将2-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)乙-1-醇(步骤1)(100g，300mmol)和TEA(240g，2400mmol)在DCM(1300ml)中的混合物在0℃下搅拌20min。然后，滴加在DCM(200ml)中的MsCl(136g，1200mmol)。添加后，将RM在RT下搅拌16h。然后，将混合物用水(3x 300ml)洗涤，经Na2SO4干燥并在减压下浓缩。通过硅胶色谱法(用在DCM中的0-50％EtOAc洗脱)纯化粗制残余物，提供87g呈无色油状物的标题化合物。
LC-MS(方法H)：Rt＝1.92min，[M+H]+＝327。
步骤3：叔丁基9-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯乙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯
将叔丁基3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯(CAS173405-78-2)(34g，133mmol)、4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯乙基甲磺酸酯(步骤2)(86g，172mmol)、K2CO3(47g，345mmol)和KI(2.3g，13.8mmol)在ACN(1000ml)中的混合物在60℃下搅拌16h。然后将RM过滤，并且将溶液在减压下浓缩。通过硅胶色谱法(用在DCM中的0-10％MeOH洗脱)纯化粗制残余物，提供49g呈白色固体的标题化合物。
LC-MS(方法F)：Rt＝1.47min，[M+H]+＝485。
步骤4：叔丁基9-(4-(4-氯-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯乙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯
将叔丁基9-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯乙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯(步骤3)(38g，79mmol)、中间体2(37g，88mmol)、K2CO3(22g，160mmol)和PdCl2(dppf)(5.8g，8mmol)在5:1二噁烷/水(480ml)中的混合物在N2下在80℃下搅拌16h。然后将RM倒入EtOAc(1500ml)中，将有机层用水(100ml)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过硅胶色谱法(用在DCM中的0-10％MeOH洗脱)纯化粗制残余物，提供34g呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(方法F)：Rt＝1.99min，[M+H]+＝650。
中间体14
1-(2-甲氧基-5-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-羰基)苯基)二氢嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮
步骤1：叔丁基9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯
在RT下，在氩气下，向3,9-二氮杂-螺[5.5]十一烷-3-甲酸叔丁酯(432mg，1.698mmol)和NMM(0.392ml，3.57mmol)在DMF(4ml)中的搅拌溶液中添加中间体1a(471mg，1.783mmol)，然后添加HATU(743mg，1.953mmol)。将澄清的RM在RT下搅拌2.5h，然后用饱和水性NaHCO3淬灭，并用EtOAc稀释。分离各层，并且将水层用EtOAc(1x)萃取。将合并的有机层用盐水/水(1:1，2x)和盐水(1x)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩，以得到900mg的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.91min，[M+H]+＝501.4。
步骤2：1-(2-甲氧基-5-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-羰基)苯基)二氢嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮
将叔丁基9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯(步骤1)(100mg，0.200mmol)和在二噁烷中的HCl(1ml，4mmol)(4M)在MeOH(1ml)中的溶液在RT下搅拌1.5h。将RM浓缩并在减压下干燥，以提供99mg呈盐酸盐的标题化合物。
LC-MS(方法D)：Rt＝0.76min；[M+H]+＝401.4。
中间体15
叔丁基4-((4-(4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)氧基)哌啶-1-甲酸酯
在氩气下，向4-氯-6-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(848mg，3.03mmol)和(4-(((1-(叔丁氧羰基)哌啶-4-基)氧基)甲基)苯基)硼酸(1.068g，3.19mmol)在1-丙醇(20ml)中的橙色悬浮液中添加PdCl2(PPh3)2(106mg，0.152mmol)，然后添加在水中的Na2CO3(3.03ml，6.07mmol)(2M)。将RM在100℃下搅拌过夜。然后将其用EtOAc稀释，用水和盐水洗涤。将有机层经MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过快速硅胶色谱法(用在CHX中的0-100％EtOAc洗脱)纯化粗产物，提供844mg的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝1.29min，[M+H]+＝443.3
中间体16
叔丁基4-(2-(4-((4-(4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)氧基)哌啶-1-基)乙基)哌啶-1-甲酸酯
步骤1：4-氯-6-(4-((哌啶-4-基氧基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶
将叔丁基4-((4-(4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)氧基)哌啶-1-甲酸酯(中间体15)(515mg，1.163mmol)和TFA(2.69ml，34.9mmol)在DCM(3ml)中的黄色溶液在RT下在氩气下搅拌2h。然后将溶液浓缩，然后在减压下干燥，以提供664mg呈TFA盐的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.66min；[M+H]+＝343.2/345.2。
步骤2：叔丁基4-(2-(4-((4-(4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)氧基)哌啶-1-基)乙基)哌啶-1-甲酸酯
向4-氯-6-(4-((哌啶-4-基氧基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(步骤1)(664mg，1.163mmol)、叔丁基4-(2-氧代乙基)哌啶-1-甲酸酯(291mg，1.279mmol)和TEA(0.486ml，3.49mmol)在MeOH(4ml)中的棕色溶液中添加在THF中的ZnCl2(2.56ml，1.279mmol)(0.5M)。将RM在RT下搅拌3h，然后添加NaBH3CN(80mg，1.279mmol)，并且将RM在RT下在氩气下搅拌过夜。将溶液用DCM稀释并用水和盐水洗涤。将有机层经MgSO4干燥，过滤，浓缩并在减压下干燥，以提供730mg的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.95min，[M+H]+＝554.4/556.3。
中间体17
2-(4-(4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)乙醇
将4-氯-6-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(1.2g，4.29mmol)、4-(2-羟基乙基)苯基硼酸(750mg，4.29mmol)、在水中的Na2CO3(4.72ml，9.45mmol)(2M)和在1-丙醇(36ml)中的PdCl2(PPh3)2(154mg，0.215mmol)的黄色乳状混合物用N2在RT下冲洗，然后在105℃下的预热油浴中搅拌。在105℃下搅拌过夜后，将棕色混合物浓缩至干，并在HV泵下干燥以产生深色固体。通过快速硅胶色谱法(用在CHX中的40％-100％EtOAc洗脱)纯化粗品，提供762mg呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.82min，[M+H]+＝274.0。
中间体18
叔丁基4-(哌啶-4-基氧基)哌啶-1-甲酸酯
步骤1：叔丁基4-(吡啶-4-基氧基)哌啶-1-甲酸酯
在500ml圆底烧瓶中混合吡啶-4-醇(5g，52.6mmol)、干燥的THF(200ml)、叔丁基4-羟基哌啶-1-甲酸酯(13.3g，65.8mmol)和PPh3(18g，68.4mmol)。然后在RT下滴加DEAD(12g，68.4mmol)。将RM在RT下搅拌3h，然后将RM浓缩。通过硅胶色谱法(用在DCM中的3％MeOH洗脱)纯化，提供10g呈白色固体的标题化合物。
LC-MS(方法H)：Rt＝1.35min，[M+H]+＝279.3。
步骤2：叔丁基4-(哌啶-4-基氧基)哌啶-1-甲酸酯
向经吹扫并在惰性气氛下维持的500ml圆底烧瓶中混合叔丁基4-(吡啶-4-基氧基)哌啶-1-甲酸酯(2g，7.2mmol)、EtOH(100ml)、AcOH(5ml)和碳载钯(0.4g)。将RM在80℃下在H2气氛(4MPa)下搅拌16h。将混合物通过过滤，并且将滤液在减压下浓缩。通过硅胶色谱法(用在DCM中的10％MeOH洗脱)纯化粗制混合物，提供0.5g呈无色油状物的标题化合物。
LC-MS(方法H)：Rt＝1.32min，[M+H]+＝285.3。
最终化合物的合成
化合物1
(3S,4R)-N-(3-(6-(4-((9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
步骤1：(3S,4R)-N-(5-氟-3-(6-(4-甲酰基苯基)-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
向100ml圆底烧瓶中添加4-(4-氯-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯甲醛(410mg，1.03mmol)(中间体3b)、(3S,4R)-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(420mg，1.0mmol)(中间体8)、PdCl2(dppf)(110mg，0.15mmol)、Na2CO3(280mg，2.64mmol)、ACN(16ml)和H2O(4ml)。将混合物脱气，用N2(2x)吹扫，并在100℃下搅拌1.5h。将RM在真空下浓缩，并添加冷水(30ml)。将混合物用EtOAc(3x 50ml)萃取，并且将合并的有机层蒸发以产生800mg的标题化合物。
LC-MS(方法J)：Rt＝1.74min，[M+H]+＝656。
步骤2：叔丁基9-(4-(4-(5-氟-3-((3S,4R)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯
向圆底烧瓶(100ml)中添加(3S,4R)-N-(5-氟-3-(6-(4-甲酰基苯基)-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(720mg，0.9mmol)(步骤1)、叔丁基3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯(360mg，1.41mmol)和MeOH(32ml)。将在THF(1.0ml，1.0mmol)中的TEA(53mg，0.52mmol)和ZnCl2 1M添加到混合物中。将混合物在30℃下搅拌1.5h，然后将NaBH3CN(160mg，2.57mmol)在5℃下添加到混合物中。将混合物在30℃下搅拌1h。将RM蒸发，并添加冷水(50ml)。将混合物用EtOAc(3x50ml)萃取，并且将合并的有机层蒸发，以提供1.2g的标题化合物。
LC-MS(方法K)：Rt＝2.67min，[M+H]+＝895。
步骤3：叔丁基9-(4-(4-(5-氟-3-((3S,4R)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯
在0℃下，在含有叔丁基9-(4-(4-(5-氟-3-((3S,4R)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯(610mg，0.45mmol)(步骤2)在DMSO(6ml)中的溶液的圆底烧瓶(50ml)中，添加在H2O(1.2ml)中的NaOH(140mg，3.5mmol)。将混合物在0℃下搅拌3h。向该混合物中添加冰水和冷水的混合物(40ml)，将沉淀的固体收集并通过硅胶色谱法(用在DCM中的0-18％MeOH洗脱)纯化，产生230mg呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(方法E)：Rt＝2.44min，[M+H]+＝754。
步骤4：(3S,4R)-N-(3-(6-(4-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
向含有叔丁基9-(4-(4-(5-氟-3-((3S,4R)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯(230mg，0.305mmol)在DCM(1.8ml)和EtOH(5.0ml)中的溶液的圆底烧瓶(100ml)中，在5℃下滴加HCl在二噁烷(2.0ml，8.0mmol)中的溶液(4M)。将混合物在30℃下搅拌4h。滴加另外量的在二噁烷中的HCl(2.0ml，8.0mmol)(4M)，并将RM进一步搅拌40min。将RM蒸发，以提供粗制品。将该粗制品用石油醚/TBME 1:1(3x 30ml)、TBME(30ml)和DCM/TBME 2:1(30ml)研磨，将固体真空干燥，以产生172mg呈茶色固体呈盐酸盐的标题化合物。
LC-MS(方法F)：Rt＝1.05min，[M+H]+＝654。
步骤5：(3S,4R)-N-(3-(6-(4-((9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
在5℃下，在含有(3S,4R)-N-(3-(6-(4-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(172mg，0.237mmol)(步骤4)和3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酸(63mg，0.237mmol)(中间体1a)在DMF(2.5ml)中的溶液的50ml圆底烧瓶中，添加DIPEA(183mg，1.42mmol)。然后在5℃下添加HATU(90mg，0.237mmol)，并且将混合物在5℃下搅拌1h。将RM过滤并通过制备型HPLC(XBridge C18，21.2x 250mm，10μm；用在水/ACN中的0.01MNH4HCO3缓冲液洗脱)纯化，产生63mg呈白色固体的标题化合物。
LC-MS(方法E)：Rt＝1.85min，[M/2+H]+＝450.7。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.70(s,1H),10.33(s,1H),8.82(s,1H),7.92(d,J＝8.2Hz,2H),7.68(s,1H),7.49(dd,J＝10.8,2.7Hz,1H),7.40-7.34(m,3H),7.32(d,J＝2.1Hz,1H),7.14(d,J＝8.7Hz,1H),7.05(dd,J＝8.9,2.8Hz,1H),6.75(s,1H),5.12(s,1H),3.90-3.86(m,1H),3.84(s,3H),3.65(dd,J＝16.3,9.2Hz,2H),3.59(t,J＝6.6Hz,2H),3.53-3.35(m,4H),3.49(s,2H),3.19(dd,J＝10.1,4.7Hz,1H),3.11-3.05(m,1H),2.68(t,J＝6.3Hz,2H),2.38-2.32(m,4H),2.09(s,3H),2.06-2.00(m,1H),1.66-1.58(m,1H),1.52-1.47(m,4H),1.45-1.38(m,4H),1.38-1.29(m,1H),1.16-1.09(m,1H),0.90(dd,J＝10.8,6.6Hz,6H)。
化合物2
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((4-(2-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
步骤1：2-((1-(叔丁氧羰基)哌啶-4-基)氧基)-1-羟基乙磺酸
将叔丁基4-(2-氧代乙氧基)哌啶-1-甲酸酯(中间体4)(1.0g，3.70mmol)在EtOH(6ml)中的溶液用氩气吹扫。然后添加焦亚硫酸钠(500mg，2.63mmol)在水(1ml)中的溶液，并且将RM在80℃下搅拌1h。然后将异质混合物冷却至RT。在RT下搅拌2天后，将悬浮液过滤，用EtOH洗涤并在减压下干燥，以提供833mg呈白色固体的标题化合物。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ5.32(d,J＝5.7Hz,1H),3.96(t,J＝7.2Hz,1H),3.80(d,J＝10.3Hz,1H),3.61(d,J＝13.4Hz,2H),3.46(s,1H),3.35(s,2H),2.99(s,2H),1.73(s,2H),1.39(s,9H),1.30(q,J＝9.1,5.9Hz,2H)。
步骤2：叔丁基4-(2-(4-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)哌嗪-1-基)乙氧基)哌啶-1-甲酸酯
向(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-(哌嗪-1-基甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(中间体11)(200mg，0.321mmol)在MeOH(3ml)中的溶液中添加NaOAc(67mg，0.973mmol)，并且将所得橙色溶液在RT下搅拌5min。然后添加2-((1-(叔丁氧羰基)哌啶-4-基)氧基)-1-羟基乙磺酸(步骤1)(130mg，0.380mmol)和2-甲基吡啶硼烷络合物(21mg，0.167mmol)，并将RM在RT下搅拌3天，然后在减压下浓缩。通过反相快速色谱法(在C18柱上，用在(水+0.1％TFA)中的5％-100％ACN洗脱)纯化粗产物，提供364mg呈TFA盐的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.94min，[M+H]+＝813.6。
步骤3：(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-((4-(2-(哌啶-4-基氧基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
将叔丁基4-(2-(4-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)哌嗪-1-基)乙氧基)哌啶-1-甲酸酯(步骤2)(364mg，0.224mmol)和在二噁烷中的HCl(2ml，8.00mmol)(4M)在MeOH(2ml)中的溶液在RT下搅拌2h。然后，将RM在减压下浓缩。通过反相快速色谱法(在C18柱上，用在(水+0.1％TFA)中的从2％-100％ACN洗脱)纯化粗产物，提供155mg呈TFA盐的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.70min，[M+H]+＝713.6。
步骤4：(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((4-(2-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
