CN117126791A

CN117126791A - 可降解端羟基聚丁二烯的枯草芽孢杆菌hdb23及其应用

Info

Publication number: CN117126791A
Application number: CN202311403424.8A
Authority: CN
Inventors: 李静娴; 桂恒; 吴世曦; 熊伟强; 张天福; 葛志强; 许建初
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS; Hubei Institute of Aerospace Chemical Technology
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS; Hubei Institute of Aerospace Chemical Technology
Priority date: 2023-10-27
Filing date: 2023-10-27
Publication date: 2023-11-28
Anticipated expiration: 2043-10-27
Also published as: CN117126791B

Abstract

本发明涉及可降解端羟基聚丁二烯的枯草芽孢杆菌HDB23及其应用，属于生物技术领域。该枯草芽孢杆菌HDB23保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.27041。该菌株HDB23具有较好的端羟基聚丁二烯（HTPB）降解活性，且降解效果明显。

Description

可降解端羟基聚丁二烯的枯草芽孢杆菌HDB23及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的说，涉及可降解端羟基聚丁二烯的枯草芽孢杆菌HDB23及其应用。

背景技术

.端羟基聚丁二烯（简称丁羟或丁羟胶，HTPB）是一种遥爪预聚物，平均相对分子质量通常在1500~10000之间，其分子链两端的羟基固化交联后形成的交联产物具有耐油耐水耐磨的特性，可用于生产防水防腐材料、汽车飞机轮胎、耐磨运输带等，同时HTPB交联固化产物对低温、酸碱环境也具有极高的耐受性，因此也被用于生产涂料、电绝缘材料、保温材料、建筑材料等。

目前，HTPB主要用途是作为粘合剂与异氰酸酯化合物通过交联固化反应组成骨架，在混合高氯酸铵（AP）、铝粉等材料后用于固体推进剂的生产（即丁羟推进剂）。HTPB是丁羟推进剂粘合体系的主要组分，其与聚氨酯在粘合体系中的质量分数超过 95%。目前针对废弃丁羟推进剂的传统处理办法是：露天焚烧、深层掩埋爆炸销毁，上述处理方法虽操作简单费用低廉但安全隐患大，且会对自然环境中的水、土壤等造成污染。针对上述情况欧美部分发达国家提出了丁羟推进剂有效成分回收再利用的方法，即通过溶剂萃取、热分解、液氨萃取等方法将废弃推进剂中的铝粉、高氯酸铵等有效成分进行回收再利用，此方法虽能对废弃丁羟推进剂中的潜在能源进行回收利用，但成本较高且在此过程中同样会产生污染。在注重绿色环保、节能减耗的今天，人们更为重视废弃丁羟推进剂的绿色无害化处理，而微生物降解处理是目前公认的最为绿色环保的降解方式。

自然环境中孕育着丰富的微生物资源，目前各国科学家已发现了30多个属的可降解塑料的细菌和真菌。HTPB是丁羟推进剂中重要的组分之一，与塑料同属于人工高分子聚合物，因此在理论上存在生物降解的可能性。如若能通过自然环境中存在的可降解HTPB微生物对废弃丁羟推进剂的骨架进行破坏，降低含能组分回收再利用的成本及污染问题，即可实现废弃丁羟推进剂的绿色无害化处理。

发明内容

本发明提供了一种可降解端羟基聚丁二烯的菌株HDB23，通过一代测序技术对菌株的16sDNA片段进行PCR扩增并测序，测序结果与NCBI数据库中数据进行比对，比对结果显示该菌株为枯草芽孢杆菌菌株DK15。该菌株HDB23于2023年04月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101；保藏编号为CGMCC No .27041，分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

本发明还提供了一种菌剂，该菌剂包含上述枯草芽孢杆菌HDB23。

本发明还提供了一种降解端羟基聚丁二烯的方法，包括使用上述枯草芽孢杆菌HDB23或上述菌剂降解端羟基聚丁二烯。

本发明还提供了一种应用，上述枯草芽孢杆菌HDB23或上述菌剂在制备降解端羟基聚丁二烯的产品中的应用。

本发明还提供了一种降解端羟基聚丁二烯的产品，包括上述枯草芽孢杆菌HDB23或上述菌剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种可降解端羟基聚丁二烯的枯草芽孢杆菌HDB23，该菌株HDB23在30天内能有效降解HTPB液体胶，且降解效果明显。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是菌株HDB23 16sDNA序列的系统发育树。

图2是菌株HDB23在LB固体培养基中的形态（培养时间3d）。

图3是经菌株HDB23降解前后的HTPB情况图；图中，a:降解前，b：降解后。

图4是菌株HDB23降解HTPB-H谱；图中，a 空白对照；b对照2（验证液体环境是否会对HTPB结构产生影响）；c.是降解后的HTPB。

图5是菌株M4生物处理后的HTPB核磁共振图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明中HTPB降解菌株的筛选过程及菌株鉴定的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。

