CN117165719A - 一种检测番茄褐色皱纹果病毒和烟草花叶病毒属病毒的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents
一种检测番茄褐色皱纹果病毒和烟草花叶病毒属病毒的引物组、试剂盒及方法 Download PDFInfo
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及植物病毒生物检测技术领域，具体涉及一种基于重组酶介导等温核酸扩增技术（RT‑RAA）检测番茄褐色皱纹果病毒和烟草花叶病毒属病毒的引物组、试剂盒及方法。本发明中所设计的检测ToBRFV的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，所设计的检测烟草花叶病毒属病毒的正向引物如SEQ ID No.4所示，反向引物如SEQ ID No.5所示，本发明引物组可以有效扩增ToBRFV CP基因、烟草花叶病毒属病毒183 kDa replicase基因，引物组具有较高的特异性和灵敏性，与其他病毒无交叉反应；可与侧向流免疫层析联合使用用于植物ToBRFV和烟草花叶病毒属病毒的现场快速检测，对于ToBRFV和烟草花叶病毒属病毒的有效防治具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及植物病毒生物检测技术领域，具体涉及一种基于重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)检测番茄褐色皱纹果病毒和烟草花叶病毒属病毒的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
番茄褐色皱纹果病毒(Tomato brown rugose fruit virus，ToBRFV)是帚状病毒科(Virgaviridae)烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的新成员，2015年首次在约旦发现，2017年以色列也出现了该病毒的报道。该病毒为无包膜正单链RNA病毒，主要通过人和工具进行机械传播，也能通过蜂、鸟和病果进行传播。ToBRFV在土耳其、英国、美国、墨西哥等多个国家相继发生，借助种子贸易和种质资源交流，其分布范围遍布欧洲、美洲和亚洲。该病毒的主要寄主为番茄和辣椒，该病毒可以破坏番茄上所有烟草花叶病毒抗性,目前所有的市售番茄品种对该病毒均易感。其侵染番茄的主要症状为花叶、深绿色突起、叶片狭窄、叶脉黄化或坏死，花和果实数量减少，果实上出现黄色或褐色斑块，果实变小，出现皱纹，严重的导致果梗坏死，极大地威胁了番茄、辣椒等茄果类的蔬菜生产。与同属的其他烟草花叶病毒一样，ToBRFV非常稳定且容易侵染，在水中、物体表面，及脱离植物宿主的情况下存活很长时间，仍具有侵染性，导致移栽、修剪、系绳、喷药、收获等日常操作，衣服、鞋子、设备及工具等农用物资均可传播该病毒。目前，各国纷纷采取措施阻断ToBRFV的传播扩散。2021年，番茄褐色皱果病毒被增补列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，各海关和各地农业农村部门都密切关注着该病毒寄主植物及其他限定物的进境检验检疫和疫情监测工作。
目前ToBRFV的检测方法主要有电镜技术、高通量测序技术及以核酸为基础的分子生物学测定法(RT-PCR和RT-qPCR及PCR-Cas12酶切检测等)，以RT-PCR法最为常用。由于该病毒为RNA病毒，目前的检测方法都需要进行核酸提取及转录后才能完成后续的扩增及检测。
重组酶介导等温核酸扩增技术(RecombinaseAidedAmplification)是近年开发的一种核酸扩增技术可在恒定的低温(39℃)下进行高特异性的DNA扩增，并在数分钟内达到可检测的水平。RT-RAA可在同一扩增管内同时进行逆转录和扩增的两步操作，产物可通过琼脂糖凝胶电泳检测，或使用侧向流试纸条(Lateral flow strip，LFS)实现核酸扩增产物的可视化，RT-RAALFS具有操作简单、样品量少、检测快速、成本低等优点，已在医学、食品和环境等多个领域得到广泛应用。
发明内容
要解决的问题
目前对于番茄褐色皱纹果病毒(Peppermild mottlevis，ToBRFV)或烟草花叶病毒属同属病毒的分子生物学检测方法较多，如RT-PCR、RT-qPCR等也已经成为检测的常规手段，但这些手段和方法要么高度依赖训练有素的实验室技术人员，要么需要复杂且昂贵的实验室仪器，或者检测操作过程繁琐，难以脱离实验室环境，在田间条件下应用。
另外，烟草普通花叶病毒的寄主范围非常广泛，包括茄科、苋科、豆科等36科350多种植物。植物感染烟草花叶病毒属病毒时，叶片均可能表现出花叶，皱缩或卷曲的症状，但目前的检测方法大多以其中的一种为鉴定靶标，难以将ToBRFV与其他烟草花叶病毒进行区分，由于ToBRFV危害性较大，在田间区分检材中是否带有ToBRFV，还是带有其他的烟草花叶病毒属病毒，其防控的手段和措施会有较大的差异，因此亟需建立一种快速、简便、准确的双重病原物检测方法。如果能将建立ToBRFV、烟草花叶病毒属病毒的RT-RAA/RAA双重等温核酸扩增体系，并与侧向层析试纸条检测相结合，既可满足海关和各地农业农村相关部门对病毒种类确定、针对性防治病害的迫切需求，也可以为国家农技服务部门、植物保护和植物检疫部门提供新的技术支撑。
技术方案
为了解决上述的技术问题，本发明的目的在于提供一种基于RT-RAA检测ToBRFV、烟草花叶病毒属病毒的引物组、试剂盒及方法。
本发明的一个方面，本发明提供了一种检测番茄褐色皱纹果病毒(ToBRFV)和烟草花叶病毒属病毒的RT-RAA检测引物组，所述引物组包括番茄褐色皱纹果病毒检测引物、烟草花叶病毒属病毒检测引物、番茄褐色皱纹果病毒检测探针ToBRFV-P和烟草花叶病毒属病毒检测检测探针TVes-P；其中，所述番茄褐色皱纹果病毒检测引物包括正向引物ToBRFV-F和反向引物ToBRFV-R，正向引物ToBRFV-F的序列为5′-AACCAGACAAAAACCAAAGGAAG-3′(SEQID NO.1)，反向引物ToBRFV-R的序列为5′-AAGCAGTAACTAGAGGATCTA-3′(SEQ ID NO.2)；
本发明的一个方面，本发明中所述番茄褐色皱纹果病毒检测探针ToBRFV-P，其序列为5′-TCACTAGGTAATCAG-TTCCAAACACAACAAG(THF)TAGAACAACCGTTCA-3′(SEQ ID NO.3)；所述烟草花叶病毒属病毒检测检测探针TVes-P，所述烟草花叶病毒属病毒检测引物包括正向引物TVes-F和反向引物TVes-R，
正向引物TVes-F的序列为:5′-ACAACTACAATGGCATACACACA-3′(SEQ ID NO.4)，反向引物TVes-R的序列为:5′-GCAAAATTCCCACCTATATCATATGT-3′(SEQ ID NO.5)。
所述烟草花叶病毒属病毒检测检测探针TVes-P，其序列为5′
-TAYCCDGARTTCCARATHACSTTYTAYAAY(THF)CKCARAAYGCYGTRC-3′(SEQ ID NO.6)；
所述ToBRFV的反向引物ToBRFV-R的5′端修饰有FITC，所述检测探针ToBRFV-P的5′端修饰有生物素，ToBRFV-P的3′端磷酸化修饰，THF为四氢呋喃；所述烟草花叶病毒属病毒反向引物TVes-R的5′端修饰有地高辛，所述探针引物TVes-P的5′端修饰有罗丹明，TVes-P的3′端有磷酸化修饰，THF为四氢呋喃。
本发明的一个方面，本发明提供了一种检测番茄褐色皱纹果病毒(ToBRFV)和烟草花叶病毒属病毒的试剂盒，所述试剂盒包括前述引物组。