在RT下，向3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酸(41mg，0.155mmol)(中间体1a)在DMF(1ml)中的溶液中添加NMM(0.050ml，0.455mmol)，然后添加HATU(59mg，0.155mmol)。在RT下搅拌30min后，将(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-((4-(2-(哌啶-4-基氧基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(步骤3)(155mg，0.143mmol)和NMM(0.050ml，0.455mmol)在DMF(0.5ml)中的溶液滴入混合物中，并将黄色RM在RT下搅拌过夜。然后将RM在减压下浓缩。通过反相快速色谱法(Interchim公司)(在C18柱上，用在(水+0.1％NH4HCO3)中的2％-100％ACN洗脱)纯化粗产物，提供114mg的材料。通过SFC(柱：Princeton 4-EP，60A，250x 30mm，5uM；用在MeOH中的40％-60％CO2洗脱)纯化材料，提供80mg呈固体的标题化合物。
LC-MS(方法B)：Rt＝3.52min，[M+H]+＝959.7。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 12.72(br s,1H),10.32(s,1H),8.83(s,1H)7.92(br d,J＝7.92Hz,2H),7.67(s,1H),7.50(br d,J＝10.71Hz,1H),7.30-7.40(m,4H),7.14(br d,J＝8.51Hz,1H),7.06(br d,J＝8.80Hz,1H),6.76(s,1H),5.11(br d,J＝4.11Hz,1H),3.81-3.89(m,4H),3.42-3.77(m,11H),3.19-3.25(m,2H),3.05-3.16(m,2H),2.67(brt,J＝5.94Hz,2H),2.52-2.55(m,1H),2.23-2.48(m,9H),2.01-2.12(m,4H),1.81(br s,2H),1.62(m,1H),1.30-1.48(m,3H),1.07-1.17(m,1H),0.90(br t,J＝7.48Hz,6H)。
化合物3
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-(2-(1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)乙基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
步骤1：叔丁基4-(2-(4-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯氧基)哌啶-1-基)乙基)哌啶-1-甲酸酯
在RT下，向(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-(哌啶-4-基氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(中间体12)(200mg，0.248mmol)、TEA(0.100ml，0.717mmol)和N-boc-4-哌啶乙醛(68mg，0.299mmol)在MeOH(2ml)中的搅拌溶液中添加在THF中的ZnCl2(0.600ml，0.300mmol)(0.5M)，并将RM在RT下在氩气下搅拌6h。然后，添加NaBH3CN(18mg，0.286mmol)。将RM在RT下搅拌过夜，然后在减压下浓缩，以提供198mg的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.96min，[M+H]+＝798.6。
步骤2：(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-((1-(2-(哌啶-4-基)乙基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
将叔丁基4-(2-(4-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯氧基)哌啶-1-基)乙基)哌啶-1-甲酸酯(步骤1)(198mg，0.248mmol)和在二噁烷中的HCl(1.5ml，6.00mmol)(4M)在MeOH(1.5ml)中的溶液在RT下搅拌3h。然后将RM在减压下浓缩。通过反相快速色谱法(在C18柱上，用在(水+0.1％TFA)中的2％-100％ACN洗脱)纯化粗产物，提供235mg呈黄色固体呈TFA盐的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.70min，[M+H]+＝698.6。
步骤3：(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-(2-(1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)乙基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
向3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酸(中间体1a)(76mg，0.289mmol)在DMF(1ml)中的搅拌溶液中添加NMM(0.050ml，0.455mmol)，然后添加HATU(110mg，0.289mmol)。将所得的RM在RT下搅拌30min。然后，将(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-((1-(2-(哌啶-4-基)乙基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(步骤2)(235mg，0.241mmol)和NMM(0.050ml，0.455mmol)在DMF(0.5ml)中的溶液滴入混合物中，并将黄色RM在RT下搅拌3h。通过反相快速色谱法(在C18柱上，用在(水+0.1％NH4HCO3)中的从2％-100％ACN洗脱)纯化粗产物，提供125mg的标题化合物。
LC-MS(方法B)：Rt＝3.77min，[M/2+H]+＝473.2。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 12.62(br s,1H),10.33(br s,1H),8.80(br s,1H),7.78-8.00(m,2H),7.59-7.74(m,1H),7.44-7.54(m,1H),7.25-7.41(m,2H),6.94-7.20(m,4H),6.65(br s,1H),4.98-5.28(m,1H),4.38-4.53(m,1H),3.77-3.92(m,4H),3.56-3.71(m,4H),3.08-3.20(m,2H),2.61-2.90(m,6H),1.84-2.36(m,12H),1.35-1.70(m,8H),1.01-1.28(m,4H)0.79-0.98(m,6H)。
化合物4
(顺式-外消旋)-N-(3-(6-(4-(((1-(2-(1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)乙基)哌啶-4-基)氧基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
步骤1：
(顺式-外消旋)-叔丁基4-((4-(4-(5-氟-3-(3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)氧基)哌啶-1-甲酸酯
向叔丁基4-((4-(4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)氧基)哌啶-1-甲酸酯(中间体15)(150mg，0.339mmol)、(顺式-外消旋)-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(中间体9)(157mg，0.373mmol)和在水中的Na2CO3(0.339ml，0.677mmol)(2M)在1-丙醇(20ml)中的混合物中添加PdCl2(PPh3)2(11.88mg，0.017mmol)。在140℃下，将所得的RM在微波中辐射15min。然后在减压下浓缩。通过快速硅胶色谱法(用在CHX中的0-100％EtOAc洗脱)纯化粗产物，提供94mg的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝1.25min，[M+H]+＝701.5。
步骤2：(顺式-外消旋)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-((哌啶-4-基氧基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
将(顺式-外消旋)-叔丁基4-((4-(4-(5-氟-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)氧基)哌啶-1-甲酸酯(步骤1)(94mg，0.134mmol)和TFA(0.310ml，4.02mmol)在DCM(3ml)中的黄色溶液在RT下在氩气下搅拌1h。然后在减压下浓缩，以提供143mg呈TFA盐的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.78min，[M+H]+＝601.6。
步骤3：
(顺式-外消旋)-叔丁基4-(2-(4-((4-(4-(5-氟-3-(3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)氧基)哌啶-1-基)乙基)哌啶-1-甲酸酯
向(顺式-外消旋)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-((哌啶-4-基氧基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(步骤2)(143mg，0.173mmol)、叔丁基4-(2-氧代乙基)哌啶-1-甲酸酯(43.1mg，0.190mmol)和TEA(0.072ml，0.518mmol)在MeOH(4ml)中的棕色溶液中添加在THF中的ZnCl2(0.380ml，0.190mmol)(0.5M)。将所得的RM在RT下搅拌3h。然后添加NaBH3CN(11.93mg，0.190mmol)，并且将RM在RT下在氩气下搅拌过夜。将所得的溶液用DCM稀释，用水和盐水洗涤。将有机层经MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过快速硅胶色谱法(用在DCM中的0-20％MeOH洗脱)纯化粗制化合物，提供83mg的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.99min，[M+H]+＝812.8。
步骤4：(顺式-外消旋)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-(((1-(2-(哌啶-4-基)乙基)哌啶-4-基)氧基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
将(顺式-外消旋)-叔丁基4-(2-(4-((4-(4-(5-氟-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)氧基)哌啶-1-基)乙基)哌啶-1-甲酸酯(步骤3)(83mg，0.102mmol)和TFA(0.236ml，3.07mmol)在DCM(3ml)中的黄色溶液在RT下在氩气下搅拌1h。然后在减压下浓缩，以提供142mg呈TFA盐的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.71min，[M+H]+＝712.4。
步骤5：(顺式-外消旋)-N-(3-(6-(4-(((1-(2-(1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)乙基)哌啶-4-基)氧基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
向(顺式-外消旋)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-(((1-(2-(哌啶-4-基)乙基)哌啶-4-基)氧基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(步骤4)(142mg，0.103mmol)、3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酸(中间体1a)(29.9mg，0.113mmol)和HBTU(46.8mg，0.123mmol)在DMF(3ml)中的棕色溶液中添加DIPEA(0.108ml，0.616mmol)。将所得的RM在RT下在氩气下搅拌2h。然后倒入水中。将所得的白色悬浮液过滤，用水洗涤并在减压下干燥，以提供100mg的粗制材料。通过反相HPLC(柱：XBridge C18，250x 50mm，5um；流速：100ml/min；用在(水+0.1％NH4OH)中的38％-58％ACN洗脱)纯化材料，提供28.5mg的标题化合物。
LC-MS(方法B)：Rt＝3.85min，[M+H]+＝959.5。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 12.77(br s,1H),10.35(s,1H),8.85(s,1H),7.96(br d,J＝7.80Hz,2H),7.66(s,1H),7.51(m,1H),7.43(br d,J＝7.90Hz,2H),7.37(br d,J＝8.40Hz,1H),7.33(s,1H),7.16(d,J＝8.31Hz,1H),7.07(br d,J＝8.60Hz,1H),6.80(s,1H),4.84-4.99(m,1H),4.55(s,2H),4.07-4.16(m,1H),3.85(s,3H),3.61(m,3H),3.43-3.52(m,3H),3.05-3.14(m,1H),2.55-2.92(m,6H),2.21-2.40(m,3H),2.13-2.21(m,1H),2.11(s,3H),2.03(br t,J＝9.11Hz,2H),1.88(m,2H),1.04-1.75(m,13H),0.92(br d,J＝6.48Hz,6H)。
化合物5
反式-外消旋-N-(3-(6-(4-((9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
步骤1：反式-外消旋-苄基3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酸酯
在3l圆底烧瓶中，苄基6-氧杂-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-甲酸酯(CAS 31865-25-5)(43.5g，148.1mmol)和溴化亚铜二甲基硫烷络合物(14g，68.4mmol)悬浮于THF(1000ml)中。在N2下将溶液冷却至-30℃，然后经90min滴加在THF中的异丁基溴化镁(913ml，1820mmol)(2M)。添加后，将反应经45min缓慢温热至-15℃，并且将混合物在-15℃下搅拌2h。然后，将反应在0℃下通过HCl 2M(1000ml)淬灭，并且将混合物在RT搅拌30min。然后分离各层，将水层用EtOAc(3x 200ml)萃取，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过硅胶色谱法(用在石油醚中的0-20％EtOAc洗脱)纯化粗制混合物，提供108g呈黄色油状物的标题化合物。
LC-MS(方法F)：Rt＝1.51min，[M+H]+＝278。
步骤2：反式-外消旋-4-异丁基吡咯烷-3-醇
在250ml圆底烧瓶中，将反式-外消旋-苄基3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酸酯(步骤1)(1g，3.6mmol)和10％碳载钯(100mg)在MeOH(40ml)中的混合物在H2下在RT下搅拌16h。将混合物过滤，并且将滤液浓缩，以提供510mg呈黄色油状物的标题化合物。
LC-MS(方法E)：Rt＝1.05min，[M+H]+＝144。
步骤3：反式-外消旋-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
将5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯胺(可商购获得的；或可以根据公开的专利申请WO 2013/008095，第37页，中间体5中制备)(853mg，3.4mmol)和DIPEA(2.2g，17mmol)在THF(40ml)中的混合物在0℃下搅拌15min。然后，添加三光气(480mg，1.63mmol)，并且将混合物在0℃下搅拌2h。然后，添加反式-外消旋-4-异丁基吡咯烷-3-醇(步骤2)(486mg，3.4mmol)。添加后，将混合物在RT下搅拌16h。向所得的混合物中添加MeOH(10ml)。浓缩后，通过硅胶色谱法(用在DCM中的0-5％MeOH洗脱)纯化粗制混合物，提供1.0g的标题化合物。
LC-MS(方法J)：Rt＝1.46min，[M+H]+＝421。
步骤4：反式-外消旋-N-(5-氟-3-(6-(4-甲酰基苯基)-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
在50ml圆底烧瓶中，将反式-外消旋-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(步骤3)(420mg，1mmol)、4-(4-氯-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯甲醛(410mg，1.05mmol)(中间体3b)、Na2CO3(280mg，2.6mmol)和PdCl2(dppf)(110mg，0.15mmol)悬浮于ACN(12ml)和水(3ml)中。将混合物在N2下在100℃下搅拌16h，然后在减压下浓缩。通过反相快速色谱法(在Agela C18柱上，用在水(10mM NH4HCO3)中的5％-90％ACN洗脱)纯化粗混合物，提供400mg的标题化合物。
LC-MS(方法E)：Rt＝2.07min，[M+H]+＝656。
步骤5：反式-外消旋-叔丁基9-(4-(4-(5-氟-3-(3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯
在50ml烧瓶中，将反式-外消旋-N-(5-氟-3-(6-(4-甲酰基苯基)-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(400mg，0.61mmol)、叔丁基3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯(CAS 173405-78-2)(186mg，0.73mmol)和K2CO3(166mg，1.2mmol)悬浮于DMSO(3ml)中。在RT下搅拌15min后，添加ZnCl2 1M在THF(0.78ml，0.78mmol)中的溶液，并且将混合物在RT下搅拌3h。然后，添加NaBH3CN(300mg，5mmol)和MeOH(3ml)，并且将混合物在RT下搅拌16h，然后过滤。通过反相快速色谱法(在Agela C18柱上，用在水(10mM NH4HCO3)中的5％-80％ACN洗脱)纯化滤液，提供200mg的标题化合物。
LC-MS(方法F)：Rt＝1.61min，[M+H]+＝894
步骤6：反式-外消旋-叔丁基9-(4-(4-(5-氟-3-(3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯
在25ml圆底烧瓶中，将叔丁基反式-外消旋-9-(4-(4-(5-氟-3-(3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯(步骤5)(200mg，0.22mmol)悬浮于DMSO(3ml)和水(1ml)中。将混合物在RT下搅拌15min，然后将混合物冷却至0℃。添加NaOH(35mg，0.88mmol)在水(1ml)中的溶液，并且将混合物在0℃下搅拌30min。将混合物温热至RT并在RT下搅拌16h。通过反相快速色谱法(在Agela C18柱上，用在水(10mM NH4HCO3)中的5％-90％ACN洗脱)纯化粗混合物，提供100mg呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(方法F)：Rt＝1.48min，[M+H]+＝754
