CN117100801A - 一种抗特异性皮炎的药物组合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗特异性皮炎的药物组合物及其制备方法和用途；所述药物组合物包括由如下重量配比的各原料制成的有效成分：黄连3～50重量份、黄芩3～30重量份、黄柏3～30重量份和白鲜皮6～50重量份。本发明对特应性皮炎皮肤损伤和瘙痒具有良好的治疗效果。

Description

一种抗特异性皮炎的药物组合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地，涉及一种抗特异性皮炎的药物组合物及其制备方法和用途。
背景技术
特应性皮炎是临床常见的过敏性炎性皮肤病，临床上皮肤损害以丘疹、水疱、渗出、糜烂、瘙痒为主，具有剧烈瘙痒、多形损害、反复发作而缠绵难愈等特点。特应性皮炎通常始发于婴幼儿，成年人中患病率也居高不下，目前全世界人口中约有15-30％的婴幼儿和2-10％的成年人患有特应性皮炎。尽管特应性皮炎的情况普遍存在，但其病因尚未十分清楚。鉴于目前对特应性皮炎的研究，现普遍认为特应性皮炎与变态反应有关，其发病机制与基因突变，接触外源性刺激物，皮肤表皮屏障功能受损，免疫系统过反应以及这几者之间的相互作用有密切关系。在接触外源性刺激物后，抗原特异性CD4+T细胞分化为1型辅助T细胞(Th1)和2型辅助T细胞(Th2)，其中Th2细胞功能亢进，造成Th1/Th2细胞功能失调，导致下游炎性因子和肥大细胞的浸润，进一步增加特应性皮炎患者的过敏反应。特应性皮炎的患者血清中均能检测到免疫球蛋白IgE显著升高，提示在这些潜在因素中，免疫系统失调在特应性皮炎的病程中扮演重要角色。因此临床上普遍采用口服糖皮质激素(地塞米松)或外用类固醇激素药等方法治疗特应性皮炎，但其副作用不可忽视，例如造成痤疮样皮疹、皮肤萎缩、毛细血管扩张、色素沉着、激素依赖性皮炎等等。
传统的中草药由于其较高的安全性受到医学界的重视。然而，对中药复方抗特应性皮炎作用的研究比较少。寻找能够调节免疫系统功能且无毒副作用的天然药物甚为重要，将其开发成为安全有效的治疗特应性皮炎的药品或食品具有十分重要的临床意义。
需要说明的是，在上述背景技术部分公开的信息仅用于对本发明的背景的理解，因此可以包括不构成对本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。
发明内容
本发明的主要目的在于克服上述背景技术的缺陷，提供一种抗特异性皮炎的药物组合物及其制备方法和用途。
在第一方面，本发明提供一种抗特异性皮炎的药物组合物，其包括由如下重量配比的各原料制成的有效成分：黄连3～50重量份、黄芩3～30重量份、黄柏3～30重量份和白鲜皮6～50重量份。
进一步地，所述各原料的重量配比为：黄连9重量份、黄芩6重量份、黄柏6重量份和白鲜皮9重量份。
进一步地，所述药物组合物还包括药学上可接受的赋形剂。
进一步地，所述有效成分和所述赋形剂一起被制成药学上可接受的剂型。
进一步地，所述剂型为颗粒剂、胶囊剂、浓缩丸、口服液或片剂。
进一步地，所述药物组合物中的有效成分由如下步骤制成：
(1)按重量配比称取各原料，加乙醇，常温浸泡预定时间后，进行提取，过滤；
(2)回收步骤(1)的滤液，除去乙醇后，得到第一提取物，将所述第一提取物作为所述有效成分；优选地，还包括步骤(3)将所述第一提取物以乙酸乙酯萃取后，干燥得到粉末状的第二提取物，将所述第二提取物作为所述有效成分。
在第二方面，本发明还提供一种抗特异性皮炎的药物组合物的制备方法，其包括如下步骤：
(1)按第一方面中所述的重量配比称取各原料，加乙醇，常温浸泡预定时间后，进行提取，过滤；
(2)回收步骤(1)的滤液，除去乙醇后，得到第一提取物，将所述第一提取物作为所述药物组合物的有效成分。
进一步地，还包括步骤(3)将所述第一提取物以乙酸乙酯萃取后，干燥得到粉末状的第二提取物，将所述第二提取物作为所述药物组合物的有效成分。
进一步地，所述制备方法还包括如下步骤：(4)将步骤(3)得到的第二提取物与药学上可接受的赋形剂一起，制成药学上可接受的剂型。
进一步地，所述剂型为颗粒剂、胶囊剂、浓缩丸、口服液或片剂。
在第三方面，本发明还提供一种第一方面所述的药物组合物在制备用于治疗或预防受试者的特应性皮炎的药物中的用途。
进一步地，所述药物以口服的方式给药。
本发明的有益效果包括：
1、本发明的药物组合物对DNCB诱导产生的特应性皮炎皮肤损伤和瘙痒具有良好的治疗效果，可用于制备具有抗特应性皮炎的药物和功能食品，为特应性皮炎的治疗提供新的选择。
2、目前特应性皮炎发病机制特别是细胞因子发病机制越来越受到人们的重视，本发明证实了本发明的药物组合物能显著改善小鼠特异性皮炎样皮肤损伤和抓痒行为，降低血清中IgE、组胺、TNF-α的含量及提高皮肤中神经酰胺的含量，抑制皮肤表皮层增厚和炎性细胞、肥大细胞的浸润，从炎症反应的角度阐明本发明的药物组合物的抗特应性皮炎的作用机制；此外，本发明的药物组合物能够下调过度反应的Th2细胞因子的基因表达，上调被抑制的Th1细胞因子的基因表达，阐明了本发明的药物组合物对免疫系统的调节作用机制，另外本发明的药物组合物还能提高皮肤中蛋白丝聚合蛋白(filagrin，FIG)和兜甲蛋白(Loricrin，LOR)的蛋白表达水平，从恢复皮肤屏障功能的角度阐明了MHLJDD和MHLJDD-F治疗特应性皮炎的作用机理。
3、经实验证明本发明的药物组合物具有改善症状快、疗程短的优点，本发明的药物原料种类少、制备方法简单易操作，具有广泛应用价值。
附图说明
图1a-1f分别是本发明具体实施方式中MHLJDD和HLJDD对：(A)小鼠耳部皮肤厚度的影响(图1a)；(B)小鼠抓挠行为学评分的影响(图1b)；(C)小鼠血清中IgE和组胺含量的影响(图1c)；(D)小鼠血清中组胺含量的影响(图1d)；(E)小鼠背部皮肤中IL-1β含量的影响(图1e)；(F)小鼠背部皮肤中IL-6含量的影响(图1f)；各数据以均数±标准误差平均值(mean±SEM)表示，n＝6，与control组比较，*p<0.05，**p<0.01。
