CN117180502A - 一种双重取向的复合神经鞘管及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种双重取向的复合神经鞘管及其制备方法，属于医学材料领域。本发明所述的复合神经鞘管包含胶原纤维轴向取向排列的致密管壁层以及具有轴向取向联通孔道结构的疏松支架层，管壁层通过电化学沉积定向引导I型胶原蛋白的自组装而制得，其取向的胶原纤维模拟了神经外膜的组织结构，有利于快速形成致密的神经外膜等外层结构，同时也可引导端口神经束实现精准对合，有利于神经功能的完全恢复；支架层提供了可供细胞黏附的活性位点及增殖空间，有利于神经细胞定向快速长入，且取向排列的联通孔道可定向引导神经细胞迁移，从而引导神经轴的定向生长，提升修复速率与效果。

Description

一种双重取向的复合神经鞘管及其制备方法

技术领域

本发明属于医学材料领域，具体涉及一种双重取向的复合神经鞘管及其制备方法。

背景技术

周围神经损伤修复因其自修复速率慢，效果差且致残率高，是临床的一大挑战。对于短距离缺损(＜5mm)可对断裂神经直接进行无张力吻合。然而，针对长距离缺损的修复，自体神经移植虽是目前修复的“金标准”，但仍有许多缺点：可移植供体来源不足，及易引起供体区域功能障碍，形成疤痕组织，而异体移植物又不可避免存在免疫原性高、排斥反应大等问题，通常需要使用免疫抑制剂，提高了感染风险。基于此，利用生物材料制备的合成人工鞘管已逐渐被临床接受，利用神经鞘管桥接断裂的神经，将其与周围软组织隔离的同时，又能引导神经细胞的定向迁移及神经轴的定向生长，从而诱导近端神经向远端神经的生长，进而实现断裂或受损神经的修复。

神经组织是一种具有多级定向结构的特殊组织，由神经外膜包裹着取向的神经束组成，神经束由取向的多根微米尺度的神经纤维组成，而神经纤维又是由雪旺细胞定向排列形成的髓鞘，引导神经轴的定向生长而形成。因此，理想的神经鞘管应具备以下条件：(1)模拟天然神经的多重取向结构，复合取向的管壁层与支架层，其中取向的支架层能诱导雪旺细胞定向迁移及神经轴突的定向生长，有利于生成平行于轴向排列的神经纤维及神经束，同时取向的管壁层可引导端口神经束的对合生长，并形成致密的神经外膜；(2)管壁层呈半透膜结构，允许营养物质透过的同时，又能有效阻挡外部成纤维细胞、炎症细胞的长入，确保神经组织的优势生长；(3)管壁层遇水湿润后呈透明状，便于缝合操作，并提升鞘管在神经端口处的对合度。

胶原蛋白作为人体组织和器官的结构基石，因其良好的促细胞黏附能力、低免疫源性及高生物相容性，是制备神经鞘管的理想材料。虽然已被广泛用于神经鞘管的制备，然而，受限于冻干等成型技术的不足，胶原在体外自组装时常倾向于发生原纤维的无规聚集而形成松散、随机的网络结构，胶原纤维间缺乏定向排列的取向结构，不利于形成定向生长及致密的神经外膜，影响其功能恢复；此外，无规排列的胶原纤维会造成光散射，使鞘管在吸收组织液或者复水浸润后仍不透明。同时，现有胶原基神经鞘管设计多为单一的中空结构，支撑性较差，后期应用过程中易发生管壁的塌陷，堵塞神经再生通道，阻碍其修复再生；同时，取向支架层的缺乏无法为神经细胞提供黏附、铺展、迁移的活性位点，不利于神经细胞的快速定向长入及加速神经修复。

例如，专利CN1380115A公开了一种脊髓、周围神经修复材料的制备工艺，可按需制成不同的外型，如圆柱型、长方型等，其具有以下特点：1)材料的外表面为全封闭结构，可有效阻止体内纤维结缔组织的长入；2)材料的微管径大小可控制在30-200μm，有利于神经再生纤维的生长；3)微管的排列走行方向为轴向且相互间平行、均匀，有利于神经再生纤维的定向延伸。专利WO2011032139A2提供了一种由高度排列的静电纺丝纤维的三维(3D)阵列形成的神经导管，静电纺丝纤维平行于导向器的长轴，堆叠的纤维阵列之间的间隙和拉长空间为定向轴突生长提供通道。