步骤7：反式-外消旋-N-(3-(6-(4-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
在50ml圆底烧瓶中，将反式-外消旋-叔丁基9-(4-(4-(5-氟-3-(-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯(110mg，0.15mmol)悬浮于DCM(5ml)中。添加4M HCl在二噁烷(4ml，16mmol)中的溶液，并且将RM在RT下搅拌3h。将所得的混合物浓缩并干燥，以提供120mg呈灰色固体盐酸盐的标题化合物。
LC-MS(方法E)：Rt＝1.74min，[M+H]+＝654
步骤8：反式-外消旋-N-(3-(6-(4-((9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
在25ml圆底烧瓶中，将反式-外消旋-N-(3-(6-(4-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(120mg，0.146mmol)、3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酸(中间体1a)(47mg，0.18mmol)和DIPEA(78mg，0.6mmol)悬浮于DMF(3ml)中。然后，添加HATU(68mg，0.18mmol)，并且将混合物在RT下搅拌16h。通过反相HPLC(在XBridge C18柱(21.2x250mm，10μm)上，用ACN和水(含有0.01M NH4HCO3缓冲液)洗脱)纯化RM，提供65mg呈白色固体的标题化合物。
LC-MS(方法E)：Rt＝1.73min，[M/2+H]+＝450.7。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.73(s,1H),10.34(s,1H),8.83(s,1H),7.92(d,J＝8.2Hz,2H),7.68(s,1H),7.49(dd,J＝10.8,2.7Hz,1H),7.37(td,J＝11.0,4.9Hz,3H),7.32(d,J＝2.1Hz,1H),7.15(d,J＝8.7Hz,1H),7.06(dd,J＝8.8,2.8Hz,1H),6.76(d,J＝2.8Hz,1H),5.12(d,J＝4.5Hz,1H),3.88-3.84(m,4H),3.68-3.64(m,2H),3.60-3.30(m,7H),3.20-3.17(m,1H),3.09-3.06(m,1H),2.67(t,J＝6.4Hz,2H),2.36(s,4H),2.15-2.00(m,4H),1.67-1.60(m,1H),1.50-1.34(m,10H),1.16-1.07(m,1H),0.91(d,J＝6.6Hz,3H),0.89(d,J＝6.6Hz,3H)。
化合物6
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
步骤1：(3R,4S)-N-(5-氟-3-(6-(4-甲酰基苯基)-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
向用N2吹扫并在惰性气氛下维持的50ml圆底烧瓶中添加(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(中间体7)(420mg，1mmol)、4-(4-氯-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯甲醛(中间体3b)(410mg，1.05mmol)、Na2CO3(280mg，2.6mmol)和PdCl2(dppf)(110mg，0.15mmol)。然后，添加ACN(12ml)和水(3ml)，并将RM在100℃下在N2下搅拌2h。通过硅胶色谱法(用在DCM中的3％-6％MeOH洗脱)纯化粗制混合物，提供500mg呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(方法E)：Rt＝1.99min，[M+H]+＝656；
步骤2：叔丁基9-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯
向50ml圆底烧瓶中添加(3R,4S)-N-(5-氟-3-(6-(4-甲酰基苯基)-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(500mg，0.76mmol)、叔丁基3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯(CAS 173405-78-2]，一点击化学公司(1ClickChemistry,Inc.))(234mg，0.92mmol)、K2CO3(207mg，1.5mmol)和DMSO(3ml)。将RM在RT下搅拌15min，然后添加在THF中的ZnCl2(0.99ml，0.99mmol)(1M)。然后，将RM在RT下搅拌3h，并添加NaBH3CN(378mg，6.0mmol)在MeOH(3ml)中的溶液。添加后，将RM在RT下搅拌16h，然后过滤。通过反相快速色谱法(在Agela C18柱上，用ACN水(0.01M NH4HCO3缓冲液)梯度洗脱)纯化滤液，提供400mg呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(方法F)：Rt＝1.50min，[M+H]+＝894。
步骤3：叔丁基9-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯
向50ml圆底烧瓶中添加叔丁基9-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯(400mg，0.45mmol)(步骤2)和DMSO(2ml)。然后，添加NaOH(72mg，1.79mmol)在水(1ml)中的溶液，并将RM在RT下搅拌3h。然后将RM倒入水(10ml)中，用EtOAc(4x 10ml)萃取。然后将合并的有机层干燥以获得粗制混合物。通过硅胶色谱法(用在DCM中的3％-6％MeOH洗脱)纯化粗制混合物，提供160mg呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(方法F)：Rt＝1.34min，[M+H]+＝754
步骤4：(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
向50ml圆底烧瓶中添加叔丁基9-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯(160mg，0.21mmol)和DCM(6ml)。将RM在RT下搅拌，并且添加4M HCl在二噁烷(5ml，20mmol)中的溶液。将RM在RT下搅拌2h，然后浓缩，以提供92mg呈盐酸盐呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(方法F)：Rt＝1.02min，[M+H]+＝654。
步骤5：(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
向50ml圆底烧瓶中添加(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(92mg，0.14mmol)、3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酸(中间体1a)(45mg，0.17mmol)、DIPEA(91mg，0.71mmol)和DMF(3ml)。然后，在RT下添加HATU(65mg，0.17mmol)，并将RM在RT下搅拌16h。通过反相HPLC(在XBridge C18柱(21.2x 250mm，10μm)上，用ACN/水(含有0.01M NH4HCO3缓冲液)梯度洗脱)纯化RM，提供40mg呈白色固体的标题化合物。
LC-MS(方法F)：Rt＝1.19min，[M+H]+＝900。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.69(s,1H),10.33(s,1H),8.80(s,1H),7.92(d,J＝8.2Hz,2H),7.67(s,1H),7.49(dd,J＝10.7,2.6Hz,1H),7.37 -7.35(m,3H),7.31(d,J＝2.1Hz,1H),7.14(d,J＝8.7Hz,1H),7.05(dd,J＝8.9,2.8Hz,1H),6.73(s,1H),5.12(s,1H),3.89-3.84(m,4H),3.71-3.41(m,9H),3.20-3.17(m,1H),3.09-3.06(m,1H),2.67(t,J＝6.0Hz,2H),2.36(s,4H),2.09-2.04(m,4H),1.65-1.60(m,1H),1.50-1.32(m,10H),1.16-1.08(m,1H),0.91(d,J＝6.6Hz,3H),0.89(d,J＝6.6Hz,3H)。
化合物7
(3R,4R)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
步骤1：(3S,4S)-叔丁基3-异丁基-4-((4-硝基苯甲酰)氧基)吡咯烷-1-甲酸酯和(3R,4R)-叔丁基3-异丁基-4-((4-硝基苯甲酰)氧基)吡咯烷-1-甲酸酯
在N2下，在RT下，经30min，向(反式-外消旋)-叔丁基3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酸酯(中间体6)(9.65g，39.7mmol)、4-硝基苯甲酸(11g，65.2mmol)和PPh3(18g，65.2mmol)在THF(250ml)中的溶液中滴加DIAD(13ml，65.5mmol)。将所得的黄色溶液缓慢温热至RT持续另外的3小时。将RM用水淬灭，并将THF部分蒸发。添加EtOAc并分离各层。将水层用EtOAc(3x)萃取，将合并的有机层用0.2M HCl和盐水洗涤、经Na2SO4干燥、过滤并在减压下浓缩，以提供50.2g的粗产物。通过快速硅胶色谱法(用在己烷中的0-40％EtOAc洗脱)纯化1/4的粗产物，提供4.28g的产物1。通过快速硅胶色谱法(用在己烷中的0-13％EtOAc洗脱)纯化剩下3//4的粗产物，提供3.98g的产物2和6.57g的产物3。通过快速硅胶色谱法(用在己烷中的0-25％EtOAc洗脱)纯化产物2，提供2.56g的产物4。通过快速硅胶色谱法(用在己烷中的0-15％EtOAc洗脱)纯化产物3，提供5.97g的产物5。合并产物1、4和5提供12.44g的外消旋体。
使用SFC(制备型方法2)手性分离外消旋体，提供单独的对映异构体。分离后，通过手性HPLC(方法L)分析每种单一对映异构体，以确认手性纯度。
(3S,4S)-叔丁基3-异丁基-4-((4-硝基苯甲酰)氧基)吡咯烷-1-甲酸酯：6.01g
第1洗脱峰(峰1)
HPLC Rt(方法L)＝5.99min。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δppm 0.79-0.92(m,6H)1.29-1.35(m,1H)1.40(d,J＝19.44Hz,10H)1.46-1.60(m,1H)2.52-2.59(m,1H)3.04-3.16(m,1H)3.42-3.51(m,1H)3.58-3.70(m,2H)5.47(t,J＝3.85Hz,1H)8.22(dd,J＝8.80,3.30Hz,2H)8.31-8.42(m,2H)
(3R,4R)-叔丁基3-异丁基-4-((4-硝基苯甲酰)氧基)吡咯烷-1-甲酸酯：6.09g第2洗脱峰(峰2)
HPLC Rt(方法L)＝9.06min。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δppm 0.79-0.95(m,6H)1.28-1.36(m,1H)1.40(d,J＝19.44Hz,10H)1.48-1.57(m,1H)2.52-2.59(m,1H)3.06-3.15(m,1H)3.44-3.49(m,1H)3.60-3.70(m,2H)5.47(t,J＝3.94Hz,1H)8.22(dd,J＝8.80,3.30Hz,2H)8.30-8.46(m,2H)
步骤2：(3S,4S)-叔丁基3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酸酯和(3R,4R)-叔丁基3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酸酯
向(3S,4S)-叔丁基3-异丁基-4-((4-硝基苯甲酰)氧基)吡咯烷-1-甲酸酯(步骤1的第一洗脱峰)(5.8g，14.78mmol)在MeOH(20ml)中的溶液中添加NaOH(14.78ml，29.6mmol)。将RM在RT下搅拌30min，然后倒入EtOAc和水的混合物中。分离各层，将有机层用水(2x)和盐水(1x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，以提供3.331g的标题化合物(3S,4S)-叔丁基3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酸酯。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δppm 0.83-0.91(m,6H)1.17-1.23(m,1H)1.39(m,10H)1.49-1.58(m,1H)2.00-2.11(m,1H)2.79-2.92(m,1H)3.19-3.24(m,1H)3.26-3.32(m,1H)3.33(m,J＝5.00Hz,1H)3.98-4.02(m,1H)4.81(br s,1H)。
向(3R,4R)-叔丁基3-异丁基-4-((4-硝基苯甲酰)氧基)吡咯烷-1-甲酸酯(步骤1的第二洗脱峰)(5.8g，14.78mmol)、MeOH(20ml)的溶液中添加NaOH(14.78ml，29.6mmol)。将RM在RT下搅拌1h，然后倒入EtOAc和水的混合物中。分离各层，将有机层用水(2x)、10％水性柠檬酸(1x)和盐水(1x)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，以提供2.995g的标题化合物(3R,4R)-叔丁基3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酸酯。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δppm 0.85-0.90(m,6H)1.18-1.23(m,1H)1.39(m,10H)1.49-1.57(m,1H)2.00-2.10(m,1H)2.81-2.91(m,1H)3.19-3.24(m,1H)3.25-3.31(m,1H)3.31-3.34(m,1H)4.01(m,1H)4.81(t,J＝3.30Hz,1H)。
步骤3：(3R,4R)-4-异丁基吡咯烷-3-醇
向(3R,4R)-叔丁基3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酸酯(2.99g，12.29mmol)在DCM(7ml)中的溶液中添加在二噁烷中的HCl(20ml，80mmol)(4M)。将所得的溶液在RT下搅拌1h。然后将RM浓缩至橙色浆液，然后用Et2O稀释，搅拌并冷却15min。将形成的沉淀物过滤，用Et2O洗涤并在减压下干燥，以提供1.909g的标题化合物，该标题化合物呈HCl盐呈白色晶体。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δppm 0.88(dd,J＝6.60,2.57Hz,6H)1.14-1.28(m,1H)1.34-1.45(m,1H)1.51-1.66(m,1H)2.07(dqd,J＝11.55,7.61,7.61,7.61,3.76Hz,1H)2.74(t,J＝11.37Hz,1H)3.06(d,J＝12.10Hz,1H)3.16-3.28(m,2H)4.16(q,J＝3.48Hz,1H)5.35(d,J＝3.85Hz,1H)9.33(br s,2H)。
步骤4：(3R,4R)-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
在氩气下，在0℃以下，向5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯胺(商用；或根据公开的专利申请WO 2013/008095，第37页，中间体5中所述的程序制备)(1.2g，4.78mmol)和DIPEA(3.34ml，19.12mmol)在DCM(25ml)中的搅拌溶液中缓慢添加在甲苯(3.02ml，5.73mmol)中的光气20％。将所得的溶液在0℃下搅拌10min，然后在0℃下滴入(3R,4R)-4-异丁基吡咯烷-3-醇(步骤3)(0.945g，5.26mmol)在DCM(25ml)中的搅拌溶液中。将所得的混合物在0℃下搅拌1h。将RM浓缩，然后倒入EtOAc/MeOH(9:1)中，用水(3x)和盐水(1x)洗涤。然后将有机层经MgSO4干燥并在减压下浓缩，以提供2.1g的粗产物。通过快速硅胶色谱法(用在己烷中的0-100％EtOAC(+5％EtOH)洗脱)纯化粗产物，提供1.46g呈白色泡沫的标题。
LC-MS(方法A)：Rt＝1.21min，[M+H]+＝421.4。
步骤5：(3R,4R)-N-(5-氟-3-(6-(4-(2-羟基乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
向2-(4-(4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯基)乙醇(中间体17)(200mg，0.731mmol)、(3R,4R)-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(步骤4)(307mg，0.731mmol)、和K2CO3(252mg，1.827mmol)在水(3ml)中的混合物中添加PdCl2(dppf)(53.5mg，0.073mmol)，然后添加二噁烷(3ml)。将所得的RM在100℃下搅拌30min并冷却至RT。通过快速硅胶色谱法(用在DCM中的0-20％MeOH洗脱)纯化，提供294mg的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.90min，[M+H]+＝532.2。
步骤6：4-(4-(5-氟-3-((3R,4R)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯乙基甲磺酸酯
向(3R,4R)-N-(5-氟-3-(6-(4-(2-羟基乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(步骤5)(294mg，0.553mmol)和TEA(0.385ml，2.77mmol)在THF(3ml)中的混合物(在0℃下冷却)中添加Ms2O(193mg，1.106mmol)。将RM在0℃下搅拌30min，然后将溶液在0℃下用水淬灭。分离各层，然后将水层用DCM(2x)萃取。将合并的有机层经MgSO4干燥，过滤并在RT下蒸发，以提供343mg呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.97min，[M+H]+＝610.3。
步骤7：叔丁基9-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4R)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯乙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯
在RT下，向4-(4-(5-氟-3-((3R,4R)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯乙基甲磺酸酯(步骤6)(150mg，0.246mmol)、叔丁基3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯(188mg，0.738mmol)和K2CO3(204mg，1.476mmol)在DMF(1.5ml)中的溶液中添加ACN(6ml)。将所得的RM在60℃下搅拌过夜，然后冷却至RT。将黄色悬浮液过滤，然后将滤液用DCM/MeOH稀释并通过二氧化硅垫过滤。将滤液在减压下浓缩，以提供257mg的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.98min，[M+H]+＝768.5。
步骤8：(3R,4R)-N-(3-(6-(4-(2-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
