CN117165444A - 一种珊瑚共附生曲霉及其胞外多糖、制备方法和应用 - Google Patents

一种珊瑚共附生曲霉及其胞外多糖、制备方法和应用 Download PDF

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CN117165444A CN202310920357.0A CN202310920357A CN117165444A CN 117165444 A CN117165444 A CN 117165444A CN 202310920357 A CN202310920357 A CN 202310920357A CN 117165444 A CN117165444 A CN 117165444A
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黄日明
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Abstract

本发明公开了一种珊瑚共附生曲霉及其胞外多糖、制备方法和应用。本发明从柳珊瑚样品中分离得到珊瑚共附生曲霉(Aspergillus sp.)SCAU265菌株，发酵后得到胞外多糖，分离纯化后得到平均分子量为36.07kDa的胞外多糖ASP‑1，为结构新颖的多糖，其对RAW264.7巨噬细胞具有免疫调节作用，促进RAW264.7巨噬细胞的增殖，细胞活力高，无细胞毒性，剂量依赖性地促进RAW264.7巨噬细胞分泌NO、TNF‑α和IL‑6，对巨噬细胞RAW 264.7具有较强的免疫刺激作用，对免疫应答产生显著影响。

Description

一种珊瑚共附生曲霉及其胞外多糖、制备方法和应用
技术领域
本发明涉及海洋多糖技术领域，具体地，涉及一种珊瑚共附生曲霉及其胞外多糖、制备方法和应用。
背景技术
真菌作为海洋微生物的重要成员，在活性天然产物的研究中发挥着重要作用。与陆生真菌相比，海洋真菌的种类更为丰富。由于环境复杂，它们的代谢产物结构新颖，活性多样。海洋真菌来源广泛，可以从海洋动物、植物、沉积物和海水中获得。
曲霉(Aspergillus)是最常见且具有重要应用价值的丝状真菌，在自然界的空气、土壤、水以及作物上都可以发现其存在，目前已广泛地应用在传统酿造业、生物工程研究和现代发酵等。曲霉是广泛分布在海洋环境中的真菌属。常见的种类包括烟曲霉、黑曲霉、杂色曲霉、黄曲霉、赭曲霉和土曲霉等。珊瑚共附生曲霉是生产类固醇、黄酮类和唑酮类等活性天然产物的重要资源。曲霉属真菌产生的一些次级代谢产物具有抗菌、抗癌、抗氧化、抗病毒等生物活性，化学结构复杂、多样、新颖，主要有生物碱、聚酮、萜类和甾体等。
由于曲霉来源广泛，次生代谢物多样，生物活性广泛，对曲霉代谢物的研究备受关注。Numata等首次报道了存在于海洋鱼类胃肠道的烟曲霉的次级代谢产物富米基那唑啉(fumiquinazoline)，其对P-388淋巴细胞白血病具有中度的细胞毒活性。1977年，Yamamoto等从土曲霉的发酵提取物中获得第1个丁内酯类化合物butyrolactone I，打开了对丁内酯类化合物研究的大门。近年来对丁内酯类化合物的深入研究说明丁内酯环结构普遍存在于各类曲霉的代谢产物中，而且此类化合物具有抗致病菌、抗疟原虫、抗炎、抗糖尿病、抗细胞毒、抗氧化及神经保护等药理活性。专利CN115260336A公开了海洋杂色曲霉胞外多糖对细胞具有免疫调节作用。
然而不同海洋微生物产生的胞外多糖在理化性质、单糖组成以及结构上均有不同。可能是因为菌株来源环境、菌株遗传差异、培养环境以及提取条件有关。即宿主的不同、所处环境不同、培养条件不同都会引起曲霉产生的次生代谢产物的不同，一方面表明曲霉产的代谢物丰富，另一方面也表现了曲霉受环境的影响较大。因此，对不同来源的曲霉的次生代谢产物进行更为系统深入的研究是十分必要的。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种珊瑚共附生曲霉胞外多糖、制备方法及其应用。
本发明的第一个目的是提供一种曲霉(Aspergillus sp.)SCAU265。
本发明的第二个目的是提供一种多糖。
