CN111748654A - 一种检测covid-2019冠状病毒的RNA探针及其制备方法与应用 - Google Patents

一种检测covid-2019冠状病毒的RNA探针及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测covid‑2019冠状病毒的RNA探针及其制备方法与应用，属于核酸杂交技术领域。RNA探针核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，制备过程包括：设计引物、构建重组质粒、PCR扩增和体外转录；本发明将制备得到的探针应用于检测covid‑2019中，能够在单细胞水平检测covid‑2019病毒核酸，提高了检测的灵敏度、准确性和特异性。

Description

一种检测covid-2019冠状病毒的RNA探针及其制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及核酸杂交技术领域，具体涉及一种检测covid-2019冠状病毒的RNA探针及其制备方法与应用。
背景技术
2019新型冠状病毒(covid-2019)，其潜伏期长、侵染力强，主要攻击动物体的肺部，引起肺部感染。
目前鉴定新型冠状病毒有荧光定量PCR法和抗体检测方法，其中核酸检测方法为检验病毒方法的金标准，但是现有方法中仍存在诸多问题，诸如：
(1)荧光定量PCR能够鉴定疑似患者体内的核酸，该方法需要提取细胞中的RNA，随后进行反转录，然后进行PCR鉴定，在这些实验操作中RNA的损失比较多，如果疑似患者处于感染早期或者体内本身含有病毒量比较少，很容易导致RNA在提取过程中丢失，导致假阴性结果出现。
(2)由于新型冠状病毒是RNA病毒，RNA病毒变异速度快，并且该变异能够不断进行累积，荧光定量PCR实验对核酸序列要求比较高，尤其是在PCR引物覆盖的区域要求比较苛刻，如果该区域核酸发生突变，导致PCR扩增效率降低甚至不能扩增出来，从而产生假阴性结果。
(3)荧光定量PCR实验未经过测序鉴定，有可能扩增出非目的片段，出现假阳性现象，造成了检测结果的不准确。
RNA探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链cDNA或cRNA分子，其是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高，可以检测到单个细胞中是否含有目的RNA，因此，可以有效检测出待测目的片段。
因此，如何提供一种可以有效检测covid-2019的探针，并将其应用于检测covid-2019中是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种检测covid-2019冠状病毒的RNA探针及其制备方法与应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测新型冠状病毒covid-2019的RNA探针，RNA探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
本发明还提供了上述的RNA探针的制备方法，步骤如下：
1)引物设计与合成：根据covid-2019待测区域核苷酸序列设计合成上游引物和下游引物；
2)构建重组载体：将covid-2019待测区域的核苷酸序列插入至表达载体中，得到带有covid-2019待测区域核苷酸序列的重组载体；
3)PCR扩增：利用步骤1)合成的上游引物和下游引物PCR扩增重组载体，所得PCR扩增产物纯化后得到covid-2019待测区DNA片段；
4)体外转录：以covid-2019待测区DNA片段为模板进行体外转录，合成反义RNA探针。
其中，步骤1)下游引物的5’端含有T7RNA聚合酶启动子序列；步骤3)反应体系为50μL：pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19 1μL，COVID-19-F1 3μL，COVID-19-R1 3μL，5×enhancebuffer 10μL，2×PCR mix 25μL，ddH2O 8μL；PCR扩增的反应程序为：98℃5min；98℃30s、59℃30s、72℃30s，30个循环；72℃4min；使用胶回收试剂盒进行回收纯化处理；步骤4)反义RNA探针带有地高辛标记，体外转录的体系20μL：10×Buffer 2μL、带有地高辛标记的rNTP混合物(10mM)4μL、T7 RNA聚合酶mix 2μL、DNA模板8μL、Nuclease-Free Water 4μL；转录过程为：将体外转录体系加入到1.5mL EP管中，混匀后，于37℃水浴2h；水浴结束后，加入DNase消化15min，然后以琼脂糖电泳检测；用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的RNA，最终得到带有地高辛标记的反义RNA探针，保存于-80℃环境中。
传统探针合成过程，要对重组质粒进行酶切线性化，再纯化回收后进行大量扩增。本发明对构建的重组质粒pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19直接进行PCR扩增，从而得到大量目的片段，与传统技术相比，省去了细菌培养、质粒提取及鉴定、酶切线性化的过程。
