CN118165131A - 真菌中型曲霉菌、其胞外多糖及胞外多糖的应用 - Google Patents
真菌中型曲霉菌、其胞外多糖及胞外多糖的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种真菌中型曲霉菌、其胞外多糖及胞外多糖的应用，发明将该菌株接种于发酵培养基中发酵培养，获得发酵液；发酵液除菌体、除蛋白、透析、得胞外多糖粗提物；胞外多糖粗提物经大孔树脂柱吸附色素、DEAE Fast Flow阴离子交换柱层析纯化，得到分子量为9015Da的胞外多糖。通过分析单糖的组成、甲基化、红外光谱分析、和核磁共振图谱分析确定了该胞外多糖的结构式。在细胞水平上，初步实验证明了其对RAW264.7巨噬细胞具有显著的免疫活性，并对其相关作用机制及关键靶点进行探究，初步提出真菌中型曲霉胞外多糖相关免疫调节机制的潜在作用靶点和可能作用机制。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域、多糖技术领域、天然产物提取技术领域，具体涉及一种从海洋珊瑚鱼肠样中分离的真菌中型曲霉菌(Aspergillus medius)SCAU236，以及由该菌株进行发酵产生的胞外多糖及该胞外多糖在制备免疫调节制剂中的应用。
背景技术
2015年伊朗德黑兰大学学者Leila Ebrahimi，在实验室从苹果叶片和果实中分离Venturia inaequalis的过程中，出现了一些真菌作为培养污染物，从这些培养污染物中分离出了真菌中型曲霉菌(Aspergillus medius)，Leila Ebrahimi，Khalil-BerdiFotouhifar，Aspergillus medius,a new record to the mycobiota of Iran，Rostaniha16(2):212-214(2015)。本文的作者通过ITS DNA基因序列的鉴定，确定该菌株为真菌中型曲霉菌(Aspergillus medius)。本申请的发明人从采集中国南海珊瑚鱼的肠样中分离提取了该菌株，经ITS DNA基因序列的鉴定，确定该菌株与Aspergillus medius(KT832076.1)的ITS序列的相似度为99％，并最终命名为真菌中型曲霉菌(Aspergillus medius)SCAU236。
同时，本申请的发明将该菌株真菌中型曲霉菌(Aspergillus medius)SCAU236接种于发酵培养基中发酵培养，获得发酵液；发酵液除菌体、除蛋白、透析、得胞外多糖粗提物；胞外多糖粗提物经大孔树脂柱吸附色素、DEAE Fast Flow阴离子交换柱层析纯化，得到分子量为9015Da的胞外多糖。发明人通过分析单糖的组成、甲基化、红外光谱分析、和核磁共振图谱分析确定了该胞外多糖的结构式。同时，本发明的发明人还初步实验证明了其对RAW264.7巨噬细胞具有显著的免疫活性，并且证明了该真菌中型曲霉胞外多糖介导铁死亡机制，来调节免疫活性靶标。
铁死亡是一种新发现的铁依赖性细胞死亡途径，其特征是由铁代谢介导的脂质过氧化和谷胱甘肽耗竭，并且铁死亡常伴有炎症反应。巨噬细胞是广泛存在于我们体内的一类用于宿主防御的免疫细胞，在不同极化下，巨噬细胞通过其独特的吞噬作用、分泌细胞因子和生成脂质过氧化物等功能，介导炎症，调节铁、脂质和氨基酸代谢，在组织稳态中发挥重要作用。根据铁死亡特征和巨噬细胞功能的这些共同点，说明免疫调节与铁死亡之间存在一定的关系。近年来有部分研究通过改变巨噬细胞的极化，调节免疫活性破坏肿瘤微环境，诱导癌细胞铁死亡来治疗癌症。
目前，现有技术中并未发现从海洋珊瑚鱼中分离得到真菌中型曲霉菌(Aspergillus medius)的报道，更未发现由该菌发酵产生胞外多糖的报道。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种从海洋珊瑚鱼肠样中分离的真菌中型曲霉菌(Aspergillus medius)SCAU236，以及由该菌株进行发酵产生的胞外多糖及该胞外多糖在制备免疫调节制剂中的应用。
本发明解决上述技术问题的方案如下：
本发明第一方面提供了一种从海洋珊瑚鱼肠样中分离的真菌中型曲霉菌，该菌株经鉴定，确定为真菌中型曲霉菌(Aspergillus medius)，并于2023年1月12日将该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地点广东省广州市天河区先烈中路100号广东省微生物研究所59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO：63136。
所述样品来源于：中国南方深圳大亚湾的珊瑚礁鱼，肠样；
进一步的，将所述的肠样磨碎、稀释、取一定量接种到PDA板，PDA板成分：46g/L马铃薯葡萄糖琼脂、30g/L海盐，26℃下培养，得到真菌中型曲霉菌(Aspergillus medius)SCAU236菌株。PDA板购自环凯微生物科技有限公司。
进一步的，根据菌株的ITSDNA基因序列鉴定菌株。提取真菌中型曲霉菌(Aspergillus medius)SCAU236菌株的基因组，PCR扩增其ITSDNA基因，将所得菌株的ITSDNA基因序列在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，发现本发明中所得的菌株与Aspergillus medius(KT832076.1)的ITS序列的相似度为99％，最终命名为真菌中型曲霉菌(Aspergillus medius)SCAU236。
本发明的第二个方面，提供真菌中型曲霉胞外多糖，所述真菌中型曲霉发酵胞外多糖结构式为：
本申请的发明将该菌株真菌中型曲霉菌(Aspergillus medius)SCAU236接种于发酵培养基中发酵培养，获得发酵液；发酵液除菌体、除蛋白、透析、得胞外多糖粗提物；胞外多糖粗提物经大孔树脂柱吸附色素、DEAE Fast Flow阴离子交换柱层析纯化，得到分子量为9015Da的胞外多糖。发明人通过分析单糖的组成、甲基化、红外光谱分析、和核磁共振图谱分析确定了该胞外多糖的结构式。
