CN114456948B

CN114456948B - 产黑色素短梗霉菌菌株、其胞外多糖及胞外多糖的应用

Info

Publication number: CN114456948B
Application number: CN202111544621.2A
Authority: CN
Inventors: 黄日明; 林雨锜; 张晓勇; 杨佳佳; 雷红涛; 徐振林
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2021-12-16
Filing date: 2021-12-16
Publication date: 2023-08-08
Anticipated expiration: 2041-12-16
Also published as: CN114456948A

Abstract

本发明公开了一种产黑色素短梗霉菌菌株SCAU 266，由该产黑色素短梗霉菌制备得到的胞外多糖，以及该胞外多糖在免疫调节中的应用。产黑色素短梗霉菌SCAU 266，表现出较高的粗多糖产量，该多糖对单核巨噬细胞(RAW264.7)表现出显著的免疫调节活性，同时，首次借助在线数据库判断多糖针对其特有活性的可能作用靶点和潜在机制分析，提出多糖的免疫活性靶标预测模型的构建及应用，对于海洋微生物多糖的提取制备、分离纯化以及活性分析提供一种全新的方法，对挖掘新海洋微生物多糖实属必要。

Description

产黑色素短梗霉菌菌株、其胞外多糖及胞外多糖的应用

技术领域

本发明涉及微生物多糖技术领域，尤其涉及一株海洋真菌产黑色素短梗霉菌(Aureobasidium melanogenum)SCAU 266、由该产黑色素短梗霉菌制备得到的胞外多糖，以及该胞外多糖在免疫调节中的应用。

背景技术

海洋真菌是海洋微生物的一个重要分支，真菌普遍合成分泌胞外多糖。微生物胞外多糖属于微生物的次级代谢产物，是微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外，与菌体分离后分泌到发酵液中的一种水溶性多糖，这类次级代谢产物具有包括免疫调节、抗肿瘤、抗菌以及降血脂等作用在内的多种活性，真菌多糖并不能直接杀死肿瘤细胞,但却可以刺激机体免疫能力,从而达到抑制肿瘤细胞增生的目的。但目前这类微生物次级代谢产物在免疫治疗上的应用仍十分缺乏，原因在于这类代谢物包括微生物胞外多糖的开发不全面，开发技术有待改进，在提取制备上的条件仍不成熟进一步引起制备成本的增加，加上微生物胞外多糖的产量较其他来源的多糖显著低，这些原因都限制了微生物次级代谢产物的进一步研究和利用。

目前，已有一些胞外多糖生产菌从不同的海洋环境中被分离，胡谷平等首次从南海海洋红树林真菌(1356号)的菌体中分离纯化出两种新型多糖W₁₁和W₂₁,W₁₁主要是由葡萄糖和半乳糖的摩尔比按3:2比例组成(胡谷平,佘志刚,吴耀文,等.南海海洋红树林内生真菌(1356号)胞外多糖的研究[J].中山大学学报(自然科学版),2002,41(1):121-122)。体外细胞毒试验显示从南海海洋红树林真菌(1356号)的菌体中分离纯化出的W₂₁的HepG2和Bel7402半数杀伤浓度(IC50)分别为50mg/L和25mg/L,有一定的细胞毒作用。体内抑瘤试验显示W₂₁与环磷酰胺合用,可提高环磷酰胺的抑瘤率,提高机体的免疫作用。

孙海红等从深海真菌Penicillium sp.F23-2中提取纯化得胞外多糖LEPS1-1、LEPS1-2、LEPS-2,结构分析结果表明3种胞外多糖均以甘露糖含量为最高,同时含有少量或微量的葡萄糖和半乳糖(Sun H H,Mao W J,Chen Y,et al.The chemicalcharacteristics and antioxidative activities of three exopolysaccharides froma deep sea fungus Penicillium sp.F23-2[J].Carbohydrate polymer.2009,78(1):117-124)。

在我们收集的海洋真菌产黑色素短梗霉菌SCAU 266，表现出较高的粗多糖产量，但其结构特征和潜在活性并未被研究，因此，本发明重点阐明一株海洋产黑色素短梗霉菌SCAU 266、其胞外多糖的分离纯化、结构鉴定以及明确其免疫调节活性，同时，首次借助在线数据库判断多糖针对其特有活性的可能作用靶点和潜在机制分析，提出多糖的免疫活性靶标预测模型的构建及应用，对于海洋微生物多糖的提取制备、分离纯化以及活性分析提供一种全新的方法，对挖掘新海洋微生物多糖实属必要。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一株海洋真菌产黑色素短梗霉菌(Aureobasidiummelanogenum)SCAU 266。

本发明的另一个目的在于提供一种由上述产黑色素短梗霉菌(Aureobasidiummelanogenum)SCAU 266产生的胞外多糖，以及该胞外多糖的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述胞外多糖的应用。

所述产黑色素短梗霉菌菌株SCAU 266，为海洋真菌产黑色素短梗霉菌Aureobasidium melanogenum，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地点为广东省广州市先烈中路100号广东省微生物研究所59号楼5楼，保藏中心登记入册编号为GDMCC 62090，保藏编号为GDMCC 62090，保藏日期2021年11月30日。