将叔丁基9-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4R)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯乙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯(步骤7)(189mg，0.246mmol)和TFA(0.569ml，7.38mmol)在DCM(5ml)中的橙色溶液在RT下搅拌2h，然后在减压下浓缩。通过反相快速色谱法(在C18柱上，用在(水+0.1％TFA)中的10％-100％ACN洗脱)纯化粗产物，提供87.3mg呈TFA盐的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.68min，[M+H]+＝668.5。
步骤9：(3R,4R)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
向(3R,4R)-N-(3-(6-(4-(2-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(步骤8)(87.3mg，0.086mmol)和中间体1a(25.1mg，0.095mmol)在DMF(3ml)中的混合物中添加DIPEA(0.091ml，0.519mmol)和HBTU(49.2mg，0.130mmol)。将所得的RM在RT下在氩气下搅拌2h，然后倒入水中，并且将所得的沉淀物过滤并在减压下干燥，以得到粗产物。通过反相快速色谱法(在C18柱上，用在(水+0.1％TFA)中的10％-100％ACN洗脱)纯化粗产物，提供呈TFA盐的标题化合物。然后将呈TFA盐的标题化合物溶解于MeOH中，在SCX柱上过滤并用在MeOH中的氨7N从SCX柱中释放。然后将滤液在减压下浓缩，以提供47.3mg的标题化合物。
LC-MS(方法B)：Rt＝3.68min，[M+H]+＝914.8。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 12.69(s,1H),10.33(s,1H),8.82(s,1H),7.88(brd,J＝7.92Hz,2H),7.63(s,1H),7.49(dd,J＝10.78,2.57Hz,1H),7.37(dd,J＝8.51,1.91Hz,1H),7.27-7.34(m,3H),7.15(d,J＝8.66Hz,1H),7.05(dd,J＝8.80,2.64Hz,1H),6.74(s,1H),4.88(br d,J＝3.37Hz,1H),4.06-4.15(m,1H),3.84(s,3H),3.35-3.65(m,9H),3.08(br t,J＝8.88Hz,1H),2.71-2.82(m,2H),2.68(m,2H),2.52-2.61(m,2H),2.34-2.47(m,4H),2.12-2.21(m,1H),2.09(s,3H),1.56-1.63(m,1H),1.34-1.56(m,9H),1.21-1.30(m,1H),0.90(d,J＝6.02Hz,6H)。
化合物8
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((4-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)哌啶-1-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
使用化合物6、步骤1和中间体18和1b，通过类似于化合物6的方法制备标题化合物。
LC-MS(方法I)：Rt＝1.72min，[M+H]+＝930。
化合物9
(顺式-外消旋)-N-(3-(6-(4-((4-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)甲基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
步骤1：
(顺式-外消旋)-叔丁基4-(4-(4-(5-氟-3-(3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)哌嗪-1-甲酸酯
在RT下，向1-Boc-哌嗪(77mg，0.413mmol)(CAS 57260-71-6)、TEA(0.100ml，0.717mmol)和(顺式-外消旋)-N-(5-氟-3-(6-(4-甲酰基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(214mg，0.345mmol)(中间体10)在MeOH(3ml)中的混合物中添加在THF中的ZnCl2(0.500ml，0.350mmol)(0.7M)。将所得的浑浊的绿色溶液在RT下搅拌过夜，然后添加NaBH3CN(22mg，0.350mmol)，并且将RM进一步在RT下搅拌5h。然后，将RM在减压下浓缩。通过反相快速色谱法(在C18柱上，用在(水+0.1％TFA)中的2％-100％ACN洗脱)纯化粗产物，提供99mg呈TFA盐的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.91min，[M+H]+＝686.5
步骤2：(顺式-外消旋)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-(哌嗪-1-基甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
将(顺式-外消旋)叔丁基4-(4-(4-(5-氟-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)哌嗪-1-甲酸酯(步骤1)(99mg，0.072mmol)和在二噁烷中的HCl(0.5ml，2.00mmol)(4M)在MeOH(2ml)中的溶液在RT下搅拌3h。然后将RM在减压下浓缩。通过反相快速色谱法(在C18柱上，用在(水+0.1％TFA)中的2％-100％ACN洗脱)纯化粗产物，提供61.5mg呈TFA盐的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.73min，[M+H]+＝586.6。
步骤3：
(顺式-外消旋)-叔丁基4-((4-(4-(4-(5-氟-3-(3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)哌嗪-1-基)甲基)哌啶-1-甲酸酯
在RT下，向(顺式-外消旋)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-(哌嗪-1-基甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(步骤2)(59mg，0.069mmol)、TEA(0.050ml，0.359mmol)和1-Boc-哌啶-吡咯甲醛(17mg，0.080mmol)在MeOH(1ml)中的混合物中添加在THF中的ZnCl2(0.120ml，0.084mmol)(0.7M)。将RM在RT下在氩气下搅拌6h。然后，添加NaBH3CN(6mg，0.095mmol)，并且将RM在RT下搅拌过夜。将RM在减压下浓缩，以提供53.9mg的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.92min，[M+H]+＝783.7。
步骤4：(顺式-外消旋)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-((4-(哌啶-4-基甲基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
将(顺式-外消旋)-叔丁基4-((4-(4-(4-(5-氟-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)哌嗪-1-基)甲基)哌啶-1-甲酸酯(步骤3)(0.069mmol)和在二噁烷中的HCl(0.5ml，2.00mmol)(4M)在MeOH(1ml)中的黄色溶液在RT下搅拌2h。将RM在减压下浓缩，以提供呈HCl盐的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.66min，[M+H]+＝683.7。
步骤5：(顺式-外消旋)-N-(3-(6-(4-((4-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)甲基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
向中间体1a(27mg，0.104mmol)在DMF(0.5ml)中的溶液中添加NMM(0.025ml，0.227mmol)，然后添加HATU(39mg，0.104mmol)。将RM在RT下搅拌30min。然后将(顺式-外消旋)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-((4-(哌啶-4-基甲基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(步骤4)(52mg，0.069mmol)和NMM(0.025ml，0.227mmol)在DMF(0.5ml)中的溶液滴入RM中，并且将所得的黄色混合物在RT下搅拌2天。通过反相快速色谱法(在C18柱上，用在(水+0.1％NH4HCO3)中的2％-100％ACN洗脱)纯化粗产物，提供38mg呈白色粉末的标题化合物。
LC-MS(方法B)：Rt＝3.68min，[M/2+H]+＝465.4。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 12.72(s,1H)；10.32(s,1H),8.83(s,1H),7.92(d,J＝7.95Hz,2H),7.64(s,1H),7.46-7.52(m,1H),7.28-7.41(m,4H),7.14(d,J＝8.44Hz,1H),7.05(dd,J＝8.93,2.32Hz,1H),6.76(s,1H),4.95-4.85(m,1H),4.15-4.05(m,1H),3.84(s,3H),3.65-3.55(m,3H),3.38-3.54(m,4H)3.15-3.05(m,1H),2.70-2.60(m,2H),2.35-2.48(m,12H),2.20-2.11(m,3H),2.06-2.11(m,3H),1.64-1.81(m,2H),1.56-1.63(m,1H),1.48-1.40(m,1H),1.22-1.30(m,1H),1.00-1.15(m,3H),0.95-0.85(m,6H)化合物10
(3S,4R)-N-(3-(6-(4-((4-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)甲基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
步骤1：叔丁基4-(4-(4-(5-氟-3-((3S,4R)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)哌嗪-1-甲酸酯
向叔丁基4-(4-(4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)哌嗪-1-甲酸酯(中间体5)(500mg，1.110mmol)、K2CO3(384mg，2.78mmol)和(3S,4R)-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(中间体8)(500mg，1.13mmol)在二噁烷/水1:1(10ml)中的混合物(用氩气脱气)中添加PdCl2(dppf)-DCM加合物(91mg，0.111mmol)。将RM在100℃下搅拌2h，然后冷却至RT并在EtOAc和水之间分配。将两层分离，将有机层用盐水洗涤、经MgSO4干燥并在减压下浓缩。通过快速硅胶色谱法(用在DCM中的0-17％MeOH洗脱)纯化粗产物，提供692mg呈棕色残余物的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.86min，[M+H]+＝686.5。
步骤2：(3S,4R)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-(哌嗪-1-基甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
将叔丁基4-(4-(4-(5-氟-3-((3S,4R)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)哌嗪-1-甲酸酯(步骤1)(692mg，0.807mmol)和在二噁烷中的HCl(2ml，8.00mmol)(4M)在MeOH(2ml)中的褐色溶液在RT下搅拌2h，然后将RM在减压下浓缩。通过反相快速色谱法(在C18柱上，用在(水+0.1％TFA)中的从2％-100％ACN洗脱)纯化粗产物，提供570mg呈TFA盐的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.72min，[M+H]+＝586.5。
步骤3：叔丁基4-((4-(4-(4-(5-氟-3-((3S,4R)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)哌嗪-1-基)甲基)哌啶-1-甲酸酯
在RT下，向(3S,4R)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-(哌嗪-1-基甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(步骤2)(188mg，0.269mmol)、TEA(0.100ml，0.717mmol)和1-Boc-哌啶-吡咯甲醛(60mg，0.281mmol)在MeOH(2ml)中的溶液中添加在THF中的ZnCl2(0.550ml，0.275mmol)(0.5M)，并将RM在RT下在氩气下搅拌3天。然后，添加NaBH3CN(16mg，0.255mmol)。将RM在RT下搅拌过夜并在减压下浓缩。通过反相快速色谱法(在C18柱上，用在(水+0.1％TFA)中的从2％-100％ACN洗脱)纯化粗产物，提供223mg呈TFA盐的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.90min，[M+H]+＝783.5。
步骤4：(3S,4R)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-((4-(哌啶-4-基甲基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
将叔丁基4-((4-(4-(4-(5-氟-3-((3S,4R)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)哌嗪-1-基)甲基)哌啶-1-甲酸酯(步骤3)(0.246mmol)和在二噁烷中的HCl(1.5ml，6.00mmol)(4M)在MeOH(2ml)中的黄色溶液在RT下搅拌2h。将RM在减压下浓缩，以提供100mg呈HCl盐的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.63min，[M+H]+＝683.6。
步骤5：(3S,4R)-N-(3-(6-(4-((4-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)甲基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
向3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酸(中间体1a)(40mg，0.151mmol)在DMF(1ml)中的溶液中添加NMM(0.050ml，0.455mmol)，然后添加HATU(59mg，0.155mmol)。将所得的RM在RT下搅拌30min，然后将(3S,4R)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-((4-(哌啶-4-基甲基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(步骤4)(100mg，0.131mmol)和NMM(0.050ml，0.455mmol)在DMF(0.5ml)中的溶液滴入混合物中，并将黄色RM在RT下搅拌2h，然后在减压下浓缩。通过反相快速色谱法(在C18柱上，用在(水+0.1％NH4HCO3)中的2％-100％ACN洗脱)纯化粗产物，在ACN蒸发后，提供黄色悬浮液，然后将该黄色悬浮液过滤并在减压下干燥，产生70mg呈固体的标题化合物。
LC-MS(方法B)：Rt＝3.55min，[M/2+H]+＝465.6。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.95(s,1H),10.32(s,1H),9.12(s,1H),8.20(d,J＝7.8Hz,2H),7.95-7.78(m,2H),7.66(d,J＝10.8Hz,1H),7.55(s,1H),7.38-7.31(m,2H),7.25-7.12(m,3H),3.95-3.65(m,10H),3.58-2.89(m,13H),2.67(m,2H),2.18-2.01(m,6H),1,99-1,82(m,2H),1.60(m,1H),1.40-1.27(m,1H,)1.26-1.11(m,6H),0.88(m,6H)。
化合物11
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)甲基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
步骤1：叔丁基4-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯氧基)哌啶-1-甲酸酯
在500ml圆底烧瓶中，将叔丁基4-羟基哌啶-1-甲酸酯(5g，24.88mmol)(CAS109384-19-2)、4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯酚(CAS 269409-70-3)(6g，27.36mmol)和PPh3(9.78g，37.31mmol)在干燥的THF(200ml)中的混合物在0℃搅拌5min。然后，在0℃滴加DIAD(10g，49.75mmol)并搅拌3h。然后将RM浓缩。通过快速硅胶色谱法(用在石油醚中的20％EtOAc洗脱)纯化残余物，提供3g呈白色固体的标题化合物。
LC-MS(方法J)：Rt＝1.73min，[M+NH4]+＝404。
步骤2：叔丁基4-(4-(4-氯-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯氧基)哌啶-1-甲酸酯
向经吹扫并在惰性气氛下维持的100ml圆底烧瓶中添加4-氯-6-碘-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(中间体2)(400mg，0.954mmol)、叔丁基4-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯氧基)哌啶-1-甲酸酯(CAS 889865-34-3)(385mg，0.954mmol)、K2CO3(289mg，2.1mmol)和PdCl2(PPh3)2(70mg，0.0954mmol)。然后添加ACN(12ml)和H2O(3ml)，并且将混合物在100℃下搅拌2h。将混合物过滤，并且将滤液浓缩。将残余物用EtOAc(30ml)萃取，将有机层用水和盐水洗涤，经Na2SO4干燥并在减压下浓缩，以提供542mg的标题化合物。
LC-MS(方法I)：Rt＝2.28min，[M+H]+＝570。
步骤3：叔丁基4-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯氧基)哌啶-1-甲酸酯
向经吹扫并在惰性气氛下维持的100ml圆底烧瓶中添加叔丁基4-(4-(4-氯-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯氧基)哌啶-1-甲酸酯(542mg，0.954mmol)、(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(400mg，0.954mmol)、K2CO3(289mg，2.1mmol)和PdCl2(PPh3)2(70mg，0.0954mmol)。然后，添加ACN(12ml)和H2O(3ml)，并且将混合物在100℃下搅拌16h。将混合物过滤，并且将滤液浓缩。将残余物用EtOAc(3x 300ml)萃取并用水、盐水洗涤，经Na2SO4干燥并在减压下浓缩。通过硅胶色谱法(用在EtOAc中的10％MeOH洗脱)纯化残余物，提供300mg的标题化合物。
LC-MS(方法I)：Rt＝2.02min，[M+H]+＝687。