图2是本发明具体实施方式中MHLJDD和MHLJDD-F对小鼠体重的影响；各数据以均数±标准误差平均值(mean±SEM)表示，n＝12；与NC组比较，#p<0.05，##p<0.01；与MC组比较，*p<0.05，**p<0.01。
图3是本发明具体实施方式中MHLJDD和MHLJDD-F对小鼠背部皮肤厚度的影响；各数据以均数±标准误差平均值(mean±SEM)表示，n＝12；与NC组比较，#p<0.05，##p<0.01；与MC组比较，*p<0.05，**p<0.01。
图4是本发明具体实施方式中MHLJDD和MHLJDD-F对DNCB诱导小鼠背部皮肤湿疹样症状的影响。
图5是本发明具体实施方式中MHLJDD和MHLJDD-F对DNCB诱导小鼠背部皮肤湿疹样症状评分的影响；各数据以均数±标准误差平均值(mean±SEM)表示，n＝12；与MC组比较，*p<0.05,**p<0.01。
图6是本发明具体实施方式中MHLJDD和MHLJDD-F对DNCB诱导小鼠抓挠背部行为分数的影响；各数据以均数±标准误差平均值(mean±SEM)表示，n＝12；与NC组比较，#p<0.05；##p<0.01；与MC组比较，*p<0.05，**p<0.01。
图7a-7d分别是本发明具体实施方式中MHLJDD和MHLJDD-F对DNCB造模小鼠：(A)血清中TNF-α的影响(图7a)；(B)血清中IgE的影响(图7b)；(C)血清中组胺的影响(图7c)；和(D)皮肤中神经酰胺含量的影响(图7d)；各数据以均数±标准误差平均值(mean±SEM)表示，n＝12；与NC组比较，#p<0.05；##p<0.01；与MC组比较，*p<0.05；**p<0.01。
图8a和图8b分别是本发明具体实施方式中MHLJDD和MHLJDD-F对DNCB造模小鼠皮肤生理结构的影响(图8a)和表皮层厚度的影响(图8b)；对小鼠背部皮肤切片进行H&E染色，在光学显微镜下放大100倍(100x)观察，箭头指示表皮厚度。
图9a和图9b共同表示本发明具体实施方式中MHLJDD和MHLJDD-F对DNCB造模小鼠皮肤中肥大细胞数量的影响；对小鼠背部皮肤切片进行甲苯胺蓝染色，肥大细胞被染成紫红色，在光学显微镜下放大100倍(100x)观察；各数据以均数±标准误差平均值(mean±SEM)表示，n＝6；与NC组比较，#p<0.05,##p<0.01；与MC组比较，*p<0.05；**p<0.01。
图10a-10f分别是本发明具体实施方式中MHLJDD和MHLJDD-F对DNCB造模小鼠皮肤中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-13和IFN-γ基因表达水平的影响；各数据以均数±标准误差平均值(mean±SEM)表示，n＝6；与NC组比较，#p<0.05；##p<0.01；与MC组比较，*p<0.05；**p<0.01。
图11是本发明具体实施方式中MHLJDD和MHLJDD-F对DNCB造模小鼠皮肤中FLG和LOR蛋白表达水平的影响，其中，(A)图是FLG和LOR蛋白表达的蛋白印迹条带，(B)图是(A)图的量化图；各数据以均数±标准误差平均值(mean±SEM)表示，n＝3；与NC组比较，#p<0.05；##p<0.01；与MC组比较，*p<0.05；**p<0.01。
具体实施方法
以下对本发明的实施方式做详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用,在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。本文中，如无特别说明，％均表示质量百分比，“室温”是指23-25℃。
本发明实施方式中提供一种抗特异性皮炎的药物组合物，其包括由如下重量配比的各原料制成的有效成分：黄连3～50重量份、黄芩3～30重量份、黄柏3～30重量份和白鲜皮6～50重量份。
在一些优选的实施方式中，药物组合物中的各原料的重量配比为：黄连9重量份、黄芩6重量份、黄柏6重量份和白鲜皮9重量份。
在一些优选的实施方式中，药物组合物还包括药学上可接受的赋形剂，通过赋形剂，可以将有效成分和赋形剂一起被制成药学上可接受的剂型，例如颗粒剂、胶囊剂、浓缩丸、口服液或片剂，其中，“药学上可接受的赋形剂”指不干扰活性成分的生物活性的除主药以外的附加物，也可称为辅料，是制药领域常规使用的，例如粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、增溶剂、矫味剂、抑菌剂、抗氧化剂、着色剂、防腐剂、乳化剂、芳香剂、渗透压调节剂等等。
在一些优选的实施方式中，药物组合物中的有效成分由如下步骤制成：(1)按重量配比称取各原料，加乙醇，常温浸泡预定时间后，进行提取，过滤；(2)回收步骤(1)的滤液，除去乙醇后，得到第一提取物，将第一提取物作为有效成分。
在进一步优选的实施方式中，还包括步骤(3)将所述第一提取物以乙酸乙酯萃取后，干燥得到粉末状的第二提取物，将所述第二提取物作为有效成分。
例如，在一个具体的示例中，药物组合物中的有效成分由如下步骤制成：(1)各原料称重后加80％的乙醇，在常温下浸泡24h后，通过超声提取1h，过滤，重复上述提取步骤2次；(2)合并三次滤液，减压回收所有乙醇，得到第一提取物；(3)将第一提取物以10倍量乙酸乙酯萃取三次，弃去乙酸乙酯后，经过减压回收后冷冻干燥得到粉末状的第二提取物。
本发明的药物组合物是中药复方制剂，其中：黄连是毛茛科植物黄连Coptischinensis Franch.、三角叶黄连Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao或云连Coptisteeta Wall.的干燥根茎，其性味苦，寒，归心、脾、胃、肝、胆、大肠经，具有清热燥湿、泻火解毒的功效，常用于湿热痞满、呕吐吞酸、泻痢、黄疸、高热神昏、心火亢盛、心烦不寐、血热吐衄、目赤、牙痛、消渴、痈肿疔疮；外治湿疹、湿疮、耳道流脓。黄连的主要化学成分为是木脂素和生物碱，还有挥发油、酚酸、黄酮类等等，小檗碱是黄连最主要的生物碱物质，具有很强的抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌活性。黄柏是芸香科植物黄皮树Phellodendron chinenseSchneid.的干燥树皮，其性味苦，寒。归肾、膀胱经，具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮的功效，用于湿热泻痢、黄疽尿赤、带下阴痒、热淋涩痛、脚气痿蹵、骨蒸劳热、盗汗、遗精、疮疡肿毒、湿疹湿疮，黄柏的主要化学成分为黄酮类和生物碱类，具有抗过敏，抗氧化和抗菌的作用。黄芩是唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，其性味苦，寒。归肺、胆、脾、大肠、小肠经，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎的功效，用于湿温、暑湿、胸闷呕恶、湿热痞满、泻痢、黄疸、肺热咳嗽、高热烦渴、血热吐衄、痈肿疮毒、胎动不安，现代研究发现，黄芩具有较强抗菌消炎、抗病毒及抗过敏的作用，并能提高机体免疫功能。白鲜皮是芸香科植物白鲜Dictamnus dasycarpus Turcz.的干燥根皮。2020年药典记载其性苦，寒，归脾、胃、膀胱经，具有清热燥湿，祛风解毒的功效，用于湿热疮毒，黄水淋漓，湿疹，风疹，疥癣疮癞，风湿热痹，黄疸尿赤，白鲜皮在皮肤科的应用也非常广泛，可用于治疗足癣、扁平疣、皮肤瘙痒、荨麻疹、湿疹等皮肤病,具有良好的抗过敏作用、止痒的作用。
本发明通过建立特应性皮炎的小鼠动物模型，研究了采用黄连、黄芩、黄柏和白鲜皮按预定的重量配比进行提取得到的药物组合物对2,4-二硝基氯苯(DNCB)诱导的特应性皮炎样皮肤损伤和瘙痒的治疗作用，并分析其可能的作用机制，通过检测小鼠血清与皮肤中各项指标，发现本发明的药物组合物(后文的MHLJDD和MHLJDD-F，尤其是MHLJDD-F)均能够显著改善小鼠皮肤损伤和瘙痒，其作用机制可能与抑制炎症反应，调节免疫细胞功能，进而修复表皮屏障功能有关，因此，经体内实验证实，本发明的药物组合物中将黄连、黄芩、黄柏和白鲜皮进行配伍协同后，对DNCB诱导的特应性皮炎样皮肤损伤和瘙痒具有很好的治疗作用。
本发明具体实施方式还提供一种抗特异性皮炎的药物组合物的制备方法，其包括如下步骤：
(1)按第一方面中所述的重量配比称取各原料，加乙醇，常温浸泡预定时间后，进行提取，过滤；
(2)回收步骤(1)的滤液，除去乙醇后，得到第一提取物，将所述第一提取物作为所述药物组合物的有效成分。
优选地，还包括步骤(3)将所述第一提取物以乙酸乙酯萃取后，干燥得到粉末状的第二提取物，将所述第二提取物作为所述药物组合物的有效成分。
可选地，还包括步骤(4)：将步骤(3)得到的第二提取物与药学上可接受的赋形剂一起，制成药学上可接受的剂型(例如颗粒剂、胶囊剂、浓缩丸、口服液或片剂)。
经本发明的研究证实，第一提取物(后文也称MHLJDD)和第二提取物(后文也称MHLJDD-F)均能够显著改善小鼠皮肤损伤和瘙痒，对DNCB诱导的特应性皮炎样皮肤损伤和瘙痒具有很好的治疗作用。由于第一、二提取物都是无毒成分，所以根据实际需要，可以直接以提取物给药，此时药物组合物中则不含药学上可接受的赋形剂，当组合物中含有药学上可接受的赋形剂时，它们可按制药领域常规方法混合而制备所需的剂型的药物。
在制备用于治疗或预防受试者的特应性皮炎的药物中的用途中，药物可以以口服的方式给药。
下面，通过一些具体的示例和对比例等，对本发明做进一步阐述。
实施例1(本发明药物组合物的制备)
将黄连9g、黄芩6g、黄柏6g和白鲜皮9g加10倍量80％乙醇浸泡24小时，超声提取1小时，过滤，重复以上提取步骤两次。合并三次的滤液，减压回收后冷冻干燥得到第一提取物(MHLJDD)，计算提取率为16.45％。
将MHLJDD以10倍量乙酸乙酯萃取三次，弃去乙酸乙酯后，经过减压回收后冷冻干燥得到第二提取物(MHLJDD-F)，计算提取率为11.67％。
实施例2(本发明药物组合物对特应性皮炎的治疗作用)
一、实验材料
1、实验动物及药品
SPF级Balb/c小鼠，雌性，22-24g，购于香港中文大学实验动物中心。实验动物分笼饲养，每2天更换一次垫料，适应性饲养7天，实验期间自由饮水和进食。饲养环境温度为22±2℃，相对湿度为60％，每天12小时光照和12小时黑夜循环。
2、供试药品制备：在实验室制备
(1)对比样1的制备：将黄连9g、黄芩6g、黄柏6g和栀子9g加10倍量80％乙醇浸泡24小时，超声提取1小时，过滤，重复以上提取步骤两次。合并三次的滤液，减压回收后冷冻干燥得到提取物，即对比样1(后文也称HLJDD)，计算提取率为50.2％。将以上提取物HLJDD以蒸馏水配制成提取物浓度为0.03g/mL的供试液样品。
(2)实验样1：将实施例1制得的第一提取物(MHLJDD)以蒸馏水配制成提取物浓度为0.148g/mL的供试液样品。
(3)实验样2：将实施例1制得的第二提取物(MHLJDD-F)以蒸馏水分别配制成提取物浓度为0.026g/mL、0.052g/mL和0.104g/mL的供试液样品。
(4)阳性对照组供试液(后文也称为DXM)：精密称取20mg地塞米松(dexamethasone，DXM)混悬于40mL0.5％羧甲基纤维素钠溶液，配成浓度为0.5mg/mL的供试液样品。
上述(1)～(4)的药物配制后，4℃冰箱保存备用。
3、实验试剂
(1)造模及给药试剂：DNCB、丙酮和DXM，均购自美国Sigma公司；蒸馏水和橄榄油，均购自香港屈臣氏公司；考马斯亮蓝蛋白定量试剂购自Bio-Rad公司；小鼠IgE、组胺(histamine)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-4和IL-6试剂盒，均购自美国Abcam公司；小鼠神经酰胺试剂盒，购自中国武汉华美公司。
(2)石蜡切片制作和染色相关试剂：伊红、苏木精、甲苯胺蓝、二甲苯、乙醇、盐酸和中性树胶，均购自美国Sigma公司。