本发明中涉及的试剂耗材等均可从商业途径购得，如未注明具体实验条件通常按照常规实验条件或按照试剂公司推荐条件进行。

实施例1菌株HDB23的分离筛选

1、菌株筛选前期准备工作：

制备HTPB-无机盐固体培养基，该培养基中仅含氮源且没有微生物生长所需的其他碳源，以HTPB为唯一碳源。具体制备流程及配方如下：

①K₂HPO₄ ^.3H₂O 0.92g/L；②KH₂HPO₄0.7 g/L；③FeSO₄.7H₂O 0.002 g/L；④MgSO₄ ^.7H₂O 0.7 g/L；⑤MnSO₄0.001 g/L；⑥NH₄NO₃1.0 g/L；⑦NaCl 0.005 g/L；⑧ZnSO₄.7H₂O 0.002 g/L；⑨Agar（琼脂）20g/L；①②分开配制，120℃灭菌35min，冷却至50-60℃后将所有试剂混合在一起，无菌环境下倒入50个90mm无菌培养皿中，每个培养皿中倒入20mL培养基，等待培养基冷却凝固并在无菌操作台中风干3-4天。

称取10gHTPB液体胶，用50mL正己烷溶解后在每个培养皿中加入1mL（约0.01g/mL）置于无菌操作台中风干3-4天直至正己烷完全挥发，HTPB在培养基表面形成一层薄膜即可。

2、HTPB降解菌的筛选：

污水中的污染物多为高分子聚合物，通常污水处理厂在处理污水时大都会采用活性污泥处理工艺，在活性污泥中还会培养微生物提升处理效果，故采集污水处理厂的污泥样来筛选HTPB专项降解菌。

从污水处理厂的采集污泥样，称取0.1g污泥样于无菌1.5mL离心管中，加入1mL无菌LB培养基，32℃ 140rpm/min摇床培养24h对污泥样本中的微生物进行富集。制备无菌去离子水，将污泥样微生物富集培养液进行稀释，稀释至10^-6次方，每个稀释度取200μL涂布于上述已制备好的HTPB-无机盐固体培养基中，32℃恒温培养箱中培养30d，初步筛选HTPB降解菌。

3、HTPB降解菌的纯化：

采用胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L、酵母提取物(Yeast extract) 5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L、Agar（琼脂） 20g/L配制LB固体培养基，120℃灭菌30min，冷却至50-60℃倒入无菌90mm培养皿中，待其冷却凝固后挑取步骤2（HTPB降解菌的筛选）HTPB-无机盐固体培养基中的细菌菌落进行划线纯化，纯化3-4次后最终获得HTPB降解纯菌株并保存，将其命名为HDB23。

实施例2菌株HDB23的鉴定

1、形态学鉴定：

如图2所示，筛选得到的HDB23菌株在HTPB-无机盐固体培养皿生长速度快、菌落较大、淡黄色、表面粗糙、边缘不整齐。HDB23菌株可在以HTPB为唯一碳源的培养基中生长，表明其具有较高的HTPB降解活性，可实现HTPB的生物降解。

2、菌株分子生物学鉴定：

提取HDB23菌株DNA，PCR扩增及扩增产物进行序列分析。

引物：27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;

1492R(5’-TACGACTTAACCCCAATCGC-3’。

反应体系：2×TaqPCR Master Mix 12.5μL、上下游引物各1μL、DNA模板1μL、ddH₂O10μL；反应程序：95℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 90 s，35个循环；72℃ 10min。

PCR产物送交上海生物工程有限公司进行测序，测序数据拼接后用NCBI进行比对，以鉴定降解菌株种属。

菌株HDB23 16sDNA测序组装结果如SEQ ID NO .1所示。

CTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCG

该菌株16sDNA测序鉴定结果显示其为枯草芽孢杆菌菌株DK15（Bacillussubtilis strain DK15），结果如图1所示。利用16sDNA测序数据构建系统发育树，结果显示HTPB降解菌株HDB23与枯草芽孢杆菌ROD110（Bacillus subtilis strain ROD110）及枯草芽孢杆菌杆菌（Bacillus subtilis strain LB3）亲缘关系较近，因此聚在一枝；菌株HDB23与短芽孢杆菌（Brevitalea aridisoli strain Ac11E3）、甲基脂蛋白吡喃单胞菌（Pyrinomonas methylaliphatogenes）亲缘关系较远。

该菌株HDB23于2023年04月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101；保藏编号为CGMCC No .27041。经生物保藏鉴定，其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）。

实施例3菌株HDB23对HTPB的降解

实例1：

1、制备LB液体培养基，其组分配比为：胰蛋白胨（Tryptone）10g/L，酵母提取物（Yeast extract）5g/L，氯化钠（NaCl）10g/L，pH7.0-7.4。

2、制备无菌HTPB-无机盐液体培养基，配方如下：K₂HPO₄ ^.3H₂O 0.92g/L、KH₂HPO₄0.7g/L、FeSO₄.7H₂O 0.002 g/L、MgSO₄ ^.7H₂O 0.7 g/L、MnSO₄0.001 g/L、NH₄NO₃1.0 g/L、NaCl0.005 g/L、ZnSO₄.7H₂O 0.002 g/L。准备150mL锥形瓶，每个瓶中平铺0.1gHTPB液体胶，120℃灭菌30min后于无菌环境中添加100mL无菌HTPB-无机盐液体培养基。

挑取实施例1中获得的纯化菌株HDB23单菌落接种于LB液体培养基中培养，32℃140rpm/min恒温震荡培养24h至OD₆₀₀=1.0时加投1mL菌液到100mL含0.1gHTPB的无机盐液体培养基中，瓶口封上封口膜及锡箔纸，32℃140rpm/min震荡培养28d后用正己烷萃取发酵液中的HTPB及其降解产物，待正己烷完全挥发或旋蒸法去除正己烷后取0.01g降解产物溶于600μL氘代氯仿中，通过核磁共振法对物质进行检测。

对照组：

与实例1的区别在于，未在HTPB无机盐培养基中接种HDB23菌液，而是添加了1mL无菌水。

对比组：

与实例1的区别在于，在HTPB无机盐培养基中接种菌株M4菌液，其他步骤相同。

M4为假单胞菌菌株（Pseudomonasstrain HL22-2），可降解HTPB。

实验结果如下：

HTPB是一种化学结构稳定的高分子液体预聚物，其分子骨架中不含醚或酯键因此水解安定性良好，因此长期浸泡于水环境中不会对其机构产生影响。

如图3所示，对照组HTPB（0.1g）浸没于100mL液体培养基中，但并未接种降解菌株（HDB23）在恒温摇床中培养28d后用正己烷对HTPB进行回收，对回收产物观察后发现HTPB外观并无明显变化，回收后的HTPB依然为透明粘稠状液体。

相较于对照组，实验组（实例1）中接种了1mL菌株HDB23的菌液，恒温震荡培养28d后液体培养基中HTPB外观形态已发生了明显变化。同样用正己烷对HTPB进行回收观察发现原透明状的HTPB已变成白色胶状物，部分形成乳白色小点挂在瓶壁上且HTPB粘稠度明显降低。相较于实验组（实例1），对照组中并未加投HTPB降解菌株HDB23的菌液，因此HTPB在液体培养基中浸没28d后其外观形态并未发生明显变化，而实验组中加投了1mL菌株HDB23菌液且培养环境中除HTPB外并未加投其他维持微生物生长必须的碳源，实验结束后HTPB回收产物外观变化较为明显，说明菌株HDB23在利用HTPB为唯一碳源生长的过程中使得HTPB液体胶的结构发生了一定变化，进而对HTPB的外观结构产生了影响。

除观形态观察研究外，为进一步说明菌株HDB23对HTPB的降解效果，对经菌株HDB23降解处理的HTPB和未经菌株HDB23降解的HTPB进行核磁共振检测，结果如图4所示。相较于未经菌株HDB23处理的HTPB样品，经菌株HDB23处理后的HTPB在-5.0ppm— -4.5ppm和-1.75ppm— -1.0ppm处峰值出现变化（图4中c），说明菌株在利用HTPB生长的过程中使其分子结构产生了变化，即降解过程中产生了新的物质。同时通过核磁共振检测法对HTPB原样、浸没于无机盐液体中但未接种降解菌株的HTPB、经菌株HDB23降解后的HTPB样进行检测，检测结果与上述HTPB形态观察结果一致：无机盐液体环境不会改变HTPB的结构（图4中a、b），经菌株HDB23降解后的HTPB外观形态已发生明显改变，而这种改变是由HTPB结构的变化造成的，说明菌株HDB23可利用HTPB为唯一碳源生长，从而实现HTPB降解的目的。

图5为单胞菌属生物处理后的HTPB核磁共振图，该假单胞菌属菌株M4可降解HTPB。M4为假单胞菌菌株（Pseudomonasstrain HL22-2），M4与HDB23为不同属的细菌，因此经二者降解后的HTPB核磁共振谱存在一定差异。

最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种可降解端羟基聚丁二烯的枯草芽孢杆菌HDB23，其特征在于：该菌株HDB232023年04月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27041，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。

2.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂包含权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HDB23。

3.一种降解端羟基聚丁二烯的方法，其特征在于：包括使用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HDB23或权利要求2所述的菌剂降解端羟基聚丁二烯。

4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HDB23或权利要求2所述的菌剂在制备降解端羟基聚丁二烯的产品中的应用。

5.一种降解端羟基聚丁二烯的产品，其特征在于，包括权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HDB23或权利要求2所述的菌剂。