进一步的，所述真菌中型曲霉胞外多糖重均分子量为9015Da，以摩尔百分比计，所述真菌中型曲霉胞外多糖的单糖组成为葡萄糖100％。
更进一步的，所述真菌中型曲霉发酵胞外多糖，是以真菌中型曲霉(Aspergillusmedius)SCAU236菌株，接种至培养基中进行发酵，得到的发酵液中分离得到的；可以理解的是，该真菌中型曲霉胞外多糖是一种具有新颖结构的多糖，该多糖可以通过真菌中型曲霉菌(Aspergillus medius)接种于适当的发酵培养基中发酵后的发酵液中分离得到，也可以从其他微生物，例如：细菌的胞外多糖分离得到，也可以由其他天然产物中直接分离得到。
本发明的第三方面，提供了一种真菌中型曲霉胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)分离真菌中型曲霉(Aspergillus medius)SCAU236菌株，所述真菌中型曲霉(Aspergillus medius)SCAU236菌株采集自中国南海珊瑚鱼的肠样；
(2)将上述真菌中型曲霉(Aspergillus medius)SCAU236菌株进行液体发酵，收集发酵液；
(3)将上述发酵液中的多糖进行分离，得到真菌中型曲霉胞外粗多糖；
(4)将上述真菌中型曲霉胞外粗多糖，用DEAE Fast Flow阴离子交换柱层析，收集洗脱峰，进行冷冻干燥，得到真菌中型曲霉胞外多糖；
本发明的步骤(2)中，将真菌中型曲霉(Aspergillus medius)SCAU236菌株进行液体发酵，收集发酵液；其中，液体发酵的液体培养基包括：麦芽糖10.0g/L、葡萄糖10.0g/L、甘露醇20.0g/L、七水硫酸镁0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、玉米浆1.0g/L、酵母膏3.0g/L、海盐30.0g/L以及L-半胱氨酸0.5g/L，溶剂为水；pH值为6.0；25-30℃条件下恒温发酵6-7天，得到发酵液。本发明的发明也尝试过其他发酵培养基，例如：
1号培养基：每1L培养液中含有：葡萄糖20g，蛋白胨5g，氨化钠3g，磷酸二氢钾0.5g，海盐30g，pH7.0；
2号培养基：每1L培养液中含有：葡萄糖40g，酵母膏10g，蛋白胨10g，海盐30g，pH6.5；
3号培养基：每1L培养液中含有：甘露醇20g，葡萄糖10g，麦芽糖10g，酵母膏3g，玉米浆1g，七水硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.5g，L-半胱氨酸0.5g，海盐30g，pH6.0。
上述3种等量的发酵液和接种量进行发酵，1号培养基、2号培养基和3号培养基的粗多糖得率分别为0.0289、0.3228、1.4322g/L。因此，3号培养基是该菌种发酵的较理想培养基。
上述步骤(2)将真菌中型曲霉(Aspergillus medius)SCAU236菌株进行液体发酵，收集发酵液是本领域常用的技术，例如：在超净台中，使用经过高温灭菌的竹签从PDA固体培养基中挑取已活化的真菌中型曲霉(Aspergillus medius)SCAU236接种于灭菌的液体培养基中，轻微摇晃使菌株均匀分布在液体培养基中，使用涡旋振荡器在25-27℃、140rpm条件下发酵6-7天，得到发酵液。
其中，所述真菌中型曲霉(Aspergillus medius)SCAU236的菌株是通过PDA固体培养基进行活化培养得到的。培养基活化是本领域已知的，例如，在超净台中，使用灭菌后的接种环将真菌中型曲霉(Aspergillus medius)SCAU236接种于已灭菌的PDA固体培养基的培养皿中进行活化，PDA固体培养基成分包括：46g/L马铃薯葡萄糖琼脂、30g/L海盐，购于(环凯微生物科技有限公司)，26-28℃条件下恒温箱活化6-7天，重复活化2-3次。提取活化性状优良的真菌中型曲霉(Aspergillus medius)SCAU236菌株进行大规模发酵。
进一步的，可将pH调节剂加入到培养基中，以将培养基的pH调节到约6.0-7.0。所述pH调节剂是本领域已知的，例如，包括但不限于氯化氢、氢氧化钠、乳酸、柠檬酸、氨水、乳酸钠、柠檬酸钠和氢氧化钠，优选氯化氢和氢氧化钠。
更进一步的，所述步骤(3)中，从发酵液中分离多糖的方法包括如下步骤：
1)去除发酵液中的菌体，浓缩，得浓缩液；
2)用硫酸铵和叔丁醇混合体系，除去上述浓缩液中的蛋白和杂质，收集硫酸铵相；
3)用截留分子量为3000Da的透析袋，透析上述硫酸铵相，收集透析袋中截留的液体，冷冻干燥，得到第一真菌中型曲霉胞外粗多糖；
4)上述第一真菌中型曲霉胞外粗多糖进行大孔树脂洗脱，第一真菌中型曲霉胞外粗多糖用水溶解为500mg/ml的溶液，上样5ml，洗脱液为一级水，收集洗脱峰，进行冷冻干燥，得到第二真菌中型曲霉胞外粗多糖。
上述步骤(3)中去除上述发酵液中的菌体是本领域已知技术，例如，采用碟式离心机或管式离心机，在约8000-10000rpm下进行约1-10分钟。或者，可通过陶瓷膜或有机膜等进行膜分离过滤。还可以通过真空过滤泵进行过滤。本发明中优选采用真空过滤泵(双圈定性滤纸)过滤除去菌体，得除杂质发酵液。
上述步骤(3)中浓缩去除菌体的发酵液是本领域已知技术，例如，采用超滤膜浓缩，例如：可采用膜材质有陶瓷膜、醋酸纤维素膜、空纤维聚砜膜、聚醚砜膜等，还可以采用旋转蒸发仪将滤液减压浓缩，条件为：60-70℃，30rpm，至原体积的1/4，收集浓缩液；
上述步骤(3)中用硫酸铵和叔丁醇混合体系，除去上述浓缩液中的蛋白和杂质，收集硫酸铵相是本领域已知技术，所述硫酸铵和叔丁醇混合体系与浓缩液的体积比为(2-4):(4-6):(8-10)磁力搅拌40-50min，超高速离心(8000-12000rpm，10min，常温)，静置20-40min，形成三相，收集硫酸铵相。也可以采用热水浸提、乙醇沉淀、sevage法除蛋白的方法，本发明中采用硫酸铵和叔丁醇混合体系，除去上述浓缩液中的蛋白和杂质。