本发明的第三个目的是提供所述曲霉(Aspergillus sp.)SCAU265或所述多糖在制备免疫调节试剂中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种免疫调节试剂。
本发明的第五个目的是提供所述多糖的制备方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种曲霉(Aspergillus sp.)SCAU265，所述曲霉(Aspergillus sp.)SCAU265已于2021年11月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为GDMCC No：62089。
基于此，本发明还提供一种多糖，所述多糖的结构式为式Ⅱ所示：
本发明还请求保护所述曲霉(Aspergillus sp.)SCAU265或所述多糖在制备免疫调节试剂中的应用。
本发明还提供一种免疫调节试剂，所述免疫调节试剂中含有所述曲霉(Aspergillus sp.)SCAU265和/或该菌的发酵产物。
本发明还提供一种免疫调节试剂，所述免疫调节试剂中含有所述的多糖。
本发明还提供一种多糖的制备方法，由所述曲霉(Aspergillus sp.)SCAU265发酵得到。
进一步地，用醇沉法提取所述曲霉(Aspergillus sp.)SCAU265发酵产物，得醇沉发酵产物。
进一步地，去除所述醇沉发酵产物中的蛋白质，得粗多糖。
进一步地，对所述粗多糖进行离子交换柱分离，透析，得中性多糖。
进一步地，对所述中性多糖进行葡聚糖凝胶柱层析纯化，即得纯化多糖。所述纯化多糖的结构式为式Ⅱ所示。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种珊瑚共附生曲霉及其胞外多糖、制备方法和应用。本发明从柳珊瑚(Gorgonian)样品中分离得到珊瑚共附生曲霉(Aspergillus sp.)SCAU265菌株，发酵后得到胞外粗多糖ASP，分离纯化后得到平均分子量为36.07kDa的胞外多糖ASP-1，为结构新颖的多糖，结构式为式Ⅱ所示，其对RAW264.7巨噬细胞具有免疫调节作用，促进RAW264.7巨噬细胞的增殖，细胞活力高，无细胞毒性，剂量依赖性地促进RAW264.7巨噬细胞分泌NO、TNF-α和IL-6，对巨噬细胞RAW 264.7具有较强的免疫刺激作用，对免疫应答产生显著影响。
附图说明
图1为曲霉(Aspergillus sp.)SCAU265系统发育进化树。
图2为粗多糖ASP的DEAE-52层析洗脱曲线。
图3为多糖的G-75凝胶层析洗脱曲线。
图4为多糖ASP-1的HPGPC出峰图，其峰型为单一对称，与G-75凝胶层析图所得的结果相符合，证明ASP-1为均一多糖。
图5为多糖ASP-1的离子色谱。a为混合单糖标准品的离子色谱图；b为多糖ASP-1的离子色谱图。
图6为多糖ASP-1的总糖含量测定的标准曲线。
图7为多糖ASP-1的蛋白质含量测定的标准曲线。
图8多糖ASP-1的硫酸根含量测定的标准曲线。
图9为多糖ASP-1的紫外扫描光谱。
图10为多糖ASP-1的红外扫描光谱。
图11为多糖的电镜扫描图谱。其中a为粗多糖ASP的1500×电镜扫描图谱；b为粗多糖ASP的3000×电镜扫描图谱；c为多糖ASP-1的1500×电镜扫描图谱；d为多糖ASP-1的3000×电镜扫描图谱。
图12为多糖ASP-1的乙酰化产物的GCMS色谱图。
图13为多糖ASP-1的一维核磁共振1H-NMR谱图。
图14为多糖ASP-1的一维核磁共振13C-NMR谱图
图15为多糖ASP-1的二维1H-1H-COSY谱图。
图16为多糖ASP-1的二维HMBC谱图。
图17为多糖ASP-1的二维HSQC谱图。
图18为多糖ASP-1对RAW 264.7巨噬细胞增殖的影响。
图19为多糖ASP-1对RAW 264.7巨噬细胞分泌NO的影响。
图20为多糖ASP-1对RAW 264.7分泌细胞因子TNF-α和IL-6的影响。其中，a为TNF-α；b为IL-6。与空白对照组相比，***：p<0.001。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