综上，如何开发一款具有双重取向结构及高透明管壁的复合神经鞘管有十分重要的研究及实用价值。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种双重取向的复合神经鞘管及其制备方法。本发明所述的复合神经鞘管包含胶原纤维轴向取向排列的致密管壁层以及具有轴向取向联通孔道结构的疏松支架层，管壁层通过电化学沉积定向引导I型胶原蛋白的自组装而制得，其取向的胶原纤维模拟了神经外膜的组织结构，有利于快速形成致密的神经外膜等外层结构，同时也可引导端口神经束实现精准对合，有利于神经功能的完全恢复；此外，紧密排列的胶原纤维使得管壁层呈半透膜性质，在允许营养物质透过的同时，也可有效阻挡成纤维细胞的长入，为神经再生提供了良好微环境。同时，复水后的透明管壁层也大大提升了缝合的便利性。支架层提供了可供细胞黏附的活性位点及增殖空间，有利于神经细胞定向快速长入，且取向排列的联通孔道可定向引导神经细胞迁移，从而引导神经轴的定向生长，提升修复速率与效果。

为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种神经鞘管，所述的神经鞘管为双重取向的复合神经鞘管，外层为胶原纤维轴向定向排列的致密管壁层，且在含水状态下呈透明状，内层为具有轴向取向联通孔道结构的疏松支架层。

又一方面，本发明提供了上述神经鞘管的制备方法，所述的方法包括以下步骤：

(1)电化学沉积：采用三电极系统进行阴极电沉积，参比电极为Ag/AgCl，将其浸入到胶原溶液中并固定，调整电极间的径向距离，以恒电流模式进行电化学沉积，获得胶原纤维取向排列的管状凝胶膜；

(2)预拉伸：将胶原凝胶在力学拉伸机上沿轴向拉伸，提升其取向度，并将其浸泡在无水乙醇溶液中，暂时固定其取向结构；

(3)交联固定：将胶原凝胶膜进行化学交联，永久固定胶原纤维的取向排列结构；

(4)取向冷冻：将胶原膜放置在一端封口的冷冻装置中，并向其中灌注胶原/硫酸软骨素混合溶液，随后将模具与冷冻介质仅保持轴向上的单面接触，诱导冰晶取向生成；

(5)冷冻干燥：将步骤(4)中预冷冻的凝胶膜进行真空冷冻干燥，得兼具胶原纤维及孔道结构沿轴向取向排列的复合神经鞘管。

具体地，所述的神经鞘管内径可通过改变阴极尺寸，外径可通过改变电沉积时间进行调节。

具体地，步骤(1)中所述的电极阴极为圆柱状铁丝或钛丝，阳极为钌铱钛网桶、铂丝或铂片。

具体地，步骤(2)中所述的在无水乙醇中的浸泡时间为1-24h。

具体地，步骤(3)中所述的化学交联包括但不限于京尼平交联、戊二醛交联、氯化4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉交联、碳二亚胺交联、二环己基碳二亚胺交联或碳二亚胺加N-羟基琥珀酸交联的一种或多种组合。

在某些实施例中，本发明所述的神经鞘管的制备方法包括以下步骤：

S1.外管壁的制备：

1)胶原溶液配制：将I型胶原以1-20mg/mL的浓度溶于醋酸溶液中，并用氢氧化钠将pH调至2-4，随后向其中加入过氧化氢溶液，使其浓度保持在5-200μL/mL，除去气泡后放置于0-10℃备用。

2)电化学沉积：采用三电极系统进行阴极电沉积，以直径为1-20mm的圆柱状铁丝或钛丝为阴极，以钌铱钛网桶或铂丝、铂片为阳极，以Ag/AgCl为参比电极，将其浸入到胶原溶液中并用支架固定，调整电极间的径向距离至0.1-5cm，在恒定电流下，电流密度为1-20mA/cm²，进行5-30min的电化学沉积后，在阴极获得胶原纤维取向排列的管状凝胶膜。