上述步骤(3)中，第一真菌中型曲霉胞外粗多糖进行大孔树脂洗脱是本领域已知技术，第一真菌中型曲霉胞外粗多糖用水溶解为500mg/ml的溶液，上样5ml，洗脱液为一级水，洗脱流速2～3BV/h，收集洗脱峰，进行冷冻干燥，得到第二真菌中型曲霉胞外粗多糖。所述用DEAE Fast Flow阴离子交换柱层析，将第二真菌中型曲霉胞外粗多糖用水溶解为500mg/ml的溶液，上样5ml，洗脱液依次为一级水、0.1M NaCl、0.3M NaCl、0.6M NaCl、0.9MNaCl和1.2M NaCl溶液，流速为1ml/min，收集一级水洗脱得到的洗脱液，进行冷冻干燥，得到真菌中型曲霉胞外多糖。
本发明的第四个方面，提供了所述的真菌中型曲霉胞外多糖在制备具备免疫调节制剂中的应用。
本发明采用CCK-8法检测真菌中型曲霉菌胞外多糖对巨噬细胞增殖的影响。
采用NO试剂盒检测真菌中型曲霉菌胞外多糖对巨噬细胞RAW 264.7释放NO的影响，进而判断产真菌中型曲霉菌胞外多糖对巨噬细胞RAW 264.7的刺激作用。
采用ELISA试剂盒检测真菌中型曲霉菌胞外多糖对巨噬细胞RAW 264.7释放免疫因子的影响，表明真菌中型曲霉菌胞外多糖存在免疫应答反应。
实验结果表明，制备得到的真菌中型曲霉胞外多糖在细胞水平上对RAW264.7巨噬细胞具有显著的免疫活性，基于真菌中型曲霉胞外多糖具有免疫调节活性的作用基础上，对其相关作用机制及关键靶点进行探究，初步提出真菌中型曲霉胞外多糖相关免疫调节机制的潜在作用靶点和可能作用机制。本发明中制得的真菌中型曲霉胞外多糖可作为免疫调节剂，拥有良好的应用前景，本发明中建立的真菌中型曲霉胞外多糖介导铁死亡机制模型的构建及应用，可为该多糖免疫调节作用的潜在机制提供初步分析，有利于为海洋真菌多糖相关免疫调节机制的深入研究提供参考依据，为海洋多糖活性机制的研究提供新的预测模型和分析方法。
生物保藏信息：
真菌中型曲霉(Aspergillus medius)SCAU236，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地点广东省广州市天河区先烈中路100号广东省微生物研究所59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO：63136，保藏日期2023年1月12日。
附图说明
图1本发明的真菌中型曲霉的ITSDNA序列构建的系统进化树
图2本发明中制得的真菌中型曲霉胞外多糖的DEAE Fast Flow洗脱曲线图
图3本发明中制得的真菌中型曲霉胞外多糖的分子量凝胶色谱图
图4本发明中制得的真菌中型曲霉胞外多糖的单糖组成离子色谱图
图5本发明中制得的真菌中型曲霉胞外多糖的甲基化单糖残基分析图
图6本发明中制得的真菌中型曲霉胞外多糖的红外光谱图
图7本发明中制得的真菌中型曲霉胞外多糖的核磁共振图
图8本发明中制得的真菌中型曲霉胞外多糖的结构图
图9本发明中制得的真菌中型曲霉胞外多糖对巨噬细胞RAW264.7细胞增殖的影响图
图10本发明中制得的真菌中型曲霉胞外多糖对RAW 264.7细胞释放NO的影响图
图11本发明中制得的真菌中型曲霉胞外多糖对RAW 264.7细胞释放免疫因子的影响图
图12本发明中制得的真菌中型曲霉胞外多糖调节RAW 264.7细胞免疫活性的免疫印迹图
图13本发明中制得的真菌中型曲霉胞外多糖介导RAW 264.7细胞铁死亡的免疫印迹图
图14本发明中制得的真菌中型曲霉胞外多糖介导RAW 264.7细胞铁死亡的脂质过氧化流式细胞图
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
1.实验原料：巨噬细胞RAW264.7
2.试剂耗材：
大孔吸附树脂NKA-9(天津浩聚树脂科技有限公司)，琼脂糖凝胶(索莱宝生物科技有限公司)，马铃薯葡萄糖琼脂PDA(环凯微生物科技有限公司)，胎牛血清(赛默飞世尔科技公司)，DMEM高糖培养基(普诺塞生命科技有限公司)，ATP细胞活力测试液(普洛麦格北京生物科技有限公司)，磷酸盐缓冲盐水PBS(索莱宝生物科技有限公司)，CCK-8试剂，脂多糖LPS(上海麦克林生化科技有限公司)，NO试剂盒(碧云天生物技术有限公司)，ELISA试剂盒(碧云天生物技术有限公司)
3.仪器设备：
二氧化碳细胞恒温培养箱(Thermo Fisher Scientific)，立式压力蒸汽灭菌锅(上海博讯)，大型旋转蒸发仪(日本东京EYELA)，高速冷冻离心机(美国贝克曼库尔特)，涡旋振荡器(上海沪西分析仪器)，冷冻干燥机(Thermo Fisher Scientific)，自动蠕动泵收集器BT-100(上海沪西分析仪器)，垂直蛋白电泳仪(美国Bio-Rad)
4.检测仪器：
①粗多糖洗脱曲线：酶标仪(Thermo Varioskan LUX)
②多糖单糖组成：离子色谱仪(ThermoFisher)
③多糖分子量：高效液相色谱仪(Shimadzu)
④多糖红外光谱：傅立叶变换红外(德国Bruker)
⑤紫外吸收光谱：Shimadzu UV-2550紫外可见分光光度计
⑥多糖甲基化：气相质谱联用仪(SHIMADZU)
⑦多糖核磁图谱：核磁共振波谱仪(瑞士Bruker Biospin AG)
⑧流式图谱：贝克曼CytoFLEX流式细胞仪
⑨荧光光谱：Hitachi FL7000荧光分光光度计仪器
⑩免疫印迹图：Amersham Imager 600超灵敏多功能成像仪
实施例1：
分离培养真菌中型曲霉菌株，具体操作步骤如下：
S1.样品采集处理：采集中国南海珊瑚鱼3～5条，中国南方深圳大亚湾用甲烷磺酸三嗪(MS222，100ppm)麻醉，以收集肠道样本。将样品用无菌海水冲洗三次，以除去松散附着的微生物及肠道内容物，称取约100mg肠样品用1ml无菌水彻底研磨。
