CN117025850A - 用于eber原位杂交检测的探针组合物，试剂盒及其应用 - Google Patents
用于eber原位杂交检测的探针组合物，试剂盒及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117025850A CN117025850A CN202311089127.0A CN202311089127A CN117025850A CN 117025850 A CN117025850 A CN 117025850A CN 202311089127 A CN202311089127 A CN 202311089127A CN 117025850 A CN117025850 A CN 117025850A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- eber
- solution
- situ hybridization
- hybridization
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 122
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 108091034120 Epstein–Barr virus-encoded small RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 73
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims abstract description 9
- AYKYXWQEBUNJCN-UHFFFAOYSA-N 3-methylfuran-2,5-dione Chemical compound CC1=CC(=O)OC1=O AYKYXWQEBUNJCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 70
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 48
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims description 35
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 18
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 17
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 16
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 15
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims description 13
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 claims description 11
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000008399 tap water Substances 0.000 claims description 10
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 9
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 9
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 8
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 8
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 claims description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 7
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 6
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 claims description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 4
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 claims description 4
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000000887 hydrating effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000036571 hydration Effects 0.000 claims description 4
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 239000012224 working solution Substances 0.000 claims description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 claims description 2
- 238000012296 in situ hybridization assay Methods 0.000 claims description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 claims description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 10
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 208000002454 Nasopharyngeal Carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 description 4
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 4
- 201000011216 nasopharynx carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 3
- LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N Digoxin Natural products O([C@H]1[C@H](C)O[C@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@](C)([C@H](O)C4)[C@H](C4=CC(=O)OC4)CC5)CC3)CC2)C[C@@H]1O)[C@H]1O[C@H](C)[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N digoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)[C@H](O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N 0.000 description 3
- LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N digoxine Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C)OC(OC2C(OC(OC3CC4C(C5C(C6(CCC(C6(C)C(O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)CC2O)C)CC1O LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 206010015108 Epstein-Barr virus infection Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000016937 Extranodal nasal NK/T cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 241000700586 Herpesviridae Species 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 201000006747 infectious mononucleosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000005554 pickling Methods 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6841—In situ hybridisation
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了用于EBER原位杂交检测的探针组合物、试剂盒及其应用，所述探针组合物包括核苷酸序列如SEQ ID No.1的第一探针和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的第二探针，所述第一探针和第二探针的3’端采用标记物标记，可与样本的EBER1/EBER2同时进行杂交，大大提高了检测的敏感性和灵敏度。与此同时，在检测过程中用含有柠康酐和二硫苏糖醇的Tris‑EDTA缓冲液对组织样本进行高温水浴处理，避免处理过程中对组织结构的破坏，同时使得EBER原位杂交检测可以和免疫组化实验同时进行操作，提高了病理科室的效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术，特别涉及用于EBER原位杂交检测的探针组合物，试剂盒及其应用。