本发明的海洋真菌产黑色素短梗霉菌(Aureobasidium melanogenum)SCAU 266是从南沙群岛石珊瑚(Scleractinia)中分离得到的，将石珊瑚用无菌水冲洗，除去松散附着的微生物，将清洗后的样品研碎，加入无菌海水和无菌砂土并混合匀浆，稀释，接种到琼脂板上，28℃环境下培养5～14天，随机从平板上挑取形态大小不同的菌落进行纯化培养，得到真菌菌株；提取所得菌株的基因组，PCR扩增其ITS DNA基因，将所得菌株的ITS DNA基因序列在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，通过MEGA软件并采用Neighbor-Joining法对所得菌株的ITS DNA序列构建系统进化树，在系统进化树中该菌株的序列与产黑色素短梗霉菌(Aureobasidium melanogenum)聚为一簇，本发明分离培养得到的菌株为产黑色素短梗霉菌菌属的新菌株。在本发明中，将此新菌株命名为：Aureobasidiummelanogenum SCAU266。

所述的产黑色素短梗霉菌生产胞外多糖的方法，包括如下步骤：

S1、获得发酵液：将产黑色素短梗霉菌菌株SCAU 266接种于液体培养基中发酵，发酵条件为28℃、130rpm恒温培养发酵7天，得发酵液；

所述的液体培养基为麦芽糖20.0g/L、葡萄糖10.0g/L、甘露醇20.0g/L、谷氨酸钠10.0g/L、七水硫酸镁0.3g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、玉米浆1.0g/L、酵母膏3.0g/L以及海盐30.0g/L，pH值为7.5；

S2、除菌体：将步骤S1所述的发酵液抽滤除去菌体，收集滤液，减压浓缩，得减压浓缩液；

S3、醇沉：向步骤S2所述的减压浓缩液中加入无水乙醇，低温过夜，离心，收集沉淀；

S4、除蛋白：将步骤S3所述的沉淀溶于去离子水，加入Sevag溶液除蛋白，离心，取水相移入透析袋，透析，收集透析袋中截留的液体，冷冻干燥，得产黑色素短梗霉菌胞外多糖粗提物；

S5、将步骤S4中的产黑色素短梗霉菌胞外多糖粗提物用去离子水配置成溶液，经大孔树脂柱进行色素吸附，洗脱液为去离子水，DEAE Fast Flow阴离子交换柱层析，洗脱液依次为超纯水、0.1M NaCl溶液、0.3M NaCl、0.6M NaCl、0.9M NaCl和1.2M NaCl，流速为1ml/min，收集超纯水得到的洗脱液，冷冻干燥，得产黑色素短梗霉菌胞外多糖。

进一步的，所述的步骤S2中的抽滤为定性滤纸抽滤，所述的减压浓缩液为原体积的20％-35％。

进一步的，所述的步骤S3中加入的无水乙醇与减压浓缩液的体积比为(3-5)：1，所述的低温为4℃。

进一步的，所述步骤S4中沉淀溶于去离子水的体积与Sevag溶液的体积比为(1-2):1，所述的透析袋直径16mm，截留分子量3000Da的透析袋。

进一步的，所述步骤S5中产黑色素短梗霉菌胞外多糖粗提物浓度为10～50mg/mL，上样量为2mL，大孔树脂柱型号是NAK-9，DEAE Fast Flow阴离子交换柱规格为2.6cm×50cm。

通过HPGPC测定多糖分子量为7966道尔顿。

通过离子测谱仪测定产黑色素短梗霉菌胞外多糖的单糖组成，所述的胞外多糖的单糖组成为葡萄糖，甘露糖，半乳糖，摩尔比为0.973：0.019：0.008。

甲基化处理，并通过GC-MS分析出糖残基及比例，结果显示所述的产黑色素短梗霉菌胞外多糖共有6种单糖残基链接方式，分别为2,3,4,6-Me4-Glcp、3,4,6-Me3-Manp、3,4,6-Me3-Glcp、2,3,6-Me3-Glcp、2,3,4-Me3-Glcp、2,3-Me2-Glcp，摩尔比为：10.98、3.08、2.75、61.96、4.82、16.42。

通过傅立叶变换红外光谱仪(FT-IR)分析多糖的官能团，推测该胞外多糖的潜在结构。

通过扫描电镜分析该产黑色素短梗霉菌胞外多糖在100倍电镜条件下，多糖样品呈混杂的片状结构和棒状结构，结构形状多样，大小不一；500倍条件下，多糖呈现薯片或蛋卷状，表面相对光滑平整；2000倍条件下，多糖表面被放大，呈片层结构，结构大体上较为致密，表面较为光滑，质地均匀，伴随部分不规则碎片。

本发明采用CCK-8法检测产黑色素短梗霉菌胞外多糖对巨噬细胞增殖的影响。结果显示，在25μg/mL和50μg/mL浓度梯度，产黑色素短梗霉菌胞外多糖可促进巨噬细胞RAW264.7的增殖，且存在梯度依赖性。当产黑色素短梗霉菌胞外多糖浓度高于100μg/mL时，增殖效果有所下降，可能是由于细胞过多增殖竞争营养物质或过多产生代谢物导致。但在25-200μg/mL浓度范围内，细胞总体未低于100％，说明产黑色素短梗霉菌胞外多糖在设定组别的浓度范围内对巨噬细胞RAW 264.7不存在细胞毒性。

本发明采用NO试剂盒检测产黑色素短梗霉菌胞外多糖对巨噬细胞RAW 264.7释放NO的影响，进而判断产黑色素短梗霉菌胞外多糖对巨噬细胞RAW 264.7的刺激作用。结果显示，与空白对照组相比，25-200μg/mL浓度梯度的产黑色素短梗霉菌胞外多糖处理组均能显著性促进NO的释放(p<0.01)，剂量和促进效果呈现剂量依赖性，但仍然小于阳性对照LPS处理组的NO释放量，表现为促炎活性。对NO释放量的促进作用说明产黑色素短梗霉菌胞外多糖对巨噬细胞RAW 264.7具有较强的免疫刺激作用。