(3)Western blot(WB)测定相关试剂：RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂cocktail、PMSF(100mM)、磷酸化蛋白酶抑制剂、蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE凝胶制备试剂、TRIS缓冲液、甘氨酸、SDS和Tween-20，均购自美国Sigma公司；PVDF膜(0.22μm)购自Bio-Rad公司；BSA购自Thermo Scientific公司；β-actin(β-肌动蛋白)购自Santa Cruz公司；丝聚合蛋白(FLG)和兜甲蛋白(LOR)抗体购自Cell Signaling Technology公司；蛋白Marker、HRP标记山羊抗兔抗体和HRP标记山羊抗小鼠抗体购自Thermo Scientific公司；RIPA(含1％蛋白抑制剂)购自Thermo Scientific公司。
(4)PCR测定相关试剂：TRIzol试剂购自Thermo Scientific公司；氯仿和异丙醇购自美国sigma公司；cDNA逆转录试剂盒购自Takara公司；TaqMan快速扩增PCR试剂盒，TaqMan小鼠TNF-α、IL-4、IL-6、IL-1β、IL-13和IFN-γ引物，购自Applied Biosystems公司。
4、实验仪器
752-P紫外分光亮度计，购自上海现科仪器有限公司；SHIMADZU分析天平，购自广州湘仪机电设备有限公司；PL-203电子天平，购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；IKA10组织匀浆机，购自德国IKA公司；BH22型光学显微镜，购自日本Olympus公司；FLUOstar Optima酶标仪，购自德国BMG Labtec公司；ABI-7500荧光定量PCR仪，购自美国ABI公司；FBZ2001-up-p标准试剂型纯水仪，购自青岛富勒姆科技有限公司；台式高速冷冻离心机，购自Heal force公司；DYY-6C电泳仪，购自北京六一仪器厂。
二、动物实验过程
1、动物分组及给药
实验开始前取各小鼠，以剃毛刀剃除背部2cmⅹ3cm面积大小的毛发，除正常组(Normal Control，NC)外，每只小鼠背部每天涂抹0.5％DNCB溶液(DNCB溶解于丙酮：橄榄油＝3:1(体积比))200μL，双耳各涂抹20μL，连续3天，一周后每只小鼠背部涂抹1％DNCB溶液200μL，双耳各涂抹20μL，每3天一次，共重复7次。涂抹DNCB致敏14天后随机分成以下8组：正常组，模型组(Model Control，MC)，阳性对照组(DXM，给药剂量为5mg/kg(即以前述配置的阳性对照组供试液的0.5mg/mL的给药浓度，小鼠的给药体积10mL/kg给药))，对比样1治疗组(HLJDD，给药剂量为0.3g/kg)，第一提取物(即实验样1)治疗组(MHLJDD，给药剂量为1.48g/kg)，低剂量的第二提取物(即实验样2)治疗组(MHLJDD-F-L，给药剂量为0.26g/kg)，中剂量的第二提取物(即实验样2)治疗组(MHLJDD-F-M，给药剂量为0.52g/kg)，高剂量的第二提取物(即实验样2)治疗组(MHLJDD-F-H，给药剂量为1.04g/kg)，每组12只小鼠。分组后，标号，再称量各小鼠体重，记录并计算相应给药体积(10mL/kg)。正常组和模型组给予相同体积的蒸馏水。其余各组小鼠灌胃给予上述浓度的DXM、HLJDD、MHLJDD、MHLJDD-F-L、MHLJDD-F-M和MHLJDD-F-H，每日一次，持续给药15天。
2、小鼠背部湿疹症状评分及皮肤厚度测试
分组当日(即DNCB致敏第15天)记录小鼠体重，拍照记录背部皮肤外观，根据EASI评分规则进行评分，并使用游标卡尺测量小鼠背部中线位置皮肤厚度，此后每周(DNCB致敏第15,22和29天)记录体重，背部皮肤外观和背部皮肤厚度一次。EASI评分规则为：根据四大湿疹症状(红斑，水肿，脱皮，苔藓化)的严重程度，分别按照0-3分评分，0分代表无症状，1分代表轻微，2分代表中度，3分代表严重，最终每只小鼠评分为四大湿疹症状的总分的平均数。
3、小鼠抓挠行为学实验
末次给药1小时后，将小鼠置于透明观察箱中，待其熟悉环境后用数码摄像头记录20分钟，隐去组别信息后由另一名实验员观察并记录小鼠在20min内后腿抓挠背部的时间和次数。持续抓挠1.5s以下每次按2分计，持续抓挠1.5秒以上每次按4分计。
4、血清和皮肤取材
实验结束后，小鼠通过眼眶取血法取血，血液样品在室温下静置2小时，随后在3000rpm条件下离心15min，分离上层清液得到血清样品。小鼠取血后用颈脱臼法处死，并马上剪出大小约1cm2的背部皮肤组织4份，其中：1份放入4％多聚甲醛中固定24h，用于制作病理组织切片；1份放入ELISA试剂盒中提供的细胞裂解液中，用于后续ELISA试剂盒检测；1份放入TRIzol试剂中，用于提取组织中RNA进行后续PCR测定；1份放入RIPA(含1％蛋白抑制剂)中用于提取细胞总蛋白进行后续WB测定。收取所需组织后，剩余组织放入-80℃冰箱保存，在后继实验使用。
5、Western Blot检测相关蛋白表达
5.1、总蛋白提取
组织块用冷PBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于IKA10组织匀浆机。加入10倍组织体积的RIPA裂解液(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂cocktail)冰上彻底匀浆。将匀浆液转移至1.5mL离心管中，振荡。其后冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解，随后行12000g离心10min，收集上清，即为总蛋白溶液。
5.2、蛋白浓度测定：考马斯亮蓝法测蛋白浓度。
5.3、SDS-PAGE电泳
SDS-PAGE凝胶参考SDS-PAGE凝胶制备试剂盒说明书进行配制。加入足够的电泳液后上样电泳，将样品加入电泳孔中电泳(浓缩胶电压70V，1h；分离胶电压120V，30min)，至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
5.4、转膜
准备6张7×9cm的滤纸和一张大小适中的PVDF膜，PVDF膜在使用之前先用甲醇活化15s。在加有转移液的盆里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、滤纸和经过活化的PVDF膜。将夹子打开使黑的一面保持水平，在垫子上垫海绵和三层滤纸，小心剥下分离胶盖于滤纸上，将膜盖于胶上，排除气泡，然后在膜上盖三张滤纸并排除气泡，最后盖上另一个海绵垫。转膜条件(湿转)为：快转，250mA恒流转膜45min。
5.5、免疫反应
将转好的膜于室温下脱色摇床上用5％的脱脂牛奶(0.5％TBST配)封闭2小时。稀释一抗(TBST溶解的5％脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5％BSA)，4℃孵育过夜。然后用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min，将二抗用TBST稀释2000倍，室温下孵育2小时后，用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。
5.6、发光
将ECLA和ECLB两种试剂在离心管中等体积混合，将PVDF膜的蛋白面朝上与此混合液充分接触，1-2min后，去尽残液，包裹好，放入暗匣中曝光。最后用显影、定影试剂进行显影和定影，并根据不同的光强度调整曝光条件。
6、PCR检测相关基因表达
6.1、RNA的提取
100mg皮肤组织加入1mlTRIzol试剂后置于IKA10组织匀浆机中充分匀浆并在冰上孵育5min，随后加入0.2ml氯仿使其裂解，再孵育2～3min。震荡混匀后使用冷冻离心机在12,000g条件下离心15min，吸取上层水液转移至另一只离心管中，加入0.5ml异丙醇混匀，孵育10min后使用冷冻离心机在12,000g条件下离心10min，白色沉淀即为RNA。弃去上清液，加入1ml 75％乙醇重悬混匀后使用冷冻离心机在7000g条件下离心5min，弃去上清液，加入20～50μL DEPC水，在55℃加热板中加热10min灭活，最后使用酶标仪测定RNA含量和纯度。
6.2、cDNA逆转录
根据Takara公司cDNA逆转录试剂盒说明书进行操作。每次反应RNA上样量为2μg。转录好的cDNA保存于-80℃冰箱用于后续相关基因的检测。
6.3、实时定量PCR测定
根据Applied Biosystems公司TaqMan快速扩增PCR试剂盒说明进行操作，将转录好的cDNA与TaqMan小鼠IL-4、IL-6、IL-13、IL-31、IFN-γ、TSLP和FLG引物结合，β-actin为内参。反应条件为50℃2min，95℃10min，随后循环扩增40次(95℃15s和60℃1min)。目的基因扩增倍数计算采用ΔΔCT法，目的基因倍数＝2^-ΔΔCT，其中ΔΔCT＝(实验组目的基因CT值-β-actin CT值)-(对照组目的基因CT值-β-actin CT值)。
7、病理组织学观察
7.1、石蜡切片制作
皮肤组织在4％多聚甲醛中固定24h后进行在组织脱水机中自动脱水，随后以石蜡进行包埋制成蜡块，切片后经过脱水，透明，封固制成石蜡切片。
7.2、病理组织学观察和皮肤表皮层厚度测定
制作好的石蜡切片经二甲苯脱蜡，再经由高浓度到低浓度乙醇(乙醇浓度从高到低分别是100％、95％、80％和70％)，最后入蒸馏水，即可使用苏木精和伊红进行染色。染色后的切片经由低到高浓度乙醇(乙醇浓度从低到高分别是70％、80％、95％和100％)脱水后，再经二甲苯使切片透明。将已透明的切片滴上树胶，盖上盖玻片封固。在光学显微镜下即可观察皮肤真皮层中炎性细胞浸润现象并测量皮肤表皮层厚度。
7.3、甲苯胺蓝染色测定肥大细胞浸润
制作好的石蜡切片经二甲苯脱蜡，再经由高浓度到低浓度乙醇，最后入蒸馏水，即可使用甲苯胺蓝进行染色。染色后的切片经由低到高浓度乙醇脱水后，再经二甲苯使切片透明。将已透明的切片滴上树胶，盖上盖玻片封固。在光学显微镜下即可观察皮肤真皮层中肥大细胞被染成紫红色，使用ImageJ软件自动计算肥大细胞数量。
8、皮肤中炎性因子含量测定
根据ELISA试剂盒说明书操作进行，准确称定皮肤组织重量，加入细胞裂解液后使用高速匀浆机制备组织匀浆液，在12,000g，4℃条件下离心15min，分离上层清液来测定皮肤组织中IL-4和IL-6的含量。
9、统计学分析
各数据以均数±标准误差平均值(mean±SEM)表示，应用GraphPad Prism 9软件制图和进行统计学分析，各组间差异比较，采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，组间两两多重比较采用Dunnett’s法，以p<0.05为标准，表示有显着性差异。此外与正常组比较，#p<0.05，##p<0.01；与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01。
三、各试样对特应性皮炎的治疗作用的实验结果
以下各图中，“Control”或“NC”均表示正常组；“DNCB”或者“MC”表示模型组；“DNCB+HLJDD”表示对比样1(HLJDD，0.3g/kg)治疗组；“DNCB+MHLJDD”或者“MHLJDD”均表示实验样1(MHLJDD，0.3g/kg)治疗组；“DNCB+MHLJDD-F-L”或“MHLJDD-F-L”均表示低剂量的实验样2(MHLJDD-F-L，0.26g/kg)治疗组；“DNCB+MHLJDD-F-M”或“MHLJDD-F-M”均表示中剂量的实验样2(MHLJDD-F-L，0.52g/kg)治疗组；“DNCB+MHLJDD-F-H”或“MHLJDD-F-H”均表示高剂量的实验样2(MHLJDD-F-L，1.04g/kg)治疗组；“DXM”表示阳性对照组(DXM，5mg/kg)。
1、实验样1(MHLJDD)和对比样1(HLJDD)对DNCB致小鼠特应性皮炎样损伤的作用比 较
如图1a-1f所示，本发明的研究发现，连续给药两周后，实验样1(MHLJDD，0.3g/kg)对DNCB致小鼠耳部皮肤增厚和抓痒行为有明显的抑制作用，其作用效果显著优于对比样1(HLJDD，0.3g/kg)。另外，MHLJDD还能显著抑制DNCB致小鼠血清中的IgE和组胺水平，其作用效果显著优于HLJDD。MHLJDD和HLJDD对DNCB致小鼠皮肤中IL-4的含量均有显著的抑制作用，但MHLJDD对抑制皮肤中IL-6的含量的作用效果显著优于HLJDD，因此可知，MHLJDD与HLJDD相比，MHLJDD对致小鼠特应性皮炎样损伤具有更好的治疗作用。
2、实验样1(MHLJDD)和实验样2(MHLJDD-F)对小鼠体重的影响
本研究发现，MHLJDD和MHLJDD-F对小鼠体重没有显著的不良影响，但阳性药地塞米松对小鼠体重有明显的抑制作用，各组体重变化如图2所示(图2中，以第15天为例，从左到右的柱子分别代表NC、MC、DXM、MHLJDD、MHLJDD-F-L、MHLJDD-F-M和MHLJDD-F-H；第22天和第29天同理)。
3、实验样1(MHLJDD)和实验样2(MHLJDD-F)对小鼠背部皮肤厚度的影响
如图3所示(图3中，以第15天为例，从左到右的柱子分别代表NC、MC、DXM、MHLJDD、MHLJDD-F-L、MHLJDD-F-M和MHLJDD-F-H；第22天和第29天同理)，本发明的研究发现，口服给予MHLJDD和MHLJDD-F两周后DNCB引起的小鼠背部皮肤增厚的现象显著改善，MHLJDD-F的抑制作用强于MHLJDD，呈剂量依赖性(即随着MHLJDD-F剂量的增加，抑制作用增强)，表明MHLJDD和MHLJDD-F能够抑制DNCB诱导的表皮增厚的作用。
4、实验样1(MHLJDD)和实验样2(MHLJDD-F)对DNCB诱导小鼠背部皮肤湿疹样症状 的影响
如图4和图5所示(图5中，以第15天为例，从左到右的柱子分别代表MC、DXM、MHLJDD、MHLJDD-F-L、MHLJDD-F-M和MHLJDD-F-H；第22天和第29天同理)，本发明的研究发现，由DNCB诱导的小鼠背部皮肤湿疹样症状，如皮肤红斑、水肿、脱皮和苔藓化现象在MHLJDD和MHLJDD-F治疗组中显著改善，给药两周后，MHLJDD治疗组和高剂量MHLJDD-F治疗组的EASI评分与模型组相比，p<0.01，其中高剂量MHLJDD-F的治疗效果最好，与阳性药地塞米松效果相当，表明MHLJDD和MHLJDD-F均能够显著改善DNCB诱导的皮肤湿疹样症状。
5、实验样1(MHLJDD)和实验样2(MHLJDD-F)对DNCB诱导小鼠背部皮肤瘙痒症状的 影响
如图6所示，本发明的研究发现，由DNCB诱导的小鼠背部皮肤瘙痒症状在中高剂量MHLJDD-F治疗组中得到明显改善，小鼠抓挠行为显著降低(与模型组相比，p<0.01)，MHLJDD虽然也有一定抑制作用但效果不及高剂量MHLJDD-F，表明MHLJDD-F对DNCB诱导小鼠产生的皮肤瘙痒有明显的止痒作用。
6、实验样1(MHLJDD)和实验样2(MHLJDD-F)对DNCB造模小鼠血清中IgE、组胺、TNF- α和皮肤中神经酰胺含量的影响
如图7a-7d所示，本发明的研究发现，DNCB造模小鼠血清中IgE、组胺、TNF-α的水平在MHLJDD和MHLJDD-F治疗组中显著降低，其中高剂量MHLJDD-F的抑制作用最为显著，表明MHLJDD-F相比于MHLJDD对DNCB诱导的IgE、组胺、TNF-α有更明显的抑制作用，能够更有效地抑制机体的炎症水平和免疫反应。另外，经过两周MHLJDD和MHLJDD-F治疗后，DNCB诱导小鼠皮肤中的神经酰胺含量明显提升，说明MHLJDD和MHLJDD-F具有保护皮肤功能，维持皮肤含水量的作用。
7、实验样1(MHLJDD)和实验样2(MHLJDD-F)对DNCB造模小鼠皮肤生理结构的影响
如图8a-8b以及图9a-9b所示，本发明研究发现，DNCB造模小鼠皮肤生理结构发生明显改变，如表皮层厚度明显增厚，表皮层与真皮层之间波浪明显变平，真皮层中炎性细胞和肥大细胞明显浸润等。但经过MHLJDD和MHLJDD-F治疗后，上述病理性结构改变明显改善，表皮厚度显著降低(与模型组相比，p<0.01)，其中高剂量MHLJDD-F治疗组的抑制作用最为显著，表皮厚度与正常组小鼠的表皮厚度相当，真皮层中炎性细胞浸润较少。另外，经过MHLJDD和MHLJDD-F治疗后DNCB导致的小鼠皮肤中肥大细胞数量显著降低(与模型组相比，p<0.01)，表明MHLJDD和MHLJDD-F均能够有效改善DNCB造成的小鼠皮肤生理结构的改变，减缓表皮层增厚并且抑制皮肤中的炎性反应。
8、实验样1(MHLJDD)和实验样2(MHLJDD-F)对DNCB造模小鼠皮肤中炎症因子TNF- α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-13和IFN-γ基因表达水平的影响
如图10a-10f所示，本发明的研究发现，DNCB造模小鼠皮肤中由Th2细胞分泌的炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6和IL-13的mRNA表达水平显著升高，而Th1细胞调控的细胞因子IFN-γ的mRNA表达水平相应降低。经过MHLJDD和MHLJDD-F治疗后，DNCB造模小鼠皮肤中TNF-α、IL-1β，IL-4、IL-6、IL-13的mRNA表达水平降低，IFN-γ的mRNA表达水平相应增高，其中高剂量MHLJDD-F的调节作用最为显著，表明MHLJDD和MHLJDD-F能够调节Th1细胞和Th2细胞分泌的细胞因子的基因表达水平，从而纠正由DNCB诱导产生的Th1/Th2细胞功能失衡。
9、实验样1(MHLJDD)和实验样2(MHLJDD-F)对DNCB造模小鼠皮肤中FLG和LOR蛋白 表达的影响
如图11所示，本发明的研究发现，皮肤中的两种关键保护蛋白FLG和LOR在DNCB造模小鼠皮肤中的蛋白表达水平明显下降，说明DNCB对小鼠皮肤造成了皮肤表皮屏障功能损伤。而经过两周MHLJDD和MHLJDD-F治疗后，DNCB造模小鼠皮肤中FLG和LOR的蛋白表达水平显著回升(与模型组相比，p<0.01)，其中高剂量MHLJDD-F治疗组的效果最为显著，表明MHLJDD和MHLJDD-F能够提高DNCB造模小鼠皮肤中FLG和LOR的蛋白表达水平从而达到修复皮肤屏障的效果。
四、讨论
特应性皮炎不仅会导致皮肤瘙痒，水肿，红斑，脱皮和苔藓化等明显的损伤，对人体免疫功能的影响亦不可忽视，如果不能得到及时的治疗，还会发展成全身性免疫疾病，对人体的健康造成威胁，并严重影响其生活质量。由于目前使用激素类及类固醇类药物会产生较为严重的副作用，中药及天然产物已经越来越受到皮肤科临床研究人员的青睐。根据传统中医理论，特应性皮炎产生的原因与机体禀赋不耐，湿热内蕴，外感风邪，风湿热邪相搏，浸淫肌肤而发病。目前对中医药治疗特应性皮炎的药理研究主要集中在抗炎、抗过敏和调节免疫的活性方面，而对其修复皮肤屏障功能的研究却很少。
本发明在预实验中比较了实验样1(MHLJDD)和对比样1(HLJDD)在DNCB诱导小鼠特应皮炎模型中的抗特应性皮炎作用，结果显示MHLJDD对DNCB诱导产生的小鼠特应性皮炎样皮肤损伤和瘙痒具有明显的治疗作用，其作用效果优于HLJDD。进而采用生物层析法对MHLJDD进行提取优化(即将MHLJDD经过乙酸乙酯萃取后进行成分优化，去除很多酯溶性强的成分)，得到MHLJDD-F。本发明的研究目的在于寻找具有治疗效果更好且副作用更小的抗特应性皮炎药物，因此本发明将MHLJDD和MHLJDD-F运用于动物实验来探究两者对特应性皮炎的治疗作用。
本发明中采用DNCB诱导小鼠产生特应性皮炎样皮肤损伤的体内模型，作为模拟人类特应性皮炎的验证模型。在研究中，观察到背部和耳部涂抹了DNCB的小鼠皮肤出现了典型的特应性皮炎样损伤。与模型组的小鼠相比，经过MHLJDD和MHLJDD-F治疗后的小鼠皮肤的红斑、水肿、脱皮和苔藓化症状得到明显改善，并且高剂量MHLJDD-F治疗组的治疗效果优于MHLJDD治疗组，结果提示MHLJDD-F相比于MHLJDD对DNCB造成的小鼠特应性皮炎样皮肤损伤和瘙痒的治疗效果更好。
炎症反应和免疫失调是特应性皮炎发病机制的两个关键因素。目前对治疗特应性皮炎的药理研究主要集中在抗炎、抗过敏和调节免疫的作用机制方面。辅助T细胞主要功能是分泌具有免疫调节和效应功能的细胞因子,在免疫反应发挥重要作用,主要分为Th1、Th2两种功能性亚群。Th1/Th2细胞的主要功能就是调控免疫反应，Th1细胞主要分泌IFN-γ和IL-2等细胞因子，Th2细胞主要分泌IL-6和IL-4等，主要介导体液免疫。Th1/Th2细胞免疫过程主要是通过分泌不同的细胞因子，相互抑制达到动态平衡。在机体正常状态下，Th1/Th2细胞处于动态平衡状态，如果动态平衡被破坏，偏向其中一方，机体便会因为Th1细胞占优势或Th2细胞占优势形成Th1/Th2“漂移”状态从而导致机体发病。现已有研究证实Th1/Th2失衡会导致特应性皮炎。在外源性因素的刺激下，抗原特异性CD4+T细胞主要分化成Th2细胞，释放大量IL4和IL-13等细胞因子刺激B细胞分泌IgE。IgE与肥大细胞的结合释放大量组胺，进一步加剧过敏反应，促使淋巴因子和巨噬细胞因子进入皮损部位，同时释放嗜酸性粒细胞进入外周血液中，从而导致机体发生全身性过敏反应。因此，测量血清中IgE、组胺以及各种炎症因子的水平可以解释和用于评估特应性皮炎的严重程度。本发明的研究表明MHLJDD和MHLJDD-F的抗特应性皮炎作用可能与抗炎抗过敏密切相关，两者均能够降低血清中IgE、组胺和TNF-α水平以及抑制皮肤组织中Th2细胞因子和其相关的炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-13基因表达水平，其中高剂量MHLJDD-F的调节作用最为明显。本发明的研究结果清楚地表明，MHLJDD和MHLJDD-F可以通过抑制炎症反应和调节免疫功能，发挥其抗特应性皮炎的效果。
皮肤表皮屏障受损同样是特应性皮炎发病机制的重要因素。FLG和LOR蛋白的缺失可以导致表皮屏障受损，神经酰胺含量减少，加速皮肤的水分流失，进而产生皮肤干燥、脱皮的症状。在本发明中，MHLJDD和MHLJDD-F均能够提高皮肤中FLG和LOR蛋白在皮肤中的表达水平，提高皮肤中神经酰胺的含量，从而达到恢复表皮屏障功能，维持皮肤含水量，减少皮肤干燥情况的效果，其中高剂量MHLJDD-F对恢复小鼠皮肤中神经酰胺含量的作用最为明显。该结果提示，恢复皮肤表皮屏障功能可能是MHLJDD和MHLJDD-F抗特应性皮炎的分子生物学作用机理。
综上所述，MHLJDD和MHLJDD-F具有良好的抗特应性皮炎活性，其作用可能与抑制炎症，调节免疫和保护皮肤屏障功能有关。本发明经过体内实验证明MHLJDD和MHLJDD-F连续给药两周后能够显著改善小鼠特应性皮炎样皮肤损伤和抓痒行为，通过采用生化试剂盒测定血清中免疫球蛋白E(IgE)、组胺(histamine)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及皮肤中神经酰胺的含量，表明MHLJDD和MHLJDD-F降低了血清中IgE、组胺、TNF-α的含量及提高了皮肤中神经酰胺的含量；通过病理组织学方法观察皮肤表皮厚度的变化和炎性细胞、肥大细胞浸润情况，表明MHLJDD和MHLJDD-F抑制了皮肤表皮层增厚和炎性细胞、肥大细胞的浸润；通过实时聚合酶链式反应检测辅助T细胞和炎症相关因子的基因表达水平，此外，通过免疫印迹法检测皮肤组织中两种关键蛋白丝聚合蛋白(FLG)和兜甲蛋白(LOR)的表达水平，表明MHLJDD和MHLJDD-F能下调过度反应的Th2细胞因子的基因表达，上调被抑制的Th1细胞因子的基因表达，进而提高皮肤中FLG和LOR的蛋白表达水平，修复皮肤表皮屏障功能。通过本发明可以证明MHLJDD和MHLJDD-F对DNCB诱导产生的特应性皮炎样皮肤损伤和瘙痒具有良好的治疗效果，具有开发成抗特应性皮炎的药物或功能食品的良好前景。
本发明的药物组合物可以将有效成分和赋形剂一起被制成各种剂型，例如可以是颗粒剂、胶囊剂、浓缩丸、口服液或片剂，以下将进一步描述本发明的具体实施例。
实施例3-20为将本发明的药物组合物制成片剂的示例，各示例的成分如下表1：
表1
以上实施例3-20的制备过程如下：取MHLJDD-F，加入乳糖、糊精、淀粉三者中的至少一者(参见上表1)混合均匀，用7％的淀粉浆作为粘合剂，湿法制粒，烘干，加入硬脂酸镁或滑石粉混匀，压制成每片含第二提取物预定量(参见上表1)的片剂10000片，每片净重预定量(参见上表1)。口服，每日2次，每次4片，用于抗特应性皮炎。症见：皮肤红斑，水肿，脱皮或苔藓化等症状。
实施例21-32为将本发明的药物组合物制成胶囊剂的示例，各示例的成分如下表2：
表2
以上实施例21-32的制备过程如下：取MHLJDD-F，加入乳糖、淀粉两者中的至少一者(参见上表2)混合均匀，用7％的淀粉浆作为粘合剂，湿法制粒，烘干，加入硬脂酸镁混匀，填充至1号胶囊制成10000粒，每粒胶囊内含第二提取物预定量(参见上表2)，每粒净重预定量(参见上表2)。口服，每日2次，每次4粒，用于抗特应性皮炎。症见：皮肤红斑，水肿，脱皮或苔藓化等症状。
实施例33(口服液)
取本MHLJDD-F 50g，加入增溶剂普罗莎姆0.5mL，和15％乙醇，充分搅匀；然后加入适宜量的附加剂(如山梨酸0.1％作抑菌剂，柠檬酸0.1％作抗氧剂，甘露醇0.1％作矫味剂)，溶解均匀，滤过澄清，将内容物装入安瓿或易拉盖瓶中，灭菌。规格为每瓶含提取物166mg的口服液，每瓶净含量10mL。口服，每日2次，每次2瓶，用于抗特应性皮炎。症见：皮肤红斑，水肿，脱皮或苔藓化等症状。
实施例35(口服液)
取本MHLJDD-F 100g，加入15％乙醇，充分搅匀；然后加入适宜量的附加剂(如山梨酸0.1％作抑菌剂，柠檬酸0.1％作抗氧剂，甘露醇0.1％作矫味剂)，溶解均匀，滤过澄清，将内容物装入安瓿或易拉盖瓶中，灭菌。规格为每瓶含提取物300mg的口服液，每瓶净含量10mL。口服，每日2次，每次2瓶，用于抗特应性皮炎。症见：皮肤红斑，水肿，脱皮或苔藓化等症状。
实施例36(口服液)
取本MHLJDD-F 200g，加入15％乙醇，充分搅匀；然后加入适宜附加剂(如山梨酸0.1％作抑菌剂，柠檬酸0.1％作抗氧剂，甘露醇0.1％作矫味剂)，溶解均匀，滤过澄清，将内容物装入安瓿或易拉盖瓶中，灭菌。规格为每瓶含提取物600mg的口服液，每瓶净含量10mL。口服，每日2次，每次2瓶，用于抗特应性皮炎。症见：皮肤红斑，水肿，脱皮或苔藓化等症状。
实施例37(口服液)
取本MHLJDD-F 300g，加入15％乙醇，充分搅匀；然后加入适宜量的附加剂(如山梨酸0.1％作抑菌剂，柠檬酸0.1％作抗氧剂，甘露醇0.1％作矫味剂)，溶解均匀，滤过澄清，将内容物装入安瓿或易拉盖瓶中，灭菌。规格为每瓶含提取物900mg的口服液，每瓶净含量10mL。口服，每日2次，每次2瓶，用于抗特应性皮炎。症见：皮肤红斑，水肿，脱皮或苔藓化等症状。
实施例38(口服液)
取本MHLJDD-F 400g，加入12％乙醇，充分搅匀；然后加入适宜量的附加剂(如山梨酸0.1％作抑菌剂，柠檬酸0.1％作抗氧剂，甘露醇0.1％作矫味剂)，溶解均匀，滤过澄清，将内容物装入安瓿或易拉盖瓶中，灭菌。规格为每瓶含提取物1333mg的口服液，每瓶净含量10mL。口服，每日2次，每次1瓶，用于抗特应性皮炎。症见：皮肤红斑，水肿，脱皮或苔藓化等症状。
实施例39(口服液)
取本MHLJDD-F 500g，加入10％乙醇，充分搅匀；然后加入适宜量的附加剂(如山梨酸0.1％作抑菌剂，柠檬酸0.1％作抗氧剂，甘露醇0.1％作矫味剂)，溶解均匀，滤过澄清，将内容物装入安瓿或易拉盖瓶中，灭菌。规格为每瓶含提取物1666mg的口服液，每瓶净含量10mL。口服，每日2次，每次1瓶，用于抗特应性皮炎。症见：皮肤红斑，水肿，脱皮或苔藓化等症状。
除此之外，在其他实施例中，剂型还可以是颗粒剂或浓缩丸。
以上内容是结合具体/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施方式做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种抗特异性皮炎的药物组合物，其特征是，所述药物组合物包括由如下重量配比的各原料制成的有效成分：黄连3～50重量份、黄芩3～30重量份、黄柏3～30重量份和白鲜皮6～50重量份。
2.根据权利要求1所述的抗特异性皮炎的药物组合物，其特征是，所述各原料的重量配比为：黄连9重量份、黄芩6重量份、黄柏6重量份和白鲜皮9重量份。
3.根据权利要求1或2所述的抗特异性皮炎的药物组合物，其特征是，所述药物组合物还包括药学上可接受的赋形剂。
4.根据权利要求3所述的抗特异性皮炎的药物组合物，其特征是，所述有效成分和所述赋形剂一起被制成药学上可接受的剂型。
5.根据权利要求4所述的抗特异性皮炎的药物组合物，其特征是，所述剂型为颗粒剂、胶囊剂、浓缩丸、口服液或片剂。
6.根据权利要求1或2所述的抗特异性皮炎的药物组合物，其特征是，所述药物组合物中的有效成分由如下步骤制成：
(1)按重量配比称取各原料，加乙醇，常温浸泡预定时间后，进行提取，过滤；
(2)回收步骤(1)的滤液，除去乙醇后，得到第一提取物，将所述第一提取物作为所述有效成分；
优选地，还包括步骤(3)将所述第一提取物以乙酸乙酯萃取后，干燥得到粉末状的第二提取物，将所述第二提取物作为所述有效成分。
7.一种抗特异性皮炎的药物组合物的制备方法，其特征是，包括如下步骤：
(1)按权利要求1或2所述的重量配比称取各原料，加乙醇，常温浸泡预定时间后，进行提取，过滤；
(2)回收步骤(1)的滤液，除去乙醇后，得到第一提取物，将所述第一提取物作为所述药物组合物的有效成分；
优选地，还包括步骤(3)将所述第一提取物以乙酸乙酯萃取后，干燥得到粉末状的第二提取物，将所述第二提取物作为所述药物组合物的有效成分。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征是，还包括如下步骤：
(4)将步骤(3)得到的第二提取物与药学上可接受的赋形剂一起，制成药学上可接受的剂型，优选地，所述剂型为颗粒剂、胶囊剂、浓缩丸、口服液或片剂。
9.权利要求1-6中任意一项所述的药物组合物在制备用于治疗或预防受试者的特应性皮炎的药物中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其特征是，所述药物以口服的方式给药。
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