CN111235662A - 一种具有天然结构的胶原长纤维及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有天然结构的胶原长纤维及其制备方法和应用,将含有PEG4000、胶原蛋白的纺丝液挤入凝固浴进行湿法纺丝,通过旋转接收装置收集,即可制备得到不同直径的胶原长纤维,长度可达到100cm以上;同时可通过后处理得到具有更好的化学稳定性和力学性能的胶原长纤维,利用该胶原长纤维可仿生构建组织工程修复材料,用于神经、血管、肌腱、韧带等具有线性排列基质特征的组织修复,还可以用于软骨组织的修复。该制备方法简单易操作,可保护胶原纤维的结构不受破坏,保留其良好的生物相容性,可进行工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学材料领域,特别是涉及一种具有天然结构的胶原长纤维及其制备方法和应用。
背景技术
胶原作为结缔组织细胞外基质的主要组成成分之一,常被用作组织工程的支架材料。由于其具有良好的生物相容性、可降解性,且能构建细胞外基质微环境,有利于细胞粘附和增殖,可诱导骨髓间充质干细胞的分化,表现出一定的生物活性与功能性,因此胶原作为一种重要的生物材料,被广泛应用于多个临床领域,具有较高的实际应用价值。
人体中有很多组织如肌腱、神经、血管等都是由高度取向的微纤维结构单元组装而成,呈现出一定的线性排列基质特征。现有报道中,大多数胶原基材料为块状凝胶、微球、海绵膜等形式,材料中的胶原纤维并不具备有序排列的特征,这影响了其在组织缺损修复与再生过程中的效果,不能充分体现胶原基材料的优势;即使制备出具备有序排列特征的胶原纤维,也存在着长度过短、胶原纤维的天然结构被破坏、成本高、难以工业化等问题,限制了胶原基材料的应用。
对于软骨组织的修复,由于其缺乏血供和未分化细胞,使得受损软骨的修复更为困难,在目前的软骨修复技术中,通常都需要额外添加生长因子;若采用纯胶原支架,还会存在机械强度不够、代谢速度过快等问题,往往需要将胶原材料与其它高强度的材料复合使用,从某种程度上可部分提高材料的力学强度,但往往会破坏胶原的特征结构,使其失去良好的生物学性能。
因此,从组成与结构上仿生构建天然组织,制备定向有序排列的胶原纤维及编织物,对细胞的定向生长和分化以及植入体的再生与重建具有重要意义。
发明内容
现有的制备胶原纤维的技术,并不十分成熟,主要有以下三种方法:
(1)利用氟醇为溶剂制备胶原纺丝溶液,采用静电纺丝技术制备纳米胶原纤维膜;
(2)采用微流控技术制备微米级胶原纤维;
(3)以有机溶剂为凝固浴,采用传统的湿法纺丝技术制备胶原纤维。
但这三种方法存在着如下问题:在静电纺丝技术中以氟醇为溶剂制备胶原纺丝液,会对胶原的结构产生强烈的破坏作用,甚至有可能使其变性成为明胶,这将会影响胶原在生物医用领域里的应用价值,且利用该技术难以制得胶原长纤维;采用微流控技术可制备微米级的胶原纤维,但制备速度慢,难以实现工业化生产,且生产成本很高;传统的湿法纺丝技术通常将有机溶剂作为凝固浴,使胶原纺丝液在凝固浴中快速凝固、析出而实现胶原纤维的制备,有机溶剂的使用会对胶原纤维的天然结构产生破坏且大量使用对环境会造成一定的污染。目前,也还没有任何与胶原纤维长度有关的针对性研究。
本发明主要解决的技术问题是提供一种胶原长纤维及其制备方法,能够得到长度100cm以上的胶原长纤维。
为解决上述技术问题,本发明采用的一个技术方案是:
提供一种胶原长纤维的制备方法,包括如下内容:将溶解有胶原蛋白的纺丝液挤入凝固浴进行湿法纺丝,通过旋转接收装置收集;所述纺丝液为胶原蛋白水溶液,所述凝固浴的原料包括PEG、TES、NaCl、缓冲物质和水;所述PEG选自PEG8000~20000。
所述缓冲物质是指对溶液的酸碱度起缓冲作用,可保持溶液的pH值基本不变的物质,通常是弱酸或弱碱及其盐的混合物,或多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐的混合物。
进一步地,所述纺丝液中还包括PEG2000~6000,优选PEG4000。
当胶原蛋白溶液浓度较低时(如2mg/mL),由于溶液太稀,粘度过低,是无法进行纺丝的,本发明在纺丝液中添加PEG2000~6000,可以增加纺丝液的粘度,促进其在凝固浴中更好地成纤,即使纺丝液中胶原蛋白浓度很低,也能成功纺丝成纤得到胶原长纤维。