优选的：上游引物为COVID-19-F1，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物为COVID-19-R1，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；covid-2019待测区域的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
优选的：表达载体为pcDNA3.1-myc-HisA载体，重组载体为pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19。
本发明还提供了上述的RNA探针在制备检测新型冠状病毒covid-2019的试剂盒或试剂中的应用。
由于covid-2019含有多种突变，并且变异还在不停的加速积累中，本发明开发了可以特异性与covid-2019杂交的RNA探针，该探针的长度为844nt，即使在目标序列中有1个甚至多个核酸发生突变，也可以与RNA的大部分碱基序列杂交，不会影响整体的杂交效果。
本发明还提供了一种非诊断治疗目的检测新型冠状病毒covid-2019的方法，步骤如下：
(1)杂交预处理：取待测样本进行预处理；
(2)预杂交：将预杂交液加入到处理后的样本中，进行孵育；
(3)杂交：除去预杂交液，将待测样本和杂交液混合，进行孵育；
(4)杂交后处理：除去杂交液，将孵育后的RNA探针回收，漂洗待测样本后和阻断溶液混合，孵育得到杂交样本；
(5)显色、照相：将杂交样本加入到含有终体积分数为1％的羔羊血清的MABT溶液中，清洗后再以MABT溶液清洗，然后以检测缓冲液清洗；加入AP底物染色缓冲液进行室温孵育，包裹避光，当待测样本着色出现后，用PBS溶液清洗，显微镜观察，照相。
优选的：杂交预处理是指将待测样品经蛋白酶K消化后，经PBST溶液漂洗后经多聚甲醛固定，再用PBST溶液漂洗。
具体步骤为：向待测样本滴加200μL蛋白酶K(10ng/μL)，于37℃孵育30min；用DEPC水配制的PBST溶液漂洗3次，每次5min；用DEPC水配制的4％多聚甲醛固定20min；用DEPC水配制的PBST溶液漂洗3次，每次5min；
优选的：步骤2)预杂交液用量200ul由以下成分构成：体积比50％的甲酰胺、5×SSCT、50μg/mL肝素、pH值8.0的5mM EDTA、50μg/mL核糖体RNA、1.84％V/V 1M柠檬酸和0.1％V/V Tween。
具体步骤为：使用24孔培养皿，每1×105个待测细胞样本滴加200μL预杂交液，再置于68℃水浴锅中水浴60min。
优选的：杂交液用量200μL，由预杂交液用量200ul和检测新型冠状病毒covid-2019的RNA探针混合构成，其中RNA探针终浓度为2ng/μL。
优选的:步骤4)具体步骤依次为：吸出杂交液，将孵育后的RNA探针回收，加入200ul 68℃预热的体积比50％的甲酰胺/2×SSCT缓冲液中洗2次，每次30min；68℃预热的2×SSCT缓冲液中洗1次，30min；68℃预热的0.2×SSCT缓冲液中洗2次，每次30min；吸出液体，滴加阻断溶液，室温孵育60min；加入用阻断溶液3000倍稀释的地高辛抗体(Anti-Digoxigenin-AP,Fab fragments)，4℃过夜，得到杂交样本。
优选的：AP底物染色缓冲液包括4.5μL/mL NBT，3.5μL/mL BCIP和4μL/mL左旋咪唑；检测缓冲液为每50mL溶液包含以下成分：100mM NaCl、50mM MgCl2、100mM三羟甲基氨基甲烷Tris-HCl、1mM 0.1％Tween-20和1mM左旋咪唑。
优选的：步骤5)具体步骤依次为：将杂交样本加入到终体积分数为1％热处理羔羊血清(heat treated lamb serum)的MABT溶液中，室温漂洗25min；清洗后再以MABT漂洗3次，每次25min；然后以检测缓冲液漂洗2次，每次5min；加入200uL AP底物染色缓冲液进行室温温育；金属箔片包裹避光；当待测样本着色出现后，用PBS洗2次，每次5min，以停止反应；显微镜观察、照相。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种检测covid-2019冠状病毒的RNA探针及其制备方法与应用，本发明取得的技术优势在于：
1.有效避免由于RNA病毒快速变异导致荧光定量PCR检测产生假阴性结果越来越多的问题，提高了检测结果的准确性；
2.最大程度的节约了制备探针的时间成本。并且通过PCR扩增得到目的基因，稳定、不易出错、产量高、快速且高效。
3.利用原位杂交技术对待测样本检测，无需提取细胞中的RNA，所需样本小无需提取细胞中的RNA，避免了RNA的损失，可以有效避免荧光定量PCR检测中RNA损失而导致假阴性结果的问题。灵敏度高，提高了检测结果的准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明的重组质粒验证电泳图，其中，泳道1为重组质粒pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19(6269bp)，泳道2为酶切后的pcDNA3.1-myc-HisA部分载体(4730bp)和病毒基因片段及部分载体(1539bp)，M为Marker。