S2.样品接种：将步骤S1中研碎的样品稀释10倍后，量取0.1mL并接种到预先准备的PDA板(成分：46g/L马铃薯葡萄糖琼脂、30g/L海盐)上，设立3-5个平行组；
S3.菌株分离培养：将平板在26℃下培养2天以观察细菌形态。根据形态学特征，对真菌生长特性、气生菌丝、底物菌丝、可扩散色素、孢子进行观察，挑取真菌单个菌落转移到PDA板(成分：46g/L马铃薯葡萄糖琼脂、30g/L海盐)上，在26℃下培养，得到真菌菌株；
S4.菌株鉴定：提取所得菌株的基因组，PCR扩增其ITSDNA基因，PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性60s、55℃退火60s、72℃延伸90s；最后72℃延伸10min；根据ITSDNA基因序列在微生物种属中的保守性，把所得菌株的ITSDNA基因提交到NCBI GenBank数据库获得登陆号，进而进行鉴定，该菌株的ITSDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示(详见本发明附件的核苷酸序列表)。将所得菌株的ITSDNA基因序列在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，发现本发明中所得的菌株与Aspergillus medius(KT832076.1)的ITS序列的相似度为99％，进而通过MEGA软件并采用Neighbor-Joining法对所得菌株的ITSDNA序列构建系统进化树，所得系统进化树，如图1所示。由图1可知，在系统进化树中该菌株的序列与中型曲霉(Aspergillus medius)聚为一簇，本发明分离培养得到的菌株为中型曲霉菌属的菌株。在本发明中，将此菌株命名为：Aspergillus medius SCAU 236，ITSDNA基因序列为：
GGCCGTCGATGCAGGGTCGGACTCTGGGTCACCTCCCATCCGTGTCTATCTGTACCCTGTTGCTTCGGCG
TGGCCACGGCCCGCCGAAGACTAACATTTGAACACTGTCTGAAGTTTGCAGTCTGAGTTTTTAGTTAAAC
AATAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAA
TTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGG
GGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCTTCCGTCCCTGGTA
ACGGGGACGGGCCCAAAAGGCAGTGGCGGCACCATGTCTGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCG
CTCCCGTAGGTCCAGCTGGCAGCTAGCCTCGCAACCAATCTTTTTAACCAGGTTGACCTCGGATCAGGTA
GGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGGCCGGAGGAA
实施例2：
本发明实施例1分离培养的真菌中型曲霉(Aspergillus medius)SCAU236菌株来进一步制备其胞外多糖，其制备方法包括以下步骤：
S1.将中型曲霉(Aspergillus medius)SCAU236菌株接种于液体培养基中(液体培养基组成为：麦芽糖10.0g/L、葡萄糖10.0g/L、甘露醇20.0g/L、七水硫酸镁0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、玉米浆1.0g/L、酵母膏3.0g/L以及海盐30.0g/L，pH值为6.0)，在26℃、140rpm条件下恒温发酵7天，得到发酵液；
S2.将步骤S1.所得的发酵液通过真空过滤泵(双圈定性滤纸)过滤除去菌体，收集滤液；使用旋转蒸发仪将滤液减压浓缩(65℃，30rpm)至原体积的1/4，收集浓缩液；
S3.将步骤S2.所得的浓缩液中分别加入30％和50％浓缩液体积的硫酸铵和叔丁醇，磁力搅拌30min，超高速离心(12000rpm，10min，常温)，静置30min，使其形成三相。上相为叔丁醇相，主要提取色素、脂类等极性较小的物质；中间相为蛋白质提取层；下相为硫酸铵相，主要为多糖等水溶性物质。取下层硫酸铵相，用截留分子量为3000Da的透析袋透析至外界的蒸馏水导电率不变，收集透析袋中截留的液体，冷冻干燥，得到第一真菌中型曲霉的胞外粗多糖；
S4.将步骤S3.中得到的第一真菌中型曲霉的胞外粗多糖，使用一级水通过大孔树脂洗脱(上样浓度500mg/ml，上样5ml，洗脱流速2～3BV/h)后，收集洗脱液，冷冻干燥，得到第二真菌中型曲霉的胞外多糖粗提物。再使用DEAE Fast Flow阴离子交换柱层析进行色素吸附与组分分离，第二真菌中型曲霉的胞外多糖粗提物，上样浓度500mg/ml，上样5ml，洗脱液依次为一级水、0.1M NaCl、0.3M NaCl、0.6M NaCl、0.9M NaCl和1.2M NaCl溶液，流速为1ml/min，每种洗脱剂收集30管(10ml/管)，用苯酚硫酸法绘制多糖洗脱曲线，如图2所示。收集一级水洗脱得到的洗脱液，进行冷冻干燥，得到真菌中型曲霉胞外多糖。
对实施例2得到的真菌中型曲霉胞外多糖，进行组成成分与结构特征的分析，进行相对分子量测定、单糖组成、单糖残基和结构特征等测定与分析，具体的实验操作如下：
1.多糖相对分子量
实验方法：通过HPGPC测定多糖分子量(Mw:重均分子量)和纯度；
样品处理：精确配置0.05M NaCl溶液，过0.45μm滤膜，超声处理10min后室温保存备用。精密称取实施例2得到的真菌中型曲霉胞外多糖和标准品，样品配制成5mg/ml溶液，12000rpm离心10min，上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，后将样品转置于1.8ml进样小瓶中；