本发明的一个方面，本发明提供的一种检测番茄褐色皱纹果病毒(ToBRFV)和烟草花叶病毒属病毒的RT-RAA检测引物组可以用于制备判断待检测的样本中是否含有ToBRFV和/或烟草花叶病毒属病毒的试剂盒。
本发明的一个方面，本发明试剂盒还可以含有其他试剂、包括RNA提取试剂、DNA提取试剂、样本裂解液、缓冲液、PCR样本扩增试剂，试剂盒说明书。
本发明的一个方面，本发明提供的一种检测番茄褐色皱纹果病毒(ToBRFV)和烟草花叶病毒属病毒的RT-RAA检测引物组可以用于判断待检测的样本中是否含有ToBRFV和/或烟草花叶病毒属病毒。
本发明的一个方面，本发明提供的试剂盒可以用于检测待测生物样本中是否含有ToBRFV和/或烟草花叶病毒属病毒。
本发明的一个方面，本发明提供了一种利用试剂盒检测ToBRFV和/或烟草花叶病毒属病毒的方法，包括以下步骤：
1)提取待测生物样本的总RNA，或对植物样本进行裂解处理；
2)以步骤1)提取的总RNA或植物裂解液为模板，采用引物组中的正向引物和反向引物进行RT-RAA扩增，获得扩增产物；
3)检测扩增产物，基于扩增产物的检测结果判断是否含有ToBRFV和/或烟草花叶病毒属病毒。
作为优选，本发明中若扩增产物中含有362bp的DNA片段，则待测生物样本中含有ToBRFV，若扩增产物中不含有362bp的DNA片段，则待测生物样本中不含有ToBRFV；若扩增产物中含有347bp的DNA片段，则待测生物样本中含有烟草花叶病毒属病毒，若扩增产物中不含有347bp的DNA片段，则待测生物样本中不含有烟草花叶病毒属病毒。
本发明的一个方面，本发明提供了一种检测待测生物样本中是否含有ToBRFV和/或烟草花叶病毒属病毒的方法，包括：
检测待测生物样本的裂解液或总RNA扩增产物中是否含有特异DNA片段，若含有特异DNA片段，则待测生物样本含有ToBRFV和/或烟草花叶病毒属病毒，若不含有特异DNA片段，则待测生物样本不含有ToBRFV和/或烟草花叶病毒属病毒；其中，所述特异DNA片段为本发明所述的正向引物和反向引物的靶序列。
本发明的一个方面，本发明提供了一种基于RT-RAA扩增方式检测ToBRFV和/或烟草花叶病毒属病毒的方法。
作为优选，所述方法包括以下步骤：
1)按照核酸释放剂提供的方法裂解植物样品；或者按照TRIzol试剂说明书操作，提取总RNA，溶于TE溶液或纯水中；
2)以步骤1)提取的总RNA或植物裂解液为模板，采用ToBRFV检测引物组中的正向引物和反向引物进行RT-RAA扩增，若扩增产物中含有362bp的DNA片段，则待测生物样本中含有ToBRFV，若扩增产物中不含有362bp的DNA片段，则待测生物样本中不含有ToBRFV；采用烟草花叶病毒属病毒检测引物组中的正向引物和反向引物进行RT-RAA扩增，若扩增产物中含有347bp的DNA片段，则待测生物样本中含有烟草花叶病毒属病毒，若扩增产物中不含有347bp的DNA片段，则待测生物样本中不含有烟草花叶病毒属病毒。
正向引物ToBRFV-F的序列为5′-AACCAGACAAAAACCAAAGGAAG-3′(SEQ ID NO.1)，
反向引物ToBRFV-R的序列为5′-AAGCAGTAACTAGAGGATCTA-3′(SEQ ID NO.2)；
正向引物TVes-F的序列为:5′-ACAACTACAATGGCATACACACA-3′(SEQ ID NO.4)，反向引物TVes-R的序列为:5′-GCAAAATTCCCACCTATATCATATGT-3′(SEQ ID NO.5)。
作为优选，所述RT-RAA扩增的反应体系如下：
| 成分 | 体积(μL) |
| 植物样品裂解液或总RNA溶液 | 2 |
| 基础缓冲液 | 29.4 |
| ToBRFV-F(5μM) | 1.6 |
| ToBRFV-R(5μM) | 2.4 |
| TVes-F(5μM) | 1.92 |
| TVes-R(5μM) | 2.88 |
| ddH2O | 至总体系为47.5 |
作为优选，所述RAA扩增的反应条件设置如下：反应液配制完成后，在每个0.2mL的eppendorf管加入2.5μL 280mM的MgAc2，充分混匀；将0.2mL的eppendorf管放入带有热盖功能的PCR仪上，39℃，保温25min。
作为优选，扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，ToBRFV RT-RAA扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测靶序列初始扩增模板最低拷贝数为101个拷贝；烟草花叶病毒属病毒RT-RAA扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测靶序列初始扩增模板最低拷贝数为101个拷贝。
其中，RT-RAA扩增产物的检测过程为：RT-RAA反应结束后，将反应管取出。每个反应管中加入100μL酚/氯仿(1:1)，充分振荡均匀，12000rpm离心10min(该步骤可使用涡旋振荡器剧烈振荡混匀)。取10μL上清液与2μL 6×Loading Buffer混合，上样于1.5％琼脂糖凝胶，200V电泳15min；待溴酚蓝移至凝胶下2/3处时结束电泳；EB染色5min，紫外灯下观察及拍照。
本发明的一个方面，本发明提供了一种检测待测生物样本中是否含有ToBRFV或/和烟草花叶病毒属病毒的方法。
作为优选，所述方法包括：检测待测生物样本的裂解液或核酸样品的扩增产物中是否含有特异DNA片段，若含有特异DNA片段，则待测生物样本中含有ToBRFV或其他烟草花叶病毒属病毒，若不含有特异DNA片段，则待测生物样本中不含有ToBRFV或其他烟草花叶病毒属病毒；其中，所述特异DNA片段为待测生物样本的总DNA中本发明所述的引物组的靶序列。
本发明的一个方面，本发明提供了一种基于RT-RAA-侧流层析技术检测ToBRFV或/和烟草花叶病毒属病毒的方法。
作为优选，所述方法包括以下步骤：
1)按照核酸释放剂提供的方法裂解植物样品；或者按照TRIzol试剂说明书操作，提取总RNA，溶于TE溶液或纯水中；
2)以步骤1)获得的植物裂解液或提取的总RNA或为模板，采用引物组进行RT-RAA扩增；
正向引物ToBRFV-F的序列为5′-AACCAGACAAAAACCAAAGGAAG-3′(SEQ ID NO.1)，
反向引物ToBRFV-R的序列为5′-AAGCAGTAACTAGAGGATCTA-3′(SEQ ID NO.2)；
番茄褐色皱纹果病毒检测探针ToBRFV-P，其序列为5′-GCACTTCTCGGAGCCTTTGATACTAGG(THF)ACAGGATAATAGAAGTT-3′(SEQ ID NO.3)正正向引物TVes-F的序列为:5′-ACAACTACAATGGCATACACACA-3′(SEQ ID NO.4)，反向引物TVes-R的序列为:5′-GCAAAATTCCCACCTATATCATATGT-3′(SEQ ID NO.5)。
烟草花叶病毒属病毒检测探针TVes-P，
其序列为5′-TAYCCDGARTTCCARATHACSTTYTAYAAY(THF)CKCARAAYGCYGTRC-3′(SEQID NO.6)；
作为优选，所述RT-RAA扩增的反应体系如下：
| 成分 | 体积(μL) |
| 植物样品裂解液或总RNA溶液 | 2 |
| 基础缓冲液 | 29.4 |
| ToBRFV-F(5μM) | 1.6 |
| ToBRFV-R(5μM) | 2.4 |
| ToBRFV-P(1μM) | 2.1 |
| TVes-F(5μM) | 1.92 |
| TVes-R(5μM) | 2.88 |
| TVes-P(1μM) | 5.2 |
| ddH2O | upto47.5 |
作为优选，所述RAA扩增的反应条件设置如下：反应液配制完成后，在每个0.2mL的eppendorf管加入2.5μL 280mM的MgAc2，充分混匀；将0.2mL的eppendorf管放入带有热盖功能的PCR仪上，39℃，保温16min。
