CN117084170A - 一种布渣叶组织培养快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种布渣叶组织培养快速繁殖方法,包括以下步骤:以布渣叶的幼嫩茎段为外植体,消毒后接种至不定芽诱导培养基进行不定芽诱导,得到丛生不定芽;将丛生不定芽分切后接种至继代增殖培养基进行继代增殖培养;取单芽接种至生根培养基进行生根培养,得到组培苗;组培苗炼苗及移栽。布渣叶组培种苗生产技术的成功应用,为其种质资源的保存及优质苗木的获取提供基础,为布渣叶较大规模设施引种栽培奠定了良好的技术基础,必将促进岭南特色中药材布渣叶的高效新型产业化的形成和发展。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域,具体涉及一种布渣叶组织培养快速繁殖方法。
背景技术
布渣叶为椴树科植物破布叶(MicrocospaniculataL.)的干燥叶,微酸,凉。归脾、胃经。具有消食化滞,清热利湿功效,用于饮食积滞,感冒发热,湿热黄疸。盛产于我国南方,主产于广东、海南、云南、广西等地,两广地区资源丰富,且药用历史悠久。布渣叶的产区较多,各地的药材质量参差不齐。
布渣叶是岭南特色药材,它是破布叶的干燥叶片,具有药用和食用价值,为两广凉茶主要原料之一,在民间有“凉茶瑰宝”美誉。布渣叶为南方药材市场上的常销产品,市场需求量大,但质量参差。
植物组培技术是一种高新生物技术,已成功应用于果树、花卉、蔬菜、林木、中药材等种苗产业化,通过组培快繁获得破布叶脱毒种苗是一种创新的、快速的技术手段,而对布渣叶植物组织培养的相关研宄相对较少。
发明内容
本发明采取的技术方案如下:
一种布渣叶组织培养快速繁殖方法,包括以下步骤:
以布渣叶的幼嫩茎段为外植体,消毒后接种至不定芽诱导培养基进行不定芽诱导,得到丛生不定芽;将丛生不定芽分切后接种至继代增殖培养基进行继代增殖培养;取单芽接种至生根培养基进行生根培养,得到组培苗;组培苗炼苗及移栽。
优选地,所述不定芽诱导培养基为1/4~1MS+6-BA 0.1~2mg/L,质量体积比3%蔗糖,质量体积比0.4%琼脂,pH 6.0,所述不定芽诱导的培养条件为光照强度2000-3000lx,光照时间12h/d,培养温度25±1℃。
优选地,所述不定芽诱导培养基为1/4MS+6-BA 0.5mg/L,质量体积比3%蔗糖,质量体积比0.4%琼脂,pH 6.0。
优选地,所述继代增殖培养基为1/4MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0~0.5mg/L+GA30.1mg/L,质量体积比3%蔗糖,质量体积比0.4%琼脂,pH 6.0,所述继代增殖培养的培养条件为光照强度2000-3000lx,光照时间12h/d,培养温度25±1℃。
优选地,所述继代增殖培养基为1/4MS+6-BA 0.5mg/L+NAA0.1 mg/L+GA30.1 mg/L,质量体积比3%蔗糖,质量体积比0.4%琼脂,pH 6.0。
优选地,所述生根培养基为1/4MS+IBA 0.5~2.0mg/L+NAA 0~0.5mg/L,质量体积比3%蔗糖,质量体积比0.6%卡拉胶,pH 6.0,所述生根培养的培养条件为光照强度2000-3000lx,光照时间12h/d,培养温度25±1℃。
优选地,所述生根培养基为1/4MS+IBA 1.0mg/L+NAA0~0.5mg/L,质量体积比3%蔗糖,质量体积比0.6%卡拉胶,pH 6.0。
优选地,所述生根培养基为1/4MS+IBA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L,质量体积比3%蔗糖,质量体积比0.6%卡拉胶,pH 6.0。
优选地,所述消毒的具体步骤为:用75%的酒精擦拭30秒后,用无菌水浸泡,在质量比10%次氯酸钠溶液中浸泡5-7分钟,用无菌水冲洗3遍。
优选地,所述炼苗为将布渣叶出根瓶苗放至温室苗圃内,温度26℃,光照3000lx,光照时间12h/d,炼苗7-10天;所述移栽为移栽至混合基质泥炭:珍珠岩:蛭石=2:1:1中。
本发明的优点:
采用植物组织培养技术可以实现布渣叶种苗的规模化生产,其组培技术指标为:外植体处理成功率达94%,繁殖系数达3.3,生根率达93.1%,移栽成活率达98%。布渣叶组培种苗生产技术的成功应用,为其种质资源的保存及优质苗木的获取提供基础,为布渣叶较大规模设施引种栽培奠定了良好的技术基础,必将促进岭南特色中药材布渣叶的高效新型产业化的形成和发展。
附图说明
图1是外植体接种。
图2是不定芽诱导。
图3是继代增殖。
图4是出根诱导。
图5是组培小苗移栽。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明,而不是本发明的限制。