采用ELISA试剂盒检测产黑色素短梗霉菌胞外多糖对巨噬细胞RAW 264.7释放免疫因子的影响，表明产黑色素短梗霉菌胞外多糖存在免疫应答反应。结果显示，与空白对照组相比，细胞免疫因子(COX-2、iNOS、TNF-α、IL-10、IL-6、IL-1β)的分泌量在50、100和200μg/mL剂量下的产黑色素短梗霉菌胞外多糖处理下呈剂量依赖性增多。以上结果表明产黑色素短梗霉菌胞外多糖可促进巨噬细胞RAW 264.7中免疫相关因子的释放，表明产黑色素短梗霉菌胞外多糖或可对免疫应答产生显著影响。

免疫荧光技术验证产黑色素短梗霉菌胞外多糖的免疫活性。结果显示，在免疫荧光显微镜下的荧光成像可以看到，不添加产黑色素短梗霉菌胞外多糖的对照组没有荧光呈现，而在浓度为50μg/mL到200μg/mL的浓度梯度条件下，荧光成像呈梯度相关性，且随着多糖样液浓度的增加荧光成像的密度效果更加接近阳性对照LPS组，免疫荧光的成像进一步验证了上述免疫活性结果。

本发明借助在线数据库，首次分析多糖免疫调节潜在靶点及通路。利用SwissTarget Prediction和TCMSP在线数据库，获取多糖潜在作用靶点共计34个，通过GeneCards数据库进行数据处理与筛选后，最终确定疾病靶点8821个；通过STRING数据库分析共有靶点的蛋白互作关系。结果显示，确定产黑色素短梗霉菌胞外多糖针对免疫缺陷疾病的共有靶点为28个，以及28个靶点之间的蛋白互作网络图，以呈现多糖如何通过“多靶点、多途径、多层次”整合调控发挥药效。利用DAVID对获取的多糖免疫调节靶点信息进行GO富集和KEGG通路注释分析，结果显示产黑色素短梗霉菌胞外多糖的免疫调节机制与介导基因表达、激活免疫细胞等相关，可能通过作用在Alzheimer's disease、Notch signaling pathway和Metabolic pathways这三条通路中的潜在靶点，包括早老素γ分泌酶抗体APH1A、乳酸链球菌肽NCSTN、雌激素调节蛋白PSEN2实现免疫调节活性。因此，本发明方法为阐释产黑色素短梗霉菌胞外多糖发挥免疫调节作用的分子机制提供新思路，为进一步研发产黑色素短梗霉菌胞外多糖创新产品奠定基础。

附图说明

图1本发明的海洋真菌产黑色素短梗霉菌的ITS DNA序列构建的系统进化树；

图2本发明中制得的胞外多糖的DEAE Fast Flow洗脱曲线图；

图3本发明中制得的胞外多糖的分子量凝胶色谱图；

图4本发明中制得的胞外多糖的单糖组成离子色谱图，a为混标离子色谱图，b为样品多糖离子色谱图；

图5本发明中制得的胞外多糖的甲基化单糖残基分析图；

图6本发明中制得的胞外多糖的傅里叶变换红外光谱图；

图7本发明中制得的胞外多糖的扫描电镜图；

图8本发明中制得的胞外多糖对巨噬细胞RAW 264.7细胞增殖的影响图；

图9本发明中制得的胞外多糖对RAW 264.7细胞释放NO的影响图；

图10本发明中制得的胞外多糖对RAW 264.7细胞释放免疫因子的影响图；

图11本发明中制得的胞外多糖的免疫活性的免疫荧光图；

图12本发明中制得的胞外多糖针对免疫缺陷的作用靶点Venn图；

图13本发明中制得的胞外多糖针对免疫缺陷的GO富集图；

图14本发明中制得的胞外多糖针对免疫缺陷的KEGG通路图；

图15本发明中制得的胞外多糖针对免疫缺陷的网络可视化图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：分离培养产黑色素短梗霉菌菌株SCAU 266，具体操作步骤如下：

S1.样品采集处理：采集南沙群岛石珊瑚(Scleractinia)3～5个样品，装入无菌无水的塑料袋中，冷冻保藏至实验室，后将石珊瑚样品用无菌海水冲洗三次，以除去松散附着的微生物，并取清洗后的样品15～20g，切成体积约为1cm3的小块后用研钵研碎；

S2.样品接种：将步骤S1中研碎的样品加入体积比为2:1的无菌海水和无菌砂土中并混合均匀，制成的匀浆用无菌海水进行10倍稀释后，量取0.1mL并接种到预先准备的琼脂板上，设立3个平行组；

S3.菌株分离培养：将接种后的琼脂板置于28℃环境下培养5～14天，直至能区分出真菌的形态学特征，根据其生物学特性的差异，对真菌生长特性、气生菌丝、底物菌丝、可扩散色素、孢子进行观察，挑取真菌单个菌落转移到相应的培养基上，继续于28℃环境下培养，得到真菌菌株；

S4.菌株鉴定：提取所得菌株的基因组，PCR扩增其ITS DNA基因，PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性60s、55℃退火60s、72℃延伸90s；最后72℃延伸10min；根据ITSDNA基因序列在微生物种属中的保守性，把所得菌株的ITS DNA基因提交到NCBI GenBank数据库获得登陆号，进而进行鉴定，该菌株的ITS DNA基因序列如SEQ ID NO.1所示(详见本发明附件的核苷酸序列表)。将所得菌株的ITS DNA基因序列在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，发现本发明中所得的菌株与Aureobasidium melanogenum(NR_159598.1)的ITS序列的相似度为99％，进而通过MEGA软件并采用Neighbor-Joining法对所得菌株的ITS DNA序列构建系统进化树，所得系统进化树如图1所示。由图1可知，在系统进化树中该菌株的序列与产黑色素短梗霉菌(Aureobasidiummelanogenum)聚为一簇，本发明分离培养得到的菌株为产黑色素短梗霉菌菌属的新菌株。在本发明中，将此新菌株命名为：Aureobasidiummelanogenum SCAU 266，其核苷酸序列表SEQ ID NO.1如下：