发酵液培养基组成为：淀粉15g/L、葡萄糖5g/L、酵母膏3g/L、麦芽糖5g/L、玉米浆2g/L、硫酸镁0.3g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、L-半胱氨酸1g/L和海盐30g/L，溶剂为水，pH＝6.0。
实施例1珊瑚共附生曲霉胞外多糖ASP的提取与分离纯化
一、实验方法
1、海洋微生物的分离纯化与鉴定
(1)样品采集处理：在中国南海海域(18°11′N，109°25′E)采集柳珊瑚样品，将其用无菌海水冲洗三次，以去除珊瑚表面的沉积物和松散附着的微生物。然后，使用无菌外科刀片将清洗后的样品切割成约0.10cm3的立方体。将小片段在体积浓度75％乙醇中浸泡60s，并在无菌海水中清洗10s。
(2)样品接种：将样品置于无菌砂浆和10mL无菌海水震荡10min作为10-1浓度的稀释液。继续稀释10倍得到10-2浓度的稀释液。用200μL移液枪取原液、两种浓度的稀释液各200μL，分别涂布于海水PDA平板(加入0.5g/L青霉素和0.03g/L孟加拉玫瑰红)，每一种浓度涂布5块平板。
(3)菌株分离培养：将涂好的平板在26℃下培养1～3周，直到能够区分真菌的形态。然后根据它们的形态差异，选择不同的真菌分离株并转移到新的培养基上。选择将得到的培养皿在26℃下培养，进行纯培养。
(4)菌株鉴定：最终选择的菌株，在PDA培养基上菌落生长较快，菌落为圆形，褐色。分生孢子头的顶囊半球形，小梗双层，第一层短，第二层长，呈放射状排列，顶端有链形孢子。
提取所得菌株的基因组，PCR扩增其ITSDNA基因，PCR扩增条件为：98℃预变10min；98℃变10s、55℃退火10s、72℃延伸1min；最后72℃延伸1min。所得纯化菌株(其ITS序列在GenBank的登录号为OR122480)与GenBank上的对照菌株Aspergillus sp.37a1(MN912600)的ITS序列的相似度为99.82％，构建系统发育树(图1)，鉴定其为曲霉(Aspergillus sp.)并将其命名为：曲霉(Aspergillus sp.)SCAU265，并于2021年11月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为：GDMCC No：62089，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
2、制备曲霉(Aspergillus sp.)SCAU265胞外多糖ASP-1
(1)接种培养：在发酵液培养基上接种曲霉(Aspergillus sp.)SCAU265的孢子，于26℃培养3d，即得种子液。
(2)发酵：将15mL种子液接种于1000mL的摇瓶中，相同培养条件下连续培养5d，获得发酵液，共发酵25L。
(3)提取：用布氏漏斗过滤发酵液，去除不溶性杂质，于50℃下减压浓缩至原体积的五分之一，加入无水乙醇(发酵液：无水乙醇＝1：2，v/v)，密封，于4℃冰箱中沉淀24h后，12000r/min离心10min，收集沉淀，即得粗多糖液。
(4)除蛋白：向步骤(3)中所得粗多糖液中加入Sevage试剂(粗多糖液：Sevage试剂＝3：1，v/v)，用磁力搅拌器搅拌20min，使蛋白充分吸附在有机相中，然后离心(12000r/min，10min)，保留水相，重复操作直至蛋白完全除去，收集的水相，即为上清液多糖水溶液，将其加入截留分子量为8000Da的透析袋中封口，置于蒸馏水中，放入冰箱内透析(4℃，3d)。取出袋内溶液，于-80℃超低温冰箱中预冻48h后冷冻干燥，得到曲霉SCAU265胞外粗多糖ASP。本发明提取的曲霉SCAU265胞外粗多糖ASP产率为1.07g/L。
(5)DEAE-25离子交换柱分离：
用阴离子交换柱层析法DEAE-52对曲霉SCAU265胞外粗多糖ASP进行分离。按照阴离子交换柱层析法DEAE-52的说明书处理填料并装柱，静置后平衡3个体积的平衡液。使用不同浓度的NaCl溶液梯度进行洗脱(NaCl浓度依次为0、0.1、0.3、0.6、0.9和1.2mol/L)，将蠕动泵的速度控制为1mL/min，自动接收仪的时间设置为每管10min，即每管收集10mL。每管吸取200μL用于测量糖含量(苯酚-硫酸法)，绘制曲线图，根据曲线图对应的洗脱峰合并收集同一峰的洗脱液，将其转移至透析袋中(截留量为8000Da)，用蒸馏水进行透析(4℃，3d)，将袋内透析液冷冻干燥后，收集得到中性多糖。收集洗脱液进行并隔管检测，绘制洗脱曲线，得到对称的单一洗脱峰。