图2附图为本发明中重组质粒pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19酶切位点示意图。
图3附图为以pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19为模板，用COVID-19-F1和COVID-19-R1引物扩增的产物的电泳图；其中，泳道1为扩增产物，M为Marker。
图4附图为PCR扩增产物胶回收纯化后电泳图；其中，泳道1为胶回收产物，M为Marker。
图5附图为本发明提供的反义RNA探针的电泳图；其中，泳道1为反义RNA探针，M为Marker。
图6附图为本发明提供的RNA探针检测结果图；其中，左图为细胞转染pcDNA3.1-myc-HisA空载体质粒4小时后原位杂交结果(对照组)；右图为细胞转染pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19质粒4小时后原位杂交结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种检测covid-2019冠状病毒的RNA探针及其制备方法与应用。
实施例中缩写说明和相关试剂配制方法：
HYB：预杂交液，体积比50％甲酰胺；5×SSCT；50ug/mL肝素；5mM EDTA；0.05mg/mL核糖体RNA；920uL1M柠檬酸(citric acid)；0.1％Tween。
MABT：顺丁烯二酸(马来酸)100mM；NaCl 150mM；pH至7.4。
EDTA：乙二胺四乙酸。
PBST溶液：磷酸盐吐温缓冲液，在PBS溶液基础上加上0.1％的Tween-20(V/V)。
NBT：氯化硝基四氮唑蓝。
BCIP：5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐。
Tween：吐温，本领域常用的一种表面活性剂。
阻断溶液：1％羊血清，2％阻断剂(Roche,REF:11096176001)，溶解于MABT中。
50％甲酰胺/2×SSCT缓冲液：50％甲酰胺，0.3M NaCl，0.03M柠檬酸钠和0.1％Tween20。
2×SSCT缓冲液：0.3M NaCl，0.03M柠檬酸钠和0.1％Tween20，溶解于dH2O中，调节pH为7.0。
5×SSCT：0.75M NaCl；0.075M柠檬酸钠，溶解到dH2O，调节pH为7.0。
0.2×SSCT缓冲液：0.03M NaCl，0.003M柠檬酸钠和0.1％Tween20，溶解于ddH2O中，调节pH为7.0。
检测缓冲液，每50mL溶液中含有100mM NaCl、50mM MgCl2、100mM三羟甲基氨基甲烷、0.1％V/V Tween-20和1mM左旋咪唑。
AP底物染色缓冲液，由3.5uL NBT、3.5uL BCIP、4uL左旋咪唑和水定容至1mL。
核糖体RNA：购买于Invitrogen公司，YEAST TRNA(life 15401029)。
实施例所使用的试剂或克隆载体等材料如无特殊说明，均为本领域常用试剂，可通过商业化途径购买获得；未提及的实验方法均为常规实验方法，例如pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19质粒，委托北京擎科生物有限公司合成；在此不再赘述。
实施例1
检测covid-2019的RNA探针的制备方法。
步骤如下：
1)设计引物：根据covid-2019待测区域碱基序列(MN988668.1中部分S蛋白核苷酸序列，易于区分不同冠状病毒，并由基因公司合成)，并利用Premier 5.0软件以及NCBI的BLAST分析设计引物，得到引物COVID-19-F1和COVID-19-R1；
COVID-19-F1：5'-ACATTGCTGACACTACTGATG-3'(SEQ ID NO.2)；
COVID-19-R1；5'-TAATACGACTCACTATAAGGTCTCTAGCAGCAATATCA-3'(SEQ IDNO.3)；其中TAATACGACTCACTATA(SEQ ID NO.5)为T7RNA聚合酶启动子序列。
covid-2019待测区域碱基序列：
Figure BDA0002623638650000071
Figure BDA0002623638650000072
Figure BDA0002623638650000081
Figure BDA0002623638650000082
(SEQ ID NO.4，其中标识加粗碱基为引物序列对应位点)。
2)对质粒pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19(酶切位点示意图参见图2)进行酶切，酶切结果如图1所示，泳道1为未经酶切处理的重组质粒pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19电泳图(质粒全长6269bp)；泳道2为MluI和ApaI双酶切结果图，pcDNA3.1-myc-HisA质粒片段为4730bp，酶切产物片段大小为1539bp，
3)PCR扩增：利用步骤1)所述的上游引物COVID-19-F1和下游引物COVID-19-R1扩增得到covid-2019待测区DNA。具体方法如下：
PCR扩增的反应体系参见表1：
表1 PCR扩增的反应体系
Figure BDA0002623638650000083
PCR扩增的反应程序为：98℃5min；98℃30s、59℃30s、72℃30s，30个循环；72℃4min。
以pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19为模板，以COVID-19-F1和COVID-19-R1按照上述体系和程序对其进行扩增，并将扩增产物进行2％琼脂糖电泳，结果如图3所示，参照DNAmarker切取位置回收纯化扩增产物，参照DNA marker切取位置在凝胶产物上844nt处的条带，即为所需目的产物条带；将切取的目的产物条带，用胶回收试剂盒进行回收，得到纯化的PCR扩增产物，对其进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示，并测量其浓度(30ng/μL)，得到DNA模板；
4)体外转录：利用上述DNA模板进行体外转录，合成带有地高辛标记的反义RNA探针；所述体外转录的体系参见表2：
表2体外转录的体系
Figure BDA0002623638650000091
体外转录过程为：
1)将所述体外转录体系加入到1.5mL EP管中，混匀后，于37℃水浴2h；
2)水浴结束后，加入DNase消化15min，然后以琼脂糖电泳检测，如图5所示，由于图中使用的为DNA marker，DNA为双链，由于RNA为单链结构，在部分U碱基中掺入地高辛标记物，所以电泳结果中RNA大小仅为其大小的一半多一点；
3)用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的RNA，最终得到带有地高辛标记的反义RNA探针，保存于-80℃环境中，所述反义RNA探针核苷酸序列为：AGGUCUCUAGCAGCAAUAUCACCAAGGCAAUCACCAUAUUGUUUGAUGAAGCCAGCAUCUGCAAGUGUCACUUUGUUGAAAAGUAGAUCUUCAAUAAAUGACCUCUUGCUUGGUUUUGAUGGAUCUGGUAAUAUUUGUGAAAAAUUAAAACCACCAAAAUCUUUAAUUGGUGGUGUUUUGUAAAUUUGUUUGACUUGUGCAAAAACUUCUUGGGUGUUUUUGUCUUGUUCAACAGCUAUUCCAGUUAAAGCACGGUUUAAUUGUGUACAAAAACUGCCAUAUUGCAACAAAAGAUUGCUGCAUUCAGUUGAAUCACCACAAAUGUACAUUGUACAAUCUACUGAUGUCUUGGUCAUAGACACUGGUAGAAUUUCUGUGGUAACACUAAUAGUAAAAUUUGUGGGUAUGGCAAUAGAGUUAUUAGAGUAAGCAACUGAAUUUUCUGCACCAAGUGACAUAGUGUAGGCAAUGAUGGAUUGACUAGCUACACUACGUGCCCGCCGAGGAGAAUUAGUCUGAGUCUGAUAACUAGCGCAUAUACCUGCACCAAUGGGUAUGUCACACUCAUAUGAGUUGUUGACAUGUUCAGCCCCUAUUAAACAGCCUGCACGUGUUUGAAAAACAUUAGAACCUGUAGAAUAAACACGCCAAGUAGGAGUAAGUUGAUCUGCAUGAAUAGCAACAGGGACUUCUGUGCAGUUAACAUCCUGAUAAAGAACAGCAACCUGGUUAGAAGUAUUUGUUCCUGGUGUUAUAACACUGACACCACCAAAAGAACAUGGUGUAAUGUCAAGAAUCUCAAGUGUCUGUGGAUCACGGACAGCAUCAGUAGUGUCAGCAAUGU(SEQ IDNO.1)。
实施例2
利用实施例1制备的反义RNA探针检测新型冠状病毒covid-2019的方法。
为了展示本发明所述的反义RNA探针检测新型冠状病毒covid-2019的方法，本实施例首先制备了携带新型冠状病毒covid-2019病毒部分核酸序列的待测样本，然后利用所述的反义RNA探针进行检测，具体方法如下：
一、Hek293细胞的复苏和传代
1.Hek293细胞(商业化购买的人胚胎肾细胞293)的复苏：
(1)从液氮中取出冻存的Hek293细胞，放入37℃恒温水浴锅中解冻1min，并不停摇晃冻存管；
(2)将融化的细胞悬液移入预热好的新鲜DMEM完全培养液中，轻轻吹打2次；
(3)1000rpm离心3min，弃上清；
(4)加入5ml新鲜DMEM完全培养基，并移入新的培养瓶，放入37℃，5％CO2的培养箱中培养；
(5)24小时后更换新的培养液，继续传代。
2.Hek293细胞的传代：
(1)当细胞生长汇合度达到95％～100％时，吸去旧的培养基，加入PBS洗一次；
(2)加入胰蛋白酶，消化30s，并吸去；
(3)加入预热的新鲜DMEM终止消化，反复吹打至其为单细胞悬液；
(4)取培养瓶，加入3ml新鲜DMEM培养基，再加入1ml细胞悬液，于37℃，5％CO2的培养箱中培养。
3、用pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19质粒转染Hek293细胞。
1)取对数生长期的Hek293细胞，用胰蛋白酶消化后，加入无双抗的DMEM培养基稀释细胞，并移入24孔板中，每孔1ml，培养24h后，更换新的培养基；
2)按照Lipofectamine 2000Reagent试剂盒进行转染，取两支1.5ml的离心管，分别加入250μL Opti-MEM培养基，其中一支再加入pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19质粒(2～4μg)；另一支加入6μL Lipofectamine 2000室温孵育5min；
3)将上述两支离心管进行混合，室温孵育20min，得到质粒-脂质体混合物，再加入1ml无双抗的DMEM培养基；
4)将上述混合液滴入24孔板中，混匀，于37℃，5％CO2的培养箱中培养。
二、检测
1.杂交预处理：
(1)将培养好的Hek293细胞中滴加200μL蛋白酶K(10ng/μL)，于37℃孵育30min；
(2)用DEPC水配制的PBST溶液漂洗3次，每次5min；
(3)用DEPC水配制的4％多聚甲醛固定20min；
(4)用DEPC水配制的PBST溶液漂洗3次，每次5min；
2.预杂交：
在1×105个Hek293细胞中滴加200μL预杂交液置于24孔培养皿，放入68℃水浴锅中水浴60min。
3.杂交：
吸掉预杂交液，滴加200μL杂交液置于68℃水浴锅中孵育过夜。
4.杂交后处理：
(1)吸出杂交液，加入200μL 68℃预热的50％甲酰胺/2×SSCT缓冲液中洗2次，每次30min；
(2)68℃预热的2×SSCT缓冲液中洗1次，30min；
(3)68℃预热的0.2×SSCT缓冲液中洗2次，每次30min；
(4)吸出液体，滴加阻断溶液，室温孵育60min。
(5)加入新用阻断溶液3000倍稀释的地高辛抗体(Anti-Digoxigenin-AP,Fabfragments)，4℃过夜。
5.显色、照相：
(1)加入到1％热处理羔羊血清(heat treated lamb serum)的MABT溶液中，室温洗25min；
(2)MABT洗3次，每次25min；
(3)检测缓冲液洗2次，每次5min；
(4)加入200uL AP底物染色缓冲液，室温温育，金属箔片包裹避光；
(5)当目标着色出现后，用PBS洗2次，每次5min，以停止反应；
(6)显微镜观察、照相。
6.结果
如图6，其中左图为转染了pCNDA3.1myc-HisA空载体质粒的对照，没有信号，只有非常弱的背景；右图为细胞转染4小时后原位杂交结果，有颜色的均为阳性信号，颜色深说明RNA拷贝数多，信号浅说明RNA拷贝数少，即使很少的RNA拷贝数也能够检测出来。无色为阴性信号。两张图片均为40×放大，可见，本发明能够在单细胞水平检测covid-2019病毒核酸，提高了检测的灵敏度。
实施例3
一种检测新型冠状病毒covid-2019的试剂盒，包括RNA探针、预杂交液、杂交液和阻断溶液。
其中，RNA探针核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 湖南师范大学
<120> 一种检测covid-2019冠状病毒的RNA探针及其制备方法与应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 844
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggucucuag cagcaauauc accaaggcaa ucaccauauu guuugaugaa gccagcaucu 60
gcaaguguca cuuuguugaa aaguagaucu ucaauaaaug accucuugcu ugguuuugau 120
ggaucuggua auauuuguga aaaauuaaaa ccaccaaaau cuuuaauugg ugguguuuug 180
uaaauuuguu ugacuugugc aaaaacuucu uggguguuuu ugucuuguuc aacagcuauu 240
ccaguuaaag cacgguuuaa uuguguacaa aaacugccau auugcaacaa aagauugcug 300
cauucaguug aaucaccaca aauguacauu guacaaucua cugaugucuu ggucauagac 360
acugguagaa uuucuguggu aacacuaaua guaaaauuug uggguauggc aauagaguua 420
uuagaguaag caacugaauu uucugcacca agugacauag uguaggcaau gauggauuga 480