3)应用侧流层析试纸条进行扩增产物的检测，若试纸条只在质控区出现一条条带，检测区没有条带，则结果为阴性，表明样本中不含有ToBRFV或烟草花叶病毒属病毒；若试纸条出现两条条带，一条位于质控区，一条位于检测区T1，则结果为阳性，表明样本中含有非ToBRFV的其他烟草花叶病毒属病毒；若试纸条出现三条条带，一条位于质控区，一条位于检测区T1，一条位于检测区T2，则结果为阳性，表明样本中含有ToBRFV，以及含有包括ToBRFV在内的烟草花叶病毒属病毒；若试纸条质控线不显色，则检测无效，需要更换试纸条重新检测。
检测的具体过程可以为：将装有50μLRT-RAA扩增产物的eppendorf管管盖打开，取2.5μL扩增产物至一新的1.5mL的eppendorf管，稀释20倍。将一根新的核酸侧向层析试纸条结合垫端直接插入装有稀释产物的eppendorf管管中，液面不得超过样品垫的浸没上限标记。待判读区全部浸润后，将试纸平放1分钟，观察显色结果，并在10分钟内记录。每个测试样品至少出现一条质控线，有或无检测线。若试纸条只在质控区出现一条条带，检测区没有条带，则结果为阴性，表明样本中不含有ToBRFV或其他烟草花叶病毒属病毒；若试纸条出现两条条带，一条位于质控区，一条位于检测区T1，则结果为阳性，表明样本中含有非ToBRFV的其他烟草花叶病毒属病毒；若试纸条出现三条条带，一条位于质控区，一条位于检测区T1，一条位于检测区T2，则结果为阳性，表明样本中含有ToBRFV，以及含有包括ToBRFV在内的烟草花叶病毒属病毒；若试纸条质控线不显色，则检测无效，需要更换试纸条重新检测。
其中，RT-RAA-侧流层析技术每50μL反应体系可检出最低拷贝数为21个拷贝的ToBRFV初始扩增模板，最低拷贝数为44个拷贝的烟草花叶病毒属病毒靶序列初始扩增模板。
有益效果
本发明提供了一种用于检测ToBRFV、烟草花叶病毒属病毒的特异性引物组，建立了ToBRFV、烟草花叶病毒属病毒双重快速检测方法。本发明中所设计的引物可以有效扩增靶基因，具有较高的特异性和灵敏性，与其他病毒无交叉反应，可用于ToBRFV、烟草花叶病毒属病毒的现场快速检测，对于病害的有效防治具有重要意义。
附图说明
图1是使用扩增引物组1～4对不同病毒进行ToBRFV RTRAA的结果；
图2是使用引物组5～8对不同病毒进行烟草花叶病毒属病毒通用检测引物的RTRAA的结果；
图3烟草花叶病毒属病毒replicase基因引物组5在ToBRFV、TMV、TMMoV与PMMoV和TMGMV扩增产物的比对结果；
图4是使用引物组1(ToBRFV-F和ToBRFV-R)和引物组2(ToBRFV-F2和ToBRFV-R2)进行ToBRFV RT-RAA扩增灵敏度检测。使用引物1、引物组2各自扩增产物转化质粒10倍连续梯度稀释物作为ToBRFV RT RAA扩增模板，分析引物组1和引物组2的检测灵敏性，ToBRFV-F和ToBRFV-R RT-RAA扩增可检出低至101个拷贝的ToBRFV CP基因质粒。ToBRFV-F2和ToBRFV-R2 RT-RAA扩增可检出103个拷贝的ToBRFV CP基因质粒。50μLRT RAA扩增初始模板拷贝数从106拷贝到100拷贝依次递减；其中，M：Plus DNA标记；“-”：用ddH2O替代同体积质粒的阴性对照；
图5中是使用引物组5烟草花叶病毒属病毒扩增引物(TVes-F和TVes-R)的扩增产物转化质粒10倍连续梯度稀释物作为RT RAA模板，分析引物组5的检测灵敏性检测结果，使用TVes-F和TVes-R可检出101个ToBRFV与TMGMV烟草花叶病毒属病毒replicase基因拷贝，可检出102个TMV、TMMoV与PMMoV的烟草花叶病毒属病毒replicase基因拷贝。50μLRT RAA扩增初始模板拷贝数从106拷贝到100拷贝依次递减；其中，M：Plus DNA标记；“-”：用ddH2O替代同体积质粒的阴性对照；
图6单靶标一次性核酸检测试纸条(JY0201)结构及检测结果示意图；
图7是使用ToBRFV引物组A、引物组B、引物组C、引物组D对106拷贝/μL的阳性质粒及阴性对照进行ToBRFV RT-RAA扩增及产物试纸条检测结果；
图8是使用烟草花叶病毒属病毒引物组E、引物组F、引物组G、引物组H对阳性质粒及阴性对照进行烟草花叶病毒属病毒的RT-RAA扩增及产物试纸条检测结果；
图9ToBRFV引物组A和引物组C RT RAA-LFS的灵敏度检测；
图10烟草花叶病毒属病毒引物组E RTRAA-LFS的灵敏度检测；
图11ToBRFV引物组A中下游引物的添加量对RT RAA-LFS灵敏度的影响；
图12ToBRFV引物组A中醋酸镁的添加量对RT RAA-LFS灵敏度的影响；
图13使用优化后的RTRAA扩增体系进行烟草花叶病毒属病毒引物组E RT RAA-LFS的灵敏度检测；
图14ToBRFV引物组A、烟草花叶病毒属病毒引物组E RT RAA-LFS引物特异性评价；
图15双靶标一次性核酸检测试纸条(JY0209)结构及检测结果示意图；
图16双重RT-RAA-LFS检测体系中ToBRFV引物组A、烟草花叶病毒属病毒引物组E2添加量的确定；
图17ToBRFV引物组AqPCR绝对定量熔解曲线分析；
图18烟草花叶病毒属病毒引物组E qPCR绝对定量熔解曲线分析；
图19ToBRFV引物组AqPCR绝对定量扩增曲线分析；
图20烟草花叶病毒属病毒引物组E qPCR绝对定量扩增曲线分析；
图21ToBRFV引物组A与烟草花叶病毒属病毒引物组E2双重RTRAA-LFS的检测灵敏度；
图22ToBRFV引物组A与烟草花叶病毒属病毒引物组E2引物添加量的优化；
图23ToBRFV引物组A与烟草花叶病毒属病毒引物组E2引物添加量的优化后双重RTRAA-LFS的检测灵敏度；
图24ToBRFV与烟草花叶病毒属病毒感染的烟草叶片裂解液上清液的双重RT RAA-LFS检测；
图25辣椒植株田间随机取样进行ToBRFV与烟草花叶病毒属病毒的RT RAA-LFS快速检测。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式做一个详细的说明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方面。下述实施例中所述的实验材料，如无特殊说明，均未自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
本发明所涉及的病毒样本来源：
本发明涉及的病毒样品，烟草花叶病毒属病毒分离物及其相应的总RNA或cDNA均保存于宁波大学植物病毒学研究所病毒与寄主互作研究室中。
其中，感染ToBRFV的辣椒植物样本2022年采于云南省元谋县，叶片出现花叶、蕨叶，果实出现黄斑、畸形、变褐、坏死等症状。样品采集后于液氮中速冻，并保存于-70℃。其中，ToBRFV RT-RAA特异性引物筛选和烟草花叶病毒属病毒通用扩增引物筛选实验中，以烟草花叶病毒属病毒番茄褐色皱纹果病毒(Tomato brown rugose fruit virus，ToBRFV)，烟草花叶病毒(Tomato mosaic virus，TMV)，番茄斑驳花叶病毒(Tomato mottle mosaicvirus，ToMMV)，辣椒轻斑驳病毒(pepper mild mottle virus，PMMoV)和烟草轻型绿花叶病毒(tobacco mild green mosaic virus，TMGMV)，及蚕豆病毒属的蚕豆萎蔫病毒2(broadbean will virus2，BBWV2)，马铃薯卷叶病毒属的辣椒脉黄病毒(Pepper veinyellows virus，PeVYV)，马铃薯Y病毒属的辣椒叶脉斑驳病毒(Chilli Veinal MottleVirus，ChiVMV)侵染植物样品为实验对象，提取植物总RNA作为扩增模板，并以健康的辣椒植株叶片作阴性对照。
本发明所涉及的样品制备方法为：
使用TRIzol试剂(Thermo Fisher Scientific)，根据TRIzol试剂的说明书操作，从ToBRFV植株样品，及实验室保存的烟草花叶病毒(TMV)，番茄斑驳花叶病毒(ToMMV)，辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)和烟草轻型绿花叶病毒(TMGMV)，及蚕豆病毒属的蚕豆萎蔫病毒2(BBWV2)，马铃薯卷叶病毒属的辣椒脉黄病毒(PeVYV)和马铃薯Y病毒属的辣椒叶脉斑驳病毒(ChiVMV)病毒感染的辣椒叶片或种子中提取含有病毒核酸的植物总RNA。核酸侧向层析试纸条来源于北京宝盈同汇生物技术有限公司。
为了评估所使用的RT-RAA-LFS体系是否可用于植物感染ToBRFV、烟草花叶病毒属病毒的快速检测，以收集自云南省元谋县感染ToBRFV植株样品，及实验室保存的烟草花叶病毒(TMV)，番茄斑驳花叶病毒(ToMMV)，辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)和烟草轻型绿花叶病毒(TMGMV)，及蚕豆病毒属的蚕豆萎蔫病毒2(BBWV2)，马铃薯卷叶病毒属的辣椒脉黄病毒(PeVYV)，马铃薯Y病毒属的辣椒叶脉斑驳病毒(ChiVMV)侵染植物样品为实验对象，提取植物总RNA作为扩增模板，并以健康的辣椒植株叶片作阴性对照。将 新鲜辣椒叶片样品放入含100μL/>酷闪核酸释放(Tiosbio，北京宝盈同汇生物技术有限公司)的1.5mL eppendorf管中用枪头轻捣数下，得到对应的植物样品裂解液。以2μL植物样品裂解液或其稀释液作为RT-RAA的扩增模板。植物样品裂解液可立即实验，或于-70℃储存3个月以上。
实验例1：ToBRFV和烟草花叶病毒属病毒检测的引物设计及筛选
本发明小组经过大量序列分析，以ToBRFV coatprotein(CP)基因与烟草花叶病毒属病毒的183kDa replicase基因为靶基因，分析靶基因序列特点后，应用Primer Premier5.0软件设计种属特异性扩增引物。引物设计遵循以下原则。
①扩增引物长度约20～30bp，不同引物的退火温度尽可能一致或相似；②扩增产物长度约200～500bp，具物种特异性。
使用美国国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST功能对引物扩增区段序列进行比对，完成引物扩增特异性的初步鉴定。通过鉴定的引物交由通用生物系统(安徽)有限公司合成，纯度级别为HPLC。引物具体序列如表1所示。
表1TOBRFV和烟草花叶病毒属病毒RT-RAA基础款扩增用引物
使用RT RAA核酸扩增试剂盒(基础款JY0203)，以健康辣椒植物总RNA或感染ToBRFV、烟草花叶病毒属病毒的辣椒植株叶片样品裂解液作为模板，分别进行组1-～2、组5-～8的正向引物和反向引物的RT-RAA扩增，扩增体系(单个样品/反应)如下：
| 成分 | 体积(μL) |
| 植物样品裂解液或总RNA溶液 | 2 |
| 基础缓冲液 | 29.4 |
| 正向引物(10μM) | 2.1 |
| 反向引物(10μM) | 2.1 |
| ddH2O | 至总体系为47.5 |
反应液配制完成后，在每个0.2mL的eppendorf管加入2.5μL 280mM的MgAc2，充分混匀；将0.2mL的eppendorf管放入带有热盖功能的PCR仪上，39℃，保温30min。
RT-RAA反应结束后，将反应管取出。每个反应管中加入100μL酚/氯仿(1:1)，充分振荡均匀，12000rpm离心10min(该步骤可使用涡旋振荡器剧烈振荡混匀)。取10μL上清液与2μL 6×Loading Buffer混合，上样于1.5％琼脂糖凝胶，200V电泳15min；待溴酚蓝移至凝胶下2/3处时结束电泳；EB染色5min，紫外灯下观察及拍照。
如图1所示，添加2μL植物总RNA溶液或样品裂解液的前提下，使用ToBRFV扩增引物组1(ToBRFV-F和ToBRFV-R)和ToBRFV扩增引物组2(ToBRFV-F2和ToBRFV-R2)分别在不同病毒侵染植物的总RNA中进行RT-RAA扩增，其中ToBRFV扩增引物组1和ToBRFV扩增引物组2在含有ToBRFV病毒材料的植物总RNA中的扩增产物电泳条带清晰、明亮，无杂带，扩增条带大小与预期一致，而其他病毒侵染植物中没有明显的扩增产物；ToBRFV扩增引物组3(ToBRFV-F3和ToBRFV-R3)、ToBRFV扩增引物组4(ToBRFV-F4和ToBRFV-R4)在含有ToBRFV病毒材料的植物总RNA中的扩增产物电泳条带呈ladder样，且其他病毒侵染植物总RNA中也可以获得明显的扩增产物，不能作为ToBRFV检测的专用引物。引物组1在带有番茄褐色皱纹果病毒ToBRFV的RNA样品中扩增产物经克隆、测序和序列比对后，显示为目的序列。
使用引物组5～引物组8进行烟草花叶病毒属183kDa replicase基因的扩增，其中扩增引物组5在带有烟草花叶病毒属病毒番茄褐色皱纹果病毒ToBRFV，烟草花叶病毒TMV，番茄斑驳花叶病毒ToMMV，辣椒轻斑驳病毒PMMoV和烟草轻型绿花叶病毒TMGMV的植物总RNA中的扩增产物电泳条带清晰、明亮，无杂带，扩增条带大小与预期一致；而在带有蚕豆病毒属的蚕豆萎蔫病毒2BBWV2，马铃薯卷叶病毒属的辣椒脉黄病毒PeVYV，马铃薯Y病毒属的辣椒叶脉斑驳病毒ChiVMV的植物总RNA中均未产生扩增产物条带。而引物组6、7、8均不能达到引物组5的扩增效果，确定引物组5(TVes-F和TVes-R)可用于检测烟草花叶病毒属病毒。引物组5在带有番茄褐色皱纹果病毒ToBRFV，烟草花叶病毒TMV，番茄斑驳花叶病毒ToMMV，辣椒轻斑驳病毒PMMoV和烟草轻型绿花叶病毒TMGMV的RNA样品中扩增产物经克隆、测序和序列比对后，显示均为目的序列(图3)。
实验例2：ToBRFV与烟草花叶病毒属病毒检验样品比对盘制备和组成
ToBRFV扩增引物组1(ToBRFV-F和ToBRFV-R)、ToBRFV扩增引物组2(ToBRFV-F2和ToBRFV-R2)CP基因扩增产物和番茄褐色皱纹果病毒ToBRFV，烟草花叶病毒TMV，番茄斑驳花叶病毒ToMMV，辣椒轻斑驳病毒PMMoV和烟草轻型绿花叶病毒TMGMV产物烟草花叶病毒属病毒183kDa replicase扩增引物组5(TVes-F和TVes-R)的扩增产物在克隆、测序正确的质粒，分别转化摇菌过夜后进行质粒抽提，以紫外分光光度计测量重组质粒OD260、OD280及OD260/OD280值，并重复3次，确定质粒DNA浓度和纯度。
按照下面的公式获得质粒的拷贝数：
拷贝数＝质粒浓度×6.02×1023/(660×质粒总长度)
计算拷贝数并稀释至1×108拷贝/μL，–20℃保存备用。将已定值的重组质粒稀释至1×106拷贝/μL，再10倍系列稀释，获得1×100拷贝/μL、1×101拷贝/μL、1×102拷贝/μL、1×103拷贝/μL、1×104拷贝/μL、1×105拷贝/μL和1×106拷贝/μL质粒稀释液为后续扩增模板。
实验例3：用于ToBRFV、烟草花叶病毒属病毒检测的引物灵敏度的检测
为了进一步检测ToBRFV扩增引物组1(ToBRFV-F和ToBRFV-R)、ToBRFV扩增引物组2(ToBRFV-F2和ToBRFV-R2)，和烟草花叶病毒属病毒扩增引物组5(TVes-F和TVes-R)的灵敏性，将各自对应扩增产物质粒DNA的10倍系列稀释液(每微升106、105、104、103、102、101、100拷贝)用作RT-RAA的模板，使用ddH2O用作阴性对照模板。通过1.5％琼脂糖凝胶电泳比较同一模板分别进行不同引物RT-RAA的扩增情况。