(6)G-75葡聚糖凝胶柱层析纯化：G-75葡聚糖凝胶是通过分子筛原理分离多糖的一种方法，进一步用G-75凝胶色谱柱纯化步骤(5)的中性多糖，超纯水洗脱，获得珊瑚共附生曲霉SCAU265胞外多糖。
二、实验结果
步骤(5)绘制洗脱曲线如图2所示，得到对称的单一洗脱峰。
步骤(6)G-75凝胶层析洗脱曲线如图3所示，共获得两个组分多糖ASP-Ⅰ和ASP-Ⅱ，ASP-Ⅰ占洗脱后得到的多糖重量的83.13％，ASP-Ⅱ占16.87％。ASP-Ⅱ因含量过少无法进行活性实验。故选择组分多糖ASP-Ⅰ进行下一步结构鉴定和免疫活性研究，并将其命名为ASP-1。
实施例2珊瑚共附生曲霉胞外多糖ASP的纯度及基本成分分析
一、实验方法
1、分子量：将实施例1获得的多糖ASP-1与已知分子量葡聚糖标准品(5000、116000、23800、48600、80900、148000、273000、409800和667800Da)分别配置成5mg/mL的多糖溶液，12000r/min离心10min，上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后转置于1.8mL进样小瓶中，用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)检测。进样20μL后，用0.05mol/L NaCl溶液在0.6mL/min的速度下进行洗脱，记录出峰时间和相对分子质量图谱。根据标准品数据得到lgMp-RT(峰位分子量)，lgMw-RT(重均分子量)，lgMn-RT(数均分子量)校正曲线。根据校正曲线计算组分多糖ASP-1的相对分子量。
数据分析和标准曲线绘制：以已知葡聚糖标准品相对分子质量的对数(logMw)为纵坐标，以保留时间为横坐标建立回归方程，拟合后的回归方程为：y＝-0.184x+11.752，(R2＝0.9956)，lgMp-RT；y＝-0.1961x+12.315，(R2＝0.9934)，lgMw-RT；y＝-0.1818x+11.589，(R2＝0.992)，lgMn-RT；得到标准曲线，根据标准曲线计算多糖ASP-1的相对分子量。
2、单糖组成：多糖是由若干单糖经脱水缩合而成的聚合物，分析多糖的单糖组成有助于结构解析以及分析构效关系。用离子色谱法测定多糖ASP-1的单糖组成。精确称取烘干单糖标准品和多糖ASP-1配制待测溶液(2.5mg/mL)，色谱条件：用Dionex Carbopac TMPA20(3mm×150mm)色谱柱，流动相A：H2O；流动相B：15mmol/L NaOH；流动相C：15mmol/LNaOH及100mmol/LNaOAC，用电化学检测器记录洗脱曲线。
3、总糖含量：用苯酚-硫酸法在490nm下测定粗多糖ASP和多糖ASP-1溶液(0.05mg/mL)的吸光度，以干燥至恒重的葡萄糖为标准品，以葡萄糖标准品质量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，拟合后的回归方程为：y＝8.0444x-0.0213(R2＝0.995)，用苯酚-硫酸法在490nm下测定多糖ASP-1溶液的吸光度，吸光度带入回归方程计算。
4、蛋白含量：用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)检测蛋白浓度。试剂配制：按照试剂盒配套说明书配制蛋白标准溶液和BCA工作液。用酶标仪测定562nm下的吸光度，以吸光度为横坐标，蛋白质浓度为纵坐标绘制标准曲线，拟合后的回归方程为：y＝0.821x+0.1867(R2＝0.999)。检测粗多糖ASP、多糖ASP-1(1mg/mL)在562nm下的吸光度，带入回归方程计算，根据标准曲线和粗多糖ASP和多糖ASP-1的样品体积、浓度计算出多糖ASP-1的蛋白浓度。
5、硫酸根含量：用氯化钡-明胶法测定粗多糖ASP和多糖ASP-1中的硫酸根含量。在360nm下用分光光度计读取吸光度，以吸光度为横坐标，硫酸根浓度为纵坐标，绘制标准曲线，拟合后的回归方程为：y＝3.0845x-0.4355(R2＝0.999)。测定粗多糖ASP和多糖ASP-1溶液(1.2mg/mL)在360nm下的吸光度，带入回归方程计算。