背景技术
EB病毒（EBV）是一个172Kbp的双螺旋DNA病毒，属于γ-1型疱疹病毒科嗜淋巴细胞病毒属的成员。EB病毒感染与多种肿瘤和非肿瘤性疾病有关，常见的如鼻咽癌、鼻型NK/T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、传染性单核细胞增多症以及慢性活动性EBV感染等。
EBER1和EBER2是EBV转录的2个非编码的小RNA，其长度分别是166和172个核苷酸。其大量存在于EBV潜伏感染的细胞核中（约107个拷贝/细胞），但并不编码蛋白质。据文献报道细胞核内EBER至少能于La(Lupus antigen)蛋白以及EAP(EBV associated protein)蛋白等两种细胞内蛋白质相结合，类似于核糖核蛋白，且存在稳定的二级结构。因此，这种小分子RNA并不像细胞内其他的RNA分子那样容易降解。有研究发现在存档4年的鼻咽癌组织石蜡切片标本中的EBER-1分子也无降解现象，因此为在RNA水平检测EBER提供了可行性。
目前检测EBV的方法有很多种，如检测EBV表达产物，通过投射电镜观察EB病毒颗粒等，不同的方法其灵敏度也存在差异。核酸原位杂交是一种比较传统的检测方法，但EBV-DNA片段做探针进行原位杂交的话其检测灵敏度并不高，而且由于EBV DNA探针较长（3.1kb）需要更长时间或更高浓度的蛋白酶消化，探针才能进入细胞，所以细胞形态保持不是很好。
目前市面上常用的EBV检测是通过对EBER进行原位杂交进行检测，其检测步骤主要包括组织切片脱蜡水化、蛋白酶K或胃酶消化、探针孵育、一抗孵育、酶标二抗孵育以及显色等过程。由于目前针对EBER进行的原位杂交检测基本都是针对EBER的mRNA进行的，探针的特异性和灵敏度决定了检测的下限以及原位杂交的时间。同时在EBV的原位杂交检测过程中基本都需要用蛋白酶K或胃酶对样本进行消化，由于酶消化容易使组织细胞的结构和形态遭到破坏，使显微镜下看到的样本组织结构不完整，不利于结果的判读。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供用于EBER原位杂交检测的探针组合物，试剂盒及应用，提高检测的敏感性和灵敏度。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明的第一方面提供了用于EBER原位杂交检测的探针组合物，包括核苷酸序列如SEQ ID No.1的第一探针和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的第二探针；核苷酸序列长度在30nt，具体核苷酸序列分别如下所示：
第一探针（5’-3’）：CTCCTCCCTAGCAAAACCCTCAGGACGGCG（SEQ ID No.1）；
第二探针（5’-3’）：AATAGCGGACAAGCCGAATACCCTTCTCCC（SEQ ID No.2）；
第一探针和第二探针是针对EBER1和EBER2的2条DNA原位杂交探针。所述第一探针和第二探针分别在3’端采用标记物标记。在一些具体实施方案中，用来标记的标记物可以是地高辛、生物素、酶或者纳米材料等。
本发明的第二方面提供了用于EBER原位杂交检测的试剂盒，包括杂交液和原位杂交试剂，所述杂交液包括1：1等量混合的第一方面所述的第一探针和第二探针以及杂交缓冲液。
进一步地，所述杂交液中第一探针和第二探针的浓度为25ng/ml-200ng/ml。
进一步地，所述杂交缓冲液的各组分为：体积分数20%的20×SSC溶液，体积分数50%的去离子甲酰胺，体积分数2%的50×Denhard溶液。
进一步地，所述原位杂交试剂包括小鼠抗地高辛抗体、阻断剂、聚合物、DAB显色液。
本发明的第三方面提供了一种第一方面所述的用于EBER原位杂交检测的探针组合物在制备用于原位杂交检测产品中的应用。
本发明的第四方面提供了一种石蜡组织切片的EBER原位杂交检测方法，包括如下步骤：
S1、切片处理：石蜡切片在烘箱中烤片；在一些具体实施方案中，石蜡切片在62℃烘箱中烤片1小时；
S2、脱蜡水化处理：S1处理后的切片放入脱蜡液中处理后用无水乙醇，95%乙醇和75%乙醇梯度酒精进行水化，每个浓度酒精处理2-3次，并用清水清洗干净，后用双氧水室温封闭，清水清洗干净；在一些具体实施方案中，切片放入脱蜡液中，15min×2次；采用无水乙醇、95%乙醇和75%乙醇梯度酒精水化，每个浓度酒精2min×2次，后用自来水浸洗3min×3次；用3%的双氧水室温封闭5min，后用自来水浸洗3min×3次；
S3、石蜡切片水浴处理：将S2处理后的石蜡切片放入装有pH=8.5，含有柠康酐和二硫苏糖醇的Tris-EDTA缓冲液中并煮沸，维持沸腾状态12-18min后关火自然冷却至室温；
S4、探针杂交：S3处理后的石蜡切片平铺在湿盒上，加入包含1:1等量混合的第一方面所述的第一探针和第二探针的杂交液后置于恒温箱中孵育，结束后用PBST浸洗；在一些具体实施方案中，将石蜡切片平铺于湿盒上，滴加杂交液100µL，将湿盒放于50℃恒温箱中孵育90min；
S5、抗体孵育：依次添加小鼠抗地高辛抗体、阻断剂、聚合物孵育；每一步孵育完成后用PBST浸洗；在一些具体实施方案中，在每张石蜡切片上滴加100µL的小鼠抗地高辛抗体，室温孵育30min，后用PBST浸洗3min×3次；在每张石蜡切片上滴加100µL的阻断剂，室温孵育20min，后用PBST浸洗3min×3次；在每张切片上滴加100µL的聚合物，室温孵育30min，后用PBST浸洗3min×3次；