ToBRFV扩增引物组RT-RAA扩增灵敏度实验结果如图4所示，从实验结果可以看出，引物组1(ToBRFV-F和ToBRFV-R)RT-RAA扩增可检出低至101个拷贝的ToBRFV CP基因质粒；引物组2(ToBRFV-F2和ToBRFV-R2)RT-RAA扩增可检出103个拷贝的ToBRFV CP基因基因质粒。
烟草花叶病毒属病毒扩增引物组5RT-RAA扩增灵敏度实验结果如图5所示，从实验结果可以看出，引物组5(Ves-F和TVes-R)在ToBRFV与TMGMV的比对盘中RT-RAA扩增可检出低至101个拷贝的烟草花叶病毒属病毒replicase基因质粒，在TMV、TMMoV与PMMoV比对盘中可检出低至102个拷贝的烟草花叶病毒属病毒replicase基因质粒。
实验例4：ToBRFV、烟草花叶病毒属病毒RT-RAA-LFS检测
针对实施例1中的引物组1～8扩增区段，应用Primer Premier 5.0软件设计种属特异性的探针序列，探针序列位于扩增引物中间区段，经四氢呋喃修饰。引物设计遵循原则为：探针长度约为30～45bp；②探针序列具有物种特异性。
使用美国国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST功能对引物扩增区段序列进行比对，完成引物扩增特异性的初步鉴定。通过鉴定的引物交由通用生物系统(安徽)有限公司合成，纯度级别为HPLC。引物具体序列、探针及扩增下游引物标记情况如下表2所示。
表2TOBRFV和烟草花叶病毒属病毒RT-RAA试纸条款扩增用引物
以各引物组上、下游引物对应扩增产物1×106拷贝/μL重组质粒溶液为模板，使用RT RAA核酸扩增试剂盒(试纸条法)(JY0204)进行引物组A～引物组H的RAA反应体系的配制(单个样品/反应)，体系如下：
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加样顺序为阴性质控样本(1×106拷贝/μL重组质粒溶液替换为同体积的超纯水)、1×106拷贝/μL重组质粒溶液，每个样本添加完毕后均需立即扣好管盖，避免气溶胶污染。将上述反应体系混匀，加入基础反应单元。使冻干粉充分溶解，注意，该步骤不能使用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。打开反应单元，在每个0.2mL的eppendorf管加入2.5μL 280mM的MgAc2，充分混匀并离心收集。注意，该步骤不能用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。
将反应管放置在39℃条件下反应16min。RAA反应结束后，打开eppendorf管，吸取扩增产物至一新的eppendorf管中，做好标记，并稀释20～50倍。
将单靶标一次性核酸检测试纸条(JY0201)结构示意图如图6所示，将试纸条的浸液区端(标示蓝色箭头向上)插入eppendorf管，液面不得超过浸液区的MAX指示线，待判读区全部浸润(约需30～60sec)，将试纸平放1min，等待红色条带出现。根据试纸条显色情况直接读取检测结果。10min内观察结果，10min后判读无效。
如图7所示，使用ToBRFV引物组B(ToBRFV-F+ToBRFV-P2+ToBRFV-R)和D(ToBRFV-F2+ToBRFV-P4+ToBRFV-R2)进行扩增时，阴性对照的RTRAA扩增产物稀释20倍后试纸条检测结果为阳性，不可用于后续RTRAA核酸扩增试纸条灵敏度检测；使用引物组A(ToBRFV-F+ToBRFV-P+ToBRFV-R)、引物组C(ToBRFV-F2+ToBRFV-P3+ToBRFV-R2)进行扩增时，阴性对照的RT RAA扩增产物稀释20倍后试纸条检测结果为阴性，1×106拷贝/μL重组质粒溶液RTRAA检测结果为阳性，可用于后续RT RAA核酸扩增试纸条灵敏度检测。
如图8所示，烟草花叶病毒属病毒引物组F阴性对照RT RAA扩增产物稀释20倍后的试纸条检测结果为强阳性，引物组G、引物组H阴性对照RT RAA扩增产物稀释20倍后的试纸条检测结果为弱阳性，均不可用于后续RTRAA核酸扩增试纸条灵敏度检测；引物组合E在阴性对照RT RAA扩增产物稀释20倍后的试纸条检测结果为阴性，1×106拷贝/μL重组质粒溶液RTRAA检测结果为阳性，可用于后续RTRAA核酸扩增试纸条灵敏度检测。
实验例5：ToBRFV、烟草花叶病毒属病毒不同引物组RT-RAA-LFS检测灵敏度的对比
以ToBRFV引物组A(ToBRFV-F+ToBRFV-P+ToBRFV-R)、引物组C(ToBRFV-F2+ToBRFV-P3+ToBRFV-R2)不同扩增引物组对相应扩增片段对应质粒为模板，使用实验例4中的RTRAA扩增体系，完成不同引物组合1×106拷贝/μL、1×105拷贝/μL、1×104拷贝/μL、1×103拷贝/μL、1×102拷贝/μL、1×101拷贝/μL和1×100拷贝/μL质粒稀释液的RT RAA扩增，扩增产物经20倍稀释后进行试纸条检测，确定不同引物组合的检测灵敏度。
ToBRFV引物组A(ToBRFV-F+ToBRFV-P+ToBRFV-R)和引物组C(ToBRFV-F2+ToBRFV-P3+ToBRFV-R2)的RT RAA-LFS灵敏度检测结果如图9所示，ToBRFV引物组ARTRAA-LFS的最低检测阈值为103个拷贝。ToBRFV引物组C RTRAA-LFS的最低检测阈值为104个拷贝。
烟草花叶病毒属病毒引物组E(TVes-F+TVes-P+TVes-R)的RT RAA-LFS灵敏度检测结果如图10所示，ToBRFV引物组E RTRAA-LFS的最低可检测出101个拷贝的ToBRFV，102个拷贝的TMV，101个拷贝的TMMoV，102个拷贝的PMMoV和102个拷贝的TMGMV，但最低检测限显色较浅。
实施例6：利用ToBRFV引物组A优化RT-RAALFS检测体系
实验中使用的探针具有以下特点：①设计方向为正向，即与上游引物为同一方向；②长度在46～52nt；③3′端经磷酸化修饰，以抑制DNA链延伸；④序列内部添加了切割位点，在探针与模板DNA结合时被exo酶切割，并起始DNA链的延伸；⑥5′端经生物素修饰，探针与下游(经FITC修饰的)引物的双链扩增产物可被核酸试纸条检测到。
试纸条检测产物为经exo酶切割后的探针和下游引物(经FITC修饰的)的双链扩增产物，因此理论上增加下游引物的添加量有助于提高RAA核酸试纸条检测的灵敏度。但下游引物添加过量时，也会导致下游引物与探针引物二聚体的形成几率，并导致检测结果的假阳性。
使用RT RAA核酸扩增试剂盒(试纸条法)(JY0204)进行RAA反应体系的配制(单个样品/反应)，下游引物添加量的调整如表3。每组体系均对102拷贝/μL样品盘、101拷贝/μL样品盘、100拷贝/μL样品盘，阴性质控样本进行测试。样本添加完毕后均需立即扣好管盖，避免气溶胶污染。将上述反应体系混匀，加入基础反应单元。使冻干粉充分溶解，注意，该步骤不能使用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。打开反应单元，在每个0.2mL的eppendorf管加入2.5μL280mM的MgAc2，充分混匀并离心收集。注意，该步骤不能用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。
将反应管放置在39℃条件下反应16min。RAA反应结束后，打开eppendorf管，吸取扩增产物至一新的eppendorf管中，做好标记，并稀释20倍，进行试纸条检测，确定最适添加量。
表3TOBRFV扩增引物组ART-RAA扩增体系下游引物添加量的调整