步骤4：(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-(哌啶-4-基氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
向100ml圆底烧瓶中添加叔丁基4-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯氧基)哌啶-1-甲酸酯(300mg，0.437mmol)和DCM(10ml)。在0℃下添加4M HCl在二噁烷(1ml，1mmol)中的溶液，并且将混合物在0℃下搅拌1h。将溶剂除去，并且将残余物在真空下干燥，以提供300mg呈白色固体呈HCl盐的标题化合物。
LC-MS(方法J)：Rt＝1.3min；MS m/z[M+H]+587。
步骤5：叔丁基4-甲酰基哌啶-1-甲酸酯
在-78℃下，向草酰氯(5.86g，46.51mmol)在干燥的DCM(40ml)中的混合物中添加DMSO(7.25g，93.02mmol)在干燥的DCM(20ml)中的混合物。在-78℃下搅拌30min后，添加N-Boc-4-哌啶甲醇(CAS123855-51-6)(4g，18.6mmol)在干燥的DCM(40ml)中的混合物，并且将混合物在-78℃下搅拌30min。然后，在-78℃下添加TEA(18.77g，186.05mmol)，并将RM经30min温热至RT。然后，将RM用DCM(2x 100ml)萃取，将合并的有机层用盐水(100ml)洗涤、经Na2SO4干燥、过滤并在减压下浓缩。通过硅胶色谱法(用在石油醚中的25％EtOAc洗脱)纯化粗制产物，提供3.04g标题化合物。
LC-MS(方法J)：Rt＝1.21min，[M+tBu+H]+＝158。
步骤6：叔丁基4-((4-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯氧基)哌啶-1-基)甲基)哌啶-1-甲酸酯
在100ml的圆底烧瓶中，添加(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-(哌啶-4-基氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺盐酸盐(280mg，0.449mmol)在DMF(4ml)和TEA(49mg，0.493mmol)中的溶液。在RT下搅拌10min后，添加叔丁基4-甲酰基哌啶-1-甲酸酯(CAS 137076-22-3)(287mg，1.34mmol)和1M ZnCl2在THF(0.67ml，0.67mmol)中的溶液。将混合物在RT下搅拌2h，然后添加NaBH3CN(170mg，2.68mmol)，并且将混合物在RT下搅拌过夜。将RM过滤，并将固体用DMF(1ml)洗涤。通过反相快速色谱法(拜泰齐公司(Biotage))(在Agela C18柱上，用在水(10mM NH4HCO3缓冲液)中的0-60％ACN洗脱)纯化滤液，提供210mg呈固体的标题化合物。
LC-MS(方法G)：Rt＝1.39min，[M+H]+＝784。
步骤7：(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-((1-(哌啶-4-基甲基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺盐酸盐
向100ml圆底烧瓶中添加叔丁基4-((4-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯氧基)哌啶-1-基)甲基)哌啶-1-甲酸酯(137mg，0.175mmol))和DCM(10ml)。添加4M HCl在二噁烷(1ml，4mmol)中的溶液，并且将混合物在RT搅拌1h。将混合物在减压下浓缩，以提供100mg呈黄色固体呈HCl盐的标题化合物。
LC-MS(方法I)：Rt＝1.67min，[M+H]+＝684。
步骤8：(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(1-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)甲基)哌啶-4-基氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
在100ml圆底烧瓶中添加(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺盐酸盐(100mg，0.137mmol)、TEA(0.54ml，0.27mmol)和DMF(5ml)。然后，在0℃下添加中间体1b(60mg，0.27mmol)，并且将混合物在RT下搅拌1h。通过反相HPLC(在XBridge C18柱(21.2x 250mm，10μm)上，用ACN和水(0.01M NH4HCO3缓冲液)的梯度洗脱)纯化混合物，提供27mg呈白色固体的标题化合物。
LC-MS(方法I)：Rt＝1.75min，[M+H]+＝931。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.63(m,1H),10.34(s,1H),8.8(s,1H),7.89(d,J＝8.0Hz,2H),7.67(s,1H),7.49(dd,J1＝3.0Hz,J2＝8.0Hz,1H),7.37-7.31(m,2H),7.16(d,J＝9.0Hz,1H),7.06-7.02(m,3H),6.65(s,1H),5.13(m,1H),4.46(m,2H),3.88-3.84(m,4H),3.67-3.58(m,5H),3.2(m,1H),3.07(m,2H),2.69(m,5H),2.17(m,4H),2.08(m,4H),1.94(m,2H),1.79-1.59(m,6H),1.35(m,1H),1.15-1.05(m,3H),0.9(m,6H)。
化合物12
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((4-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)甲基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
步骤1：叔丁基4-((4-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)哌嗪-1-基)甲基)哌啶-1-甲酸酯
在RT下，向(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-(哌嗪-1-基甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(中间体11)(128mg，0.195mmol)、TEA(0.100ml，0.717mmol)和1-Boc-哌啶-吡咯甲醛(50mg，0.234mmol)在MeOH(2ml)中的溶液中添加在THF中的ZnCl2(0.300ml，0.210mmol)(0.7M)，并且将所得的RM在RT下在氩气下搅拌7h。然后，添加NaBH3CN(14mg，0.223mmol)，并且将RM在RT下搅拌4天，并在减压下浓缩，以提供153mg的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.91min，[M+H]+＝783.7。
步骤2：(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-((4-(哌啶-4-基甲基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
将叔丁基4-((4-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)哌嗪-1-基)甲基)哌啶-1-甲酸酯(步骤1)(0.195mmol)和在二噁烷中的HCl(1ml，4.00mmol)(4M)在MeOH(2ml)中的黄色溶液在RT下搅拌2h，然后将RM在减压下浓缩。通过反相快速色谱法(在C18柱上，用在(水+0.1％TFA)中的2％-100％ACN洗脱)纯化粗产物，提供160mg呈TFA盐的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.65min，[M+H]+＝683.7。
步骤3：(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((4-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)甲基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
向3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酸(中间体1a)(46mg，0.174mmol)在DMF(1ml)中的溶液中添加NMM(0.050ml，0.455mmol)，然后添加HATU(67mg，0.176mmol)。将所得的RM在RT下搅拌30min，然后将(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-((4-(哌啶-4-基甲基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(步骤2)(160mg，0.158mmol)和NMM(0.050ml，0.455mmol)在DMF(0.5ml)中的溶液滴入混合物中，并将黄色RM在RT下搅拌3h，然后在减压下浓缩。通过反相快速色谱法(在C18柱上，用在(水+0.1％NH4HCO3)中的2％-100％ACN洗脱)纯化粗产物，提供127mg呈白色粉末的标题化合物。
LC-MS(方法B)：Rt＝3.63min，[M/2+H]+＝465.5。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.72(s,1H),10.32(s,1H),8.83(s,1H),7.92(d,J＝7.8Hz,2H),7.67(s,1H),7.49(dd,J＝10.8,2.7Hz,1H),7.45-7.27(m,4H),7.14(d,J＝8.5Hz,1H),7.05(dd,J＝9.1,2.7Hz,1H),6.76(s,1H),5.12(d,J＝4.6Hz,1H),4.35(s,1H),3.85(s,4H),3.62(dt,J＝26.9,7.8Hz,5H),3.48(s,2H),3.19(dt,J＝8.6,4.7Hz,1H),3.14-3.04(m,1H),2.73-2.60(m,2H),2.37(s,7H),2.09(d,J＝11.7Hz,7H),1.85-1.53(m,4H),1.35(dt,J＝13.9,6.7Hz,1H),1.21-0.96(m,3H),0.89(t,J＝7.6Hz,6H)。
化合物13
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(4-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)哌啶-1-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
步骤1：叔丁基4-((1-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯乙基)哌啶-4-基)氧基)哌啶-1-甲酸酯
向100ml圆底烧瓶中添加4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯乙基甲磺酸酯(1g，3.0mmol)、叔丁基4-(哌啶-4-基氧基)哌啶-1-甲酸酯(中间体18)(1.7g，6.0mmol)、K2CO3(828mg，6.0mmol)、KI(50mg，0.3mmol)和ACN(20ml)。将RM在50℃下搅拌16h然后过滤。将滤饼用DCM(2x 30ml)洗涤，并与滤液合并，并浓缩。将粗制混合物通过硅胶色谱法(用在DCM中的0-10％MeOH洗脱)纯化，产生1.3g呈白色固体的标题化合物。
LC-MS(方法I)：Rt＝2.54min，[M+H]+＝515。
步骤2：叔丁基4-((1-(4-(4-氯-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯乙基)哌啶-4-基)氧基)哌啶-1-甲酸酯
向经吹扫并在惰性气氛下维持的100ml圆底烧瓶中添加4-氯-6-碘-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(中间体2)(163mg，0.39mmol)、叔丁基4-((1-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯乙基)哌啶-4-基)氧基)哌啶-1-甲酸酯(步骤1)(200mg，0.39mmol)、Na2CO3(83mg，0.78mmol)和PdCl2(dppf)-CH2Cl2(43mg，0.06mmol)。然后，添加ACN(8ml)和水(2ml)，并将RM在100℃下在N2下搅拌16h。将RM用水(10ml)稀释并用DCM(4x 20ml)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥并在减压下浓缩。将粗制混合物通过硅胶色谱法(用在DCM中的0-8％MeOH洗脱)纯化，产生130mg呈黄色固体的标题化合物叔丁基4-((1-(4-(4-氯-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯乙基)哌啶-4-基)氧基)哌啶-1-甲酸酯(P1)和50mg呈黄色固体的叔丁基4-((1-(4-(4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯乙基)哌啶-4-基)氧基)哌啶-1-甲酸酯(P2)。
P1：LC-MS(方法I)：Rt＝2.42min，[M+H]+＝680。
P2：LC-MS(方法I)：Rt＝2.16min，[M+H]+＝540。
步骤3：叔丁基4-((1-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯乙基)哌啶-4-基)氧基)哌啶-1-甲酸酯
向经吹扫并在惰性气氛下维持的100ml圆底烧瓶中添加步骤2的P1(130mg，0.19mmol)、步骤2的P2(50mg，0.09mmol)、中间体7(114mg，0.28mmol)、Na2CO3(74mg，0.7mmol)和PdCl2(dppf)-CH2Cl2(30mg，0.04mmol)。添加ACN(8ml)和水(2ml)，并将RM在100℃下在N2下搅拌16h。将RM用水(10ml)稀释并用DCM(4x 20ml)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，在减压下浓缩。将粗制混合物通过硅胶色谱法(用在DCM中的0-10％MeOH洗脱)纯化，产生85mg呈深黄色固体的标题化合物。
LC-MS(方法I)：Rt＝2.03min，[M+H]+＝798。
步骤4：(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-(2-(4-(哌啶-4-基氧基)哌啶-1-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
向50ml圆底烧瓶中添加叔丁基4-((1-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯乙基)哌啶-4-基)氧基)哌啶-1-甲酸酯(步骤3)(85mg，0.1mmol)和DCM(3ml)，并将RM在RT下搅拌。缓慢添加4MHCl在二噁烷(3ml，12mmol)中的溶液。添加后，将RM在RT下搅拌1h，然后在减压下浓缩，以提供120mg呈黄色固体呈HCl盐的标题化合物。
LC-MS(方法F)：Rt＝1.40min，[M+H]+＝698。
步骤5：(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(4-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)哌啶-1-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
向25ml圆底烧瓶中添加(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-(2-(4-(哌啶-4-基氧基)哌啶-1-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(步骤4)(120mg，0.1mmol)、五氟苯基3-(2，4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酸酯(43mg，0.1mmol)(中间体1b)、DIPEA(64mg，0.5mmol)和DMF(2ml)。将RM在RT下搅拌2h。将RM通过制备型HPLC(XBridge C18，21.2x 250mm，10μm；用在水/ACN中的0.01MNH4HCO3缓冲液洗脱)纯化，产生40mg呈白色固体的标题化合物。
LC-MS(方法I)：Rt＝1.71min，[M+H]+＝944。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.82(s,1H),7.87(d,J＝8.1Hz,2H),7.67(s,1H),7.49(dd,J＝10.7,2.7Hz,1H),7.38(dd,J＝8.4,2.1Hz,1H),7.35-7.30(m,3H),7.15(d,J＝8.6Hz,1H),7.06(dd,J＝8.9,2.7Hz,1H),6.74(s,1H),5.12(s,1H),3.95-3.79(m,5H),3.72-3.55(m,6H),3.43(s,1H),3.27-3.13(m,4H),3.11-3.04(m,1H),2.83-2.71(m,4H),2.68(t,J＝6.6Hz,2H),2.20-1.95(m,6H),1.87-1.75(m,4H),1.66-1.58(m,1H),1.45-1.31(m,5H),1.17-1.08(m,1H),0.91-0.88(m,6H)。
化合物14
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)甲基)哌啶-4-基)甲氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
步骤1：叔丁基4-((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯氧基)甲基)哌啶-1-甲酸酯
在0℃下，在氩气下，向4-羟基苯基硼酸频哪醇酯(4.5g，20.44mmol)、叔丁基4-(羟基甲基)哌啶-1-甲酸酯(4g，18.58mmol)和PPh3(7.3g，27.9mmol)在THF(70ml)中的溶液中滴加DIAD(5.4ml，27.8mmol)。将所得的溶液在RT下搅拌3天。然后在EtOAc和饱和NaHCO3之间分配。分离各层，将有机层用盐水洗涤、经MgSO4干燥并在减压下浓缩。通过快速硅胶色谱法(用在CHX中的从0-15％EtOAc洗脱)纯化粗产物，提供1.636g的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝1.51min，[M+H]+＝418.2。
步骤2：4-((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯氧基)甲基)哌啶
将叔丁基4-((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯氧基)甲基)哌啶-1-甲酸酯(步骤1)(1.626g，3.70mmol)和在二噁烷中的HCl(10ml，40.00mmol)(4M)在DCM/MeOH 1:1(10ml)中的溶液在RT下搅拌5h，然后在减压下浓缩，以提供1.347g呈HCl盐呈白色固体的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.83min，[M+H]+＝318.1。
步骤3：叔丁基4-((4-((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯氧基)甲基)哌啶-1-基)甲基)哌啶-1-甲酸酯
在RT下，向4-((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯氧基)甲基)哌啶(步骤2)(348mg，0.886mmol)、TEA(0.300ml，2.152mmol)和1-Boc-哌啶-4-吡咯甲醛(200mg，0.919mmol)在MeOH(8ml)中的溶液中添加在THF中的ZnCl2(2ml，1.000mmol)(0.5M)，并且将RM在RT下在氩气下搅拌1h。然后添加NaBH3CN(60mg，0.955mmol)。将RM在RT下搅拌1.5h并在减压下浓缩。通过快速硅胶色谱法(用在DCM中的从0-15％DCM/MeOH/NH3(95:4:1)洗脱)纯化粗产物，提供372mg呈无色残余物的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝1.05min，[M+H]+＝515.3。