3)预拉伸：通过力学拉伸机，将上述制得的胶原凝胶膜沿轴向拉伸至初始长度的110-200％，实现进一步取向，随后将其浸泡在无水乙醇中，暂时固定其取向结构。

4)交联固定：将胶原凝胶膜进行化学交联固定1-24h，包括京尼平交联、戊二醛交联、氯化4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉(DMTMM)交联、碳二亚胺(EDC)交联、二环己基碳二亚胺(DCC)交联或碳化二亚胺(EDC)加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联，永久固定胶原的取向排列结构，使其在后续加工及服役期间始终保持高度取向。京尼平交联是将胶原凝胶膜浸泡在0.2-2％的京尼平溶液里，交联1-24h，随后通过漂洗/透析去除残留的京尼平；戊二醛交联，是指将胶原凝胶膜浸泡在0.1-0.6％w/v戊二醛溶液里，90％v/v乙醇-水为溶剂，交联15-120min，随后通过漂洗/透析去除残留的戊二醛；EDC交联，是指将胶原凝胶膜浸泡在EDC的90％v/v乙醇-水溶液中，EDC的质量浓度为1-3g/L，用MES缓冲剂调pH值至5.5，4℃下交联24h，随后通过漂洗/透析去除残留的EDC。

S2.内层基质的制备：将I型胶原以0.1-20mg/mL，硫酸软骨素以0.01-1mg/mL的浓度溶于醋酸溶液中，除去气泡后放置于0-10℃备用。

S3.取向冷冻：将S1制得的胶原膜放置在特定的取向冷冻装置中，其中一端用铜箔进行密封，并向其灌注S2配置的胶原/硫酸软骨素混合溶液，随后与冷冻介质保持单面接触，诱导冰晶沿轴向取向生成。冷冻介质包括液氮、干冰或异丙醇/干冰混合物等。

S4.真空冷冻干燥：将S3制得的预冻物按指定程序进行真空冷冻干燥，得兼具胶原纤维及孔道结构取向排列的复合神经鞘管。冷冻程序包括(1)在常压、温度为-40～-60℃条件下预冷冻处理30-120min；(2)在真空度0.1-0.3bar、温度-30～-10℃条件下干燥处理24-48h；(3)在真空度0.1-0.3bar、温度5～20℃条件下干燥处理6-12h。

又一方面，本发明提供了上述神经鞘管在制备用于断裂神经的桥接与修复药物和/或医疗装置中的应用。

具体地，所述的神经鞘管可替代天然神经移植物。

具体地，所述的应用为：将上述神经鞘管置于神经缺损部位，用于断裂神经的桥接与修复。

进一步具体地，所述的应用包括以下步骤：

(1)将上述神经鞘管复水软化，按需求裁剪尺寸，并使用医用镊小心去除两边端口处的支架层，留出缝合空间；

(2)将裁剪后的鞘管置于神经缺损部位进行缝合；

(3)材料降解时间为1-3个月。

与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：

(1)本发明所述的复合神经鞘管模拟了天然神经的取向结构特点，外层管壁中的胶原纤维沿轴向定向排列，有利于诱导神经束的取向排列，并快速诱导形成致密的神经外膜等外层结构，促进神经功能的完全恢复。

(2)本发明所述的复合神经鞘管外层管壁为致密层，呈半透膜结构，允许营养物质通过的同时，又能阻挡成纤维细胞的长入，为神经再生提供了一个相对隔绝的微环境，可有效避免疤痕组织的生成。

(3)本发明所述的复合神经鞘管外层管壁在含水状态下呈现透明状，便于缝合操作并提升了神经鞘管在神经端口处的对合精度。

(4)本发明所述的复合神经鞘管内层支架层具有联通的取向孔道，利于神经细胞的长入及定向迁移，并为其增殖、分化提供了良好的微环境。

附图说明

图1为实施例1所用的电极装置示意图及实物图。

图2为实施例6搭建的取向冷冻装置示意图。

图3为实施例1制备的管壁层冻干后及含水状态下的实物展示图，其中(a)为管壁层冻干后的状态，(b)为管壁层含水状态。

图4为实施例1制备的胶原纤维定向排列的管壁层扫描电镜图。

图5为实施例7制备的具有连通取向孔道结构的支架层扫描电镜图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