二、实验结果
1、图4为多糖ASP-1的HPGPC出峰图，其峰型为单一对称，与G-75凝胶柱层析图3所得的结果相符合，证明ASP-1为均一多糖，其峰位分子量(Mp)为29.70kDa，重均分子量(Mw)为36.07kDa，数均分子量(Mn)为24.94kDa。
2、如图5所示，图5中a为混合单糖标准品的离子色谱图；图5中b为多糖ASP-1的离子色谱图。对比离子色谱，表明多糖ASP-1主要是由葡萄糖组成，其含量为95.3％，还有少量的甘露糖和半乳糖，其含量比分别为3.9％和0.8％。
3、粗多糖ASP的总糖含量为47.71±1.00％，如图6所示，多糖ASP-1的总糖含量为89.31±0.70％，n＝3。粗多糖ASP的含糖量较少，经过离子交换和凝胶渗透层析分离纯化后，组分ASP-1的含糖量提升近一倍。
4、，如图7所示，多糖ASP-1未检测到蛋白，n＝3。经过Sevage法处理已完全去除多糖中的蛋白杂质。
5、如图8所示，多糖ASP-1未检测到硫酸根，n＝3。
综上，实施例1获得的粗多糖ASP和多糖ASP-1的基本成分如表1所示。
表1珊瑚共附生曲霉SCAU265多糖的基本成分
实施例3珊瑚共附生曲霉胞外多糖ASP-1的结构解析
一、实验方法
1、紫外光谱：用紫外分光光度计在190～400nm波长范围内对实施例1的曲霉SCAU265胞外多糖(粗多糖ASP和多糖ASP-1)溶液(200μg/mL)进行扫描。
2、红外光谱；用FT-IR对多糖ASP-1的特征官能团、糖环构型进行分析，
3、扫描电镜分析：采用扫描电镜(SEM)对粗多糖ASP和多糖ASP-1的表面形态结构进行观察分析。
4、甲基化分析：甲基化分析是确定单糖残基类型以及糖苷键连接位点的重要解析手段。分析经甲基化、完全酸水解、完全乙酰化制成阿尔迪醇乙酸酯衍生物的多糖，能够从数据中分析得到多糖ASP-1的单糖组成、糖苷键类型的重要信息。
5、核磁共振分析：用脉冲傅里叶变换谱仪，对多糖ASP-1进行扫描，通过核磁共振对多糖ASP-1的十个序列残基连接顺序进行分析。
二、实验结果
1、粗多糖ASP和多糖ASP-1在260nm和280nm处没有特征吸收峰，说明粗多糖ASP和多糖ASP-1几乎不含核酸、三磷酸腺苷、酶类和蛋白质。多糖ASP-1在260nm和280nm的紫外图谱如图9所示。
2、如图10所示，在3369cm-1处的宽峰是由于O-H的伸缩振动，存在分子间或分子内氢键。2929cm-1和1413cm-1附近的吸收峰分别为C-H的伸缩振动和弯曲振动产生，由此可见多糖ASP-1具有典型的多糖特征吸收峰。在1642cm-1处的弱吸收峰是糖的水化物特征吸收。1200～1000cm-1之间的信号为糖环外的C-O-H和糖苷键的C-O-C的伸缩振动重叠吸收峰，1153cm-1、1079cm-1和1053cm-1处的吸收峰归属为C-O-C与C-O-H的伸缩振动，说明多糖ASP-1有吡喃环结构。α-(1→4)连接的葡聚糖在931cm-1左右有吸收峰，848cm-1处存在α-型糖苷键的特征吸收峰，说明其为α-多糖。多糖ASP-1在1700～1735cm-1附近无吸收峰，提示不含糖醛酸。
3、如图11中a和b所示，粗多糖ASP为表面粗糙、弯曲褶皱的片状结构；如图11中c和d所示，组分多糖ASP-1为表面光滑的片状结构，有少量孔洞和粗糙结构。
4、如图12和相关残基信息表2所示，非还原性端基T-Glcp、T-Manp和T-Galp的总含量为14.0％，而主要支链糖残基1,4,6-Glcp的含量为12.8％，其次，1,3,4-Glcp和1,4,6-Galp的含量分别为2.1％和1.8％，由此可以看出端基和支链数的比例为1：1.19。未被取代的糖残基有1,2-Manp、1,3-Glcp、1,4-Glcp和1,6-Glcp，其百分含量分别为0.8％、1.4％、65.7％和1.3％。另外ASP-1的主链主要由1,4-Glcp组成，在主链和支链上还可能有1,2-Manp、1,3-Glcp和1,6-Glcp这3种连接方式，主要的支链点出现在Glcp的O-4位置上。
表2甲基化多糖ASP-1产物分析结果
5、如图13的1H-NMR一维谱图、图14所示的13C-NMR一维谱图、图15所示的二维1H-1H-COSY谱图、图16所示的HMBC谱图和图17所示的HSQC谱图所示。