步骤4：叔丁基4-((4-((4-(4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯氧基)甲基)哌啶-1-基)甲基)哌啶-1-甲酸酯
向4-氯-6-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(177mg，0.633mmol)、Cs2CO3(516mg，1.583mmol)和叔丁基4-((4-((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯氧基)甲基)哌啶-1-基)甲基)哌啶-1-甲酸酯(步骤3)(362mg，0.633mmol)在二噁烷/水1:1(6ml)中的混合物(用氩气脱气)中添加PdCl2(dppf)-CH2Cl2(51mg，0.062mmol)。将所得的RM在100℃下搅拌5h，然后冷却至RT并在EtOAc和水之间分配。将两层分离。然后将有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥并在减压下浓缩。通过快速硅胶色谱法(用在DCM中的0-60％DCM/MeOH/NH3(95:4:1)洗脱)纯化粗产物，提供268mg呈米色固体的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.93min，[M+H]+＝540.3/542.2。
步骤5：叔丁基4-((4-((4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯氧基)甲基)哌啶-1-基)甲基)哌啶-1-甲酸酯
向叔丁基4-((4-((4-(4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯氧基)甲基)哌啶-1-基)甲基)哌啶-1-甲酸酯(步骤4)(134mg，0.223mmol)、K2CO3(77mg，0.558mmol)和(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(中间体7)(113mg，0.268mmol)在二噁烷/水1:1(3ml)中的混合物(用氩气脱气)中添加PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(18mg，0.022mmol)，并且将所得的RM在100℃下搅拌2h。然后，将RM冷却至RT、经(过滤材料)过滤，并且将所得的滤液在减压下浓缩。通过反相快速色谱法(在C18柱上，用在(水+0.1％TFA)中的从2％-100％ACN洗脱)纯化粗产物，提供201mg呈TFA盐呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.96min，[M+H]+＝798.5。
步骤6：(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-((1-(哌啶-4-基甲基)哌啶-4-基)甲氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
将叔丁基4-((4-((4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯氧基)甲基)哌啶-1-基)甲基)哌啶-1-甲酸酯(步骤5)(201mg，0.198mmol)和在二噁烷中的HCl(1ml，8.00mmol)(4M)在MeOH(1ml)中的溶液在RT下搅拌2h，然后在减压下浓缩。通过反相快速色谱法(在C18柱上，用在(水+0.1％TFA)中的从2％-100％ACN洗脱)纯化粗产物，提供133mg呈TFA盐呈黄色粉末的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.70min，[M+H]+＝698.7。
步骤7：(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)甲基)哌啶-4-基)甲氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
向3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酸(中间体1a)(43mg，0.163mmol)在DMF(1ml)中的溶液中添加NMM(0.050ml，0.455mmol)，然后添加HATU(62mg，0.163mmol)。将所得的RM在RT下搅拌30min，然后将(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-((1-(哌啶-4-基甲基)哌啶-4-基)甲氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(步骤6)(133mg，0.136mmol)和NMM(0.050ml，0.455mmol)在DMF(0.5ml)中的溶液滴入混合物中，并将黄色RM在RT下搅拌1.5h，然后在减压下浓缩。通过反相快速色谱法(在C18柱上，用在(水+0.1％NH4HCO3)中的从2％-100％ACN洗脱)纯化粗产物，提供97mg的材料。将材料在MeOH/DCM 4:1(1ml)中稀释。将形成的沉淀物过滤并在减压下干燥，以提供75mg呈白色固体的标题化合物。
LC-MS(方法B)：Rt＝3.82min；[M+H]+＝944.7。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.60(s,1H),10.31(s,1H),8.77(s,1H),7.86(d,J＝8.8Hz,2H),7.73(s,1H),7.43(dd,J＝10.7,2.8Hz,1H),7.35(dd,J＝8.5,2.2Hz,1H),7.29(d,J＝2.1Hz,1H),7.14(d,J＝8.6Hz,1H),7.07-6.94(m,3H),6.63(s,1H),5.23(m,1H),3.84(m,6H),3.24-2.79(m,13H),2.75-2.60(m,4H),2.22-1.54(m,12H),1.50-0.94(m,6H),0.88(m,6H)。
化合物15
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
步骤1：叔丁基9-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯乙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯
向50ml圆底烧瓶中添加(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(中间体7)(168mg，0.40mmol)、叔丁基9-(4-(4-氯-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯乙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯(中间体13)(250mg，0.38mmol)、Na2CO3(101mg，0.95mmol)和PdCl2(dppf)(41mg，0.06mmol)。然后，添加ACN(8ml)和水(2ml)，并将RM在100℃下在N2下搅拌2h。将RM在减压下浓缩。通过硅胶色谱法(用在DCM中的6％MeOH洗脱)纯化粗制残余物，提供250mg呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(方法F)：Rt＝1.51min，[M+H]+＝908。
步骤2：叔丁基9-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯乙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯
向25ml圆底烧瓶中添加叔丁基9-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯乙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯(250mg，0.27mmol)、DMSO(2ml)和水(1ml)。将RM在0℃下搅拌15min，然后添加NaOH(86mg，2.16mmol)在水(2ml)中的溶液。将RM温热至RT，然后在RT下搅拌16h。在用水(20ml)稀释后，用EtOAc(3x 20ml)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过硅胶色谱法(用在DCM中的MeOH洗脱)纯化粗制残余物，提供130mg呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(方法F)：Rt＝1.35min，[M+H]+＝768。
步骤3：(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
向50ml烧瓶中添加叔丁基9-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯乙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯(130mg，0.17mmol)和DCM(10ml)，然后将RM冷却至0℃。缓慢添加4M HCl在二噁烷(2ml，8mmol)中的溶液，然后将RM温热至RT，在RT下搅拌3h并浓缩，以提供130mg呈灰色固体呈HCl盐的标题化合物。
LC-MS(方法F)：Rt＝1.06min，[M+H]+＝668。
步骤4：(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
向25ml烧瓶中添加(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺盐酸盐(120mg，0.17mmol)、中间体1a(50mg，0.19mmol)、DIPEA(88mg，0.68mmol)和DMF(3ml)。然后，添加HATU(76mg，0.20mmol)，并且将RM在RT下搅拌16h。通过反相HPLC(在XBridge C18柱(21.2x 250mm，10μm)上，用在水中的ACN(0.01M NH4HCO3缓冲液)洗脱)纯化粗制混合物，提供72mg呈白色固体的标题化合物。
LC-MS(方法J)：Rt＝1.41min，[M/2+H]+＝457.6。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.90(dd,J＝8.44,6.68Hz,6H)1.08-1.16(m,1H)1.31-1.36(m,1H)1.37-1.45(m,4H)1.49(br s,4H)1.62(dt,J＝13.86,6.71Hz,1H)2.01-2.07(m,1H)2.09(s,3H)2.41(br s,4H)2.55(br s,2H)2.66-2.70(m,2H)2.72-2.79(m,2H)3.08(brdd,J＝9.39,6.46Hz,1H)3.19(br dd,J＝10.34,4.92Hz,1H)3.35-3.6(m,4H)3.59(br t,J＝6.68Hz,2H)3.62-3.69(m,2H)3.84(s,3H)3.85-3.92(m,1H)5.11(d,J＝4.55Hz,1H)6.74(s,1H)7.05(dd,J＝8.88,2.57Hz,1H)7.15(d,J＝8.66Hz,1H)7.28-7.33(m,3H)7.37(dd,J＝8.51,1.91Hz,1H)7.49(dd,J＝10.71,2.64Hz,1H)7.66(s,1H)7.87(d,J＝8.22Hz,2H)8.82(s,1H)10.32(s,1H)12.69(s,1H)。
化合物16
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-乙氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
此化合物通过与前述类似物的类似方法制备。(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(化合物15，步骤3)和中间体1c在标准酰胺形成条件下偶联，以产生呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(方法K)：Rt＝2.03min，[M+H]+＝928。
化合物17
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-6-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
该化合物通过与前述类似物的类似方法制备。(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(2-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-6-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺与中间体1b偶联，以产生呈白色固体的标题化合物。
LC-MS(方法K)：Rt＝1.93min，[M+H]+＝915.2。
化合物18
(顺式-外消旋)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
步骤1：叔丁基9-(4-(4-(5-氟-3-((顺式-外消旋)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯乙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯
向经吹扫并在惰性气氛下维持的50ml圆底烧瓶中添加叔丁基-9-(4-(4-氯-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯乙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯(中间体13)(200mg，0.31mmol)、(顺式-外消旋)-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(中间体9)(155mg，0.37mmol)、Na2CO3(85mg，0.8mmol)和PdCl2(dppf)(34mg，0.05mmol)。添加ACN(12ml)和水(3ml)，将RM在100℃下搅拌2h，然后在减压下浓缩。通过硅胶色谱法(用在DCM中的3％-6％MeOH洗脱)纯化粗制混合物，提供380mg呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(方法F)：Rt＝1.54min，[M+H]+＝909。
步骤2：叔丁基9-(4-(4-(5-氟-3-((顺式-外消旋)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯乙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯
向50ml圆底烧瓶中添加叔丁基9-(4-(4-(5-氟-3-((顺式-外消旋)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯乙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯(380mg，0.31mmol)和DMSO(2ml)。在RT下缓慢添加NaOH(50mg，1.24mmol)在水(1ml)中的溶液，将RM在RT下搅拌16h。将RM倒入水(10ml)中并用EtOAc(4x 10ml)萃取。然后将合并的有机层干燥，以提供粗制混合物。通过硅胶色谱法(用在DCM中的3％-6％MeOH洗脱)纯化粗制混合物，提供130mg呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(方法F)：Rt＝1.37min，[M+H]+＝769。
步骤3：(顺式-外消旋)-N-(3-(6-(4-(2-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
向50ml圆底烧瓶中添加叔丁基9-(4-(4-(5-氟-3-((顺式-外消旋)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯乙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯(100mg，0.13mmol)(步骤2)和DCM(6ml)。将RM在RT下搅拌，并添加4M HCl在二噁烷(3.5ml，14mmol)中的溶液。添加后，将混合物在RT下搅拌3h。将RM浓缩，以提供120mg呈黄色固体呈HCl盐的标题化合物。
LC-MS(方法F)：Rt＝1.09min，[M+H]+＝668。
步骤4：(顺式-外消旋)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
向50ml圆底烧瓶中添加(顺式-外消旋)-N-(3-(6-(4-(2-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺盐酸盐(120mg，0.17mmol)(步骤3)、3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酸(中间体1a)(53mg，0.20mmol)、DIPEA(110mg，0.85mmol)和DMF(3ml)。将RM在RT下搅拌，然后添加HATU(76mg，0.20mmol)并在RT下再搅拌2h。通过反相HPLC(用ACN/水(含有0.01M NH4HCO3缓冲液)梯度洗脱)纯化RM，提供70mg呈白色固体的标题化合物。
LC-MS(方法E)：Rt＝1.75min，[M+H]+＝914。
1H NMR(500MHz,DMSO)δ12.71(s,1H),10.35(s,1H),8.82(s,1H),7.88(d,J＝8.2Hz,2H),7.65(s,1H),7.49(dd,J＝10.9,2.7Hz,1H),7.38(dd,J＝8.4,2.1Hz,1H),7.33-7.31(m,3H),7.16(d,J＝8.6Hz,1H),7.06(dd,J＝8.8,2.7Hz,1H),6.75(s,1H),4.91(s,1H),4.11(s,1H),3.85(s,3H)3.68-3.40(m,9H),3.08(s,1H),2.76(t,J＝6.4Hz,2H),2.66(m,2H),2.54(m,2H)2.42-2.37(m,4H),2.17(s,1H),2.10(s,3H),1.64-1.56(m,1H),1.49-1.42(m,9H),1.29-1.25(m,1H),0.92-0.90(m,6H)。
化合物19
(3S,4R)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
步骤1：叔丁基9-(4-(4-(5-氟-3-((3S,4R)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯乙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯
向经吹扫并在惰性气氛下维持的50ml圆底烧瓶中添加(3S,4R)-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(中间体8)(154mg，0.37mmol)、叔丁基9-(4-(4-氯-7-(苯基磺酰基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯乙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯(中间体13)(250mg，0.38mmol)、Na2CO3(101mg，0.95mmol)和PdCl2(dppf)(41mg，0.06mmol)。添加ACN(8ml)和水(2ml)，并将RM在100℃下在N2下搅拌2h，然后在减压下浓缩。通过硅胶色谱法(用在DCM中的3％-6％MeOH洗脱)纯化粗制混合物，提供200mg呈黄色固体的标题化合物。
LC-MS(方法F)：Rt＝1.34min，[M+H]+＝768。
步骤2：(3S,4R)-N-(3-(6-(4-(2-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
向50ml圆底烧瓶中添加叔丁基9-(4-(4-(5-氟-3-((3S,4R)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯乙基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯(120mg，0.16mmol)和DCM(6ml)。将RM在RT下搅拌，然后添加4M HCl在二噁烷(4ml，16mmol)中的溶液。添加后，将RM在RT下搅拌3h并浓缩，以提供115mg呈黄色固体呈HCl盐的标题化合物。