S6、DAB显色：制备DAB工作液，向样本中加入DAB工作液，至完全覆盖样本，室温孵育染色，染色结束后使用纯化水冲洗样本；在一些具体实施方案中，DAB工作液采用DAB色原试剂与DAB缓冲液按照1：20现配现用，每张切片滴加100µL，室温孵育5min，后用自来水终止并冲洗切片；
S7、苏木素复染：使用苏木素进行复染，复染后使用自来水冲洗至无紫色为止，用PBST返蓝；在一些具体实施方案中，苏木素复染7min，后用自来水冲洗至无紫色为止，用PBST返蓝10S；
S8、脱水、透明和封片：用75%，95%和无水乙醇脱水的梯度酒精脱水，每道乙醇的脱水时间30S，脱蜡液透明后用中性树胶滴加在切片上盖上盖玻片。
进一步地，所述S3中，Tris-EDTA缓冲液的各组分为：摩尔浓度为10mM的TrisBase、摩尔浓度为1mM的EDTA、质量分数为0.5%的柠康酐、摩尔浓度为0.1M的二硫苏糖醇以及质量分数为0.35%的ProClinTM300。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明设计了针对EBER1和EBER2的两条DNA探针并采用地高辛在3’端标记，与样本的EBER1和EBER2同时进行杂交，大大提高了检测的敏感性和灵敏度。与此同时，在检测过程中不使用蛋白酶K或胃酶对组织样本进行消化，而是采用含有柠康酐和二硫苏糖醇的Tris-EDTA缓冲液对组织样本进行高温水浴处理，避免了使用蛋白酶K和胃酶处理对组织结构形态的破坏，同时本发明方法中的石蜡切片可以与常规的石蜡切面同时进行切片的前序处理，使得EBER原位杂交检测可以和免疫组化实验同时进行操作，提高了病理科室的效率。
附图说明
图1为本发明实施例2的染色结果图；
图2为本发明实施例3的染色结果图；
图3为本发明实施例4的染色结果图；
图4为本发明实施例5的染色结果图；
图5为对比例1中市售EBER原位杂交试剂盒的染色结果；
图6为本发明实施例6中水浴热处理的杂交结果；
图7为本发明对比例2中蛋白酶K消化法处理的杂交结果；
图8为本发明实施例7的染色结果图；
图9为本发明实施例8的染色结果图；
图10为本发明实施例9的染色结果图；
图11为本发明实施例10的染色结果图；
图12为本发明实施例11的染色结果图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
用于EBER原位杂交检测的试剂盒包括：
杂交液、小鼠抗地高辛抗体、阻断剂、聚合物、DAB显色液。
其中，杂交液中包括1：1等量混合的EBER1探针和EBER2探针以及杂交缓冲液，杂交液中EBER1探针和EBER2探针的浓度为25ng/ml-200ng/ml，杂交缓冲液的各组分为：体积分数20%的20×SSC溶液，体积分数50%的去离子甲酰胺，体积分数2%的50×Denhard溶液。
EBER1探针和EBER2探针的具体核苷酸序列分别如下所示：
EBER1探针（5’-3’）：CTCCTCCCTAGCAAAACCCTCAGGACGGCG（SEQ ID No.1）；
EBER2探针（5’-3’）：AATAGCGGACAAGCCGAATACCCTTCTCCC（SEQ ID No.2）；
其中，EBER1探针和EBER2探针分别在3’端标记地高辛。
实施例2
（1）20×SSC溶液配制：取175.3gNaCl，88.2g枸橼酸钠，先用800ml ddH2O完全溶解并调PH至7.0，后定容至1000ml。
（2）50×Denhard溶液配制：取5g聚蔗糖（Ficoll400型），5g聚乙烯吡咯烷酮，5g牛血清白蛋白（BSA），完全溶于500ml ddH2O中。
（3）杂交缓冲液配制：20×SSC溶液2000µL，去离子甲酰胺5000µL，50×Denhard溶液200µL，用ddH2O补充至10ml。
（4）探针溶液配制：将100µg/瓶的EBER1和EBER2探针冻干粉分别用1ml的杂交缓冲液充分溶解，变成质量分数（w/v）为100µg/ml的EBER1探针溶液和EBER2探针溶液。
（5）杂交液配方：EBER1探针250ng（浓度25ng/ml）；EBER2探针250ng（浓度25ng/ml）溶于10ml的杂交缓冲液中。
（6）杂交液的配制：分别吸取2.5µL的EBER1探针溶液和EBER2探针溶液溶于10ml的杂交缓冲液中。
石蜡切片处理步骤如下：
实验材料：Raji细胞石蜡切片。
S1、切片处理
Raji细胞石蜡切片在62℃烘箱中烤片1小时。
S2、脱蜡和水化
1.将切片放入脱蜡液中，15min×2次；
2.无水乙醇，95%乙醇和75%乙醇梯度酒精水化，每个浓度酒精2min×2次，后用自来水浸洗3min×3次；
3.双氧水封闭：用3%的双氧水室温封闭5min，后用自来水浸洗3min×3次。
S3、水浴处理石蜡切片
1.将石蜡切片放入pH=8.5的缓冲液中并煮沸，维持沸腾状态15min后关火自然冷却至室温；其中，缓冲液由摩尔浓度为10mM的Tris Base、摩尔浓度为1mM的EDTA、质量分数为0.5%的柠康酐、摩尔浓度为0.1M的二硫苏糖醇（DTT）以及质量分数为0.35%的ProClinTM300组成。
S4、探针杂交