通过核磁共振分析对ASP-1的十个序列残基连接顺序进行了分析，在图13和图14中，残基A为[α-D-Glcp-(1→]，残基B为[β-D-Manp-(1→]，残基C为[α-D-Galp-(1→]，残基D为[→2)-α-D-Manp-(1→]，残基E为[→3)-α-D-Glcp-(1→]，残基F为[→4)-α-D-Glcp-(1→]，残基G为[→6)-β-D-Glcp-(1→]，残基H为[→3,4)-α-D-Glcp-(1→]，残基I为[→4,6)-α-D-Glcp-(1→]，残基J为[→4,6)-α-D-Galp-(1→]。
如表3所示，为多糖ASP-1糖残基的13C、1H的化学位移。在图13和图14中，残基A-J的1H-NMR化学位移4.89ppm、5.27ppm、5.29ppm、5.27ppm、5.27ppm、5.33ppm、4.81ppm、4.91ppm、4.89ppm、5.28ppm，及残基A-J13C NMR化学位移98.57ppm、99.98ppm、99.93ppm、100.01ppm、99.20ppm、99.60ppm、99.32ppm、99.98ppm、98.57ppm、98.60ppm，图15的1H-1H-COSY谱图，可以区分H-1/H-2、H-2/H-3、H-3/H-4、H-4/H-5和H-5/H-6的分离自旋体系，结合图16的HMBC谱图，表明存在葡萄糖残基A。同样，残基B-J的化学位移也得到了证实。δH 4.89(A:H-1)与δC 70.35(H:C-4)之间有交叉峰，表示在A和H之间有一个葡萄糖苷键连接，δH5.27(D:H-1)与δC73.86(J:C-4)之间有交叉峰，也表示D和J之间存在葡萄糖苷键连接，δH5.27(E:H-1)与δC 76.72(F:C-4)之间有交叉峰，表示E与F之间存在葡萄糖苷键连接，δH5.27(E:H-1)与δC 70.35(H:C-4)之间有交叉峰，表示E与H之间存在葡萄糖苷键连接，δH5.33(F:H-1)与δC 76.72(F:C-4)之间有交叉峰，表示F与F之间存在葡萄糖苷键连接，δH5.33(F:H-1)与δC 70.30(I:C-6)之间也有交叉峰,表示F与I之间存在葡萄糖苷键连接，δH4.81(G:H-1)与δC 73.86(J:C-4)之间有交叉峰，表示G与J之间存在葡萄糖苷键连接，δH4.91(H:H-1)与δC 73.07(G:C-6)之间有交叉峰，表示H与G之间存在葡萄糖苷键连接，δH3.87(H:H-3)与δC 98.57(I:C-1)之间有交叉峰，表示H与I之间存在葡萄糖苷键连接，δH3.75(I:H-6)与δC 98.57(A:C-1)之间有交叉峰，，表示I与A之间存在葡萄糖苷键连接，δH3.57(I:H-4)与δC 99.98(B:C-1)之间有交叉峰，表示I与B之间存在葡萄糖苷键连接，δH3.57(I:H-4)与δC 98.57(I:C-1)之间有交叉峰，表示I与I之间存在葡萄糖苷键连接，δH3.75(I:H-6)与δC 98.57(I:C-1)之间有交叉峰，表示I与I之间存在葡萄糖苷键连接。
根据上述证据，确定多糖ASP-1的结构式如式Ⅰ和式Ⅱ所示，其糖苷键类型为：A：[Glcp-(1→]，B：[Manp-(1→]，C：[Galp-(1→]，D：[→2)-Manp-(1→]，E：[→3)-Glcp-(1→]，F：[→4)-Glcp-(1→]，G：[→6)-Glcp-(1→]，H：[→3,4)–Glcp-(1→]，I：[→4,6)–Glcp-(1→]，J：[→4,6)–Glap-(1→]]。
表3多糖ASP-1糖残基的13C、1H的化学位移
实施例4珊瑚共附生曲霉胞外多糖ASP-1的免疫活性调节
一、实验方法
1、对RAW264.7细胞增殖的影响。用CCK-8法来检测实施例1获得的多糖ASP-1对RAW264.7巨噬细胞增殖的影响。
将细胞培养皿中的旧培养基吸弃，用2mL PBS缓冲液摇动清洗2次后，加入2mL新的完全培养基，将RAW264.7细胞轻轻吹打下来，形成细胞悬液，并用细胞计数板进行计数。吸取一定体积的细胞悬液移至空白细胞培养皿中，加入新的完全培养液将细胞密度调整为1.0×104个/mL。吸取100μL移至96孔板中，置于细胞培养箱(37℃、5％ CO2)中培养24h。弃上清，加入不同浓度的组分多糖ASP-1样品(0、10、50、100、200、500和1000μg/mL)，每组设置6个复孔，再置于细胞培养箱(37℃、5％ CO2)中培养24h。每孔加入10μLCCK-8试剂，于37℃中避光孵育2h，测定吸光值(450nm)，分析多糖ASP-1对RAW264.7细胞增殖的影响。