LC-MS(方法F)：Rt＝1.08min，[M+H]+＝668。
步骤3：(3S,4R)-N-(3-(6-(4-(2-(9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
向50ml烧瓶中添加(3S,4R)-N-(3-(6-(4-(2-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(步骤2)(106mg，0.16mmol)、3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酸(中间体1a)(50mg，0.19mmol)、DIPEA(103mg，0.8mmol)和DMF(3ml)。在RT下添加HATU(72mg，0.19mmol)，并将RM在RT下搅拌16h。通过反相HPLC(在XBridge C18柱上，用ACN/水(含有0.01M NH4HCO3缓冲液)梯度洗脱)纯化RM，提供41mg呈白色固体的标题化合物。
LC-MS(方法F)：Rt＝1.20min，[M+H]+＝914。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.67(s,1H),10.34(s,1H),8.79(s,1H),7.87(d,J＝8.2Hz,2H),7.66(s,1H),7.48(dd,J＝10.7,2.6Hz,1H),7.38-7.29(m,4H),7.15(d,J＝8.6Hz,1H),7.05(dd,J＝8.8,2.8Hz,1H),6.71(s,1H),5.13(s,1H),3.87-3.84(m,4H),3.73-3.38(m,8H),3.20-3.17(m,1H),3.09-3.06(m,1H),2.80-2.72(m,2H),2.68(t,J＝6.5Hz,2H),2.41-2.36(m,6H),2.09-2.04(m,4H),1.66-1.58(m,1H),1.56-1.27(m,9H),1.16-1.10(m,1H),0.91(d,J＝6.6Hz,3H),0.89(d,J＝6.6Hz,3H)。
化合物20
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-(2-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
步骤1：
2-((1-(叔丁氧羰基)哌啶-4-基)氧基)-1-羟基乙磺酸
将叔丁基4-(2-氧代乙氧基)哌啶-1-甲酸酯(中间体4)(1000mg，3.70mmol)在EtOH(6ml)中的溶液用氩气吹扫，然后添加焦亚硫酸钠(500mg，2.63mmol)在水(1ml)中的溶液，并且然后将RM在80℃下搅拌1h。将异质RM冷却至RT，搅拌2天，然后过滤。将固体饼用EtOH洗涤并在减压下干燥，以提供833mg呈白色固体的标题化合物。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ5.32(d,J＝5.7Hz,1H),3.96(t,J＝7.2Hz,1H),3.80(d,J＝10.3Hz,1H),3.61(d,J＝13.4Hz,2H),3.46(s,1H),3.35(s,2H),2.99(s,2H),1.73(s,2H),1.39(s,9H),1.30(q,J＝9.1,5.9Hz,2H)。
步骤2：
叔丁基4-(2-(4-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯氧基)哌啶-1-基)乙氧基)哌啶-1-甲酸酯
在RT下，将(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-(哌啶-4-基氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(中间体12)(130mg，0.161mmol)溶解于MeOH(1.5ml)中。然后添加NaOAc(33mg，0.402mmol)，并将橙色溶液在RT下搅拌5min。然后添加2-((1-(叔丁氧羰基)哌啶-4-基)氧基)-1-羟基乙磺酸(90mg，0.277mmol)和2-甲基吡啶硼烷络合物(CAS 3999-38-0)(8mg，0.064mmol)，并将RM在RT下搅拌过夜。然后添加另外批次的2-((1-(叔丁氧羰基)哌啶-4-基)氧基)-1-羟基乙磺酸(15mg，0.046mmol)和2-甲基吡啶硼烷络合物(4mg，0.032mmol)，并将RM搅拌2天，然后浓缩至干。通过反相快速色谱法(在C18柱上，用在水+0.1％TFA中的2％-90％ACN洗脱)纯化粗产物，提供128mg标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.96min，[M+H]+＝814.7
步骤3：(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-((1-(2-(哌啶-4-基氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
将叔丁基4-(2-(4-(4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苯氧基)哌啶-1-基)乙氧基)哌啶-1-甲酸酯(步骤2)(128mg，0.127mmol)和在二噁烷中的HCl(1ml，4.00mmol)(4M)在MeOH(1.5ml)中的溶液在RT下搅拌1h，然后将RM浓缩至干。通过反相快速色谱法(在C18柱上，用在水+0.1％TFA中的2％-100％ACN洗脱)纯化粗产物，提供94mg呈黄色粉末呈TFA盐的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.64min，[M+H]+＝714.5
步骤4：(3R,4S)-N-(3-(6-(4-((1-(2-((1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
将3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酸(中间体1a)(31mg，0.117mmol)溶解于DMF(1ml)中。然后添加NMM(0.050ml，0.455mmol)，然后添加HATU(45mg，0.118mmol)。30min后，将(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-((1-(2-(哌啶-4-基氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(94mg，0.098mmol)(步骤3)和NMM(0.050ml，0.455mmol)在DMF(0.5ml)中的溶液滴入混合物中，并将黄色RM在RT下搅拌3h。通过反相快速色谱法(在C18柱上，用在水+0.1％NH4HCO3中的2％-100％ACN洗脱)纯化粗产物，提供43mg的标题化合物。
LC-MS(方法B)：Rt＝3.69min，[M+H]+＝960.5
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.62(s,1H),10.32(s,1H),8.80(s,1H),7.88(d,J＝8.4Hz,2H),7.67(s,1H),7.48(dd,J＝10.8,2.8Hz,1H),7.44-7.29(m,2H),7.15(d,J＝8.5Hz,1H),7.04(m,2.9Hz,3H),6.65(s,1H),5.12(d,J＝4.6Hz,1H),4.45(s,1H),3.85(m,4H),3.74-3.44(m,7H),3.27-3.01(m,4H),2.83-2.61(m,4H),2.50(m,2H),2.32(m,4H),2.08(m,4H),1.93(m,2H),1.83(m,2H),1.62(m,3H),1.55-1.29(m,3H),1.13(m,1H),0.89(m,6H)。
化合物21
(3S,4R)-N-(3-(6-(4-(((1-(2-(1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)乙基)哌啶-4-基)氧基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
步骤1：叔丁基4-(2-(4-((4-(4-(5-氟-3-((3S,4R)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)氧基)哌啶-1-基)乙基)哌啶-1-甲酸酯
向叔丁基4-(2-(4-((4-(4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)氧基)哌啶-1-基)乙基)哌啶-1-甲酸酯(中间体16)(130mg，0.195mmol)、(3S,4R)-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(中间体8)(90mg，0.214mmol)、和在水中的Na2CO3(0.195ml，0.389mmol)(2M)在1-丙醇(15ml)中的混合物中添加PdCl2(PPh3)2(6.83mg，9.74μmol)。在140℃下，将所得的RM在微波中辐射15min。然后在减压下浓缩。通过快速硅胶色谱法(用在DCM中的0-16％MeOH洗脱)纯化粗产物，提供25mg的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.96min，[M+H]+＝812.7。
步骤2：(3S,4R)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-(((1-(2-(哌啶-4-基)乙基)哌啶-4-基)氧基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
将叔丁基4-(2-(4-((4-(4-(5-氟-3-((3S,4R)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)氧基)哌啶-1-基)乙基)哌啶-1-甲酸酯(步骤1)(25mg，0.031mmol)和TFA(0.071ml，0.924mmol)在DCM(3ml)中的绿色溶液在RT下搅拌24h。然后将溶液在压力下浓缩并干燥，以提供47mg呈TFA盐的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.70min；[M+H]+＝712.5。
步骤3：(3S,4R)-N-(3-(6-(4-(((1-(2-(1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)乙基)哌啶-4-基)氧基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
向(3S,4R)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-(((1-(2-(哌啶-4-基)乙基)哌啶-4-基)氧基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(步骤2)(28.9mg，0.031mmol)和3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酸(中间体1a)(8.94mg，0.034mmol)在DMF(3ml)中的混合物中添加DIPEA(0.032ml，0.184mmol)，然后添加HBTU(17.49mg，0.046mmol)。将所得的RM在RT下搅拌2h，然后倒入H2O中并过滤。将所得的滤液再次过滤。将合并的固体溶解于MeOH中并在减压下浓缩。将所得的粗产物吸附在(吸附剂材料)上，并且通过反相快速色谱法(在C18柱上，用在(水+0.1％TFA)中的10％-100％ACN洗脱)纯化，以提供7.5mg呈TFA盐的标题化合物。
LC-MS(方法B)：Rt＝3.82min，[M/2+H]+＝480.1
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.83(s,1H),10.35(s,1H),9.05(s,1H),8.87(s,1H),7.99(d,J＝8.1Hz,2H),7.72(s,1H),7.63-7.28(m,5H),7.13(dd,J＝33.8,7.4Hz,2H),4.59(d,J＝9.7Hz,2H),3.98-3.78(m,5H),3.75-3.54(m,6H),3.14(d,J＝33.2Hz,9H),2.77-2.64(m,3H),2.40-2.17(m,3H),2.09(d,J＝16.7Hz,5H),1.86(s,1H),1.63(d,J＝6.6Hz,7H),1.37(s,1H),1.15(d,J＝8.7Hz,3H),1.00-0.83(m,6H)。
化合物22
(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(((1-(2-(1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)乙基)哌啶-4-基)氧基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
步骤1：叔丁基4-(2-(4-((4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)氧基)哌啶-1-基)乙基)哌啶-1-甲酸酯
向叔丁基4-(2-(4-((4-(4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)氧基)哌啶-1-基)乙基)哌啶-1-甲酸酯(中间体16)(358mg，0.646mmol)、(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(中间体7)(272mg，0.646mmol)、和K2CO3(223mg，1.615mmol)在水(10ml)中的混合物中添加PdCl2(dppf)(47.3mg，0.065mmol)，然后添加二噁烷(10ml)。然后将所得的RM在100℃下搅拌1h，然后用EtOAc和水稀释。将两层分离，然后将水层用EtOAc(3x)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过快速硅胶色谱法(用在DCM中的0-20％MeOH洗脱)纯化粗产物，提供300mg的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.95min，[M+H]+＝812.6。
步骤2：(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-(((1-(2-(哌啶-4-基)乙基)哌啶-4-基)氧基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
将叔丁基4-(2-(4-((4-(4-(5-氟-3-((3R,4S)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺基)-2-甲基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基)苄基)氧基)哌啶-1-基)乙基)哌啶-1-甲酸酯(步骤1)(300mg，0.314mmol)和TFA(0.726ml，9.42mmol)在DCM(3ml)中的绿色溶液在RT下搅拌2h，然后将RM在减压下浓缩，以提供300mg呈TFA盐的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.68min，[M+H]+＝712.6。
步骤3：(3R,4S)-N-(3-(6-(4-(((1-(2-(1-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)哌啶-4-基)乙基)哌啶-4-基)氧基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
向(3R,4S)-N-(5-氟-2-甲基-3-(6-(4-(((1-(2-(哌啶-4-基)乙基)哌啶-4-基)氧基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(步骤2)(295mg，0.314mmol)和3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酸(中间体1a)(91mg，0.345mmol)在DMF(3ml)中的混合物中添加DIPEA(0.329ml，1.883mmol)和HBTU(179mg，0.471mmol)。将RM在RT下在氩气下搅拌2h，然后倒入水和DCM中。将两层分离，然后将有机层(含有一些粘性固体)用MeOH稀释以溶解固体。然后将所得的澄清有机层在减压下浓缩并吸附到(吸附剂材料)上。通过反相快速色谱法(在C18柱上，用在(水+0.1％TFA)中的10％-100％ACN洗脱)纯化粗产物，提供呈TFA盐的标题化合物。然后将呈TFA盐的标题化合物溶解于MeOH中，在SCX柱上过滤并用在MeOH中的氨7N从SCX柱中释放。将滤液在减压下浓缩，以提供142mg呈固体的标题化合物。
LC-MS(方法B)：Rt＝3.88min，[M+H]+＝959。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.75(s,1H),10.33(s,1H),8.84(s,1H),7.95(d,J＝8.2Hz,2H),7.67(s,1H),7.49(dd,J＝10.8,2.6Hz,1H),7.41(d,J＝8.1Hz,2H),7.35(dd,J＝8.5,1.9Hz,1H),7.31(d,J＝1.9Hz,1H),7.15(d,J＝8.6Hz,1H),7.06(dd,J＝8.8,2.6Hz,1H),6.82-6.75(m,1H),5.12(d,J＝4.4Hz,1H),4.53(s,2H),4.47-4.20(m,1H),3.92-3.85(m,1H),3.84(s,3H),3.71-3.61(m,2H),3.59(t,J＝6.6Hz,2H),3.45-3.34(m,1H),3.24-3.14(m,1H),3.14-3.03(m,1H),2.91-2.52(m,6H),2.32-2.20(m,2H),2.09(s,3H),2.06-1.94(m,3H),1.93-1.82(m,2H),1.80-1.21(m,10H),1.18-1.02(m,3H),0.94-0.84(m,6H)。
化合物23
(顺式-外消旋)-N-(3-(6-(4-((9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
步骤1：叔丁基9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯
在RT下，在氩气下，向3,9-二氮杂-螺[5.5]十一烷-3-甲酸叔丁酯(432mg，1.698mmol)和NMM(0.392ml，3.57mmol)在DMF(4ml)中的搅拌溶液中添加3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酸(中间体1a)(471mg，1.783mmol)，然后添加HATU(743mg，1.953mmol)。将澄清的RM在RT下搅拌2.5h，然后用饱和水性NaHCO3淬灭，并用EtOAc稀释。将两层分离，并且将水层用EtOAc(1x)萃取。将合并的有机层用盐水/水(1:1，2x)和盐水(1x)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并蒸发，以提供900mg的标题化合物。
LC-MS(方法A)：Rt＝0.91min，[M+H]+＝501.4。
步骤2：1-(2-甲氧基-5-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-羰基)苯基)二氢嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮
将叔丁基9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-甲酸酯(步骤1)(100mg，0.200mmol)和在二噁烷中的HCl(1ml，4mmol)(4M)在MeOH(1ml)中的溶液在RT下搅拌1.5h。将RM浓缩并在减压下干燥，以提供99mg呈HCl盐的标题化合物。
LC-MS(方法D)：Rt＝0.76min；[M+H]+＝401.4。
步骤3：(顺式-外消旋)-N-(3-(6-(4-((9-(3-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基苯甲酰)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)甲基)苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺
在RT下，向(顺式-外消旋)-N-(5-氟-3-(6-(4-甲酰基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-2-甲基苯基)-3-羟基-4-异丁基吡咯烷-1-甲酰胺(中间体10)(100mg，0.193mmol)、TEA(0.100ml，0.717mmol)和1-(2-甲氧基-5-(3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-羰基)苯基)二氢嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(步骤2)(96mg，0.193mmol)在MeOH(2ml)中的搅拌混合物中添加在THF中的ZnCl2(0.450ml，0.225mmol)(0.5M)；并将RM在RT下搅拌过夜。然后，添加NaBH3CN(15mg，0.239mmol)，并将RM在RT下搅拌3天。然后在减压下浓缩。通过反相快速色谱法(在C18柱上，用在(水+0.1％TFA)中的2％-100％ACN洗脱)纯化粗产物来提供溶液，将该溶液经PL-HCO3 MP SPE盒过滤并冻干，以提供210mg材料。通过SFC(柱：Princeton PPU，250x30 mm，100A，5um；用在MeOH中的30％-50％CO2洗脱)纯化材料，提供130mg呈白色粉末的标题化合物。
LC-MS(方法B)：Rt＝3.61min，[M+H]+＝900.7。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.78(s,1H),10.31(s,1H),8.84(s,1H),8.02(d,J＝33.4Hz,2H),7.64(s,1H),7.60-7.41(m,3H),7.35(d,J＝8.5Hz,1H),7.30(s,1H),7.14(d,J＝8.5Hz,1H),7.09-6.99(m,1H),6.85(s,1H),4.88(s,1H),4.09(m,1H),3.83(s,3H),3.57(m,3H),3.52-3.37(m,7H),3.06(m,1H),2.66-2.61(m,6H),2.14(m,1H),2.08(s,3H),1.68-1.18(m,12H),0.89(m,6H)。
测定说明
在以下细胞测定中测试了本发明的化合物。获得的数据示于表1中。表1中的术语定义如下：DC50是指观察到50％最大降解时的浓度；deg Amax是降解的程度，该值是指在看到最大降解的浓度下残留的蛋白质％；Prol GI50是指增殖数据，并定义了在孵育时间结束时与媒介物处理的对照相比观察到50％生长抑制的浓度。TMD8细胞是BTK依赖性的，而OCI-LY3细胞是非BTK依赖性的。
HEK293A细胞中的BTK-GFP和IKZF3-GFP蛋白丰度流式细胞术测定：
在分别从稳定整合的双顺反子BTK-GFP-iresRFP或IKZF3-GFP-iresRFP构建体表达BTK-GFP和RFP或IKZF3-GFP和RFP的HEK293A细胞(英杰公司R70507)中测量了BTK或IKZF3的降解。通过流式细胞术测量的GFP信号的减少充当降解剂处理后BTK或IKZF3降解的读数。
i)pLenti6-BTK-GFP-Ires-RFP和IKZF3-GFP-Ires-RFP传感器载体的克隆
双顺反子BTK-GFP-iresRFP构建体基于pLenti6-DEST载体主链，其中将GFP引入目的盒下游(DEST)下游的独特Xho1位点，并将RFP克隆到内部核糖体进入位点(Ires)之后。
详细地，通过用GFP代替纳米萤光素酶(NLuc)和用来自pLenti6-DEST-NLuc-Ires-FF的RFP代替萤火虫荧光素酶(FF)来工程化传感器构建体。
通过使用平末端克隆替换两个PmlI之间的Ires-eGFP，用合成的填充元件(其编码Ires-FF，其中FF的两侧为两个Nhe1限制位点)替换来自pLenti6-DEST-Ires-eGFP的eGFP，从而克隆pLenti6-DEST-NLuc-Ires-FF传感器构建体。为了能够用纳米荧光素酶(NLuc)进行C端标记，使用具有Xho1位点的接头引物从pNL1.1(普洛麦格公司#N1001)扩增NLuc，以使用Xho1消化物连接到线性化的pLenti6-DEST-Ires-FF中，从而产生构建体pLenti6-DEST-NLuc-Ires-FF。
使用吉布森(Gibson)组装将pLenti6-DEST-NLuc-Ires-FF用作克隆pLenti6-DEST-GFP-Ires-RFP的基本载体，从而用RFP代替FF并用GFP代替NLuc。在第一轮中，通过使用以下吉布森组装接头引物(Gibson-Nhe1 RFPfw，CGATGAATTCGCCACCgctagcATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC(SEQ ID NO:1)；Gibson-Nhe1 RFP-Stoprev，CTCATTACTAACCGGctagcTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC(SEQ ID NO:2))从模板扩增RFP，以RFP取代FF，以克隆到经Nhe1消化并凝胶纯化以去除FF片段的pLenti6-DEST-NLuc-Ires-FF中。所得的pLenti6-DEST-NLuc-Ires-RFP载体用作模板，通过使用以下吉布森组装接头引物(Gibson-Xho1 GFPfw，CCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGcATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG TTCACC(SEQ ID NO:3)；Gibson-Xho1GFP-Stoprev，CCGCGGGCCCTCTAGACTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG AGT(SEQ ID NO:4))从模板扩增GFP来用GFP替代NLuc，以克隆到经Xho1消化并凝胶纯化以去除NLuc片段的pLenti6-DEST-NLuc-Ires-RFP中。根据制造商手册，使用吉布森组装预混合液(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)NEB E2611L)进行所有吉布森组装反应，得到目的载体pLenti6-DEST-GFP-Ires-RFP以进行Gateway克隆。
为了实现BTK的gateway克隆和C-末端GFP标记，首先根据制造商手册(英杰公司11789-013)使用gateway BP反应将BTK可读框(ORF)从pcDNA-DEST40-BTK载体(英杰公司文库ID INV_20090504v1)穿入pDONR221(英杰公司12536-017)载体，产生新的构建体pENTR221-BTK。对于C-末端标记，根据制造商手册，使用QuikChange Lightning诱变试剂盒(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)#210518)，用以下引物(pENTR221-BTKQuikchange STOP-Leu fw，gtcatggatgaagaatccTTGaacccagctttcttgtac；pENTR221-BTKQuikchange STOP-Leu REVC，gtacaagaaagctgggttCAAggattcttcatccatgac)进行诱变反应，将STOP密码子突变为亮氨酸，产生pENTR221-BTK(STOP-Leu)。
为了获得最终的pLenti6-BTK-GFP-Ires-RFP传感器构建体，根据制造商手册，使用LR克隆酶试剂盒(英杰公司11791-019)，在pLenti6-DEST-GFP-Ires-RFP和pENTR221-BTK(STOP-Leu)之间进行Gateway LR反应。所描述的所有载体均已测序进行验证。
根据制造商手册，使用LR克隆酶试剂盒(英杰公司11791-019)，通过类比，通过将IKZF3从pENTR221-IKZF3(STOP-Leu)构建体gateway克隆到先前描述的pLenti6-DEST-GFP-Ires-RFP载体中来工程化双顺反子pLenti6-IKZF3-GFP-iresRFP。所描述的所有载体均已测序进行验证。
为了实现IKZF3的gateway克隆和C-末端GFP标记，根据制造商手册，使用QuikChange Lightning诱变试剂盒(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)#210518)，用以下引物(pENTR221-IKZF3 Quikchange STOP-Leu fw，AGAGCCCTGCTGAAGttgaaccCAGCTTTcttgtac(SEQ ID NO:5)；pENTR221-IKZF3 Quikchange STOP-Leu REVC，gtacaagAAAGCTGggttcaaCTTCAGCAGGGCTCT(SEQ ID NO:6))进行诱变反应，将STOP密码子从pENTR221-IKZF3(英杰公司#INVE089_A8)突变为亮氨酸，产生pENTR221-IKZF3(STOP-Leu)。
ii)工程化稳定表达的293A BTK-GFP-Ires-RFP和IKZF3-GFP-Ires-RFP传感器细 胞
使用之前描述的pLenti6-BTK-GFP-Ires-RFP或pLenti6-IKZF3-GFP-Ires-RFP传感器构建体通过慢病毒载体转导产生293A BTK-GFP-Ires-RFP和IKZF3-GFP-Ires-RFP传感器细胞。通过在100μl OptiMEM无血清培养基(英杰公司#11058-021)(将其与3μl的Lipofectamine2000(英杰公司#11668-019)在97μl OptiMEM无血清培养基中预孵育5min后混合)中稀释的500ng pLenti6-BTK-GFP-Ires-RFP或pLenti6-IKZF3-GFP-Ires-RFP、500ngdelta8.71和200ng pVSVG的共转染，在HEK293FT细胞(英杰公司R70007)中产生慢病毒颗粒。将混合物在RT下再孵育20min，然后添加到6孔板孔中的1ml新鲜制备的HEK293FT细胞悬浮液中(浓度1.2x 106个细胞/ml)。转染后1天，将培养基替换为1.5ml完全生长培养基(DMEM高葡萄糖+10％FCS+1％L-谷氨酰胺+1％NEAA+1％NaPyr.)。转染后48h，收集含有病毒转导颗粒的上清液，并将其冷冻在-80℃下。
在用病毒颗粒转导前两天，将1x105个HEK293A细胞(英杰公司R70507)接种到6孔板孔中的2ml生长培养基中。用90μl收集的含有病毒转导颗粒的上清液在1ml包括8μg/ml聚凝胺的培养基中进行感染。感染后24h，用杀稻瘟素以8μg/ml的浓度选择稳定转染的细胞。
iii)定量BTK-GFP和IKZF3-GFP丰度测量
将稳定的HEK293A-BTK-GFP-iresRFP细胞保持在完全生长培养基(DMEM高葡萄糖+10％FCS+1％L-谷氨酰胺+1％NEAA+1％NaPyr.)中，每周传代两次。在第0天，将HEK293A-BTK-GFP-iresRFP或HEK293A-IKZF3-GFP-iresRFP和HEK293A-iresRFP细胞以10,000个细胞/孔接种在260μl完全培养基中的96孔微量滴定板中。在第1天，使用HP D300数字分配器(帝肯公司(Tecan))用10点1:3稀释系列化合物一式两份处理细胞。将整个板上的DMSO浓度标准化为0.1％。在第2天，在37℃下孵育24h后，弃去处理培养基，用100ul/孔PBS冲洗细胞，并然后使用40ul胰蛋白酶/孔分离5min。用100ul/孔PBS+20％FCS中和胰蛋白酶。使用BDFACS CANTO II(贝迪公司(Becton Dickinson))对样品进行流式细胞术。然后使用前向(FSC)对侧向(SSC)散点分析进行细胞鉴定。使用SSC宽度(SSC-W)对SSC高度(SSC-H)散点分析进行单细胞区分。将5,000个单细胞的GFP中值用于确定BTK水平。将来自HEK293A-iresRFP的GFP中值用作背景信号，并且因此定义为0％BTK信号。将来自DMSO处理的HEK293A-BTK-GFP-iresRFP或HEK293A-IKZF3-GFP-iresRFP的中值GFP值用于定义100％BTK信号，用于随后的DC50曲线(50％BTK降解时的浓度)。分别在称为FITC和PE的通道中读取GFP和RFP。
绘制GFP信号的相对减少(通过流式细胞术测量)相对于化合物的10种化合物浓度(起始浓度10μM，3倍稀释步骤)的浓度应答曲线可以产生DC50值。
对于IKZF3丰度测定，将文献分子泊马度胺和来那度胺作为阳性对照化合物进行测试。数据示于表2，其中DC50是指观察到50％最大降解时的浓度；deg Amax是降解的程度，该值是指在看到最大降解的浓度下残留的蛋白质％。
在TMD8细胞中的BTK(C481S)-GFP蛋白丰度流式细胞术
在表达BTK(C481S)-GFP和mCherry的TMD8细胞中，从稳定整合的第二代双顺反子BTK(C481S)-GFP-CHYSEL-mCherry构建体中测量BTK(C481S)的降解。通过流式细胞术测量的GFP信号的减少充当降解剂处理后BTK(C481S)降解的读数。
pLenti6-BTK(C481S)-GFP-CHYSEL-mCherry传感器载体的克隆
BTK(C481S)蛋白丰度传感器基于第二代双顺反子构建体，其中2个阅读框BTK(C481S)和mCherry对照由顺式作用水解酶元件隔开(参见：Lo等人,2015Cell Reports[细胞报告]13,2634)，从前面描述的第一代载体中替换Ires。
双顺反子BTK(C481S)-GFP-CHYSEL-mCherry构建体基于pLenti6-DEST载体骨架，其中合成GFP-CHYSEL-mCherry盒并通过吉布森组装将其插入DEST盒的下游，产生新的gateway相容载体pLenti6-DEST-GFP-CHYSEL-mCherry以允许使用pENTR221-BTK(C481S)(STOP-Leu)进行gateway克隆以获得最终传感器构建体pLenti6-BTK(C481S)-GFP-CHYSEL-mCherry。通过用根据制造商手册进行的、使用QuikChange Lightning诱变试剂盒(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)#210518)，用以下引物(BTK C481S Quikchange fw，gagtacatggccaatggctCcctcctgaactacctgagg(SEQ ID NO:7)；BTK C481S Quikchange REVC，cctcaggtagttcaggaggGagccattggccatgtactc(SEQ ID NO:8))在pENTR221-BTK(STOP-Leu)上进行诱变反应，将野生型BTK突变为BTK(C481S)来产生pENTR221-BTK(C481S)(STOP-Leu)，从而生成pENTR221-BTK(C481S)(STOP-Leu)。
合成构建体的序列(Xho1位点以粗体显示，mCherry-ORF以小写字母显示)：
稳定表达的TMD8BTK(C481S)-GFP-CHYSEL-mCherry传感器细胞的工程化
使用之前描述的pLenti6-BTK(C481S)-GFP-CHYSEL-mCherry传感器构建体通过慢病毒载体转导产生TMD8 BTK(C481S)-GFP-CHYSEL-mCherry传感器细胞。通过在100μlOptiMEM无血清培养基(英杰公司#11058-021)(将其与3μl的Lipofectamine2000(英杰公司#11668-019)在97μl OptiMEM无血清培养基中预孵育5min后混合)中稀释的500ngpLenti6-BTK-GFP-Ires-RFP或pLenti6-IKZF3-GFP-Ires-RFP、500ng delta8.71和200ngpVSVG的共转染，在HEK293FT细胞(英杰公司R70007)中产生慢病毒颗粒。将混合物在RT下再孵育20min，然后添加到6孔板孔中的1ml新鲜制备的HEK293FT细胞悬浮液中(浓度1.2x 106个细胞/ml)。转染后1天，将培养基替换为1.5ml完全生长培养基(DMEM高葡萄糖+10％FCS+1％L-谷氨酰胺+1％NEAA+1％NaPyr.)。转染后48h，收集含有病毒转导颗粒的上清液，并将其冷冻在-80℃下。
在用病毒颗粒转导前两天，将1x105个HEK293A细胞(英杰公司R70507)接种到6孔板孔中的2ml生长培养基中。用90μl收集的含有病毒转导颗粒的上清液在1ml包括8μg/ml聚凝胺的培养基中进行感染。感染后24h，用杀稻瘟素以8μg/ml的浓度选择稳定转染的细胞。
DLBCL(弥漫性大B细胞淋巴瘤)细胞中的细胞活力测定：
通过基于刃天青(Resazurin)(西格玛公司，#R7017)的细胞活力测定法测量BTK化合物对细胞增殖的作用。将TMD8(对BTK化合物敏感)和OCI-LY3(对BTK化合物不敏感)细胞与相应化合物一起在37℃和5％CO2下孵育72h。刃天青是无毒的、细胞可渗透的底物，其实际上是无荧光的。进入活细胞后，刃天青(西格玛公司，#R7017)还原为荧光强的试卤灵(Resorufin)。通过测量荧光信号(激发谱530nm；发射谱600nm)来评估代谢活性。
将TMD8和OCI-Ly3细胞在第0天一式三份接种在96孔板(科斯塔尔公司(Costar)#3904)中，每150μl/孔的细胞密度为1x104个细胞。为了在实验开始时评估两种细胞系的基础代谢活性，准备了其他板。对于这些参照板，在接种后3h添加刃天青(西格玛公司，#R7017)至终浓度为13μg/ml，并在37℃和5％CO2下孵育2h。孵育后，在Mithras LB940多模式读板器上以530/600nm(德国伯托公司(Berthold Technologies,Germany))测量96孔板的荧光信号强度。
平行地，在接种后3h，用各种浓度的化合物或单独用媒介物(DMSO)处理试验板3天。使用HP D300数字分配器(瑞士帝肯公司(TECAN,Switzerland))将化合物添加到板中。将化合物一式三份以8点连续稀释(1:4)进行测试，其中OCI-LY3和TMD8细胞的起始浓度分别为10μM和1μM。为了评估细胞的相对增殖，将刃天青直接添加到培养基的每个孔中，至最终浓度为13μg/ml。将板在37℃和5％CO2下孵育2h以产生72h终点。孵育后，在MithrasLB940多模式读板器上以530/600nm(德国伯托公司(Berthold Technologies,Germany))测量96孔板的荧光信号强度。试卤灵染料的形成与代谢活性细胞的数量直接相关。对于每次一式三份的处理，计算平均值和标准偏差，并通过曲线拟合软件进行分析，以确定各自的化合物浓度，从而得出50％生长抑制(GI50)值。对于每种化合物，GI50值通常由至少2个完全独立的实验确定。
OCI-LY3细胞是通过与加拿大多伦多教学医院(University Health Network,Toronto,Canada)达成的许可协议获得的。在RPMI1640培养基(Gibco公司，#61870-010，批次1894759)中培养细胞，该培养基补充有10％FCS(HyClone公司，GE#SH30066.03，批次AB217603)、2mM L-谷氨酰胺(生物概念公司(BioConcept)，#5-10K50-H，批次LA03467P)、1mM丙酮酸钠(生物概念公司，#5-60F00-H，批次LB10510P)、10mM HEPES(Gibco公司，#15630-056，批次1854074)、1％Pen/Strep(生物概念公司，#4-01F00-H，批次LB04235P)。
TMD8细胞是通过与日本东京医科齿科大学(Tokyo Medical and DentalUniversity,Japan)达成的许可协议获得的。在MEM Alpha培养基(生物概念公司，#1-23F01-I，批次LB04262P)中培养细胞，该培养基补充有10％FCS(HyClone公司，GE#SH30066.03，批次AB217603)、2mM L-谷氨酰胺(生物概念公司，#5-10K50-H，批次LA03467P)、1％Pen/Strep(生物概念公司，#4-01F00-H，批次LB04235P)。
n.d.＝未确定

Claims (4)

1.式(XXIa)的化合物或其盐，
其中:
R6选自H和F；并且
R7选自H、F、Cl、-CH3、-OCH3和-OCH2CH3。
2.根据权利要求1所述的化合物或其盐，其中R6是F。
3.根据权利要求1所述的化合物或其盐，其中R7选自F、Cl、-CH3、-OCH3和-OCH2CH3。
4.根据权利要求1所述的化合物或其盐，其为
或其盐。
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