序列表

实施例2：通过本发明实施例1分离培养的产黑色素短梗霉菌(Aureobasidiummelanogenum)SCAU 266来进一步制备其胞外多糖，其制备方法包括以下步骤：

S1.将实施例1中的产黑色素短梗霉菌菌株SCAU 266接种于液体培养基中，液体培养基组成为：麦芽糖20.0g/L、葡萄糖10.0g/L、甘露醇20.0g/L、谷氨酸钠10.0g/L、七水硫酸镁0.3g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、玉米浆1.0g/L、酵母膏3.0g/L以及海盐30.0g/L，pH值为7.5，在28℃、130rpm条件下恒温发酵7天，得到产黑色素短梗霉菌发酵液；

S2.将步骤S1所得的发酵液抽滤除去菌体，抽滤采用定性滤纸抽滤，收集滤液，减压浓缩至原体积的1/3，收集浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇，相当于75％乙醇醇沉，低温4℃静置过夜；

S3.将步骤S2所得的醇沉液进行超高速离心(12000r/min，10min，常温)，弃去上清液，收集底部沉淀物，用去离子水充分溶解后，加入1/2的Sevag溶液除去蛋白质，后用截留分子量为3000Da的透析袋透析，所述透析袋直径为16mm，至外界的蒸馏水导电率不变，收集透析袋中截留的液体，冷冻干燥，得到产黑色素短梗霉菌胞外多糖粗提物；

S4.将步骤S3中得到的产黑色素短梗霉菌胞外多糖粗提物通过大孔树脂，所述大孔树脂型号是NAK-9，洗脱液为去离子水；DEAE Fast Flow阴离子交换柱层析，柱子规格为2.6cm×50cm，洗脱液依次为超纯水、0.1M NaCl溶液、0.3MNaCl、0.6M NaCl、0.9M NaCl和1.2M NaCl，流速为1ml/min，进行色素吸附与组分分离，每种洗脱剂收集30管(10ml/管)，后用苯酚硫酸法绘制多糖洗脱曲线，结果如图2所示。收集超纯水得到的洗脱液，进行冷冻干燥，得到产黑色素短梗霉菌胞外多糖。

实施例3：通过HPGPC测定实施例2中多糖分子量和纯度；

样品处理：精确配置0.05M NaCl溶液，过0.45μm滤膜，超声处理10min后室温保存备用。精密称取实施例2中产黑色素短梗霉菌胞外多糖和标准品，样品配制成5mg/ml溶液，12000rpm离心10min，上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，后将样品转置于1.8ml进样小瓶中；

色谱柱分析条件：色谱柱为BRT105-104-102串联凝胶柱(8×300mm)；流动相为0.05M NaCl溶液，控制流速为0.6ml/min，柱温为40℃；进样量为20μl；检测器为示差检测器RI-10A。

峰位分子量Mp：最高峰的分子量，Mp也是分子量分布的一种表达方式，用于表征分子量分布极窄的聚合物，如校准聚合物标准品；

数均分子量Mn：数均分子量是样品中所有聚合链分子量的统计平均值，Mn可以通过聚合机制来进行预测，并通过测定给定质量样品中的分子数量来确定，例如端基分析等依数性方法。如果用Mn来表征分子量分布，则Mn两侧分布有同等数量的分子。

重均分子量Mw：重均分子量如下定义相对于Mn，Mw测定平均分子量时把单链分子量大小对Mw的贡献也考虑进去。链的质量越大，对Mw的贡献也越大。通过灵敏地测定分子大小，而不只是测定其数量的方法来确定Mw，如果用Mw表征分子量分布，则Mw两侧分布有同等重量的分子。

实验结果：得到lgMp-RT(峰位分子量)，lgMw-RT(重均分子量)，lgMn-RT(数均分子量)校正曲线：

lgMp-RT校正曲线方程为：y＝-0.1861x+11.927，R2＝0.9968；

lgMw-RT校正曲线方程为：y＝-0.1985x+12.509，R2＝0.9964；

lgMn-RT校正曲线方程为：y＝-0.1839x+11.763，R2＝0.9933；

根据标准品曲线，得出计算公式进而计算出每个样品的分子量大小，通过HPGPC测定产黑色素短梗霉菌胞外多糖分子量(Mw)为7966Da，数据结果如图3和表1所示。

表1产黑色素短梗霉菌胞外多糖分子量数据

实施例4：通过离子测谱仪测定实施例2中多糖的单糖组成；

标准溶液的配制与计算方法：取16种单糖标准品(岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖盐酸盐、盐酸氨基葡萄糖、N-乙酰-D氨基葡萄糖、古罗糖醛酸、甘露糖醛酸)配成约10mg/ml标准溶液。取各单糖标准溶液精密配置5mg/L标准品作为Standard。根据单标法，测定不同单糖浓度，根据单糖摩尔质量计算出摩尔比；

样品准备：精密称量10mg样品置于安瓿瓶中，加入3M三氟乙酸10ml，120℃水解3h。准确吸取酸水解溶液转移至管中氮吹吹干，加入5ml水涡旋混匀，吸取100uL加入900uL去离子水，12000rpm离心5min。取上清进离子色谱分析；