色谱柱分析条件：色谱柱为BRT105-104-102串联凝胶柱(8×300mm)；流动相为0.05M NaCl溶液，控制流速为0.6ml/min，柱温为40℃；进样量为20μl；检测器为示差检测器RI-10A。
峰位分子量Mp：最高峰的分子量，Mp也是分子量分布的一种表达方式，用于表征分子量分布极窄的聚合物，如校准聚合物标准品；
数均分子量Mn：数均分子量是样品中所有聚合链分子量的统计平均值，Mn可以通过聚合机制来进行预测，并通过测定给定质量样品中的分子数量来确定，例如端基分析等依数性方法。如果用Mn来表征分子量分布，则Mn两侧分布有同等数量的分子。
重均分子量Mv：重均分子量如下定义相对于Mn，Mw测定平均分子量时把单链分子量大小对Mw的贡献也考虑进去。链的质量越大，对Mw的贡献也越大。通过灵敏地测定分子大小，而不只是测定其数量的方法来确定Mw，如果用Mw表征分子量分布，则Mw两侧分布有同等重量的分子。
实验结果：得到lgMp-RT(峰位分子量)，lgMw-RT(重均分子量)，lgMn-RT(数均分子量)校正曲线：
lgMp-RT校正曲线方程为：y＝-0.1813x+11.654R2＝0.9951；
lgMw-RT校正曲线方程为：y＝-0.1932x+12.211R2＝0.9929；
lgMn-RT校正曲线方程为：y＝-0.1792x+11.494R2＝0.9918
根据标准品曲线，得出计算公式进而计算出每个样品的分子量大小，通过HPGPC测定真菌中型曲霉胞外多糖分子量(Mw)为9015Da，数据结果如图3和表1所示。
表1中型曲霉胞外多糖分子量数据
2.多糖的单糖组成
实验方法：通过离子测谱仪测定真菌中型曲霉胞外多糖的单糖组成；
标准溶液的配制与计算方法：取16种单糖标准品(岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖盐酸盐、盐酸氨基葡萄糖、N-乙酰-D氨基葡萄糖、古罗糖醛酸、甘露糖醛酸)配成约10mg/ml标准溶液。取各单糖标准溶液精密配置5mg/L标准品作为Standard。根据单标法，测定不同单糖浓度，根据单糖摩尔质量计算出摩尔比；
样品准备：精密称量10mg实施例2得到的真菌中型曲霉胞外多糖置于安瓿瓶中，加入3M三氟乙酸10ml，120℃水解3h。准确吸取酸水解溶液转移至管中氮吹吹干，加入5ml水涡旋混匀，吸取100uL加入900uL去离子水，12000rpm离心5min。取上清进IC分析；
色谱条件：色谱柱为DionexCarbopacTMPA20(3*150)，流动相为A:H2O；B:15mMNaOH；C:15mM NaOH&100mM NaOAC，流速设定为0.3ml/min，进样量为5μL，柱温设定为30℃，检测器为电化学检测器；
混标溶剂峰：2.0min为氢氧化钠的峰，41min为乙酸钠的峰；
实验结果：离子色谱分析结果，如图4和表2所示，与单糖标样对比发现，本发明中的真菌中型曲霉胞外多糖是由葡萄糖(100％)单糖聚合成的大分子化合物。
表2中型曲霉胞外多糖单糖组成
3.甲基化
实施例2得到的真菌中型曲霉胞外多糖经甲基化、水解、乙酰化后，经GC-MS测定并与标准质谱图库进行比对。
实验方法：称量实施例2得到的真菌中型曲霉胞外多糖(2-3mg)置于玻璃反应瓶中，加入1mL无水DMSO，快速加入甲基化试剂A液，封闭，在超声作用下溶解，再加入甲基化试剂B液。在磁力搅拌水浴30℃反应60min反应。最后将2mL超纯水加入到上述混合物中终止甲基化反应。取甲基化后的多糖，加入1ml的2M三氟乙酸(TFA)水解90min，旋转蒸发仪蒸干。残基加入2ml双蒸水，60mg硼氢化钠还原8小时，加入冰醋酸中和，旋蒸，101度烘箱烘干，然后加入1ml乙酸酐乙酰化100℃反应1h，冷却。然后加入3mL甲苯，减压浓缩蒸干，重复4-5次，以除去多余的醋酐。将乙酰化后的产物用3mL CH2Cl2溶解后转移至分液漏斗，加入少量蒸馏水充分震荡后，除去上层水溶液，如此重复4次。CH2Cl2层以适量的无水硫酸钠干燥，定容10mL，放入液相小瓶；
分析仪器：采用Shimadzu GCMS-QP 2010气相色谱-质谱联用仪测定乙酰化产物样品；
GC-MS条件：RXI-5SIL MS色谱柱30m*0.25mm*0.25um，程序升温条件为起始温度120℃，以3℃/min升温至250℃/min，保持5min，进样口温度为250℃，检测器温度为250℃/min，载气为氦气，流速为1mL/min；
实验结果：真菌中型曲霉胞外多糖中甲基化单糖形式结果，如图5和表3所示，甲基化处理并通过GC-MS分析出糖残基及比例，结果显示中型曲霉胞外多糖共有4种单糖残基链接方式，分别为2,3,4,6-Me4-Glcp，2,3,6-Me3-Glcp，2,6-Me2-Glcp，2,3-Me2-Glcp，其组成摩尔比依次为：10.4、77.5、6.1、6.0，以此分析中型曲霉胞外多糖主链上主要糖残基连接方式为葡萄糖(1→4)。
表3中型曲霉胞外多糖甲基化糖醇乙酰酯(PMAA)结果分析
| RT | Methylated sugar | Mass fragments(m/z) | Area(％) | Type of linkage |
| 17.483 | 2，3，4，6-Me4-Glcp | 43，71，87，101，117，129，145，161，205 | 10.4 | Glcp-(1→ |
| 22.368 | 2，3，6-Me3-Glcp | 43，87，99，101，113，117，129，131，161，173，233 | 77.5 | →4)-Glcp-(1→ |
| 25.032 | 2，6-Me2-Glcp | 43，87，97，117，159，185 | 6.1 | →3，4)-Glcp-(1→ |
| 27.309 | 2，3-Me2-Glcp | 43，71，85，87，99，101，117，127，150，161，201 | 6.0 | →4，6)-Glcp-(1→ |
4.红外光谱分析