1.将石蜡切片平铺于湿盒上，滴加杂交液100µL，后将湿盒放于50℃恒温箱中孵育90min；
2.孵育结束后用PBST浸洗3min×3次。
S5、抗体孵育
1.在每张石蜡切片上滴加100µL的小鼠抗地高辛抗体，室温孵育30min，后用PBST浸洗3min×3次；
2.在每张石蜡切片上滴加100µL的阻断剂，室温孵育20min，后用PBST浸洗3min×3次；
3.在每张切片上滴加100µL的聚合物，室温孵育30min，后用PBST浸洗3min×3次。
S6、DAB显色
1.DAB显色液试剂采用DAB色原试剂与DAB缓冲液按照1：20现配现用，每张切片滴加100µL，室温孵育5min，后用自来水终止并冲洗切片。
S7、苏木素复染
1.苏木素复染7min，后用自来水冲洗至无紫色为止，用PBST返蓝10S。
S8、脱水、透明和封片
1.用梯度酒精脱水；
2.脱蜡液透明后用中性树胶滴加在切片上盖上盖玻片。
其中，上述步骤中用到的小鼠抗地高辛抗体、阻断剂、聚合物、DAB显色液试剂，采用的是购自厦门通灵生物医药科技有限公司的EBER原位杂交试剂盒中相应的试剂组分。
结果如图1所示。
实施例3
所用试剂材料以及实验步骤与实施例2相同，区别在于：
（1）杂交液配方：EBER1探针500ng（浓度50ng/ml）；EBER2探针500ng（浓度50ng/ml）溶于10ml的杂交缓冲液中。
（2）杂交液的配制：分别吸取5µL的EBER1探针溶液和EBER2探针溶液溶于10ml的杂交缓冲液中。
结果如图2所示。
实施例4
所用试剂材料以及实验步骤与实施例2相同，区别在于：
（1）杂交液配方：EBER1探针1000ng（浓度100ng/ml）；EBER2探针1000ng（浓度100ng/ml）溶于10ml的杂交缓冲液中。
（2）杂交液的配制：分别吸取10µL的EBER1探针溶液和EBER2探针溶液溶于10ml的杂交缓冲液中。
结果如图3所示。
实施例5
所用试剂材料以及实验步骤与实施例2相同，区别在于：
（1）杂交液配方：EBER1探针2000ng（浓度200ng/ml）；EBER2探针2000ng（浓度200ng/ml）溶于10ml的杂交缓冲液中。
（2）杂交液的配制：分别吸取20µL的EBER1探针溶液和EBER2探针溶液溶于10ml的杂交缓冲液中。
结果如图4所示。
对比例1
采用购自厦门通灵生物医药科技有限公司的EBER原位杂交试剂盒，按照其说明书进行操作。
结果如图5所示。
对比观察实施例2-实施例5以及对比例1的结果图。
结果显示：本发明在双探针浓度各为25ng/ml-200ng/ml时都得到了中等至强的染色结果，其中100ng/ml和200ng/ml的情况下，染色强度达到最佳。对比例采用市售试剂盒，在说明书推荐的最优操作条件下其染色强度仍弱于用量最低的实施例2（双探针浓度25ng/ml）的染色强度；本发明探针试剂表现出比对比试剂更优的灵敏度。
实施例6
实验材料：鼻咽癌石蜡切片组织。
（1）杂交液配方：EBER1探针1000ng（浓度100ng/ml）；EBER2探针1000ng（浓度100ng/ml）溶于10ml的杂交缓冲液中。
（2）杂交液的配制：分别吸取10µL的EBER1探针溶液和EBER2探针溶液溶于10ml的杂交缓冲液中。
石蜡切片的处理步骤如实施例2相同。
结果如图6所示。
对比例2
与实施例6的区别在于：探针杂交步骤之前，石蜡切片的处理步骤为：采用蛋白酶K在37℃条件下消化鼻咽癌石蜡切片组织10min。
蛋白酶K的浓度为200µg/ml。
蛋白酶K的配方：0.5ml的1M Tris-HCL，3.3ml 0.5M EDTA，1ml 5M NaC，10mg蛋白酶K，加ddH2O定容至50ml。
结果如图7所示。
对比观察实施例6以及对比例2的结果图。
结果显示：用pH=8.5的含有柠康酐和二硫苏糖醇的Tris-EDTA缓冲液处理石蜡切片后进行EBER原位杂交其染色结果阳性细胞强表达，背景干净，组织和细胞形态清晰完整。而用200µg/ml的蛋白酶K消化石蜡组织切片进行EBER原位杂交其染色结果阳性细胞强表达，有较多的背景和非特染，细胞形态不清晰。
实施例7
所用试剂材料以及实验步骤与实施例2相同，区别在于：
（1）杂交液配方：EBER1探针500ng（浓度50ng/ml）溶于10ml的杂交缓冲液中。
（2）杂交液的配制：吸取5µL的EBER1探针溶液溶于10ml的杂交缓冲液中。
结果如图8所示。
实施例8
所用试剂材料以及实验步骤与实施例2相同，区别在于：
（1）杂交液配方：EBER1探针1000ng（浓度100ng/ml）溶于10ml的杂交缓冲液中。
（2）杂交液的配制：吸取10µL的EBER1探针溶液溶于10ml的杂交缓冲液中。
结果如图9所示。
实施例9
所用试剂材料以及实验步骤与实施例2相同，区别在于：
（1）杂交液配方：EBER1探针2000ng（浓度200ng/ml）溶于10ml的杂交缓冲液中。
（2）杂交液的配制：吸取20µL的EBER1探针溶液溶于10ml的杂交缓冲液中。
结果如图10所示。
实施例10
所用试剂材料以及实验步骤与实施例2相同，区别在于：
（1）杂交液配方：EBER1探针4000ng（浓度400ng/ml）溶于10ml的杂交缓冲液中。
（2）杂交液的配制：吸取40µL的EBER1探针溶液溶于10ml的杂交缓冲液中。
结果如图11所示。
对比观察实施例7-实施例10与实施例2-实施例5的结果图。