实施例
1.材料与方法
1.1试验材料
本试验以布渣叶半年生植株为试验材料,布渣叶种子于2021年12月广东天生药业有限公司快递而至,2022年1月在中国科学院华南植物园种质资源圃于沙土内播种,设置遮光度95%黑网遮盖,30天后发芽,3个月后成15cm带2-3对对叶幼苗。之后开始对其进行防虫、防菌、控水预处理,使其体内的含菌量及含水量尽量降低。
1.2试验方法
1.2.1外植体的选择
于上述播种苗中,选择健壮无病虫害的布渣叶幼苗,切取其幼嫩茎段,长度约1.5-2cm,切除叶片后用自来水冲洗一个小时,在超净工作台上用纸擦干表面水分备用。
1.2.2外植体消毒
用75%的酒精擦拭30秒后,用无菌水浸泡1min。然后浸泡在质量体积比10%次氯酸钠溶液中消毒3-7分钟,无菌水冲洗3遍后用无菌滤纸吸干水分,在超净工作台中接种于预设的培养基(图1)。
1.2.3培养基
在不同种类以及不同比例的基本培养基的基础上,根据不同培养阶段添加不同种类及浓度的生长调节剂,设定不同培养基配方,观察各预设培养基的培养效果,筛选最适培养基配方。一般情况下,培养基均添加质量比3%的蔗糖,0.4%琼脂,酸碱度为pH 6.0。
1.2.4培养条件
光照强度2000-3000lx,光照时间12h/d,培养温度25±1℃。
2结果与分析
2.1不同灭菌处理时间对外植体灭菌效果的影响
外植体灭菌后接种到MS空白培养基中,10天后陆续发现污染的外植体,20天后统计结果如下(见表1)。
表1不同灭菌时间对外植体灭菌效果的影响
从表1可以看出,次氯酸钠溶液的灭菌处理时间长短对布渣叶外植体的灭菌效果影响很大,随着灭菌时间的延长,外植体的污染数逐步减少,但同时其死亡芽数也随之增加。因此,合理设定灭菌时间对外植体处理极为重要,试验结果表明,当灭菌时间为6min时外植体成活率最高为94%。
2.2不同浓度的6-BA对不定芽诱导的影响
将经过消毒步骤后存活的无污染的外植体,接种于预设培养基(如表2,基本培养基为1/4MS)中,经20天培养后,开始产生不定芽。观察外植体的生长状况,统计不定芽的诱导数量,计算不定芽诱导率(不定芽诱导率=分化出芽的外植体数/未污染的外植体总数×100%)。
表2不同6-BA浓度对不定芽诱导影响情况
表2结果表明,在合适的培养基中可以诱导不定芽的形成,6-BA对布渣叶不定芽诱导的影响较大,培养基中6-BA含量达到3mg/L时,不定芽出现明显的玻璃化,而且繁殖率较低,应该是高浓度的6-BA会抑制不定芽的诱导。从试验的培养基效果来看,A4较为合适,其6-BA含量为0.5mg/L,不定芽诱导率达92.5%。
2.3不同基本培养基对不定芽生长的影响
由于在培养过程中发现,布渣叶的不定芽即使在低浓度6-BA培养基中仍然会出现不同程度的玻璃化、黄叶掉叶现象,所以推测可能是基本培养基需要调整。因此,在同一激素水平(6-BA 0.5mg/L),设置多个不同种类、不同比例的基本培养基(表3)进行对照试验。将经过消毒步骤后存活的无污染的外植体,接种于表3所示培养基中,记录第20-35天不定芽生长情况。
表3不同基本培养基对不定芽生长影响情况
从表3可以看出,不同基本培养基由于营养含量不同,所以对不定芽生长有很大影响。营养含量过低(如1/2N6、1/4N6)会使不定芽无法诱导出来,甚至会导致原材料的死亡;营养含量过高(如WPM、1/2WPM)则会导致原材料营养失衡,虽然诱导出不定芽,但出现黄叶、掉叶,最后甚至死亡。因此,适当的营养含量对不定芽的生长起着重要的作用。本试验中,基本培养基为1/4MS的营养含量最为合适布渣叶的不定芽生长(图2)。
2.4不同植物生长调节剂对不定芽继代增殖的影响
将2.3获得的丛生不定芽进行分切,使得每个不定芽为0.8-1.2cm,每一丛芽保留有3-5个不定芽。以1/4MS为基本培养基,加上0.5mg/L的6-BA,再配以不同浓度的GA3和NAA(如表4所示),进行继代增殖,重复3次,每次转移周期为35天。观察不定芽的诱导情况,统计增殖系数(增殖系数=每个不定芽经过一次诱导所获得的有效不定芽数/原芽数),以及布渣叶不定芽的生长状况。
表4不同植物生长调节剂对不定芽继代增殖影响情况
从表4结果可知,NAA浓度过高也会引起布渣叶不定芽的玻璃化,适当浓度的NAA有壮芽的作用。此外,NAA和GA3适量配合使用,能使继代芽生长青绿壮盛。B6培养基1/4MS+6-BA 0.5mg/L+NAA0.1 mg/L+GA30.1 mg/L,为布渣叶不定芽继代增殖的最佳培养基,其增殖系数达3.3(图3)。
2.5生长调节剂NAA、IBA对出根诱导的影响