通过傅里叶变化红外光谱仪测定实施例2中的真菌曲霉胞外多糖的官能团；
实验方法：称取1mg充分干燥的真菌中型曲霉胞外多糖，在加热灯下与100mg干燥的溴化钾混合研磨均匀，置于压片机中压至透明片状，再将压片置于VERTEX 70红外光谱仪上，于4000-400cm-1区间内进行红外数据收集；
实验结果：真菌中型曲霉胞外多糖的红外光谱结果，如图6所示。红外光谱显示，在3371.36cm-1处有最强的信号，为O-H伸缩振动吸收带。同时，还检测到与糖类相关的化学键C-H(2929.50cm-1)、C＝O(1643.43cm-1)、C-O-C(1415.04cm-1、1153.77cm-1)，1200-1000cm-1的吸收带表示该多糖中含有吡喃糖。除此之外，在930.78cm-1和851.57cm-1存在红外信号，证明真菌中型曲霉胞外多糖中存在β构型及α构型。
5.核磁共振图谱分析
通过超导核磁共振波谱仪推测实施例2得到的真菌中型曲霉胞外多糖的结构；
实验方法：称取约40mg的真菌中型曲霉胞外多糖样品，溶于0.55ml的D2O中，置于水浴锅中使其充分溶解再离心取上清放入核磁管，在Bruker600MHz核磁共振仪上进行一维(1H NMR和13C NMR)和二维(COSY，HSQC和HMBC)光谱的测定；
实验结果：真菌中型曲霉胞外多糖的核磁结果，如图7所示，结合甲基化的结果，从一维波谱(1H和13C)中能够找到属于4种单糖残基的端基氢和端基碳的化学迁移信号，分别是A(H/C＝5.26ppm/91.88ppm)：D-Glcp-(1→，B(H/C＝5.43ppm/99.55ppm)：→4)-D-Glcp-(1→，C(H/C＝4.68ppm/95.76ppm)：→3,4)-D-Glcp-(1→，D(H/C＝5.00ppm/98.57ppm)：→4,6)-D-Glcp-(1→，并根据它们所归属的化学迁移信号，确定了它们的构型，大于等于5ppm的为α构型，小于5ppm的为β构型。然后再根据二维波谱(COSY和HSQC)确定4种单糖残基中剩余的氢和碳所归属的化学迁移信号，结果如表5所示。最后，结合HMBC谱，确定4种单糖残基的连接方式，得到真菌中型曲霉胞外多糖的结构，如图8所示。
表5真菌中型曲霉胞外多糖残基的化学位移归属
实施例3：
为验证本发明的实施例2所制得的真菌中型曲霉胞外多糖的免疫活性，实验结果如下：
S1.巨噬细胞RAW 264.7细胞的培养
实验内容：在DMEM培养基中加入10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)双抗，作为巨噬细胞RAW 264.7的完全培养基。将冻存的巨噬细胞RAW 264.7复苏后，用完全培养基重悬混匀后置于无菌的培养瓶中，放在37℃、5％CO2的培养箱中培养，待细胞贴壁几乎长满培养瓶底部时进行传代，或铺板进行进一步的实验。
实验操作：
①复苏：从液氮罐中取出装在冻存管中的RAW 264.7细胞，在37℃水浴锅中摇晃使其快速融化后转移至已装有5mL完全培养基的离心管中，吹打混匀后低速离心(1000g，3min)，弃上清，加入5mL新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液转移至细胞培养瓶中，放在37℃、5％ CO2的培养箱中培养过夜再更换新鲜完全细胞培养液继续培养。待贴壁细胞密度为80％左右时可进行传代培养。
②传代：将旧培养基吸弃，用PBS缓冲液清洗2次后，加入5mL新鲜的完全培养基，将细胞从瓶壁吹打下来，将细胞悬液按照一定比例传代至新细胞培养瓶中，放在细胞培养箱中继续培养。
③冻存：将吹打均匀的细胞悬液低速离心(1000r/min，3min)，弃上清，加入细胞冻存液，吹打混匀，转移至无菌冻存管中，标记好细胞名称和冻存时间。-80℃过夜，最后保存至液氮罐中。
S2.真菌中型曲霉胞外多糖对巨噬细胞RAW264.7细胞的影响
实验内容：采用CCK-8法检测中型曲霉胞外多糖对巨噬细胞RAW264.7增殖的影响，采用试剂盒检测中型曲霉胞外多糖对巨噬细胞RAW264.7的NO及免疫调节因子(TNF-α、IL-6)释放量的影响，采用免疫印迹成像法检测真菌中型曲霉胞外多糖对巨噬细胞RAW264.7的免疫调节蛋白(cox-
2、iNOS)表达量的影响，初步判断其免疫调节活性。
实验操作：
①对巨噬细胞RAW264.7增殖的影响：采用CCK-8试剂盒来测定真菌中型曲霉胞外多糖对RAW 264.7细胞增殖的影响。将培养瓶中细胞用完全培养基吹打下来，再用完全培养基将RAW 264.7细胞密度调整1.0×105个/mL，混匀后往96孔板中每孔加入100μL，放入培养箱中培养24h。24h后弃去上清培养液，加入50、100、和200μg/mL浓度的真菌中型曲霉胞外多糖样品，同时设置空白对照组，空白对照组中加细胞和完全培养基，每组设置六个复孔。放置培养箱中培养24h后，每孔加入10μLCCK-8试剂，避光孵育2h后，用酶标仪在450nm波长下检测记录吸光度。
②对RAW 264.7细胞释放NO的影响：采用NO试剂盒来测定真菌中型曲霉胞外多糖对RAW 264.7细胞释放NO的影响。将培养瓶中细胞用完全培养基吹打下来，再用完全培养基将RAW 264.7细胞密度调整2.0×105个/mL，混匀后往12孔板中每孔加入1mL，放入培养箱中培养24h。24h后弃去上清培养液，加入浓度为50、100和200μg/mL的真菌中型曲霉胞外多糖样品，同时设置空白对照组和阳性对照组，空白对照组加入等体积的完全培养基，阳性对照组为2.5μg/mL LPS溶液，每组设置四个复孔。再放置培养箱中培养24h，收集上清液，采用NO试剂盒，根据说明书操作检测NO释放情况。
③对RAW 264.7细胞释放免疫因子的影响：采用ELISA试剂盒来测定中型曲霉胞外多糖对RAW 264.7细胞释放细胞因子的影响。将培养瓶中细胞用完全培养基吹打下来，再用完全培养基将RAW 264.7细胞密度调整2.0×105个/mL，混匀后往12孔板中每孔加入1mL，放入培养箱中培养24h。24h后弃去上清培养液，分别加入浓度为50、100和200μg/mL的真菌中型曲霉胞外多糖样品，同时设置空白对照组。放置培养箱中培养24h，收集上清液，分别用TNF-α及IL-6试剂盒检测对应免疫因子的分泌情况。