并且,通过不添加PEG2000~6000的纺丝液进行纺丝的过程中,在凝固浴中得到的胶原纤维不够稳定,力学强度较差,在纺丝过程中稍有受力就容易发生断裂,本发明通过添加PEG2000~6000,能够很好的解决这一问题,保证了纺丝液成纤的连续性,以确保胶原长纤维的成功制备。
还需要说明是,最终制备得到的胶原长纤维的洗涤过程中,其中的PEG2000~6000会被洗掉去除,相应的会在本发明胶原长纤维上形成若干细微的小孔,这将有利于后续实际应用过程中细胞的粘附和表达。
本发明中所述PEG8000~20000,使用的PEG可以是分子量为8000~20000中任一值的PEG,也可以是8000~20000中多种不同分子量的PEG的混合物;PEG2000~6000同理。
进一步地,所述纺丝液中胶原蛋白的浓度为2~20mg/mL;
进一步地,所述纺丝液中胶原蛋白的浓度为5~20mg/mL;
在本发明的具体实施方式中,所述纺丝液中胶原蛋白的浓度为10mg/mL。
进一步地,所述纺丝液中PEG2000~6000的质量分数为2%~5%;优选为3%。
更进一步地,所述纺丝液的pH值为3.8~4.5。
在本发明的具体实施方式中,所述纺丝液是通过如下方法制备:在0~5℃将PEG2000~6000溶液分批次加入胶原蛋白溶液中,再调节溶液的pH至3.8~4.5,在0~5℃离心脱泡后得到;
进一步地,所述胶原蛋白溶液的pH值为2~3,优选pH值为2;
在本发明的具体实施方式中,所述PEG4000溶液的加入方式为滴加。
进一步地,所述凝固浴的pH值为7.8~8.6,优选pH值为8.0;
进一步地,所述凝固浴中PEG、TES、NaCl的用量分别为:质量体积分数为8~12%的PEG8000~20000、6~7.5mg/mL TES、7~8.5mg/mL NaCl;优选质量体积分数为10%的PEG20000、6mg/mL TES、7mg/mL NaCl。
进一步地,所述缓冲物质选自磷酸缓冲系统或碳酸缓冲系统。
所述磷酸缓冲系统是指由磷酸、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、氢氧化钠、氯化钠、氯化钾中的两种或两种以上组成,且加入到溶液中能保持溶液pH稳定的混合物。
所述碳酸缓冲系统是指由碳酸盐和碳酸氢盐组成,且加入到溶液中能保持溶液pH稳定的混合物。
上述磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、碳酸盐、碳酸氢盐,均包括其对应的水合物,无论以哪种形式加入凝固浴中配置成溶液,并不影响本发明的效果,其加入量均按照其中含有的磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、碳酸盐、碳酸氢盐等同计算。
在本发明的具体实施方式中,所述缓冲物质采用的是磷酸缓冲系统,进一步地,是采用Na2HPO4和NaH2PO4配制成缓冲物质加入到凝固浴中,以维持凝固浴的pH值保持稳定。
进一步地,所述凝固浴的温度为18~40℃,优选37℃。
进一步地,所述纺丝液的灌流速度为0.1~4.0mL/min,优选0.2mL/min;纺丝头的大小为0.16~0.5mm,优选0.33mm;
进一步地,旋转接收装置的旋转速度为10~120r/min,优选60~100r/min。
在本发明的具体实施方式中,所述胶原蛋白为I型胶原蛋白,优选牛源I型胶原蛋白。
进一步地,上述制备方法还包括改性处理:将胶原长纤维通过交联剂进行化学交联,所述交联剂选自戊二醛、京尼平、EDC/NHS中的一种或几种,优选EDC/NHS;
对胶原纤维进行化学交联可增强胶原纤维的机械强度和稳定性。
进一步地,所述改性处理为:用50mM EDC和25mM NHS为交联剂对胶原长纤维进行化学交联;
更进一步地,所述胶原长纤维经化学交联后还进行冷冻干燥。
本发明还提供了一种胶原长纤维,具有胶原的天然结构;
进一步地,所述胶原长纤维的直径为30~600μm,优选30~100μm;
进一步地,所述胶原长纤维是由上述的制备方法制得。
本发明还提供了上述胶原长纤维在制备组织修复材料和/或诱导干细胞分化的材料中的应用。
所述组织修复材料,是指用以修复和/或替代机体中发生病变或者损伤的组织,恢复或部分恢复原有组织形态和功能的材料,例如可以是组织工程支架等材料。
进一步地,所述组织修复材料为软骨修复材料或具有线性排列基质特征的组织的修复材料;
本发明通过实验证明,不外加生长因子的条件下BMSCs可在本发明胶原长纤维中向软骨细胞分化,且定向胶原纤维有利于细胞的定向排列,且本发明胶原长纤维的定向结构更有利于BMSCs向软骨细胞分化过程中的基质表达并使分泌的基质沿着纤维方向定向排列,因此,本发明胶原长纤维可用于制备软骨修复材料。