反应原理

1.外层管壁胶原纤维取向排列原理：在电化学组装过程中，电信号触发电场，诱导带正电荷的胶原分子迁移到阴极，并且使得分子在溶胶相中聚集形成部分取向结构。同时，水在电化学过程中还原产生OH^-，从阴极扩散，中和阴极附近带正电荷的胶原分子。分子间的静电排斥被吸引的超分子相互作用(即氢键和疏水间相互作用)所取代，诱导胶原分子定向组装成亚稳态的原纤维结构单元，这些组装单元再进一步拉伸交联形成取向胶原凝胶膜。

2.外层管壁透明原理：当均匀且尺寸较小的胶原纤维(纳米级)在紧密取向排列，且纤维间的尺寸远小于可见光的波长时，可使胶原膜呈现透明状，通过电沉积诱导胶原分子可控自组装并形成取向排列结构后，再经交联固定，可使其在含水状态下始终保持透明度。

3.管内支架层孔道结构取向排列原理：利用特殊定制的取向冷冻装置，可使其在轴向上出现温度梯度变化，而径向上温度保持一致，从而诱导冰晶在凝胶中沿轴向生长，经冷冻干燥去除冰晶后，得孔道结构取向排列的神经鞘管。

实施例1.胶原纤维定向排列的外管壁层制备例I

(1)胶原溶液的配置：配置0.05M的冰醋酸溶液，将I型胶原蛋白(以下所用的胶原蛋白均购自海南华研胶原科技股份有限公司)以10mg/mL的浓度溶于醋酸溶液中，并用NaOH调节最终溶液的pH值为3.5，随后将其装入截留分子量为7kDa的透析袋中，在4℃下于1.5％(w/v)的冰醋酸中透析72h以去除小分子杂质，透析后完成后在蛋白溶液中加入过氧化氢，浓度为100μl/mL，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡后，放置在冰水混合浴中保存。

(2)电化学沉积：采用三电极系统进行阴极电沉积，以直径为5mm的圆柱状铁丝为阴极，以钌铱钛网桶为阳极(详见图1)，以Ag/AgCl为参比电极，将其浸入到胶原溶液中并用支架固定，调整电极间的径向距离至1.5cm，在恒定电流下，电流密度为6.67mA/cm²，进行15min的电化学沉积，在阴极获得胶原纤维取向排列的中空管状凝胶膜。

(3)预拉伸：通过力学拉伸机，将上述制得的胶原凝胶膜沿轴向拉伸至初始长度的140％，实现进一步取向，随后将其浸泡在无水乙醇中，暂时固定其取向结构。

(4)交联固定：配制1％的京尼平溶液，将步骤(3)处理所得到的胶原膜浸泡其中，交联10h。随后用超纯水反复清洗，去除胶原膜中残留的京尼平组分。

其制备的管壁层实物图详见图3，扫描电镜图详见图4。

实施例2.胶原纤维定向排列的外管壁层制备例II

(1)胶原溶液的配置：参照实施例1的步骤进行溶液配制，将I型胶原蛋白浓度替换为15mg/mL，其余不变。

(2)电化学沉积：参照实施例1的步骤进行电化学沉积，将阴极替换为圆柱状钛丝，电极间的径向距离至2cm，电流密度调整为10mA/cm²，其余不变。

(3)预拉伸：参照实施例1进行定向拉伸，将拉伸长度替换为初始长度的150％，其余不变。

(4)交联固定：参照实施例1进行交联固定，将京尼平溶液替换为2％，其余不变。

实施例3.具有联通孔道结构的内支架层制备例I

配置0.05M的冰醋酸溶液，将I型胶原蛋白以5mg/mL、硫酸软骨素(以下所用的硫酸软骨素均购自Sigma-Aldrich)以0.5mg/mL的浓度溶于醋酸溶液中，并同NaOH调节最终溶液的pH值为3.5，随后将其装入截留分子量为7kDa的透析袋中，在4℃下于1.5％(w/v)的冰醋酸中透析72h以去除小分子杂质，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡后，放置在冰水混合浴中保存。

