CN100557008C - 腐皮镰孢p-1菌株及其降解多氯联苯的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种腐皮镰孢新菌株，腐皮镰孢(Fusarium solani)P-1 CCTCC No：M 207128，还涉及该腐皮镰孢P-1在降解多氯联苯的应用。本发明的腐皮镰孢P-1能有效地降解多氯联苯，尤其在好氧条件下降解高氯取代的多氯联苯，对存在于环境中较有代表性的多氯联苯Aroclor1254的平均降解率能达到64.15%，对Aroclor1254中六氯取代的多氯联苯的降解率为70.32%～100%。

Description

腐皮镰孢P-1菌株及其降解多氯联苯的用途
技术领域
本发明涉及一种腐皮镰孢新菌株，具体来说是腐皮镰孢(Fusarium solani)P-1CCTCCNo：M 207128及其在降解多氯联苯的应用。
背景技术
多氯联苯广泛地分布在污染的土壤、水体和沉积物中，具有环境持久性、生物富集性和潜在的致癌性，可耐受350℃高温，同时对氧化剂、酸、碱都有抗性，很难被降解。传统的修复技术如填埋、焚烧等不仅费用高效率低，而且容易造成二次污染，因此近年来的研究主要都集中在生物修复技术上。目前国内外对多氯联苯的生物降解主要依靠细菌或真菌的厌氧脱氯和有氧开环，目前已经分离到的厌氧细菌有Desulfomonile tiedjei、Desulfitobacterium、Dehalobacter restrictus、Dehalospirillum multivorans、Desulforomonaschloroethenica、Dehalococcoides etnenogenes、Enterobacter MS-1和Enterobacteragglomerans，好氧细菌有Burkholderia sp.、Pseudomonas sp.、Sphingomonas sp.、Rhodococcus sp.、Microccus sp.、Achromobacter sp.、Norcardia sp.、Alcalegenes sp.、Arthrobacter sp.、Acinetobacter sp.、Janibacter sp.、Bacillus sp.以及Corynebacteriumsp.，真菌如白腐真菌，但目前没发现真菌腐皮镰孢有降解多氯联苯的功能。
发明内容
本发明的目的在于开发出能降解多氯联苯的腐皮镰孢新菌株，另一目的是开发出这种新菌株的用途。
我们从污染了多氯联苯的半野外模拟红树林根际土壤中分离出腐皮镰孢新菌株，这种新菌株能降解多氯联苯，尤其是好氧条件下能有效降解高氯取代的多氯联苯，从而实现了本发明的目的。
本发明是腐皮镰孢(Fusarium solani)P-1 CCTCC No：M 207128。
本发明的腐皮镰孢(Fusarium solani)P-1已于2007年8月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC No：M 207128。
本发明的腐皮镰孢P-1从污染了多氯联苯的半野外模拟红树林根际土壤中分离得到，具体方法是：取5g土壤，用PBS液稀释10倍，接种1mL到50mL培养基P中，30℃200r/min摇床培养7～10d，待培养基中的盐类结晶消失之后，连续传代培养几次。取0.1mL接种到培养基P琼脂上进行分离培养，经多次分离后，得到腐皮镰孢P-1 CCTCC No：M 207128，其中的培养基P由下述步骤配得：先配得每升含有(NH4)6Mo7O24.4H2O 5.28g，ZnSO4.7H2O 29.87g，CuSO41.28g，H3BO3 4.0g，MnSO4.H2O 2.805g，CoCl2.6H2O 4.0g的微量盐溶液，然后将KH2PO4 2.93g，K2HPO4.3H2O 5.87g，MgSO4 0.3g，FeSO4.7H2O 0.01g，NaCl 2.0g，(NH4)2SO4 5.0g，CaSO4.H2O 0.44g和上述微量盐溶液2mL混合，补充蒸馏水至1000mL，pH7.0，得到基础MM培养基，最后将2，2’，4，4’，6，6’-六氯联苯用丙酮溶解，再加到上述基础MM培养基中得到终浓度为100μg/mL培养基P。
本发明的腐皮镰孢P-1具有如下生物学特性和分子分类地位：
在虎红琼脂上4天的生长直径约为4cm，气生菌丝绒毛状，白色，菌落反面淡褐色，在培养基P上的菌落形态见附图1，经TaKaRa公司以Seq Forward primer、Seq Reverse primer为引物对CTB211PCR回收产物进行测序，测序结果在GenBank用BLAST进行检索和同源性比较，与Fusarium sp.Dzf1和Fusarium solani 18S rRNA部分序列同源性100％(序列表见附录1：SEQID NO.1)，从而证实其归属于镰孢霉属，是该菌属的一个新种，命名为腐皮镰孢(Fusariumsolani)P-1。
本发明的腐皮镰孢P-1可以在好氧条件下降解多氯联苯。
本发明的腐皮镰孢P-1降解多氯联苯的方法包括以下的步骤：
(1)菌种选择：腐皮镰孢菌(Fusarium solani)P-1 CCTCC No：M 207128；
(2)斜面培养：将菌种接种至虎红琼脂培养基，pH值5.2～6.2，25～30℃条件下，静止培养48～72小时；
(3)种子培养：将上一步骤培养的菌株在无菌条件下用接种环接种于100～250mL的培养基P中，pH值5.5～7.0，25～30℃条件下，震荡培养48～72小时；
(4)降解应用：收集上一步骤的菌体，用pH 7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)液洗涤3次，接种于2000～5000mL污染了多氯联苯的水体，pH值5.5～7.0，20～30℃条件下，震荡培养7～10天。
本发明的腐皮镰孢菌P-1能有效地降解多氯联苯，尤其在好氧条件下降解高氯取代的多氯联苯，对存在于环境中较有代表性的多氯联苯Aroclor1254混合物的降解率为43.64％～100％，平均降解率能达到64.15％，对Aroclor1254中六氯取代的多氯联苯的降解率为70.32％～100％。
附图说明
图1：腐皮镰孢P-1(Fusarium solani P-1)CCTCC No：M 207128在培养基P上的菌落形态(数码相机拍摄：FinePix S602ZOOM，柯达公司)。
具体实施方式：
实施例1：腐皮镰孢P-1的筛选
将(NH4)6Mo7O24.4H2O 5.28g，ZnSO4.7H2O 29.87g，CuSO4 1.28g，H3BO3 4.0g，MnSO4.H2O 2.805g，CoCl2.6H2O 4.0g配成1L溶液，115℃灭菌20分钟，得到微量盐溶液。将KH2PO4 2.93g，K2HPO4.3H2O5.87g，MgSO4 0.3g，FeSO4.7H2O 0.01g，NaCl 2.0g，(NH4)2SO4 5.0g，CaSO4.H2O 0.44g，微量盐溶液2mL混合，补充蒸馏水至1000mL，pH7.0，115℃灭菌20分钟，得到基础MM培养基。将2，2’，4，4’，6，6’-六氯联苯用丙酮溶解，然后加到基础MM培养基中，115℃灭菌20分钟，得到终浓度为100μg/mL的培养基P。
从人工污染了多氯联苯一年的半野外红树林湿地模拟系统的红树林根际土壤中取5g根际土壤，用PBS稀释10倍，接种1mL至装有50mL培养基P的250mL三角瓶中，30℃200r/min摇床培养7～10d，待培养基中的盐类结晶消失之后，传代培养，连续传代几次。取0.1mL接种在培养基P琼脂上进行分离培养，经多次分离后，得到的菌株在虎红琼脂上4天的生长直径约为4cm，气生菌丝绒毛状，白色，菌落反面淡褐色，与Fusarium sp.Dzf1和Fusarium solani 18SrRNA部分序列同源性100％(序列表见附录1：SEQ ID NO.1)，证实是腐皮镰孢(Fusarium solani)P-1 CCTCC No：M 207128。
实施例2：
将实施例1得到的腐皮镰孢P-1斜面接种至虎红琼脂培养基，27℃条件下静止培养60小时，将得到的菌株在无菌条件下用接种环接种于150mL的培养基P中，27℃条件下，震荡培养60小时，收集菌体，用0.05mol/L的PBS(pH7.5)洗3次，然后用重悬，稀释到OD600(600nm广密度值)为1.0，接种1％到装有5mL基础MM培养基，Aroclor1254含量为50μg/mL的血清瓶中，盖好橡胶塞，30℃200r/min摇床培养10d。另接种相同浓度沸水浴30min的菌液作为对照。
向血清瓶中加入4倍体积的正己烷，盖上内表面为聚四氟乙烯的橡胶塞，加铝盖密封后放入恒温振荡器中振荡2h(300r/min)，然后超声波萃取1h，4000r/min离心10min。将上层有机相移出，进行GC分析。分析条件是程序升温至120℃，保持1min，然后以10℃/min的速度升温到150℃，保持1min，再以6℃/min的速度升温到280℃，保持10min。得到的降解率见表1。
表1腐皮镰孢P-1 CCTCC No：M 207128对多氯联苯1254同系物的降解率
  品名   降解率(％)   品名   降解率(％)
  2，2’，4，4’-四氯联苯   43.64   2，2’，3，3’，4-五氯联苯   100.00
  2，2’，5，6-四氯联苯   73.94   2，3，3’，4，6-五氯联苯   71.79
  2，4，4’，6-四氯联苯   80.78   2’，3’，4，4’，6-五氯联苯   85.76
  2，3’，5，5’-四氯联苯   56.63   2，3，3’，4，4’，5’-六氯联苯   70.32
  2，2’，3，5，5’-五氯联苯   77.14   2，2’，3，4’，5’，6-六氯联苯   100.00
  2，2’，3，5’，6-五氯联苯   67.82   2，3’，4，4’，5，5’-六氯联苯   100.00
  2，3’，4，4，5’-五氯联苯   85.74   2，2’，3，3’，4，6’-六氯联苯   70.54
  2，2’，3，5，5’-五氯联苯   84.60   2，3，3’，4，4，5’-六氯联苯   86.34
  2，3’，4，4’，5-五氯联苯   67.77   2，2’，3，3’，4，4’-六氯联苯   100.00
  2，2’，3，5’，6-五氯联苯   69.26   2，3，3’，4，4’，5-六氯联苯   100.00
  2，3’，4，4’，6-五氯联苯   90.25   2，3’，4，4，5，5’-六氯联苯   100.00
序列表
腐皮镰孢核苷酸序列(SEQ ID NO.1)
<110>中山大学
<120>腐皮镰孢P-1菌株及其降解多氯联苯的用途
<160>1
<210>1
<211>539
<212>DNA
<213>腐皮镰孢(Fusarium solani)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(539)
<400>1
tgcggaggga tcattaccga gttatacaac tcatcaaccc tgtgaacata cctataacgt     60
tgcctcggcg ggaacagacg gccccgtaac acgggccgcc cccgccagag gaccccctaa    120
ctctgtttct ataatgtttc ttctgagtaa acaagcaaat aaattaaaac tttcaacaac    180
ggatctcttg gctctggcat cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgataagt aatgtgaatt    240
gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga acgcacattg cgcccgccag tattctggcg    300
ggcatgcctg ttcgagcgtc attacaaccc tcaggccccc gggcctggcg ttggggatcg    360
gcggaagccc cctgcgggca caacgccgtc ccccaaatac agtggcggtc ccgccgcagc    420
ttccattgcg tagtagctaa cacctcgcaa ctggagagcg gcgcggccac gccgtaaaac    480
acccaacttc tgaatgttga cctcgaatca ggtaggaata cccgetgaac ttaagcata     539

Claims (2)

1.一种腐皮镰孢(Fusarium solani)，其特征为该腐皮镰孢为腐皮镰孢P-1，其在中国典型培养物保藏中心保藏编号为CCTCC No：M 207128。
2.权利要求1的腐皮镰孢(Fusarium solani)P-1降解多氯联苯的应用。
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