以1/4MS为基本培养基,培养基凝固剂将0.4%琼脂改为0.6%卡拉胶,将3cm左右高的合适单芽接种到添加不同浓度的NAA、IBA组合的生根培养基(如表5所示)中。培养7-15天,根点发生,培养15-20天根系发生,长成完整的植株。在培养室中培养35天后,统计布渣叶的生根率(出根率=已出根芽数/原芽数)。
表5生长调节剂NAA、IBA对生根诱导情况
从表5可以看出,在1/4MS为基本培养基的基础上添加不同浓度的IBA,对布渣叶的诱导生根有明显的作用,IBA添加的浓度过高会抑制根点的形成,浓度过低也不能诱导根系的形成。同样地,适量的NAA也能促进布渣叶的根系诱导。诱导出根最适宜的培养基为C6:1/4MS+IBA 1.0mg/L+NAA0.1 mg/L,其出根时间只有12天,平均发根数达2.6条,生根率达93.1%(图4)。
2.6组培苗炼苗及移栽
将布渣叶出根瓶苗放至温室苗圃内,保持合适的温度、光照(26℃、3000lx),进行炼苗7-10天,使其适应瓶外的自然环境。
将完成炼苗的布渣叶生根小苗的根部用清水清洗干净,移栽至混合基质(泥炭:珍珠岩:蛭石=2:1:1)中,浇透定根水。移栽后7天内用遮光率为95%的黑网遮阴,保持75%湿度,温度控制在26-28℃。10天后,可掀开黑网,保持通风及其土壤湿润,待组培小苗长出新叶,即移栽成活。本次移栽试验,布渣叶组培小苗的移栽成活率为98%(图5)。
Claims (10)
1.一种布渣叶组织培养快速繁殖方法,其特征在于,包括以下步骤:以布渣叶的幼嫩茎段为外植体,消毒后接种至不定芽诱导培养基进行不定芽诱导,得到丛生不定芽;将丛生不定芽分切后接种至继代增殖培养基进行继代增殖培养;取单芽接种至生根培养基进行生根培养,得到组培苗;组培苗炼苗及移栽。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述不定芽诱导培养基为1/4~1MS+6-BA0.1~2mg/L,质量体积比3%蔗糖,质量体积比0.4%琼脂,pH 6.0,所述不定芽诱导的培养条件为光照强度2000-3000lx,光照时间12h/d,培养温度25±1℃。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述不定芽诱导培养基为1/4MS+6-BA0.5mg/L,质量体积比3%蔗糖,质量体积比0.4%琼脂,pH 6.0。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述继代增殖培养基为1/4MS+6-BA0.5mg/L+NAA0~0.5mg/L+GA30.1 mg/L,质量体积比3%蔗糖,质量体积比0.4%琼脂,pH 6.0,所述继代增殖培养的培养条件为光照强度2000-3000lx,光照时间12h/d,培养温度25±1℃。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述继代增殖培养基为1/4MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1 mg/L+GA30.1 mg/L,质量体积比3%蔗糖,质量体积比0.4%琼脂,pH 6.0。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述生根培养基为1/4MS+IBA 0.5~2.0mg/L+NAA0~0.5mg/L,质量体积比3%蔗糖,质量体积比0.6%卡拉胶,pH 6.0,所述生根培养的培养条件为光照强度2000-3000lx,光照时间12h/d,培养温度25±1℃。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述生根培养基为1/4MS+IBA 1.0mg/L+NAA0~0.5mg/L,质量体积比3%蔗糖,质量体积比0.6%卡拉胶,pH 6.0。
8.根据权利要求6或7所述的方法,其特征在于,所述生根培养基为1/4MS+IBA 1.0mg/L+NAA0.1 mg/L,质量体积比3%蔗糖,质量体积比0.6%卡拉胶,pH 6.0。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述消毒的具体步骤为:用75%的酒精擦拭30秒后,用无菌水浸泡,在质量比10%次氯酸钠溶液中浸泡5-7分钟,用无菌水冲洗3遍。
10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述炼苗为将布渣叶出根瓶苗放至温室苗圃内,温度26℃,光照3000lx,光照时间12h/d,炼苗7-10天;所述移栽为移栽至混合基质泥炭:珍珠岩:蛭石=2:1:1中。
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