结果显示：EBER1单探针浓度为50ng/ml-400ng/ml时染色均弱于实施例2中EBER1/EBER2各25ng/ml混合探针的染色强度，由此可见，双探针检测的灵敏度要优于单探针。
实施例11
针对EBER1设计了序列2，用来比较不同序列探针的效果，EBER1-2序列如下：
5’-3’：CAGAGTCTGGGAAGACAACCACAGACACCG（SEQ ID No.3）；
所用试剂材料以及实验步骤与实施例2相同，区别在于：
（1）EBER1-2序列探针溶液配制：将100µg/瓶的EBER1-2探针冻干粉用1ml的杂交缓冲液充分溶解，变成质量分数（w/v）为100µg/ml的探针溶液。
（2）杂交液配方：选用EBER1-2序列的探针2000ng（浓度200ng/ml）和EBER2探针2000ng/ml(浓度200ng/ml)溶于10ml的杂交缓冲液中。
（3）杂交液的配制：分别吸取20µL的EBER1-2序列探针溶液和EBER2探针溶液溶于10ml的杂交缓冲液中。
结果如图12所示。
对比观察实施例11与实施例5的结果图。
结果显示：在混合探针浓度相同的条件下，EBER1-2与EBER2探针混合后其强度明显弱于实施例5的结果，由此可见，本发明针对EBER1和EBER2的两条探针检测效果要优于其他序列探针混合的检测效果，表现出高的检测敏感性和灵敏度。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
Claims (9)
1.用于EBER原位杂交检测的探针组合物，其特征在于：所述探针组合物包括核苷酸序列如SEQ ID No.1的第一探针和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的第二探针，所述第一探针和第二探针的3’端采用标记物标记。
2.用于EBER原位杂交检测的试剂盒，其特征在于：包括杂交液和原位杂交试剂，所述杂交液包括权利要求1所述的探针组合物以及杂交缓冲液，所述探针组合物中第一探针和第二探针按照1：1等量混合。
3.根据权利要求2所述的用于EBER原位杂交检测的试剂盒，其特征在于：所述杂交液中第一探针和第二探针的浓度为25ng/ml-200ng/ml。
4.根据权利要求3所述的用于EBER原位杂交检测的试剂盒，其特征在于：所述杂交缓冲液的各组分为：体积分数20%的20×SSC溶液，体积分数50%的去离子甲酰胺，体积分数2%的50×Denhard溶液。
5.根据权利要求2所述的用于EBER原位杂交检测的试剂盒，其特征在于：所述原位杂交试剂包括小鼠抗地高辛抗体、阻断剂、聚合物以及DAB显色液。
6.权利要求1所述的用于EBER原位杂交检测的探针组合物在制备用于原位杂交检测产品中的应用。
7.一种石蜡组织切片的EBER原位杂交检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、切片处理：石蜡切片在烘箱中烤片；
S2、脱蜡水化处理：S1处理后的切片放入脱蜡液中处理后用无水乙醇，95%乙醇和75%乙醇梯度酒精进行水化，每个浓度酒精处理2-3次，并用清水清洗干净，后用双氧水室温封闭，清水清洗干净；
S3、石蜡切片水浴处理：将S2处理后的石蜡切片放入pH=8.5，含有柠康酐和二硫苏糖醇的Tris-EDTA缓冲液中煮沸，维持沸腾状态12-18min后关火自然冷却至室温；
S4、探针杂交：S3处理后的石蜡切片平铺在湿盒上，加入权利要求4所述的杂交液后置于恒温箱中孵育，孵育结束后用PBST浸洗；
S5、抗体孵育：依次添加小鼠抗地高辛抗体、阻断剂、聚合物孵育；每一步孵育完成后用PBST浸洗；
S6、DAB显色：制备DAB工作液，向样本中加入DAB工作液，至完全覆盖样本，室温孵育染色，染色结束后使用纯化水冲洗样本；
S7、苏木素复染：使用苏木素进行复染，复染后使用自来水冲洗至无紫色为止，用PBST返蓝；
S8、脱水、透明和封片：用75%，95%和无水乙醇脱水的梯度酒精脱水，脱蜡液透明后用中性树胶滴加在切片上盖上盖玻片。
8.根据权利要求7所述的一种石蜡组织切片的EBER原位杂交检测方法，其特征在于：所述S3中，Tris-EDTA缓冲液的各组分为：摩尔浓度为10mM的Tris Base、摩尔浓度为1mM的EDTA、质量分数为0.5%的柠康酐、摩尔浓度为0.1M的二硫苏糖醇以及质量分数为0.35%的ProClinTM300。
9.根据权利要求7所述的一种石蜡组织切片的EBER原位杂交检测方法，其特征在于：所述S4中，探针杂交的温度为50℃，探针杂交的时间为90min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311089127.0A CN117025850A (zh) | 2023-08-28 | 2023-08-28 | 用于eber原位杂交检测的探针组合物，试剂盒及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311089127.0A CN117025850A (zh) | 2023-08-28 | 2023-08-28 | 用于eber原位杂交检测的探针组合物，试剂盒及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117025850A true CN117025850A (zh) | 2023-11-10 |