结果图11显示，以102拷贝/μL样品盘、101拷贝/μL样品盘、100拷贝/μL样品盘，阴性质控样本为模板，模板添加体积相同的条件下，调整下游引物的添加量，当50μL扩增体系下游引物(10μM)添加量调整为3μL时，检测灵敏度表现最佳，不仅可以检测到101拷贝/μL的样品，同时阴性质控样本为阴性。
扩增体系中添加MgAc2可启动RAA扩增，且扩增体系中MgAc2的添加量直接影响扩增的效率和产物得率。理论上，增加MgAc2的添加量有助于提高扩增产物得率，并增加RAA核酸试纸条检测的灵敏度。但MgAc2添加过量时，也会导致阴性样本检测结果的假阳性。
使用RT RAA核酸扩增试剂盒(试纸条法)(JY0204)进行RAA反应体系的配制(单个样品/反应)，MgAc2添加量的调整体系如下。
表4TOBRFV扩增引物组A和C RT-RAA扩增体系MgAc2添加量的调整
每组体系均对102拷贝/μL样品盘、101拷贝/μL样品盘、100拷贝/μL样品盘，阴性质控样本进行测试。样本添加完毕后均需立即扣好管盖，避免气溶胶污染。将上述反应体系混匀，加入基础反应单元。使冻干粉充分溶解，注意，该步骤不能使用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。打开反应单元，在每个0.2mL的eppendorf管加入表3中不同体积的280mM的MgAc2，充分混匀并离心收集。注意，该步骤不能用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。
将反应管放置在39℃条件下反应16min。RAA反应结束后，打开eppendorf管，吸取扩增产物至一新的eppendorf管中，做好标记，并稀释20倍，进行试纸条检测，确定最适添加量。
实验结果图12所示，以102拷贝/μL样品盘、101拷贝/μL样品盘、100拷贝/μL样品盘，阴性质控样本为模板，模板添加体积相同的条件下，调整MgAc2的添加量，当MgAc2调整为2.5μL与2.8μL时，检测灵敏度表现相同，不仅可以检测到101拷贝/μL的样品，同时阴性质控样本为阴性。根据表3中调整体系2、调整体系3中的结果可知，MgAc2添加过量会导致阴性质控样本出现假阳性。鉴于每50μL扩增体系MgAc2添加量为2.5μL与2.8μL检测灵敏度表现相同，最终确定MgAc2的最适添加量为2.5μL，以避免阴性样本出现假阳性。
实施例7：烟草花叶病毒属病毒引物组RT RAA-LFS检测灵敏度
使用实施例6所述的RT RAA核酸扩增试剂盒(试纸条法)(JY0204)扩增体系和试纸条检测方式进行烟草花叶病毒属病毒引物组合E的RT RAA反应体系的配制，完成不同引物组合1×102拷贝/μL、1×101拷贝/μL和1×100拷贝/μL质粒稀释液的RT RAA扩增，扩增产物经20倍稀释后进行试纸条检测。
烟草花叶病毒属病毒引物组E(TVes-F+TVes-P+TVes-R)的RT RAA-LFS灵敏度检测结果如图10所示，ToBRFV引物组E RTRAA-LFS的最低可检测出101个拷贝的ToBRFV，102个拷贝的TMV，101个拷贝的TMMoV，102个拷贝的PMMoV和101个拷贝的TMGMV(图13)。
结合实施例6和实施例7的结果，最终确定ToBRFV引物组A和烟草花叶病毒属病毒引物组E可用于引物特异性检测及后续的双重RT RAA-LFS检测。
实施例8：用于ToBRFV、烟草花叶病毒属病毒检测引物的特异性评价
本实施例以经RT-PCR验证，分别被烟草花叶病毒属病毒ToBRFV、TMV、ToMMV、PMMoV和TMGMV，及蚕豆病毒属的BBWV2，马铃薯卷叶病毒属的PeVYV，马铃薯Y病毒属的ChiVMV侵染植物作为实验对象，提取植物总RNA作为扩增模板，并以健康的辣椒植株叶片作阴性对照。使用实施例4所筛选出的引物ToBRFV引物组A，和实施例7烟草花叶病毒属病毒引物组E，使用实施例6所述的RT RAA核酸扩增试剂盒(试纸条法)(JY0204)扩增体系和试纸条检测方式进行RAA反应体系的配制，分别对带有上述病毒的总RNA进行RT-RAA扩增，完成不同病毒植物总RNA的RT-RAA扩增，扩增产物经20倍稀释后进行试纸条检测，确定不同引物组合检测的特异性。
ToBRFV引物组A、烟草花叶病毒属病毒引物组E RT RAA-LFS引物特异性评价结果如图14所示，可以看出，ToBRFV引物组A扩增产物的LFS检测结果均仅在ToBRFV感染植物的总RNA中显示阳性，未发现与其他病毒发生交叉反应，表明该引物对特异性很好，适于进行ToBRFV的RT RAA-LFS检测；烟草花叶病毒属病毒引物组E RT RAA-LFS检测结果在所检测的致病烟草花叶病毒属病毒中感染植物的总RNA中均显示阳性，表明该引物适于进行多种致病烟草花叶病毒属病毒的RT RAA-LFS检测。
实验例9：ToBRFV、烟草花叶病毒属病毒不同引物组双重RT-RAA-LFS检测体系的建立
实验例9使用的引物交由通用生物系统(安徽)有限公司合成，纯度级别为HPLC。引物具体序列、探针及扩增下游引物标记情况如下表所示：
将实施例9中的ToBRFV引物组A、烟草花叶病毒属病毒引物组E配置为mix，以利于RT RAA双重扩增系内的引物添加量优化，引物mix各组分如下：
以各引物组上、下游引物扩增产物的1×106拷贝/μL的质粒稀释液为模板，使用RT RAA核酸扩增试剂盒(试纸条法)(JY0204)进行ToBRFV和烟草花叶病毒属病毒双重RT RAA反应体系的配制(单个样品/反应)，体系如下：/>
经RT-PCR鉴定为ToBRFV、烟草花叶病毒属病毒阳性的植物叶片样本，取100μL的酷闪核酸释放剂(BT0068)，以枪头碾压待检材料数次，离心，取上清液待检。分别进行RT-RAA扩增，同时设置阴性质控样本(1×106拷贝/μL重组质粒溶液替换为同体积的超纯水)，加样顺序为阴性质控样本、1×106拷贝/μLT oBRFV、烟草花叶病毒属病毒混合质粒溶液，每个样本添加完毕后均需立即扣好管盖，避免气溶胶污染。将上述反应体系混匀，加入基础反应单元。使冻干粉充分溶解，注意，该步骤不能使用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。打开反应单元，在每个0.2mL的eppendorf管加入2.5μL 280mM的MgAc2，充分混匀并离心收集。注意，该步骤不能用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。
将反应管放置在39℃条件下反应16min。RAA反应结束后，打开eppendorf管，吸取扩增产物至一新的eppendorf管中，做好标记，并稀释20～50倍。
将双靶标一次性核酸检测试纸条(JY0209)结构示意图如图15所示，将试纸条的浸液区端(标示蓝色箭头向上)插入eppendorf管，液面不得超过浸液区的MAX指示线，待判读区全部浸润(约需30～60sec)，将试纸平放1min，等待红色条带出现。根据试纸条显色情况直接读取检测结果。10min内观察结果，10min后判读无效。
质粒及阴性对照双重RT RAA-LFS检测情况结果如图16所示，其中引物组A和引物组E2阴性对照扩增产物稀释20倍后的试纸条检测结果均为阴性，质粒扩增产物稀释20倍后的试纸条检测结果均为阳性，可用于后续双重RT RAA-LFS对叶片裂解液的检测。根据阳性质粒扩增产物的显色强弱，确定双重引物组Mix1的添加比例为最佳反应体系，并完成后续的实验。
实验例10：ToBRFV引物组A与烟草花叶病毒属病毒引物组E绝对定量标准曲线绘制
从qPCR融解曲线分析结果可以看出，ToBRFV引物组A(ToBRFV-F和ToBRFV-R)(图17)、烟草花叶病毒属病毒引物组E(TVes-F和TVes-R)以ToBRFV(图18a)、TMV(图18b)、TMMoV(图18c)、PMMoV(图18d)和TMGMV(图18e)对应质粒的扩增产物qPCR熔解曲线分析均为尖锐单峰，说明本实施例筛选的ToBRFV引物组A(ToBRFV-F和ToBRFV-R)和烟草花叶病毒属病毒引物组E(TVes-F和TVes-R)扩增特异性均较高。
ToBRFV引物组A(ToBRFV-F和ToBRFV-R，图19)可以成功检测101～106拷贝的初始模板，跨越6个对数值的动态检测范围，每个模板浓度梯度之间的Ct相差相似。烟草花叶病毒属病毒引物组E(TVes-F和TVes-R，图20a～20e)可以成功检测ToBRFV(图20a)、TMV(图20b)、TMMoV(图20c)、PMMoV(图20d)和TMGMV(图20e)对应质粒的101～106拷贝的初始模板，跨越6个对数值的动态检测范围，每个模板浓度梯度之间的Ct相差相似。
ToBRFV引物组A(ToBRFV-F和ToBRFV-R)Ct值和对数转换后的拷贝数(y＝-6.2146x+48.206，R2>0.9889)，烟草花叶病毒属病毒引物组E(TVes-F和TVes-R)Ct值和对数转换后的拷贝数在ToBRFV(y＝-3.6873x+33.244，R2＝0.9973)，TMV(y＝-4.053x+38.109，R2＝0.9975)，ToMMV(y＝-3.324x+34.712，R2＝0.9913)，PMMoV(y＝-4.4399x+40.522，R2＝0.9993)和TMGMV(y＝-3.951x+36.512，R2＝0.9982)中均具有良好的线性关系，说明本实施例所设计的引物具有较好的扩增特异性和较高的扩增效率，可以同时用于ToBRFV和烟草花叶病毒属病毒RT-PCR和RT-RAA分析。
实验例11:ToBRFV、烟草花叶病毒属病毒双重RT RAA-LFS灵敏度检测
以ToBRFV引物组A、烟草花叶病毒属病毒引物组E2引物组对相应扩增片段对应质粒为模板，使用实验例9中的RTRAA扩增体系，完成1×103拷贝/μL、1×102拷贝/μL、1×101拷贝/μLToBRFV、烟草花叶病毒属病毒混合质粒稀释液的RT RAA扩增，扩增产物经20倍稀释后进行试纸条检测，确定引物组合的检测灵敏度。
ToBRFV引物组A、烟草花叶病毒属病毒引物组E2的RT RAA-LFS灵敏度检测结果如图21所示，ToBRFV引物组ARTRAA-LFS的检测灵敏度为102个拷贝/反应，烟草花叶病毒属病毒引物组E2的检测灵敏度未达到103个拷贝/反应(图21)。
实验例12:ToBRFV、烟草花叶病毒属病毒双重RT-RAA-LFS检测体系的优化
将ToBRFV引物组A、烟草花叶病毒属病毒引物组E2预混为Mix，以便于调整RT RAA双重扩增系内的引物添加量，不同引物Mix种各引物添加量如下所示：
使用RT RAA核酸扩增试剂盒(试纸条法)(JY0204)进行ToBRFV和烟草花叶病毒属病毒双重RT RAA反应体系的配制(单个样品/反应)，体系如下：
加样顺序为阴性质控样本(植物叶片裂解液上清液替换为同体积的超纯水)、1×103拷贝/μL引物对A和引物对E2 ToBRFV扩增产物对应质粒，每个样本添加完毕后均需立即扣好管盖，避免气溶胶污染。将上述反应体系混匀，加入基础反应单元。使冻干粉充分溶解，注意，该步骤不能使用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。打开反应单元，在每个0.2mL的eppendorf管加入2.5μL280mM的MgAc2，充分混匀并离心收集。注意，该步骤不能用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。
将反应管放置在39℃条件下反应16min。RTRAA反应结束后，打开eppendorf管，吸取扩增产物至一新的eppendorf管中，做好标记，并稀释20～50倍。
如图22所示，检测结果显示，引物组A与引物组E2的RAA扩增引物不同添加量组合中，阴性对照及1×103拷贝/μL阳性质粒扩增产物稀释20倍后的试纸条检测结果正确显色的仅有引物组合优化3和优化4，其烟草花叶病毒属病毒(检测线T1)和ToBRFV(检测线T2)1×103拷贝/μL的混合质粒扩增产物的检测结果均为阳性。根据显色结果，确定扩增产物显色效果更佳的优化4添加量为双重RTRAA-LFS的引物组的添加量。
使用ToBRFV引物组A、烟草花叶病毒属病毒引物组E2引物组对相应扩增片段对应质粒为模板，使用引物添加量方案优化4，添加浓度为1×103拷贝/μL、1×102拷贝/μL、1×101拷贝/μL的质粒作为模板，完成ToBRFV、烟草花叶病毒属病毒混合质粒稀释液的双重RTRAA扩增，扩增产物经20倍稀释后进行试纸条检测，确定引物组合的检测灵敏度。
ToBRFV引物组A、烟草花叶病毒属病毒引物组E2的RT RAA-LFS灵敏度检测结果如图23所示，ToBRFV引物组A、烟草花叶病毒属病毒引物组E2双重RT RAA-LFS的检测灵敏度均可达到101个拷贝。
实验例13：ToBRFV、烟草花叶病毒属病毒引物组添加裂解液双重RT RAA-LFS检测体系的建立
经RT-qPCR鉴定为ToBRFV阳性(约3.2×103个病毒拷贝/mg叶片)、烟草花叶病毒属病毒TMV阳性(约3.8×106个病毒拷贝/mg叶片)、TMMoV阳性(约5.4×105个病毒拷贝/mg叶片)、PMMoV阳性(约7.1×106个病毒拷贝/mg叶片)和TMGMV阳性(约1.3×105个病毒拷贝/mg叶片)的植物叶片样本，取20mg植物叶片样品和100μL的酷闪核酸释放剂(BT0068)，以枪头碾压待检材料数次，离心，取2μL叶片裂解液上清液待检。
使用实验例12中优化好的双重RT RAA扩增体系扩增，以植物叶片裂解液上清液为模板，使用RT RAA核酸扩增试剂盒(试纸条法)(JY0204)进行ToBRFV和烟草花叶病毒属病毒双重RT RAA反应体系的配制(单个样品/反应)，体系如下：
| 组分 | 用量(μL) |
| 基础缓冲液 | 29.4 |
| ToBRFV-F(5μM) | 1.6 |
| ToBRFV-R(5μM) | 2.4 |
| ToBRFV-P(1μM) | 2.1 |
| TVes-F(5μM) | 1.92 |
| TVes-R(5μM) | 2.88 |
| TVes-P(1μM) | 5.2 |
| 植物叶片裂解液上清液 | 2 |
| 以水补足体积至 | 47.5 |
每个材料均进行ToBRFV、ToBRFV+同属另一病毒、同属另一病毒、阴性对照的扩增和LFS检测，加样顺序为阴性质控样本(植物叶片裂解液上清液替换为同体积的超纯水)、植物叶片裂解液上清液，每个样本添加完毕后均需立即扣好管盖，避免气溶胶污染。将上述反应体系混匀，加入基础反应单元。使冻干粉充分溶解，注意，该步骤不能使用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。打开反应单元，在每个0.2mL的eppendorf管加入2.5μL280mM的MgAc2，充分混匀并离心收集。注意，该步骤不能用涡旋振荡器剧烈振荡混匀。
将反应管放置在39℃条件下反应16min。RAA反应结束后，打开eppendorf管，吸取扩增产物至一新的eppendorf管中，做好标记，并稀释20～50倍。
如图24所示，感染ToBRFV、TMV、TMMoV、PMMoV和TMGMV的烟草叶片经裂解后，取上清液按照实施例12确定的最佳反应体系，进行裂解液上清液的混合或单一扩增，均可正确扩增并显色。
实验例14：辣椒植株ToBRFV、烟草花叶病毒属病毒双重RT RAA-LFS田间快速检测
使用实验例11中的双重RTRAA扩增体系扩增。在田间随机取样进行辣椒植株的田间检测，取每份样品选取40mg，其中的20mg样品提取总RNA，进行RT qPCR分析，测定Ct值，并计算样品拷贝数；另外20mg样品按照酷闪核酸释放剂提供的方法完成辣椒的叶片及种子样品的裂解，进行RT-RAA扩增反应，体系如下：
| 成分 | 体积(μL) |
| 植物样品裂解液或总RNA溶液 | 2 |
| 基础缓冲液 | 29.4 |
| ToBRFV-F(5μM) | 1.6 |
| ToBRFV-R(5μM) | 2.4 |
| ToBRFV-P(1μM) | 2.1 |
| TVes-F(5μM) | 1.92 |
| TVes-R(5μM) | 2.88 |
| TVes-P(1μM) | 5.2 |
| ddH2O | 至总体系为47.5 |
所述RAA扩增的反应条件设置如下：反应液配制完成后，在每个0.2mL的eppendorf管加入2.5μL 280mM的MgAc2，充分混匀；将0.2mL的eppendorf管放入带有热盖功能的PCR仪上，39℃，保温16min。RTRAA反应结束后，打开eppendorf管，吸取扩增产物至一新的eppendorf管中，做好标记，并稀释20倍。
4个样品的不同取材位置RT qPCR结果如下表所示：
各样品的RT RAA-LFS检测结果如图25所示，显示该体系可借助样品的快速裂解，实现同一样品同时进行ToBRFV、烟草花叶病毒属病毒的田间快速检测。
综上所述，本申请通过一系列验证筛选出了能够同时检测ToBRFV和烟草花叶病毒属病毒的引物组，该引物组可以有效扩增靶基因，具有较高的特异性和灵敏性，与其他病毒无交叉反应，可用于植物ToBRFV和烟草花叶病毒属病毒的现场快速检测，对于有效防治这些病害具有重要意义。
在缺少本文中所具体公开的任何元件、限制的情况下，可以实现本文所示和所述的发明。所采用的术语和表达法被用作说明的术语而非限制，并且不希望在这些术语和表达法的使用中排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物，而且应该认识到各种改型在本发明的范围内都是可行的。因此应该理解，尽管通过各种实施例和可选的特征具体公开了本发明，但是本文所述的概念的修改和变型可以被本领域普通技术人员所采用，并且认为这些修改和变型落入所附权利要求书限定的本发明的范围之内。
本文中所述或记载的文章、专利、专利申请以及所有其他文献和以电子方式可得的信息的内容在某种程度上全文包括在此以作参考，就如同每个单独的出版物被具体和单独指出以作参考一样。申请人保留把来自任何这种文章、专利、专利申请或其他文献的任何及所有材料和信息结合入本申请中的权利。
Claims (10)
1.一种检测番茄褐色皱纹果病毒（ToBRFV）和烟草花叶病毒属病毒tobamoviruses的RT-RAA检测引物组，其特征在于，所述引物组包括番茄褐色皱纹果病毒检测引物、烟草花叶病毒属病毒检测引物、番茄褐色皱纹果病毒检测探针ToBRFV-P和烟草花叶病毒属病毒检测检测探针TVes-P；其中，
所述番茄褐色皱纹果病毒检测引物包括正向引物ToBRFV-F和反向引物ToBRFV-R，
正向引物ToBRFV-F的序列为5´- AACCAGACAAAAACCAAAGGAAG -3´，
反向引物ToBRFV-R的序列为5´- AAGCAGTAACTAGAGGATCTA -3´；
所述烟草花叶病毒属病毒检测引物包括正向引物TVes-F和反向引物TVes-R，
正向引物TVes-F的序列为: 5´-ACAACTACAATGGCATACACACA-3´，
反向引物TVes-R的序列为:5´-GCAAAATTCCCACCTATATCATATGT-3´。
2.如权利要求1所述的引物组，其特在于，所述番茄褐色皱纹果病毒检测探针ToBRFV-P，其序列为5´-TCACTAGGTAATCAGTTCCAAACACAACAAG(THF)TAGAACAACCGTTCA-3´；所述烟草花叶病毒属病毒检测检测探针TVes-P，其序列为
5´-TAYCCDGARTTCCARATHACSTTYTAYAAY（THF）CKCARAAYGCYGTRC -3´；
所述ToBRFV的反向引物ToBRFV-R的5´端修饰有FITC，所述检测探针ToBRFV-P的5´端修饰有生物素，ToBRFV-P的3´端磷酸化修饰，THF为四氢呋喃；所述烟草花叶病毒属病毒反向引物TVes-R的5´端修饰有地高辛，所述探针引物TVes-P的5´端修饰有罗丹明，TVes-P的3´端有磷酸化修饰，THF为四氢呋喃。
3.一种检测番茄褐色皱纹果病毒（ToBRFV）和烟草花叶病毒属病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物组。
4.如权利要求1或2所述的引物组在用于检测待测生物样本中ToBRFV和/或烟草花叶病毒属病毒，或用于制备检测待测生物样本中是否含有ToBRFV和/或烟草花叶病毒属病毒的试剂盒中的应用。
5.如权利要求3所述的试剂盒在用于检测待测生物样本中是否/含有ToBRFV和/或烟草花叶病毒属病毒中的应用。
6.一种利用试剂盒检测ToBRFV和/或烟草花叶病毒属病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取待测生物样本的总RNA，或对植物样本进行裂解处理；
2）以步骤1）提取的总RNA或植物裂解液为模板，采用权利要求1或2所述的引物组中的正向引物和反向引物进行RT-RAA扩增，获得扩增产物；
3）检测扩增产物，基于扩增产物的检测结果判断是否含有ToBRFV和/或烟草花叶病毒属病毒。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，若扩增产物中含有362bp的DNA片段，则待测生物样本中含有ToBRFV，若扩增产物中不含有362bp的DNA片段，则待测生物样本中不含有ToBRFV；若扩增产物中含有347bp的DNA片段，则待测生物样本中含有烟草花叶病毒属病毒，若扩增产物中不含有347bp的DNA片段，则待测生物样本中不含有烟草花叶病毒属病毒。
8.一种检测待测生物样本中是否含有ToBRFV和/或烟草花叶病毒属病毒的方法，其特征在于，包括：
检测待测生物样本的裂解液或总RNA扩增产物中是否含有特异DNA片段，若含有特异DNA片段，则待测生物样本含有ToBRFV和/或烟草花叶病毒属病毒，若不含有特异DNA片段，则待测生物样本不含有ToBRFV和/或烟草花叶病毒属病毒；其中，所述特异DNA片段为权利要求1或2所述的正向引物和反向引物的靶序列。
9.一种基于RT-RAA-侧流层析技术检测ToBRFV或/和烟草花叶病毒属病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）对样本进行裂解处理，或提取待测生物样本的总RNA；
2）以步骤1）获得的样本裂解液或提取的总RNA为模板，采用权利要求1或2所述的引物组进行RT-RAA扩增；
3）应用侧流层析试纸条进行扩增产物的检测，若试纸条只在质控区出现一条条带，检测区没有条带，则结果为阴性，表明样本中不含有ToBRFV和其他烟草花叶病毒属病毒；若试纸条出现两条条带，一条位于质控区，一条位于检测线T1，则结果为阳性，检测线T1阳性表明样本中含有非ToBRFV的烟草花叶病毒属病毒；若试纸条出现三条条带，一条位于质控区，一条位于检测区T1，一条位于检测区T2，则结果为阳性，表明样本中含有ToBRFV，以及含有包括ToBRFV在内的烟草花叶病毒属病毒；若试纸条质控线不显色，则检测无效，需要更换试纸条重新检测。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，若试纸条出现两条条带，一条位于质控区，一条位于检测区T1，则结果为阳性，表明样本中含有非ToBRFV的烟草花叶病毒属病毒；若试纸条出现三条条带，一条位于质控区，一条位于检测区T1，一条位于检测区T2，则结果为阳性，表明样本中含有ToBRFV，以及含有包括ToBRFV在内的烟草花叶病毒属病毒。
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