2、对RAW264.7细胞释放NO的影响。
在免疫应答过程中活性物质的产生有利于实现免疫调节作用。NO是参与免疫调节的活性物质，通过检测NO的释放量可有效判断是否促进免疫调节。NO在多种免疫调节性疾病中起着重要作用，例如抑制癌症、预防心血管疾病、提升生殖性能、增强体内抗氧化能力、促进细胞增殖等。测定多糖ASP-1处理的RAW 264.7巨噬细胞释放NO的情况，由此判断ASP-1对巨噬细胞的刺激作用。
采用NO试剂盒来测定多糖ASP-1对RAW 264.7细胞释放NO的影响。将细胞培养皿中的旧培养基吸弃，用2mL PBS缓冲液摇动清洗2次后，加入2mL新的完全培养基，将细胞轻轻吹打下来，形成细胞悬液，并用细胞计数板进行计数。吸取一定体积的细胞胞悬液移至空白细胞培养皿中，加入新的完全培养液将细胞密度调整为1.0×105个/mL。吸取500μL移至24孔板中，置于细胞培养箱(37℃、5％ CO2)中培养24h。弃上清，加入不同浓度的多糖ASP-1样品(0、100、200和400μg/mL)，设置阳性对照组(1μg/mL脂多糖LPS溶液)，每组设置6个复孔，再置于细胞培养箱(37℃、5％ CO2)中培养24h。离心(1000×g，3min)收集上清，按照NO试剂盒说明书进行操作，分析组分多糖ASP-1对RAW264.7细胞对NO释放量的影响。
3、对RAW264.7细胞分泌细胞因子的影响。
细胞因子是一类具有广泛生物活性的小分子蛋白质，在调节机体的免疫应答和炎症反应中发挥着重要作用，其中TNF-α及IL-6就是常见的细胞因子。对AVP141-A刺激巨噬细胞RAW 264.7分泌的细胞因子TNF-α、IL-6进行测定。
用上述检测NO实验中收集的上清，按照TNF-α试剂盒和IL-6试剂盒说明书进行操作，检测TNF-α和IL-6分泌情况，分析组分多糖ASP-1对RAW264.7细胞对分泌细胞因子的影响。
二、实验结果
1、如图18所示，在10～1000μg/mL浓度范围内，多糖ASP-1促进巨噬细胞RAW 264.7的增殖，且浓度越高，对细胞增殖的促进效果也越好。在10～1000μg/mL浓度范围内，细胞活力总体都未低于100％，说明多糖ASP-1在此浓度范围内对巨噬细胞RAW 264.7无细胞毒性。
2、如图19所示，低浓度(100、200μg/mL)干预下的巨噬细胞RAW 264.7的NO释放量与空白对照组相比无显著性差异，但当剂量为400μg/mL时，多糖ASP-1能极显著促进NO的释放(p<0.001)，但仍然小于阳性对照LPS处理组的NO的释放量。NO释放量显著增加说明组分多糖ASP-1对巨噬细胞RAW 264.7具有较强的免疫刺激作用。
3、如图20中a所示，在多糖ASP-1处理24h后，与空白对照组相比，细胞因子TNF-α的分泌量在不同剂量的多糖ASP-1(100、200和400μg/mL)处理下均达到空白对照组的10倍以上，呈极显著性增多(P<0.001)，且呈剂量依赖性增多。当剂量为400μg/mL时，TNF-α的分泌量大于阳性对照LPS处理组的分泌量。
如图20中b所示，在多糖ASP-1处理24h后，低浓度(100、200μg/mL)干预下的巨噬细胞RAW 264.7的IL-6分泌量与空白对照组相比无显著性差异，在较高浓度(400μg/mL)干预下的巨噬细胞RAW 264.7的IL-6分泌量与空白对照组相比有极显著差异(p<0.001)。以上结果表明多糖ASP-1促进巨噬细胞RAW 264.7中细胞因子(TNF-α和IL-6)的分泌，多糖ASP-1对免疫应答产生显著影响。
实施例5珊瑚共附生曲霉胞外多糖ASP-1的网络药理学-代谢组学联合分析
一、实验方法