由于本发明胶原长纤维具有良好的定向结构,可使得细胞分化过程中基质沿着纤维方向定向排列,因此可应用于多种具有线性排列基质特征的组织的修复材料中。
进一步地,所述具有线性排列基质特征的组织选自肌腱、韧带、神经、血管;
更进一步地,是通过编织所述胶原长纤维制备仿生组织修复材料。
由于本发明的胶原长纤维长度较长,可应用于编织仿生组织修复材料中,在材料的各个方向,均可用一束纤维直接贯穿编织,这样可以保证最终得到的组织修复材料的各个方向上的力学性能,更有利于组织的修复,目标材料很小,只需一根本发明的胶原长纤维就能进行编织,这是现有的胶原纤维不能做到的。
本发明的有益效果是:
(1)本发明方法工艺简单,可快速制备不同直径、不同长度的胶原长纤维,其长度可根据需求调整,至少可达到100cm以上,不使用有机溶剂,环境友好,绿色环保。
(2)本发明方法制备的胶原长纤维为纯胶原基质,保持了胶原良好的天然结构,并保持定向有序排列,有利于细胞的定向生长和功能表达,细胞分泌的细胞外基质可实现定向排列,有利于线性组织的修复效果。
(3)本发明方法制备的胶原长纤维,安全无毒,能较好支持骨髓间充质干细胞的粘附、增殖和生长,并实现细胞的定向生长,可用于制备线性组织如肌腱、韧带、神经和血管等组织的修复材料。
(4)本发明方法制备的胶原长纤维,力学性能优异,可在不添加生长因子的情况下诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化,可用于制备软骨组织的修复材料。
(5)本发明方法制备的胶原长纤维,可通过编织等方法仿生构建组织修复材料,较现有的通过多根短纤维编织得到的材料力学性能更好,更有利于组织的修复。
附图说明
图1是本发明胶原长纤维结构图;(a)不同接收转速下湿态胶原长纤维的光镜图;(b)60r/min的转速下制备的本发明胶原长纤维的扫描电镜图;(c)本发明胶原长纤维宏观图;
图2是本发明胶原长纤维长度测量图;
图3是本发明胶原长纤维圆二色谱仪扫描结果图;
图4是本发明体外培养7d时骨髓间充质干细胞在定向胶原纤维和块状胶原水凝胶上的激光共聚焦图;
图5是本发明体外培养14d时骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的HE、番红(SO)和甲苯胺蓝(TB)染色图;
图6是本发明胶原长纤维编织后的显微镜照片;
图7是本发明胶原长纤维编织后的宏观图;
图8是本发明在不同转速下制备不同直径的胶原纤维的应力-应变曲线图;
图9是本发明在相同转速下制备的胶原纤维在交联前和交联后的应力-应变曲线图;
图8和图9中,f表示未改性处理的胶原长纤维,cf表示经改性处理后的胶原长纤维。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明中,所述TES为三羟甲基甲胺基乙磺酸;
所述PEG为聚乙二醇。
实施例1
在冰水浴条件下将PEG4000溶液缓慢滴入从牛皮中提取出的具有一定浓度的I型胶原溶液(pH=2)中混合均匀,用NaOH调节纺丝溶液的pH至3.8~4.5,胶原溶液的最终浓度为10mg/mL,其中PEG4000的质量分数为3.25%,低温(0~4℃)离心脱泡得到纺丝液。
将PEG20000、TES、NaCl、Na2HPO4·2H2O、NaH2PO4溶于水中混合均匀,溶液中各物质的浓度为:质量体积分数为10%的PEG20000、6.8mg/mL TES、7.8mg/mL NaCl、4.1mg/mLNa2HPO4·2H2O和12.1mg/mL NaH2PO4,用NaOH调节其pH至8,得到水相凝固浴。
将水相凝固浴加热至37℃,将纺丝液加入注射泵,注射泵的针头规格为23G(内径D=0.33mm),推动注射泵使纺丝液以0.2mL/min注射速度注入凝固浴中,旋转接收装置的转速在60r/min、80r/min、100r/min的三种条件下分别可制备得到直径为60μm、45μm、30μm的胶原长纤维。
制备得到的胶原长纤维的光学图见图1(a);图1(b)为在60r/min的转速下制备的胶原纤维的扫描电镜图;图1(c)为湿法纺丝制备的胶原长纤维宏观图,纤维缠绕后用量尺进行测量,可以看出本发明制备的胶原纤维具有很长的长度;选取本发明制备得到的一根胶原长纤维对其长度进行进一步测量,如图2所示,可以更直观的看出,本发明制备的胶原长纤维长度可达100cm左右。