色谱条件：色谱柱为DionexCarbopacTMPA20(3×150)，流动相为A:H₂O；B:15mMNaOH C:15mM NaOH&100mM NaOAC，流速设定为0.3ml/min，进样量为5μL，柱温设定为30℃，检测器为电化学检测器；

混标溶剂峰：20min为氢氧化钠的峰，40min为乙酸钠的峰；

实验结果：离子色谱分析结果如图4和表2所示，与单糖标样对比发现，本发明中的海洋产黑色素短梗霉菌(Aureobasidium melanogenum)SCAU 266制备的胞外多糖是由葡萄糖(97.3％)、甘露糖(1.9％)、半乳糖(0.8％)三种单糖聚合成的大分子化合物。

表2产黑色素短梗霉菌胞外多糖单糖组成

实施例5：实施例2多糖经甲基化、水解、乙酰化后，经GC-MS测定并与标准质谱图库进行比对。

实验方法：称量实施例2产黑色素短梗霉菌胞外多糖样品(2-3mg)置于玻璃反应瓶中，加入1mL无水DMSO，快速加入甲基化试剂A液，封闭，在超声作用下溶解，再加入甲基化试剂B液。在磁力搅拌水浴30℃反应60min反应。最后将2mL超纯水加入到上述混合物中终止甲基化反应。取甲基化后的多糖，加入1ml的2M三氟乙酸(TFA)水解90min，旋转蒸发仪蒸干。残基加入2ml双蒸水，60mg硼氢化钠还原8小时，加入冰醋酸中和，旋蒸，101度烘箱烘干，然后加入1ml乙酸酐乙酰化100℃反应1h，冷却。然后加入3mL甲苯，减压浓缩蒸干，重复4-5次，以除去多余的醋酐。将乙酰化后的产物用3mLCH₂Cl₂溶解后转移至分液漏斗，加入少量蒸馏水充分震荡后，除去上层水溶液，如此重复4次。CH₂Cl₂层以适量的无水硫酸钠干燥，定容10mL，放入液相小瓶；

分析仪器：采用Shimadzu GCMS-QP 2010气相色谱-质谱联用仪测定乙酰化产物样品；

GC-MS条件：RXI-5SIL MS色谱柱30m*0.25mm*0.25um，程序升温条件为起始温度120℃，以3℃/min升温至250℃/min，保持5min，进样口温度为250℃，检测器温度为250℃/min，载气为氦气，流速为1mL/min；

实验结果：产黑色素短梗霉菌胞外多糖中甲基化单糖形式结果如图5和表3所示，甲基化处理并通过GC-MS分析出糖残基及比例，结果显示产黑色素短梗霉菌胞外多糖共有6种单糖残基链接方式，分别为2,3,4,6-Me4-Glcp、3,4,6-Me3-Manp、3,4,6-Me3-Glcp、2,3,6-Me3-Glcp、2,3,4-Me3-Glcp、2,3-Me2-Glcp，其组成摩尔比依次为：10.98、3.08、2.75、61.96、4.82、16.42，以此分析产黑色素短梗霉菌胞外多糖主链上主要糖残基连接方式为葡萄糖(1→4)，且有少量的甘露糖残基，其中半乳糖残基由于含量极低，可能在甲基化处理过程中丢失或低于检测限而未被检测出。

表3产黑色素短梗霉菌胞外多糖甲基化糖醇乙酰酯(PMAA)结果分析

实施例6：通过傅立叶变换红外光谱仪(FT-IR)分析实施例2中多糖的官能团；

样品预处理：精密称量实施例2中产黑色素短梗霉菌胞外多糖样品2mg和溴化钾200mg，压制成片，空白对照采用溴化钾粉末压片而成，分别置于傅里叶变换红外光谱仪FT-IR650(天津港东科技发展股份有限公司)进行扫描记录；

扫描参数：4000～400cm^-1范围；

实验结果：产黑色素短梗霉菌胞外多糖的红外结果如图6所示，结果显示吸收带在3600-3200cm^-1是-OH的伸缩振动吸收峰，这个区域的吸收峰是糖类的特征峰。具体如下：3386cm^-1是O-H的伸缩振动吸收峰，是糖类的特征峰。在2927cm^-1处有一个吸收峰，归属于C-H伸缩振动。在1643cm^-1处有吸收峰，可能归属于结晶水。在1413cm^-1处和1149cm^-1处有吸收峰，可能归属于C-O伸缩振动。在1367cm^-1处有吸收峰，可能归属于C＝O对称伸缩振动。在1236cm^-1处有吸收峰，可能归属于O-H的变角振动。在927cm^-1处的吸收峰归属于吡喃环的非对称环伸缩振动。在846cm^-1处的吸收峰归属于吡喃环的α-端基差向异构的C-H变角振动。

实施例7：实施例2中多糖扫描电镜；

实验方法：取约5mg干燥后实施例2的产黑色素短梗霉菌胞外多糖样本，粘附于含有双面粘合剂的导电碳膜上，置于MC1000型离子溅射仪(HITACHI公司，日本)样品舱中，进行喷金40s左右。样品取出后，置入SU8100型扫描电子显微镜(HITACHI公司，日本)进行观察，加速电压设定为2KV。

实验结果：产黑色素短梗霉菌胞外多糖在电镜下呈现的扫描结果，如图7所示，在100倍电镜条件下，多糖样品呈混杂的片状结构和棒状结构，结构形状多样，大小不一；500倍条件下，多糖呈现薯片或蛋卷状，表面相对光滑平整；2000倍条件下，多糖表面被放大，呈片层结构，结构大体上较为致密，表面较为光滑，质地均匀，伴随部分不规则碎片。