④对RAW 264.7细胞蛋白表达的影响：采用Western Blot法来检测中型曲霉胞外多糖对RAW 264.7细胞蛋白表达的影响。将培养瓶中细胞用完全培养基吹打下来，再用完全培养基将RAW 264.7细胞密度调整2.0×105个/mL，混匀后往6孔板中每孔加入2mL，放入培养箱中培养24h。24h后弃去上清培养液，分别加入浓度为50、100和200μg/mL的真菌中型曲霉胞外多糖对样品，同时设置空白对照组，每组设置四个复孔。再放置培养箱中培养24h，弃上清，PBS清洗细胞，每孔加入60μL RIPA裂解液(含PMSF)于冰上裂解15min，用细胞刮轻轻将细胞刮下，收集至1.5mL离心管中，12000rpm，4℃离心10min，收集上清，加入Loadingbuffer沸水浴进行蛋白变性。在120V下进行凝胶电泳45min，使用PVDF膜165mA电流转膜80min，5％BSA封闭液封闭1h。室温孵育一抗(GAPDH、cox-2、iNOS)1.5h，TBST清洗3次，每次5min，室温孵育二抗1h，TBST清洗3次，每次10min。在PVDF膜上滴加发光液，用凝胶成像仪进行显影。
实验结果：
①本发明采用CCK-8法检测中型曲霉胞外多糖对巨噬细胞增殖的影响。结果如图9所示，在50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL浓度梯度，真菌中型曲霉胞外多糖可促进巨噬细胞RAW 264.7的增殖，且存在梯度依赖性。加入真菌中型曲霉胞外多糖后细胞数量均大于150％，说明真菌中型曲霉胞外多糖在设定组别的浓度范围内对巨噬细胞RAW 264.7不存在细胞毒性。
②本发明采用NO试剂盒检测中型曲霉胞外多糖对RAW 264.7细胞释放NO的影响进而判断中型曲霉胞外多糖对巨噬细胞的刺激作用。结果如图10所示，与空白对照组相比，50-200μg/mL浓度梯度的真菌中型曲霉胞外多糖处理组均能显著性促进NO的释放(p<0.01)，剂量和促进效果呈现剂量依赖性，但仍然小于阳性对照LPS处理组的NO释放量，表现为促炎活性。对NO释放量的促进作用说明真菌中型曲霉胞外多糖对巨噬细胞RAW 264.7具有较强的免疫刺激作用。
③本发明采用ELISA试剂盒检测中型曲霉胞外多糖对RAW 264.7细胞释放免疫因子的影响，表明中型曲霉胞外多糖存在免疫应答反应。结果如图11所示，与空白对照组相比，细胞免疫因子(TNF-α、IL-6)的分泌量在50、100和200μg/mL剂量下的真菌中型曲霉胞外多糖处理下均上调。以上结果表明真菌中型曲霉胞外多糖可促进巨噬细胞RAW 264.7中免疫相关因子的释放，表明真菌中型曲霉胞外多糖可产生免疫应答。
④本发明采用Western Blot法验证真菌中型曲霉胞外多糖对RAW264.7细胞免疫相关蛋白表达的影响，表明真菌中型曲霉胞外多糖存在免疫应答反应。结果如图12所示，与空白对照组相比，细胞免疫相关蛋白(cox-2、iNOS)的表达在50、100和200μg/mL剂量下的真菌中型曲霉胞外多糖处理下呈剂量依赖性增多。以上结果表明真菌中型曲霉胞外多糖可上调巨噬细胞RAW 264.7中免疫相关蛋白的表达，表明真菌中型曲霉胞外多糖有较显著的免疫活性。
实施例4：
为验证本发明的真菌中型曲霉胞外多糖介导铁死亡产生免疫活性，在实施例3测得免疫活性基础上，对其进行铁死亡相关指标的检测，以体现实验结果。
S1.真菌中型曲霉胞外多糖对巨噬细胞RAW264.7细胞的影响
实验内容：采用免疫印迹成像法检测真菌中型曲霉胞外多糖对巨噬细胞RAW264.7的免疫调节蛋白(cox-2、iNOS)表达量的影响，采用流式细胞术检测真菌中型曲霉胞外多糖对巨噬细胞RAW264.7的脂质过氧化水平的影响，进一步判断其通过介导铁死亡机制产生免疫调节活性。
实验操作：
①对RAW 264.7细胞蛋白表达的影响：采用Western Blot法来检测中型曲霉胞外多糖对RAW 264.7细胞蛋白表达的影响。将培养瓶中细胞用完全培养基吹打下来，再用完全培养基将RAW 264.7细胞密度调整2.0×105个/mL，混匀后往6孔板中每孔加入2mL，放入培养箱中培养24h。24h后弃去上清培养液，两组分别加入浓度为200μg/mL的真菌中型曲霉胞外多糖，其中一组加入1μM铁死亡抑制剂Fer-1，同时设置空白对照组，空白对照组加入等体积的完全培养基，每组设置四个复孔。再放置培养箱中培养24h，弃上清，PBS清洗细胞，每孔加入60μL RIPA裂解液(含PMSF)于冰上裂解15min，用细胞刮轻轻将细胞刮下，收集至1.5mL离心管中，12000rpm，4℃离心10min，收集上清，加入Loading buffer沸水浴进行蛋白变性。在120V下进行凝胶电泳45min，使用PVDF膜165mA电流转膜80min，5％ BSA封闭液封闭1h。室温孵育一抗(GAPDH、cox-2、iNOS)1.5h，TBST清洗3次，每次5min，室温孵育二抗1h，TBST清洗3次，每次10min。在PVDF膜上滴加发光液，用凝胶成像仪进行显影。
②采用流式细胞术检测细胞脂质过氧化水平，验证真菌中型曲霉孢外多糖的免疫活性与铁死亡之间的相关性。将培养瓶中细胞用完全培养基吹打下来，再用完全培养基将RAW 264.7细胞密度调整2.0×105个/mL，混匀后往12孔板中每孔加入1mL，放入培养箱中培养24h。24h后弃去上清培养液，分别加入浓度为50、100、200μg/mL和200μg/mL的真菌中型曲霉胞外多糖，其中一组200μg/mL的加入1μM铁死亡抑制剂Fer-1，同时设置空白对照组，空白对照组加入等体积的完全培养基，每组设置三个复孔，再放置培养箱中培养24h。24h后弃去上清，加入10μM的C11 BODIPY 581/591脂质过氧化荧光探针孵育1h，PBS漂洗3次，每孔加入50μL胰酶消化细胞，待细胞消化完全，加入1mL含5％FBS的PBS将细胞收集至离心管中，用流式细胞仪进行检测。
实验结果：
①本发明采用Western Blot法验证真菌中型曲霉胞外多糖对RAW264.7细胞免疫相关蛋白表达的影响，表明真菌中型曲霉胞外多糖存在免疫应答反应且可能与铁死亡相关。结果如图13所示，在加入了铁死亡抑制剂Fer-1(1μM)后，显著下调了200μg/mL剂量下的真菌中型曲霉胞外多糖处理引起的免疫蛋白(cox-2、iNOS)表达上调。以上结果表明真菌中型曲霉胞外多糖可上调巨噬细胞RAW 264.7中免疫相关蛋白的表达，该蛋白表达的上调可以被铁死亡抑制剂抑制，表明真菌中型曲霉胞外多糖或可通过介导铁死亡产生免疫应答。
②本发明采用流式细胞术验证真菌中型曲霉胞外多糖对RAW264.7细胞脂质过氧化水平的影响，进而引起细胞发生铁死亡。结果如图14所示，与空白对照相比，细胞脂质过氧化程度在50、100和200μg/mL剂量下的真菌中型曲霉胞外多糖处理下呈剂量依赖性上调，而加入铁死亡抑制剂Fer-1(1μM)后，显著下调了200μg/mL剂量下的真菌中型曲霉胞外多糖处理引起的脂质过氧化。以上结果表明真菌中型曲霉胞外多糖促进了RAW264.7细胞的脂质过氧化，引起细胞铁死亡，进而调节了其免疫活性。
上述为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述内容的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.真菌中型曲霉胞外多糖，其特征在于：所述真菌中型曲霉发酵胞外多糖结构式为：
2.根据权利要求1所述的真菌中型曲霉胞外多糖，其特征在于：所述真菌中型曲霉胞外多糖重均分子量为9015Da，以摩尔百分比计，真菌中型曲霉胞外多糖的单糖组成为葡萄糖100％。
3.根据权利要求1或2所述的真菌中型曲霉胞外多糖，其特征在于：所述真菌中型曲霉发酵胞外多糖，是以真菌中型曲霉(Aspergillus medius)SCAU236菌株，接种至培养基中进行发酵，得到的发酵液中分离得到的；
所述真菌中型曲霉(Aspergillus medius)SCAU236菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63136，保藏日期2023年1月12日。
4.根据权利要求1或2或3所述的真菌中型曲霉胞外多糖的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)分离真菌中型曲霉(Aspergillus medius)SCAU236菌株，所述真菌中型曲霉(Aspergillus medius)SCAU236菌株采集自中国南海珊瑚鱼的肠样；
(2)将上述真菌中型曲霉(Aspergillus medius)SCAU236菌株进行液体发酵，收集发酵液；
(3)将上述发酵液中的多糖进行分离，得到真菌中型曲霉胞外粗多糖；
(4)将上述真菌中型曲霉胞外粗多糖，用DEAE Fast Flow阴离子交换柱层析，收集洗脱峰，进行冷冻干燥，得到真菌中型曲霉胞外多糖。
5.根据权利要求4所述的真菌中型曲霉胞外多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中液体发酵的液体培养基包括：：麦芽糖10.0g/L、葡萄糖10.0g/L、甘露醇20.0g/L、七水硫酸镁0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、玉米浆1.0g/L、酵母膏3.0g/L、海盐30.0g/L以及L-半胱氨酸0.5g/L，溶剂为水。
6.根据权利要求4所述的真菌中型曲霉胞外多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，从发酵液中分离多糖的方法包括如下步骤：
1)去除发酵液中的菌体，浓缩，得浓缩液；
2)用硫酸铵和叔丁醇混合体系，除去上述浓缩液中的蛋白和杂质，收集硫酸铵相；
3)用截留分子量为3000Da的透析袋，透析上述硫酸铵相，收集透析袋中截留的液体，冷冻干燥，得到第一真菌中型曲霉胞外粗多糖；
4)上述第一真菌中型曲霉胞外粗多糖进行大孔树脂洗脱，洗脱液为一级水，收集洗脱峰，进行冷冻干燥，得到第二真菌中型曲霉胞外粗多糖。
7.根据权利要求6所述的真菌中型曲霉胞外多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中，所述第二真菌中型曲霉胞外粗多糖用DEAE Fast Flow阴离子交换柱层析，洗脱液依次为一级水和NaCl溶液，收集一级水洗脱得到的洗脱液，进行冷冻干燥，得到真菌中型曲霉胞外多糖。
8.根据权利要求6所述的真菌中型曲霉胞外多糖的制备方法，其特征在于：所述去除发酵液中的菌体，采用真空过滤泵过滤除去菌体，收集滤液，用旋转蒸发仪60-70℃将滤液减压浓缩，得浓缩液；
所述硫酸铵和叔丁醇混合体系与浓缩液的体积比为(2-4):(4-6):(8-10)磁力搅拌40-50min，超高速离心(8000-12000rpm，10min，常温)，静置20-40min，形成三相，收集硫酸铵相。
9.根据权利要求5所述的真菌中型曲霉胞外多糖的制备方法，其特征在于：步骤(2)中液体发酵前将真菌中型曲霉(Aspergillus medius)SCAU236菌株在PDA培养基中进行活化。
10.一种如权利要求1或2或3所述的真菌中型曲霉胞外多糖在制备具备免疫调节制剂中的应用。
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN118165131A true CN118165131A (zh) | 2024-06-11 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication |