CN116790525A - 一种古柯芽子酮合成酶EnES及其基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种古柯芽子酮合成酶EnES及其基因和应用。其中，EnES氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。经酿酒酵母表达的蛋白能够催化4‑(1‑甲基‑2‑吡咯)‑3‑氧代丁酸生成芽子酮或托品酮。该产物是植物体内生物合成以及体外化学合成莨菪碱、可卡因等托品烷生物碱的重要中间体。本发明的芽子酮合成酶可作为元件用于托品烷生物碱的合成生物学，以及生物合成路径中涉及芽子酮或托品酮的天然产物的代谢工程，为合成生物学提供基本元件。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种古柯芽子酮合成酶EnES及其基因和应用。
背景技术
托品烷生物碱(tropane alkaloids)是一类含有8-氮杂双环[3.2.1]辛烷为骨架的生物碱，主要分布于古柯科(Erythroxylaceae)，茄科(Solanaceae)，旋花科(Convolvulaceae)，红树科(Rhizophoraceae)，十字花科(Brassicaceae)等植物，现已鉴定出300多种托品烷生物碱。植物源托品烷生物碱具有很好的生理活性，如：古柯科中分离得到的可卡因能阻断神经纤维之间的传导及具有术后血管收缩作用，可作为鼻、喉咙和下呼吸道等区域外科手术的局部麻醉药；茄科中分离得到的莨菪碱和东莨菪碱可阻断副交感神经或抑制中枢神经系统等，从而用于止痛、解痉，并可治疗帕金森等疾病。
托品烷生物碱因其结构具有多个手性中心，直接通过化学手段合成工艺复杂且成本高，现阶段医疗使用的托品烷生物碱多是从植物中分离；而可卡因等托品烷生物碱的生物合成途径不清楚，无法解除可卡因等托品烷生物碱体内合成的限速步骤，限制了植物中托品烷生物碱产量的提高。此外，通过植物分离托品烷生物碱受到植物生长、气候变动等各种因素影响，也限制了可卡因等托品烷生物碱的供应。现代分子生物学和合成生物学的发展，使得可卡因等药用天然产物脱离原植物，在微生物中生产成为了可能。可卡因生物合成途径的解析及生物合成基因的挖掘作为其进行代谢工程的基础，是微生物生产中最重要的基本元件。
莨菪碱作为茄科中代表性的托品类生物碱，其生物合成途径已被解析清楚，其托品酮的骨架由鸟氨酸等来源的N-甲基吡咯阳离子与丙酮二羧酸自发缩合，形成4-(1-甲基-2-吡咯)-3-氧代丁酸(4-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)-3-oxobutanoic acid)，并在CYP82M3酶作用下环化形成托品酮。基于现有同位素前体标记实验等推测古柯科来源的可卡因中托品烷骨架的形成也同样经历4-(1-甲基-2-吡咯)-3-氧代丁酸中间体。
迄今为止，现有技术中没有来自古柯中芽子酮合成酶EnES及其编码基因鉴定，以及古柯芽子酮合成酶的应用的报道。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种古柯芽子酮合成酶EnES及其基因和应用。本发明从古柯当中鉴定出了一条芽子酮合成酶，其能催化底物4-(1-甲基-2-吡咯)-3-氧代丁酸氧化环化为芽子酮，并自发脱羧形成托品酮。这一芽子酮合成酶的多样性拓宽了合成生物学应用中元件的可选范围，并为改造这类酶提供了新思路，可指导这类酶的理性设计。
为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
提供一种古柯芽子酮合成酶，其具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：
a)具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸残基序列的蛋白质；
b)将SEQ ID NO.4中的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有a)酶功能的由a)衍生的氨基酸序列；
c)与a)或b)限定的氨基酸序列具有80％以上的同源性，且具有a)酶功能的由a)衍生的蛋白质；
d)序列中含有a)、b)或c)所述氨基酸序列的衍生蛋白质。
提供一种古柯芽子酮合成酶基因，其具有下述核苷酸序列之一的多核苷酸：
a)核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的多核苷酸；
b)编码如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的多核苷酸；
c)与a)或b)限定的核苷酸序列具有80％以上的同源性且编码具有古柯芽子酮合成酶功能的多核苷酸；
d)与a)、b)或c)的序列互补的多核苷酸。
提供一种含有古柯芽子酮合成酶基因的重组表达载体。
进一步地，重组表达载体为将古柯芽子酮合成酶基因插入原核或真核表达载体得到表达古柯芽子酮合成酶的重组表达载体。
进一步地，将古柯芽子酮合成酶基因构建到AtATR1-pESC-URA载体而得。
提供一种含有古柯芽子酮合成酶基因的转基因重组菌或转基因细胞系。
进一步地，转基因重组菌为细菌和真菌，细菌和真菌包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、根癌农杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、昆虫细胞。
提供一种古柯芽子酮合成酶在体内或体外催化生成芽子酮或托品酮及其衍生物中的应用。
提供一种古柯芽子酮合成酶在体内或体外催化生产托品烷生物碱中的应用，所述托品烷生物碱包括但不限于可卡因、莨菪碱、东莨菪碱。
提供一种含有古柯芽子酮合成酶基因的重组表达载体在不具有芽子酮或托品酮及其衍生物生物合成途径的原核生物或真核生物中构建芽子酮或托品酮及其衍生物合成途径，或是在提升芽子酮或托品酮及其衍生物在具有芽子酮或托品酮及其衍生物合成途径的原核生物或真核生物产量中的应用。
提供一种含有古柯芽子酮合成酶基因的重组表达载体在不具有托品烷生物碱生物合成途径的原核生物或真核生物中构建托品烷生物碱的生物合成途径中或是在提升托品烷生物碱在具有托品烷生物碱生物合成途径的原核生物或真核生物产量中的应用。
提供一种含有古柯芽子酮合成酶基因的转基因重组菌或转基因细胞系在催化生产芽子酮或托品酮及其衍生物中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明公开了一种古柯芽子酮合成酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，其编码的核苷酸如SEQ ID NO.3所示，将古柯芽子酮合成酶在酿酒酵母表达后能够催化4-(1-甲基-2-吡咯)-3-氧代丁酸生成芽子酮和托品酮。古柯芽子酮合成酶与从颠茄中鉴定的CYP82M3的氨基酸一致性很低(约36％)。古柯芽子酮合成酶的发现为天然产物的合成生物学提供了更多可选择的元件，并且为这类酶的理性设计提供了指导和依据，具有很好的工业化前景。本发明完善了对古柯托品烷类生物碱生物合成的认识。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为本发明实施例提供的EnES催化的酶化学反应方程式；
图2为本发明实施例提供的EnES的质粒图谱；
图3为本发明实施例提供的EnES催化4-(1-甲基-2-吡咯)-3-氧代丁酸生成芽子酮的LC-MS分析图；
图4为本发明实施例提供的EnES催化4-(1-甲基-2-吡咯)-3-氧代丁酸生成托品酮的LC-MS分析图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1
古柯芽子酮合成酶(ecgonone synthase，ES)基因的克隆。
(1)古柯嫩芽总RNA的提取及cDNA第一链的合成。
取适量古柯叶芽组织，在液氮中研磨，用biotek多糖多酚植物总RNA快速提取试剂盒按说明书提取总RNA。用Thermo ScientificNanoDrop分光光度计检测RNA浓度及质量，并用琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。
用诺唯赞公司HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒，按照其产品说明书指示，以总RNA为模板，合成cDNA。
(2)EnES基因的克隆。
设计特异性引物，具体引物序列如下：
EnES-F:5’-atgttggacacagtcttgtacgccctc-3’(SEQ ID NO.1)
EnES-R:5’-ctaatcaatcatgtctagtactttag-3’(SEQ ID NO.2)
通过PCR以嫩芽组织的cDNA为模板，扩增EnES的基因并测序，获得EnES基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG；翻译出蛋白编码序列如SEQ ID NO.4所示。
实施例2
酿酒酵母表达验证EnES基因功能。
在载体AtATR1-pESC-URA的EcoRI和BglII酶切位点引入EnES基因。为EnES基因设计引物，EnES正向引物带有同源臂序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物带有同源臂序列如SEQ ID NO.6所示。通过PCR扩增得到两端带有同源臂序列的EnES基因后，用重组酶(ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit)将EnES的编码区完整序列连接质粒AtATR1-pESC-URA，如图2所示，获得重组表达载体EnES-AtATR1-pESC-URA。
引物序列如下：
EnES-AF:5’-atttttgaaaattcgaattcatgttggacacagtcttgtacg-3’(SEQ ID NO.5)
EnES-AR:5’-ttaattaagagctcagatctctaatcaatcatgtctagtact-3’(SEQ ID NO.6)
将构建好的EnES-AtATR1-pESC-URA质粒转化到酿酒酵母BY4742，涂布SC-URA(含2％葡萄糖)固体平板，挑取单菌落进行PCR验证，筛选阳性克隆子，获得酿酒酵母表达工程菌EnES-AtATR1-pESC-URA-BY4742。将构建好的酿酒酵母表达工程菌接种至5mL SC-URA(含2％葡萄糖)液体培养基中，30℃孵育16h。再按1：100比例接种量分别接种到500mL SC-URA(含2％棉子糖)液体培养基中，30℃孵育48h。将培养好的菌体离心收集，并在悬浮于500mLSC-URA(含2％半乳糖)液体培养基中，30℃诱导蛋白24h。将收获的菌液4000rpm离心，去掉上清。把菌体用TEK缓冲液(50mM Tris-HCl,1mM EDTA,100mM KCl,pH＝7.4)悬浮。离心后，再悬浮于TES缓冲液(50mM Tris-HCl,1mM EDTA,600mM sorbitol,0.25mM PMSF,pH＝7.4)。将悬浮液用高压破碎仪进行破碎，并用7,500g离心20min。将上层悬浮液用85,000g离心3h，去除上清，将获得的微粒体用TEG缓冲液(50mM Tris-HCl,1mM EDTA,20％glycerol,pH＝7.4)悬浮。
EnES催化的酶化学反应方程式如图1所示，EnES催化的体外酶反应的体系如下：50mM磷酸钾缓冲盐(pH 7.5)，100μM 4-(1-甲基-2-吡咯)-3-氧代丁酸，1mM NADPH，10μLEnES微粒体蛋白，总体积100μL，30℃孵育，加等量乙腈终止反应。
酶反应产物用LC-MS进行分析，液质联用仪为agilent 1290/6530system，色谱柱为YMC-Triart C18(I.D.4.6×250mm)，柱温30℃，流速1mL/min，流动相洗脱程序为：90％A相(含0.1％甲酸的水)，10％B相(乙腈)，等度洗脱6min，质谱仪为电喷雾离子源(ESI)，进行正离子模式扫描，扫描范围(m/z)：50-400。
检测结果显示，EnES催化4-(1-甲基-2-吡咯)-3-氧代丁酸生产芽子酮(m/z:184.0948[M+H]+)，在分析条件下保留时间为3.2min，如图3所示；EnES催化4-(1-甲基-2-吡咯)-3-氧代丁酸生产托品酮(m/z:140.1070[M+H]+)，在分析条件下保留时间为2.8min，如图4所示。
本发明公开了一种古柯芽子酮合成酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，其编码的核苷酸如SEQ ID NO.3所示，将古柯芽子酮合成酶在酿酒酵母表达后能够催化4-(1-甲基-2-吡咯)-3-氧代丁酸生成芽子酮和托品酮。该产物是植物体内生物合成以及体外化学合成莨菪碱、可卡因等托品烷生物碱的重要中间体。本发明的芽子酮合成酶可作为元件用于托品烷生物碱的合成生物学，以及生物合成路径中涉及芽子酮或托品酮的天然产物的代谢工程。
古柯芽子酮合成酶与之前的从颠茄中鉴定的CYP82M3的氨基酸一致性很低(约36％)。古柯芽子酮合成酶的发现为天然产物的合成生物学提供了更多可选择的元件，并且为这类酶的理性设计提供了指导和依据，具有很好的工业化前景。本发明完善了对古柯托品烷类生物碱生物合成的认识。
于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (12)
1.一种古柯芽子酮合成酶，其特征在于，具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：
a)具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸残基序列的蛋白质；
b)将SEQ ID NO.4中的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有a)酶功能的由a)衍生的氨基酸序列；
c)与a)或b)限定的氨基酸序列具有80％以上的同源性，且具有a)酶功能的由a)衍生的蛋白质；
d)序列中含有a)、b)或c)所述氨基酸序列的衍生蛋白质。
2.一种古柯芽子酮合成酶基因，其特征在于，具有下述核苷酸序列之一的多核苷酸：
a)核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的多核苷酸；
b)编码如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的多核苷酸；
c)与a)或b)限定的核苷酸序列具有80％以上的同源性且编码具有权利要求1所述古柯芽子酮合成酶功能的多核苷酸；
d)与a)、b)或c)所述的序列互补的多核苷酸。
3.一种含有权利要求2所述古柯芽子酮合成酶基因的重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为将古柯芽子酮合成酶基因插入原核或真核表达载体得到表达古柯芽子酮合成酶的重组表达载体。
5.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，将所述古柯芽子酮合成酶基因构建到AtATR1-pESC-URA载体而得。
6.一种含有权利要求2所述古柯芽子酮合成酶基因的转基因重组菌或转基因细胞系。
7.根据权利要求6所述的转基因重组菌或转基因细胞系，其特征在于，所述转基因重组菌为细菌和真菌，所述细菌和真菌包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、根癌农杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、昆虫细胞。
8.权利要求1所述的古柯芽子酮合成酶在体内或体外催化生成芽子酮或托品酮及其衍生物中的应用。
9.权利要求1所述的古柯芽子酮合成酶在体内或体外催化生产托品烷生物碱中的应用，所述托品烷生物碱包括但不限于可卡因、莨菪碱、东莨菪碱。
10.权利要求3-5任一所述的重组表达载体在不具有芽子酮或托品酮及其衍生物生物合成途径的原核生物或真核生物中构建芽子酮或托品酮及其衍生物合成途径，或是在提升芽子酮或托品酮及其衍生物在具有芽子酮或托品酮及其衍生物合成途径的原核生物或真核生物产量中的应用。
11.权利要求3-5任一所述的重组表达载体在不具有托品烷生物碱生物合成途径的原核生物或真核生物中构建托品烷生物碱的生物合成途径中或是在提升托品烷生物碱在具有托品烷生物碱生物合成途径的原核生物或真核生物产量中的应用。
12.权利要求6所述的转基因重组菌或转基因细胞系在催化生产芽子酮或托品酮及其衍生物中的应用。
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