按照实施例4检测多糖ASP-1对RAW 264.7巨噬细胞增殖的影响的方法，用500μg/mL多糖ASP-1处理RAW 264.7巨噬细胞24h后，收集细胞，借助代谢组学分析ASP-1作用后细胞的差异代谢物的变化，利用网络药理学分析ASP-1可能作用靶点，联合分析多糖ASP-1在免疫调节方面可能的作用机制。筛选出多维统计分析VIP>1的代谢物，当单变量统计分析满足0.05<p<0.1的代谢物作为差异代谢物，而p<0.05的代谢物则作为具有显著性差异的代谢物。
二、实验结果
共筛选到64个显著差异代谢物，其中有28个上调，36个下调。其中显著上调的有瓜氨酸(Citrulline)、衣康酸(Itaconic acid)、L-苏氨酸-3-苹果酸甲酯(L-threo-3-Methylmalate)、琥珀酸(Succinic acid)、己二酸(Oxoadipic acid)和十一烷酸(Undecanoic acid)等差异代谢物；显著下调的有邻苯二甲酸(Phthalic acid)、脱氢表雄甾酮(Dehydroepiandrosterone)、胆固醇(Cholesterol)和水杨酸(Salicylic acid)等。对差异代谢物富集到的67条通路和网络药理学富集的80条通路进行联合分析，共筛选到6条相同的通路，包括癌症中的中心碳代谢(Central carbon metabolismin cancer)、精氨酸生物合成(Arginine biosynthesis)、胰高血糖素信号通路(Glucagon signalingpathway)、癌症通路(Pathways in cancer)、鞘脂类信号通路(Sphingolipid signalingpathway)和肾细胞癌(Renal cell carcinoma)。
对p<0.05，FDR<0.05且impact>0.1的网络药理学和代谢组学KEGG富集的通路进行联合分析，富集的KEGG通路有精氨酸生物合成(Arginine biosynthesis)和胰高血糖素信号通路(Glucagon signaling pathway)2条通路，这表示多糖ASP-1主要对这两条通路有影响。
在精氨酸生物合成通路中，显著变化的代谢物为谷氨酸，N-乙酰-谷氨酸，柠檬酸，天冬氨酸，延胡索酸。在胰高血糖素信号通路中，显著变化的代谢物为3-磷酸甘油酸，柠檬酸，琥珀酸，延胡索酸。在网络药理学-代谢组学联合分析中发现，精氨酸生物合成通路是多糖ASP-1主要影响的通路，多糖ASP-1或通过影响氨基酸(精氨酸)的合成和代谢从而影响细胞的免疫调节功能。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种曲霉(Aspergillus sp.)SCAU265，其特征在于，所述曲霉(Aspergillus sp.)SCAU265已于2021年11月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为GDMCC No：62089。
2.一种多糖，其特征在于，所述多糖的结构式为式Ⅱ所示：
3.权利要求1所述曲霉(Aspergillus sp.)SCAU265或权利要求2所述多糖在制备免疫调节试剂中的应用。
4.一种免疫调节试剂，其特征在于，所述免疫调节试剂中含有权利要求1所述曲霉(Aspergillus sp.)SCAU265和/或该菌的发酵产物。
5.一种免疫调节试剂，其特征在于，所述免疫调节试剂中含有权利要求2所述的多糖。
6.一种多糖的制备方法，其特征在于，由权利要求1所述曲霉(Aspergillussp.)SCAU265发酵得到。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，用醇沉法提取权利要求1所述曲霉(Aspergillus sp.)SCAU265发酵产物，得醇沉发酵产物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，去除所述醇沉发酵产物中的蛋白质，得粗多糖。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，对所述粗多糖进行离子交换柱分离，透析，得中性多糖。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，对所述中性多糖进行葡聚糖凝胶柱层析纯化，即得纯化多糖。
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