实施例8：实施例2产黑色素短梗霉菌胞外多糖的免疫活性测定。

S1.巨噬细胞RAW264.7的培养

实验内容：在DMEM培养基中加入10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)双抗，作为巨噬细胞RAW 264.7的完全培养液。将冻存的巨噬细胞RAW 264.7复苏后，用完全培养液重悬混匀后置于无菌的培养瓶中，放在37℃、5％ CO₂的培养箱中培养，待细胞贴壁几乎长满培养瓶底部时进行传代，或铺板进行进一步的实验。

实验操作：

①复苏：从液氮罐中取出装在冻存管中的巨噬细胞RAW 264.7，在37℃水浴锅中摇晃使其快速融化后转移至已装有5mL完全培养液的离心管中，吹打混匀后低速离心(1000g，3min)，弃上清，加入5mL新鲜的完全培养液重悬细胞，将细胞悬液转移至细胞培养瓶中，放在37℃、5％ CO₂的培养箱中培养过夜再更换新鲜完全细胞培养液继续培养。待贴壁细胞密度为80％左右时可进行传代培养。

②传代：将旧培养基吸弃，用PBS缓冲液清洗2次后，加入5mL新鲜的完全培养基，将细胞从瓶壁吹打下来，将细胞悬液按照一定比例传代至新细胞培养瓶中，放在细胞培养箱中继续培养。

③冻存：将吹打均匀的细胞悬液低速离心(1000r/min，3min)，弃上清，加入细胞冻存液，吹打混匀，转移至无菌冻存管中，标记好细胞名称和冻存时间。-80℃过夜，最后保存至液氮罐中。

S2.产黑色素短梗霉菌胞外多糖对巨噬细胞RAW264.7细胞的影响

实验内容：采用CCK-8法检测产黑色素短梗霉菌胞外多糖对巨噬细胞RAW264.7增殖的影响、采用NO试剂盒检测产黑色素短梗霉菌胞外多糖对巨噬细胞RAW264.7的NO释放量的影响、通过ELISA检测对免疫调节因子(COX-2、iNOS、TNF-α、IL-10、IL-6、IL-1β)表达的影响，初步判断其免疫调节活性。

实验操作：

①对巨噬细胞RAW264.7增殖的影响：采用CCK-8试剂盒来测定产黑色素短梗霉菌胞外多糖对巨噬细胞RAW 264.7增殖的影响。将培养瓶中细胞用完全培养液吹打下来，再用完全培养液将巨噬细胞RAW 264.7密度调整3.0×10⁴个/mL，混匀后往96孔板中每孔加入100μL，放入培养箱中培养24h。24h后弃去上清培养液，加入25、50、100、和200μg/mL浓度的产黑色素短梗霉菌胞外多糖样品，同时设置空白对照组和LPS对照组，空白对照组中加细胞和完全培养液，LPS组的加样浓度为2.5μg/mL，每组设置六个复孔。放置培养箱中培养24h后，每孔加入10μL CCK-8试剂，避光孵育2h后，用酶标仪在450nm波长下检测记录吸光度。

②对巨噬细胞RAW 264.7释放NO的影响：采用NO试剂盒来测定产黑色素短梗霉菌胞外多糖对巨噬细胞RAW 264.7释放NO的影响。将培养瓶中细胞用完全培养液吹打下来，再用完全培养液将巨噬细胞RAW 264.7密度调整3.0×10⁵个/mL，混匀后往24孔板中每孔加入500μL，放入培养箱中培养24h。24h后弃去上清培养液，加入浓度为50、100和200μg/mL的产黑色素短梗霉菌胞外多糖样品，同时设置空白对照组和阳性对照组，空白对照组加入等体积的完全培养液，阳性对照组为2.5μg/mL LPS溶液，每组设置四个复孔。再放置培养箱中培养24h，收集上清液，采用NO试剂盒，根据说明书操作检测NO释放情况。

③对巨噬细胞RAW 264.7释放免疫因子的影响：采用ELISA试剂盒来测定产黑色素短梗霉菌胞外多糖对巨噬细胞RAW 264.7释放细胞因子的影响。将培养瓶中细胞用完全培养液吹打下来，再用完全培养液将巨噬细胞RAW 264.7密度调整3.0×10⁵个/mL，混匀后往24孔板中每孔加入500μL，放入培养箱中培养24h。24h后弃去上清培养液，加入浓度为50、100和200μg/mL的产黑色素短梗霉菌胞外多糖对样品，同时设置空白对照组，空白对照组加入等体积的完全培养液，每组设置四个复孔。再放置培养箱中培养24h，收集上清液，分别用COX-2、iNOS、TNF-α、IL-10、IL-6、IL-1β试剂盒检测对应免疫因子的分泌情况。

④采用免疫荧光技术验证产黑色素短梗霉菌胞外多糖的免疫活性，在巨噬细胞RAW 264.7传代培养时，将细胞接种到预先处理过盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层细胞时取出盖玻片，用PBS清洗2次，后用4％多聚甲醛交联剂固定细胞20min，后用0.5％曲拉通溶液对细胞进行通透处理15min，通透后用PBS洗涤3～5min，使用山羊血清封闭液对细胞进行封闭处理30min，加入一抗覆盖盖玻片区域，4℃过夜，次日回收；后在室温条件下孵育1小时，用PBS漂洗3次，每次5min，加入荧光二抗覆盖盖玻片区域，避光孵育1h后，PBS清洗3次；加入DAPI孵育10min后，PBS清洗3次，滴加甘油封片剂30μl进行封片后在荧光显微镜下检测。

实验结果：

①本发明采用CCK-8法检测产黑色素短梗霉菌胞外多糖对巨噬细胞增殖的影响。结果如图8所示，在25μg/mL和50μg/mL浓度梯度，产黑色素短梗霉菌胞外多糖可促进巨噬细胞RAW 264.7的增殖，且存在梯度依赖性。当产黑色素短梗霉菌胞外多糖浓度高于100μg/mL时，增殖效果有所下降，可能是由于细胞过多增殖竞争营养物质或过多产生代谢物导致。但在25-200μg/mL浓度范围内，细胞量总体未低于100％，说明产黑色素短梗霉菌胞外多糖在设定组别的浓度范围内对巨噬细胞RAW 264.7不存在细胞毒性。

②本发明采用NO试剂盒检测产黑色素短梗霉菌胞外多糖对巨噬细胞RAW 264.7释放NO的影响进而判断产黑色素短梗霉菌胞外多糖对巨噬细胞的刺激作用。结果如图9所示，与空白对照组相比，25-200μg/mL浓度梯度的产黑色素短梗霉菌胞外多糖处理组均能显著性促进NO的释放(p<0.01)，剂量和促进效果呈现剂量依赖性，但仍然小于阳性对照LPS处理组的NO释放量，表现为促炎活性。对NO释放量的促进作用说明产黑色素短梗霉菌胞外多糖对巨噬细胞RAW 264.7具有较强的免疫刺激作用。

③本发明采用ELISA试剂盒检测产黑色素短梗霉菌胞外多糖对巨噬细胞RAW264.7释放免疫因子的影响，表明产黑色素短梗霉菌胞外多糖存在免疫应答反应。结果如图10所示，与空白对照组相比，细胞免疫因子(COX-2、iNOS、TNF-α、IL-10、IL-6、IL-1β)的分泌量在50、100和200μg/mL剂量下的产黑色素短梗霉菌胞外多糖处理下呈剂量依赖性增多。以上结果表明产黑色素短梗霉菌胞外多糖可促进巨噬细胞RAW 264.7中免疫相关因子的释放，表明产黑色素短梗霉菌胞外多糖或可对免疫应答产生显著影响。

④免疫荧光技术验证产黑色素短梗霉菌胞外多糖的免疫活性。结果如图11所示，在免疫荧光显微镜下的荧光成像可以看到，不添加产黑色素短梗霉菌胞外多糖的对照组没有荧光呈现，而在浓度为50ug/mL到200ug/mL的浓度梯度条件下，荧光成像呈梯度相关性，且随着多糖样液浓度的增加荧光成像的效果更加接近阳性对照组LPS组，免疫荧光的成像进一步验证了②和③中得到的免疫活性结果。

实施例9：借助在线数据库的大数据合集初步分析实施例2中产黑色素短梗霉菌胞外多糖免疫调节活性的潜在靶点与作用机制

根据实施例8中已经确定的产黑色素短梗霉菌胞外多糖对巨噬细胞RAW264.7具有调节作用，与免疫调节相关的免疫因子均有显著差异，基于这一活性的明确前提，结合多糖中的单糖组成进行网络药理学分析，借助在线数据库的大数据合集初步分析该多糖免疫调节活性的潜在靶点与作用机制，首次借助在线数据库判断多糖针对其特有活性的可能作用靶点和潜在机制分析，有利于初步挖掘多糖的作用靶点以及与靶点相关的潜在作用机制，提供活性作用机制分析手段的同时也有利于减少活性成分作用机制研究和新成分开发的研究成本。

S1.产黑色素短梗霉菌胞外多糖针对免疫缺陷疾病共有靶点分析：

根据产黑色素短梗霉菌胞外多糖中含有的单糖分析，在PubChem上导出单糖结构的Smile号(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，接着通过在线数据库Swiss TargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)和TCMSP(https://www.tcmsp- e.com/)，找到多糖的并集作用靶点共计34个；以免疫缺陷(Immune deficiency)为特征疾病搜索对应的疾病靶点，通过GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)进行数据处理与筛选后，最终确定疾病靶点8821个；将筛选得到的多糖靶点与疾病靶点通过Venn图进行药物-疾病的共有靶点富集，并以置信度>0.7为标准通过STRING数据库(https:// cn.string-db.org/)分析共有靶点的蛋白互作关系。结果如图12所示，确定产黑色素短梗霉菌胞外多糖针对免疫缺陷疾病的共有靶点为28个，以及28个靶点之间的蛋白互作网络图。

S2.产黑色素短梗霉菌胞外多糖针对免疫缺陷疾病的潜在GO富集结果与KEGG通路分析：

将S1.筛选确定的多糖-免疫缺陷共有靶点导出后导入在线数据库DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)进行GO富集(Gene Ontology Enrichment)，以鼠源物种(Mus musculus[10090])作为分析的选择物种源，根据p-value<0.05筛选高置信度的GO富集结果，包括分子机制(MF:Molecular Function)、生物进程(BP:Biological Process)和细胞功能(CC:Cellular Component)三类GO富集结果。如图13所示，28个多糖-疾病的共有靶点富集到的置信度排序在前的15条GO富集结果，可能与蛋白水解裂解、酶活性的调节有关；如图14所示，以p-value<0.05作为条件筛选得到相关KEGG通路共计11条，其中Alzheimer'sdisease、Notch signaling pathway和Metabolic pathways这三条通路对应p-value<0.005(为KEGG通路筛选标准的)，被认为是高度置信的潜在作用机制，基于在线数据库的信息与文献报道的联合分析，我们推测产黑色素短梗霉菌胞外多糖发挥免疫调节活性可能是通过Alzheimer's disease、Notch signaling pathway和Metabolic pathways这三条通路中的潜在靶点，包括早老素γ分泌酶抗体APH1A、乳酸链球菌肽NCSTN、雌激素调节蛋白PSEN2，介导基因表达、激活免疫细胞实现的。

S3.产黑色素短梗霉菌胞外多糖针对免疫缺陷疾病的作用靶点-GO富集-KEGG通路网络可视化：根据Cytoscape软件(Cytoscape 3.6.1)分析需要文件的要求，建立Network和Type两个工作表，导入数据文件后得到初步的可视化图表，设置靶点参数、GO富集参数和KEGG通路参数，调整整体布局以得到可视化图表。如图14所示，将S1、S2和S3分析中得到的多糖疾病作用靶点、靶点对应GO富集结果和潜在KEGG机制，以“KEGG机制-多糖与疾病共有靶点-GO富集”的可视化图表显示产黑色素短梗霉菌胞外多糖针对免疫缺陷疾病的潜在作用机制。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 产黑色素短梗霉菌菌株、其胞外多糖及胞外多糖的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 559

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

acctgcggaa ggatcattaa agagtaaggg tgctcagcgc ccgacctcca accctttgtt 60

gttaaaacta ccttgttgct ttggcgggac cgctcggtct cgagccgctg gggattcgtc 120

ccaggcgagc gcccgccaga gttaaaccaa actcttgtta ttaaaccggt cgtctgagtt 180

aaaattttga ataaatcaaa actttcaaca acggatctct tggttctcgc atcgatgaag 240

aacgcagcga aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt 300

gaacgcacat tgcgcccctt ggtattccga ggggcatgcc tgttcgagcg tcattacacc 360

actcaagcta tgcttggtat tgggtgccgt ccttagttgg gcgcgcctta aagacctcgg 420

cgaggcctca ccggctttag gcgtagtaga atttattcga acgtctgtca aaggagagga 480

cttctgccga ctgaaacctt ttatttttct aggttgacct cggatcaggt agggataccc 540

gctgaactta agcatatca 559

Claims

1.产黑色素短梗霉菌菌株（Aureobasidium melanogenum）SCAU 266，其特征在于，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地点广东省广州市天河区先烈中路100号广东省微生物研究所59号楼5楼，保藏编号为GDMCC 62090，保藏日期2021年11月30日。

2.产黑色素短梗霉菌胞外多糖，其特征在于，将如权利要求1所述的产黑色素短梗霉菌菌株SCAU 266接种于发酵培养基中发酵培养，获得发酵液；发酵液除菌体、醇沉、除蛋白、透析、得胞外多糖粗提物；胞外多糖粗提物经大孔树脂柱吸附色素、DEAE Fast Flow阴离子交换柱层析纯化，得到分子量为7966Da的胞外多糖。

3.如权利要求2所述的产黑色素短梗霉菌胞外多糖，其特征在于，所述的产黑色素短梗霉菌胞外多糖的单糖组成为葡萄糖，甘露糖，半乳糖，且摩尔比为0.973：0.019：0.008。

4.如权利要求3所述的产黑色素短梗霉菌胞外多糖，其特征在于，所述的产黑色素短梗霉菌胞外多糖共有6种单糖残基链接方式，分别为2,3,4,6-Me4-Glcp、3,4,6-Me3-Manp、3,4,6-Me3-Glcp、2,3,6-Me3-Glcp、2,3,4-Me3-Glcp、2,3-Me2-Glcp，且摩尔比为：10.98、3.08、2.75、61.96、4.82、16.42。

5.一种制备如权利要求2-4任一项所述的产黑色素短梗霉菌胞外多糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、获得发酵液：将如权利要求1所述的产黑色素短梗霉菌菌株SCAU 266接种于液体培养基中发酵，发酵条件为28℃、130rpm恒温培养发酵7天，得发酵液；

所述的液体培养基为麦芽糖20.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、甘露醇20.0 g/L、谷氨酸钠10.0 g/L、七水硫酸镁0.3 g/L、磷酸二氢钾0.5 g/L、玉米浆1.0 g/L、酵母膏3.0 g/L以及海盐30.0 g/L，pH值为7.5；

S5、将步骤S4中的产黑色素短梗霉菌胞外多糖粗提物用去离子水配置成溶液，经大孔树脂柱进行色素吸附，洗脱液为去离子水，再经DEAE Fast Flow阴离子交换柱层析，洗脱液依次为超纯水、0.1M NaCl溶液、0.3M NaCl、0.6M NaCl、0.9M NaCl和1.2M NaCl，流速为1ml/min，收集超纯水得到的洗脱液，冷冻干燥，得产黑色素短梗霉菌胞外多糖。

6.如权利要求5所述的制备产黑色素短梗霉菌胞外多糖的方法，其特征在于，所述的步骤S2中的抽滤为定性滤纸抽滤，所述的减压浓缩液为原体积的20%-35%。

7.如权利要求5所述的制备产黑色素短梗霉菌胞外多糖的方法，其特征在于，所述的步骤S3中加入的无水乙醇与减压浓缩液的体积比为（3-5）：1，所述的低温为4℃。

8.如权利要求5所述的制备产黑色素短梗霉菌胞外多糖的方法，其特征在于，所述步骤S4中沉淀溶于去离子水的体积与Sevag溶液的体积比为（1-2）:1，所述的透析袋直径16mm，截留分子量3000Da的透析袋。

9.如权利要求5所述的制备产黑色素短梗霉菌胞外多糖的方法，其特征在于，所述步骤S5中产黑色素短梗霉菌胞外多糖粗提物浓度为10～50mg/mL，上样量为2mL，大孔树脂柱型号是NAK-9，DEAE Fast Flow阴离子交换柱规格为2.6cm×50cm。

10.如权利要求2-4任一项所述的产黑色素短梗霉菌胞外多糖在制备免疫调节的产品中的应用。