实施例2
将实施例1中60r/min转速下制备的胶原纤维和10mg/mL的胶原蛋白溶液进行冷冻干燥,然后各称取1mg溶于10mL 20mM HCl溶液中,待完全溶解后用圆二色谱仪进行扫描,其结果见图3。
从图3结果可看出在该条件下制备的胶原纤维与胶原蛋白溶液均在190~260nm的波长范围内有两个特征峰,分别是221nm处的正吸收峰和197nm处的负吸收峰。虽然胶原纤维的正吸收峰和负吸收峰强度有所降低,但峰的位置几乎没有发生移动,说明该方法制备的胶原纤维能够保持其本身的二级结构。
实施例3骨髓间充质干细胞体外培养
(1)将10mg/mL的胶原纺丝液进行湿法纺丝,在注射速度为0.2min/mL,针头尺寸为23G(内径d=0.33mm)和收集转速为60r/min条件下制备尺寸均匀的定向排列胶原纤维。进一步将胶原纤维进行后处理,用50mM EDC和25mM NHS为交联剂对胶原纤维进行化学交联,然后进行充分洗涤。
(2)以常规的块状无序结构胶原水凝胶为对照组,按照(1)中相同的方法制备块状胶原水凝胶,即将相同的纺丝液滴入凝固浴中制备块状胶原水凝胶,并利用相同的方法将块状水凝胶进行改性。
(3)在接种细胞之前,将定向胶原纤维和块状胶原水凝胶用75%乙醇浸泡过夜处理,用无菌PBS溶液清洗。
(4)将事先准备好的处于指数生长期的骨髓间充质干细胞进行计数并离心,用细胞培养液制备具有一定数量的细胞悬液。
(5)将细胞悬液均匀的接种在已灭菌的(3)中的定向胶原纤维和块状胶原水凝胶上,接种密度为1×104个/mL,用细胞培养液(含10%胎牛血清的α-MEM培养基和1%双抗)进行后续培养。在7d时取样用激光共聚焦显微镜进行观察,结果如图4所示,可见细胞的定向生长情况良好。
实施例4骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化
将实施例3中制备的定向胶原纤维和块状胶原水凝胶进行灭菌后,在材料表面接种骨髓间充质干细胞1×105个/支架,用细胞培养液(h-DMEM高糖培养基,0.1mM非必需氨基酸,40μg/mL L-脯氨酸,100nM地塞米松,91.5μg/mL磷酸化的维生素C,1%ITS和100U/ml双抗)进行培养,每2~3天换一次液。在14d时,将样品进行收集并用多聚甲醛固定24h,随后用石蜡包埋、切片和染色,其染色结果如图5。
从图5染色结果可看出,在体外培养21天时,BMSCs在块状胶原水凝胶和定向排列胶原纤维上呈现出不同的细胞排列状态且均出现BMSCs向软骨细胞分化过程中软骨陷窝的出现,说明在不外加生长因子的条件下BMSCs可向软骨细胞分化且定向胶原纤维有利于细胞的定向排列;同时,定向胶原纤维有利于BMSCs向软骨细胞分化过程中的基质表达并使分泌的基质沿着纤维方向定向排列。
实施例5编织仿生构建组织修复材料
本发明胶原长纤维可通过编织仿生构建组织修复材料,本发明制备的胶原长纤维可具有较长的长度,因此采用本发明胶原长纤维进行编织时能更好的保证组织修复材料结构中各部位的连续性,较以往通过多根短纤维编织得到的材料,具有更好的力学性能,若目标材料很小,只需一根本发明的胶原长纤维就能进行编织,这是现有的胶原纤维不能做到的。
图6为本发明胶原长纤维编织后在显微镜下的照片,可以看出,在材料中的各个方向,均可用一束纤维直接贯穿编织,这样可以保证最终得到的组织修复材料的各个方向上的力学性能,更有利于组织的修复,图7为本发明胶原长纤维编织后的宏观图(图中量尺的最小刻度为0.5mm)。
实施例6力学性能的检测
对本发明在不同转速下制备不同直径的胶原纤维进行力学性能检测,结果见图8,在不同转速下制备的不同直径胶原纤维的力学强度不同,直径越小,其弹性模量越高,在100r/min的速度下收集的胶原纤维直径为35μm,其弹性模量达到9kPa,远高于在30r/min速度下制备的胶原纤维(直径为100μm)的弹性模量(3.11kPa)。
再对本发明未改性处理和经改性处理后的胶原长纤维的力学性能进行检测并对比,结果见图9,当在60r/min速度下制备的胶原纤维(直径为63μm)交联后,其弹性模量可以从6.84kPa提高到97.02kPa,说明交联可显著提高胶原纤维的力学性能。
综上所述,本发明方法工艺简单,通过特殊的纺丝液和凝固浴,配合不同的工艺参数,可快速高效制备得到不同直径和长度的胶原长纤维,不使用有机溶剂,环境友好,绿色环保。
本发明制得的胶原长纤维安全无毒,保持了胶原的天然结构和定向有序排列,能较好支持骨髓间充质干细胞的粘附、增殖和生长,有利于细胞的定向生长和功能表达,细胞分泌的细胞外基质可实现定向排列,有利于线性组织的修复,可用于制备线性组织修复材料,如肌腱、韧带、神经和血管等组织的修复材料。同时,本发明胶原长纤维,可在不添加生长因子的情况下诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化,可用于制备软骨组织的修复材料。
另外,本发明胶原长纤维力学性能优异,长度可达100cm以上,有利于其应用范围的拓展,并能更好地保证最终产品力学性能。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种胶原长纤维的制备方法,其特征在于,包括如下内容:将溶解有胶原蛋白的纺丝液挤入凝固浴进行湿法纺丝,通过旋转接收装置收集;所述纺丝液为胶原蛋白水溶液,所述凝固浴的原料包括PEG、TES、NaCl、缓冲物质和水;所述PEG选自PEG8000~20000。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述纺丝液中还包括PEG2000~6000,优选PEG4000;
进一步地,所述纺丝液中胶原蛋白的浓度为2~20mg/mL;优选为10mg/mL;
进一步地,所述纺丝液中PEG2000~6000的质量分数为2%~5%;优选为3%;
更进一步地,所述纺丝液的pH值为3.8~4.5。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述纺丝液是通过如下方法制备:在0~5℃将PEG2000~6000溶液分批次加入胶原蛋白溶液中,再调节溶液的pH至3.8~4.5,在0~5℃离心脱泡后得到;
进一步地,所述胶原蛋白溶液的pH值为2~3,优选pH值为2;
进一步地,所述PEG2000~6000溶液的加入方式为滴加。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述凝固浴的pH值为7.8~8.6,优选pH值为8.0;
进一步地,所述凝固浴中PEG、TES、NaCl的用量分别为:质量体积分数为8~12%的PEG8000~20000、6~7.5mg/mL TES、7~8.5mg/mL NaCl;优选质量体积分数为10%的PEG20000、6mg/mL TES、7mg/mL NaCl;
进一步地,所述缓冲物质选自磷酸缓冲系统或碳酸缓冲系统,优选磷酸缓冲系统;进一步地,所述磷酸缓冲系统选自Na2HPO4和NaH2PO4;
进一步地,所述凝固浴的温度为18~40℃,优选37℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述纺丝液的灌流速度为0.1~4.0mL/min,优选0.2mL/min;纺丝头的大小为0.16~0.5mm,优选0.33mm;
进一步地,旋转接收装置的旋转速度为10~120r/min,优选60~100r/min。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述胶原蛋白为I型胶原蛋白,优选牛源I型胶原蛋白。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,还包括改性处理:将胶原长纤维通过交联剂进行化学交联,所述交联剂选自戊二醛、京尼平、EDC/NHS中的一种或几种,优选EDC/NHS;
进一步地,所述改性处理为:用50mM EDC和25mM NHS为交联剂对胶原长纤维进行化学交联;
更进一步地,所述胶原长纤维经化学交联后还进行冷冻干燥。
8.一种胶原长纤维,其特征在于,具有胶原的天然结构;
进一步地,所述胶原长纤维的直径为30~600μm,优选30~100μm;
进一步地,所述胶原长纤维是由权利要求1~7任一项权利要求所述的制备方法制得。
9.权利要求8所述的胶原长纤维在制备组织修复材料和/或诱导干细胞分化的材料中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述组织修复材料为软骨修复材料或具有线性排列基质特征的组织的修复材料;
进一步地,所述具有线性排列基质特征的组织选自肌腱、韧带、神经、血管;
更进一步地,是通过编织所述胶原长纤维制备仿生组织修复材料。
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