Family
ID=88639094
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311089127.0A Pending CN117025850A (zh) | 2023-08-28 | 2023-08-28 | 用于eber原位杂交检测的探针组合物，试剂盒及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117025850A (zh) |
-
2023
- 2023-08-28 CN CN202311089127.0A patent/CN117025850A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1231303A (en) | Detection of bacteria by nucleic acid hybridization | |
| JP5132557B2 (ja) | 外来微粒子の細胞透過性を向上させる方法 | |
| EP1584923A2 (en) | Stabilization of biomolecules in samples | |
| Park et al. | Automated molecular pathology: one hour in situ DNA hybridization | |
| EP0238332A2 (en) | Liquid hybridization method and kit for detecting the presence of nucleic acid sequences in samples | |
| JPH0591898A (ja) | 制限増巾検定法 | |
| CN113528513B (zh) | 原位杂交探针复合体、其制备方法及应用 | |
| EP0133288A2 (en) | Bacterial detection by nucleic acid hybridization, labeled probes and test kit therefore | |
| CN105462961A (zh) | 一种提取核酸的方法及试剂盒 | |
| NO841725L (no) | Fremgangsmaate og stoffer til bruk ved analyse og paavisning av genetisk materiale | |
| WO1996004402A1 (en) | Detection of mycobacteria | |
| CN110257483B (zh) | 用于原位杂交的杂交液、其制备方法及检测试剂盒 | |
| JP2022530140A (ja) | ハイブリダイゼーション組成物ならびに組成物を調製および使用するための方法 | |
| Noll | Chromosome map of the thermophilic archaebacterium Thermococcus celer | |
| CN117025850A (zh) | 用于eber原位杂交检测的探针组合物，试剂盒及其应用 | |
| Pizard et al. | Whole‐Mount In Situ Hybridization and Detection of RNA s in Vertebrate Embryos and Isolated Organs | |
| CN111748654A (zh) | 一种检测covid-2019冠状病毒的RNA探针及其制备方法与应用 | |
| Erkenbrack et al. | Whole mount in situ hybridization techniques for analysis of the spatial distribution of mRNAs in sea urchin embryos and early larvae | |
| CN113151588B (zh) | 一种ebv感染组织的检测用eber探针及检测试剂盒 | |
| CN113025690B (zh) | 一种核酸探针组及其应用 | |
| CN116004913A (zh) | 运用crispr技术结合石墨烯场效应晶体管对非洲猪瘟野生毒株与疫苗株的鉴别诊断 | |
| AU2020101142A4 (en) | In-Situ Hybridization Detection Method for P36 Gene of Mycoplasma Hyopneumoniae in Luchuan, Probe and Kit Thereof | |
| CN110592233B (zh) | 一种常见食源性寄生虫检测基因芯片及其应用 | |
| US20040241734A1 (en) | Methods for in situ hybridization without the need for competitior DNA | |
| CN110106245B (zh) | 一种适于翘嘴鲌性腺组织mRNA冰冻切片原位杂交的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |