CN117110505A - 一种枸橼酸西地那非中基因毒性杂质的检测方法及质控限度 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分析化学技术领域，具体公开了一种枸橼酸西地那非中基因毒性杂质1‑甲基‑4‑硝基‑3‑丙基吡唑‑5‑甲酰胺检测方法及质控限度，所述方法包括：配制供试品溶液、对照品溶液和灵敏度溶液，采用液相色谱质谱联用仪（LC‑MS/MS）进行检测；所述高效液相色谱采用C18色谱柱，流动相A为0.1~0.3%甲酸水溶液，流动相B为甲醇溶液，流动相流速0.3～0.7mL/min，采用梯度洗脱，色谱柱柱温为35～45℃，进样量为5~20μL；所述质谱采用ESI离子源，MRM正离子模式，离子对为213.1/170.2，CE为10‑30V，DP为35~55V；所述基因毒性杂质的质量控制限度为10ppm。本发明提供的检测方法具有优异的专属性、灵敏度、线性、精密度、准确度和耐用性，适用于枸橼酸西地那非原料中基因毒性杂质的质量控制，保证了用药安全性。
Description
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，涉及一种枸橼酸西地那非中基因毒性杂质1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺检测方法，其质控限度为10ppm，为制定枸橼酸西地那非原料的质量标准提供依据，提高药品的安全性。
背景技术
枸橼酸西地那非，由Pfizer公司研发，是一种研发治疗心血管疾病药物时意外发明出的治疗男性勃起功能障碍药物，一般以其商业名称Viagra广为人知。它是西地那非的枸橼酸盐，一种对环磷酸鸟苷（cGMP）特异的5型磷酸二酯酶（PDE5）选择性抑制剂。作用机制：阴茎勃起的生理机制涉及性刺激过程中阴茎海绵体内一氧化氮（NO）的释放。NO激活鸟苷酸环化酶导致环磷酸鸟苷（cGMP）水平增高，使海绵体内平滑肌松弛，血液充盈。
枸橼酸西地那非化学名为1-{4-乙氧基-3-(6,7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1氢-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)苯磺酰}-4-甲基哌嗪枸橼酸盐，分子式：C22H30N6O4S·C6H8O7，分子量：666.70，其结构式为：
通过分析本品原料药的合成工艺路线，本品工艺合成过程中可产生微量的1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺杂质，属于基因毒性杂质，根据ICH M7指导原则，需要严格控制其含量，其基因毒性杂质的质控限度为10ppm。基因毒性杂质对应结构式如下：
为了确保枸橼酸西地那非的用药安全性，须对原料药合成过程中产生的基因毒性杂质进行研究和质控，但现有技术中均未报道过对上述基因毒性杂质的分离检测方法，亟待开发检测方法。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于一种枸橼酸西地那非中基因毒性杂质1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺检测方法。本发明的目的通过以下方案实现：
一种枸橼酸西地那非中基因毒性杂质1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺检测方法包括以下步骤：该方法高效液相色谱采用C18色谱柱，流动相A为0.1~0.3%甲酸水溶液，流动相B为甲醇溶液，流动相流速0.3～0.7mL/min，采用梯度洗脱，色谱柱柱温为35～45℃，进样量为5-20μL；所述质谱采用ESI离子源，MRM正离子模式，离子对为213.1/170.2，CE为10~30V，DP为35~55V；其中所述的杂质为：
。
进一步地，所述流动相A为0.1%甲酸水溶液；流动相B为甲醇；稀释剂为甲酸-甲醇-水=1：800：200。
进一步地，所述色谱柱柱温为40℃，进样体积为10μL。
进一步地，所述流动相流速为0.5mL/min。
进一步地，所述色谱柱为CORTECS C18柱，规格为150×3.0mm，填料粒径为2.7μm。
进一步地，所述质谱条件采用ESI离子源，MRM正离子模式，离子对为213.1/170.2，CE为20V，DP为45V。
进一步地，高效液相色谱所采用的梯度洗脱程序如下表：
本发明提供的一种枸橼酸西地那非中基因毒性杂质1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺检测方法，包括如下步骤：(1)配制供试品溶液、对照品溶液和灵敏度溶液；(2)设置高效液相色谱条件：采用CORTECS C18，150×3.0mm，2.7μm色谱柱，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为甲醇，流动相流速0.5mL/min，采用梯度洗脱，色谱柱柱温为40℃，进样量为10μL；(3)设置质谱条件：采用ESI离子源，MRM正离子模式，离子对为213.1/170.2，CE为20V，DP为45V。(4)分别吸取对照溶液和供试品溶液，注入液相色谱质谱联用仪，进行检测分析。
其中，所述对照品溶液的配制方法为：取基因毒性杂质对照品1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺适量，精密称定，加稀释剂溶解，并定量稀释制成每1ml约含20ng的溶液。
其中，所述供试品溶液的配制方法为：取枸橼酸西地那非原料药适量，精密称定，加稀释剂溶解，并定量稀释制成每1ml约含2mg的溶液。
其中，所述灵敏度溶液的配制方法为：精密量取1ml对照品溶液，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并定容，摇匀。
其中，液相色谱梯度程序如下：
本发明，公开了一种枸橼酸西地那非中基因毒性杂质1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺检测方法，该方法灵敏度高，重复性好，含量测定结果准确，专属性和线性关系良好，可用于枸橼酸西地那非中基因毒性杂质的质量控制。本发明，选用液相色谱质谱联用仪进行方法开发和检测，实现对枸橼酸西地那非中基因毒性杂质的高灵敏、高准确地定性定量研究，为枸橼酸西地那非中基因毒性杂质的质量控制奠定基础。
附图说明
图1 空白溶液、供试品溶液、对照品溶液、供试品加标溶液色谱。
具体实施方式
结合以下实施案列，进一步地，详细说明本发明所涉及的分析方法适用于枸橼酸西地那非中基因毒性杂质1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺的检测。
实施例1：一种枸橼酸西地那非中基因毒性杂质1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺检测方法
1、色谱条件：
仪器：Shimadzu/AB SCIEX LC-MS/MS液相色谱质谱联用仪；
色谱柱：CORTECS C18柱，规格为150×3.0mm，填料粒径为2.7μm；
流动相：流动相A为0.1%甲酸水溶液；流动相B为甲醇；稀释剂为甲酸-甲醇-水=1：800：200；
流动相流速：0.5mL/min，采用梯度洗脱；
色谱柱柱温为40℃，进样量10μL；
质谱条件采用ESI离子源，MRM正离子模式，离子对为213.1/170.2，CE为20V，DP为45V；
液相色谱梯度洗脱程序如下：
2、样品配制：
对照品溶液的配制：取基因毒性杂质对照品1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺适量，精密称定，加稀释剂溶解，并定量稀释制成每1ml约含20ng的溶液。
供试品溶液的配制：取枸橼酸西地那非原料药适量，精密称定，加稀释剂溶解，并定量稀释制成每1ml约含2mg的溶液。
灵敏度溶液的配制：精密量取1ml对照品溶液，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并定容，摇匀。
3、检测方法
精密量取灵敏度溶液、对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱质谱联用仪，进行检测分析，记录色谱图。
实施例2：一种枸橼酸西地那非中基因毒性杂质1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺检测方法
参照实施例1的检测方法进行，不同于实施例1之处在于：改变流速为0.48ml/min。
实施例3：一种枸橼酸西地那非中基因毒性杂质1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺检测方法
参照实施例1的检测方法进行，不同于实施例1之处在于：改变流速为0.52ml/min。
实施例4：一种枸橼酸西地那非中基因毒性杂质1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺检测方法
参照实施例1的检测方法进行，不同于实施例1之处在于：改变柱温为35℃。
实施例5：一种枸橼酸西地那非中基因毒性杂质1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺检测方法
参照实施例1的检测方法进行，不同于实施例1之处在于：改变柱温为45℃。
实施例6：一种枸橼酸西地那非中基因毒性杂质1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺检测方法
参照实施例1的检测方法进行，不同于实施例1之处在于：改变起始梯度洗脱程序中纯甲醇比例为25%。
实施例7：一种枸橼酸西地那非中基因毒性杂质1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺检测方法
参照实施例1的检测方法进行，不同于实施例1之处在于：改变起始梯度洗脱程序中纯甲醇比例为35%。
以上实施例1~7结果汇总如下：
分析结果：实施例1-7中，各考察条件下的回收率结果均在80%~120%之间，符合规定。
按照实施例1对本发明检测方法进行方法学验证，包括专属性、灵敏度、线性、校正因子、精密度、准确性、耐用性、溶液稳定性。结果汇总如下：
专属性结果显示：空白溶剂和供试品对目标杂质测定均无干扰。
检测限、定量限结果显示：1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺的浓度为0.4032ng/mL (0.2 ppm) 时，S/N≥3；1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺的浓度为2.0158 ng/mL (1 pm)时，S/N≥10；且定量限浓度项下进样精密度实验中，目标杂质6针峰面积的RSD小于20%，符合规定。
线性结果显示：1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺的浓度在2.0158~40.3156ng/ml范围内，浓度与峰面积呈线性关系，且线性关系良好，线性回归方程为：y=574.7683x+902.8128(r=0.9952，n=5)，符合要求。
重复性结果显示：6份加标供试品溶液中测得的1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺回收率均在80%~120%之间，且回收率的RSD%为6%，小于15%，符合规定。
中间精密度结果显示：第二人次6份加标供试品溶液中测得的1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺回收率均在80%~120%之间；两人次12份加标供试品溶液中测得的1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺回收率均在80%~120%之间，且回收率的RSD%为12%，小于15%，符合规定。
准确度结果显示：9份准确度溶液回收率均在80%～120%之间，回收率结果的RSD%为6% ≤ 15%，符合规定。
稳定性结果显示：对照品溶液至少在22小时内溶液稳定；供试品加标溶液至少在18小时内溶液稳定。
根据上述结果，本发明枸橼酸西地那非中基因毒性杂质1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺检测方法具有令人满意的专属性、线性、灵敏度、精密度、准确度、耐用性和溶液稳定性，适用于枸橼酸西地那非中基因毒性杂质1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺检测方法。
Claims (9)
1.一种枸橼酸西地那非中基因毒性杂质1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺检测方法及质控限度，其特征在于包括以下步骤：该方法高效液相色谱采用C18色谱柱，流动相A为0.1~0.3%甲酸水溶液，流动相B为甲醇，流动相流速0.3～0.7mL/min，采用梯度洗脱，色谱柱柱温为35～45℃，进样量为5-20μL；所述质谱采用ESI离子源，MRM正离子模式，离子对为213.1/170.2，CE为10-30V，DP为35~55V；其中所述的杂质化学名为：1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺，质控限度为10ppm，其结构式为：。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：流动相A为0.1%甲酸水溶液；流动相B为甲醇；稀释剂为甲酸-甲醇-水=1：800：200。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：色谱柱柱温为40℃，进样体积为10μL，流动相流速为0.5mL/min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：色谱柱为CORTECS C18柱，规格为150×3.0mm，填料粒径为2.7μm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：质谱离子源采用ESI离子源，MRM正离子模式，离子对为213.1/170.2，CE为20V，DP为45V。
6.本发明提供的一种枸橼酸西地那非中基因毒性杂质1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺检测方法，包括如下步骤：(1)配制供试品溶液、对照品溶液和灵敏度溶液；(2)设置高效液相色谱条件：采用CORTECS C18，150×3.0mm，2.7μm色谱柱，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为甲醇，流动相流速0.5mL/min，采用梯度洗脱，色谱柱柱温为40℃，进样量为10μL；(3)设置质谱条件：采用ESI离子源，MRM正离子模式，离子对为213.1/170.2，CE为20V，DP为45V。(4)分别吸取对照品溶液、供试品溶液和灵敏度溶液，注入液相色谱质谱联用仪，进行检测分析。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：一种对照品溶液的配制方法为：取基因毒性杂质对照品1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-甲酰胺适量，精密称定，加稀释剂溶解，并定量稀释制成每1ml约含20ng的溶液。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：一种供试品溶液的配制方法为：取枸橼酸西地那非原料药适量，精密称定，加稀释剂溶解，并定量稀释制成每1ml约含2mg的溶液。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：一种灵敏度溶液的配制方法为：精密量取1ml对照品溶液，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并定容，摇匀，即得；其中，根据权利要求7所述的步骤(2)中，梯度程序如下：
。
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