实施例4.具有联通孔道结构的内支架层制备例II

参照实施例3配置胶原/硫酸软骨素溶液，将I型胶原蛋白浓度替换为7mg/mL、硫酸软骨素浓度替换为0.6mg/mL，其余不变。

实施例5.具有联通孔道结构的内支架层制备例III

参照实施例3配置胶原/硫酸软骨素溶液，将I型胶原蛋白浓度替换为8mg/mL、硫酸软骨素浓度替换为0.8mg/mL，其余不变。

实施例6.取向冷冻装置的搭建

冷冻装置(详见图2)由四部分组成：样品容器1、导热台2、冷冻池3和隔热层4，样品容器呈长方体方体，内设多个圆柱形空腔，管壁材质为聚四氟乙烯，底部被导热性能优良的铜箔密封，隔热层材质为高密度聚苯乙烯，包裹在样品容器四周，以最大程度减少径向上的热损失，导热台置于冷冻池中央，容器底部与导热台直接接触，保证轴向上的热传导，以形成连续的温度梯度分布，进而诱导冰晶的定向生成。

实施例7.具有双重取向结构的复合神经鞘管制备例I

(1)取向冷冻：以液氮为冷冻介质，将实施例1中制得的外层管壁放置在实施例6搭建的取向冷冻装置中，并向其空腔中灌注实施例3配置的内层基质浆液，随后进行约15min的冷冻，完成冰晶的定向诱导生长。

(2)真空冷冻干燥：将预冻物按指定程序进行真空冷冻干燥，冷冻程序包括(1)在常压、温度为-50℃条件下预冷冻处理15min；(2)在真空度0.2bar、温度-20℃条件下干燥处理30h；(3)在真空度0.2bar、温度10℃条件下干燥处理6h，得兼具胶原纤维及孔道结构取向排列的复合神经鞘管(扫描电镜图详见图5)。

实施例8.具有双重取向结构的复合神经鞘管制备例II

(1)取向冷冻：以干冰为冷冻介质，将实施例2中制得的外层管壁放置在实施例6搭建的取向冷冻装置中，并向其空腔中灌注实施例4配置的内层基质浆液，随后进行约45min的冷冻，完成冰晶的定向诱导生长。

(2)真空冷冻干燥：参照实施例7的程序进行真空冷冻干燥。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种神经鞘管，其特征在于：所述的神经鞘管为双重取向的复合神经鞘管，外层为胶原纤维轴向定向排列的致密管壁层，且在含水状态下呈透明状，内层为具有轴向取向联通孔道结构的疏松支架层。

2.一种权利要求1所述的神经鞘管的制备方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：

(1)电化学沉积：采用三电极系统进行阴极电沉积，参比电极为Ag/AgCl，将其浸入到胶原溶液中并固定，调整电极间的径向距离，以恒电流模式进行电化学沉积，获得胶原纤维取向排列的管状凝胶膜；

(2)预拉伸：将胶原凝胶在力学拉伸机上沿轴向拉伸，提升其取向度，并将其浸泡在无水乙醇溶液中，暂时固定其取向结构；

(3)交联固定：将胶原凝胶膜进行化学交联，永久固定胶原纤维的取向排列结构；

(4)取向冷冻：将胶原膜放置在一端封口的冷冻装置中，并向其中灌注胶原/硫酸软骨素混合溶液，随后将模具与冷冻介质仅保持轴向上的单面接触，诱导冰晶取向生成；

(5)冷冻干燥：将步骤(4)中预冷冻的凝胶膜进行真空冷冻干燥，得兼具胶原纤维及孔道结构沿轴向取向排列的复合神经鞘管。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的神经鞘管内径通过改变阴极尺寸，外径通过改变电沉积时间进行调节。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的电极阴极为圆柱状铁丝或钛丝，阳极为钌铱钛网桶、铂丝或铂片。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的在无水乙醇中的浸泡时间为1-24h。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的化学交联包括但不限于京尼平交联、戊二醛交联、氯化4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉交联、碳二亚胺交联、二环己基碳二亚胺交联或碳二亚胺加N-羟基琥珀酸交联的一种或多种组合。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的冷冻介质包括液氮、干冰或异丙醇/干冰混合物。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(5)中所述的真空冷冻干燥程序包括：1)在常压、温度为-40～-60℃条件下预冷冻处理30-120min；2)在真空度0.1-0.3bar、温度-30～-10℃条件下干燥处理24-48h；3)在真空度0.1-0.3bar、温度5～20℃条件下干燥处理6-12h。

9.权利要求1所述的神经鞘管在制备用于断裂神经的桥接与修复药物和/或医疗装置中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的应用为：将权利要求1所述的神经鞘管置于神经缺损部位，用于断裂神经的桥接与修复。