cuagcuacac uacgugcccg ccgaggagaa uuagucugag ucugauaacu agcgcauaua 540
ccugcaccaa uggguauguc acacucauau gaguuguuga cauguucagc cccuauuaaa 600
cagccugcac guguuugaaa aacauuagaa ccuguagaau aaacacgcca aguaggagua 660
aguugaucug caugaauagc aacagggacu ucugugcagu uaacauccug auaaagaaca 720
gcaaccuggu uagaaguauu uguuccuggu guuauaacac ugacaccacc aaaagaacau 780
gguguaaugu caagaaucuc aagugucugu ggaucacgga cagcaucagu agugucagca 840
augu 844
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acattgctga cactactgat g 21
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taatacgact cactataagg tctctagcag caatatca 38
<210> 4
<211> 844
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acattgctga cactactgat gctgtccgtg atccacagac acttgagatt cttgacatta 60
caccatgttc ttttggtggt gtcagtgtta taacaccagg aacaaatact tctaaccagg 120
ttgctgttct ttatcaggat gttaactgca cagaagtccc tgttgctatt catgcagatc 180
aacttactcc tacttggcgt gtttattcta caggttctaa tgtttttcaa acacgtgcag 240
gctgtttaat aggggctgaa catgtcaaca actcatatga gtgtgacata cccattggtg 300
caggtatatg cgctagttat cagactcaga ctaattctcc tcggcgggca cgtagtgtag 360
ctagtcaatc catcattgcc tacactatgt cacttggtgc agaaaattca gttgcttact 420
ctaataactc tattgccata cccacaaatt ttactattag tgttaccaca gaaattctac 480
cagtgtctat gaccaagaca tcagtagatt gtacaatgta catttgtggt gattcaactg 540
aatgcagcaa tcttttgttg caatatggca gtttttgtac acaattaaac cgtgctttaa 600
ctggaatagc tgttgaacaa gacaaaaaca cccaagaagt ttttgcacaa gtcaaacaaa 660
tttacaaaac accaccaatt aaagattttg gtggttttaa tttttcacaa atattaccag 720
atccatcaaa accaagcaag aggtcattta ttgaagatct acttttcaac aaagtgacac 780
ttgcagatgc tggcttcatc aaacaatatg gtgattgcct tggtgatatt gctgctagag 840
acct 844
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
taatacgact cactata 17

Claims (10)

1.一种检测新型冠状病毒covid-2019的RNA探针，其特征在于，所述RNA探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述的RNA探针的制备方法，其特征在于，步骤如下：
1)引物设计与合成：根据covid-2019待测区域核苷酸序列设计合成上游引物和下游引物；
2)构建重组载体：将所述covid-2019待测区域的核苷酸序列插入至表达载体中，得到带有covid-2019待测区域核苷酸序列的重组载体；
3)PCR扩增：利用步骤1)合成的上游引物和下游引物PCR扩增所述重组载体，所得PCR扩增产物纯化后得到covid-2019待测区DNA片段；
4)体外转录：以所述covid-2019待测区DNA片段为模板进行体外转录，合成反义RNA探针。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述上游引物为COVID-19-F1，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物为COVID-19-R1，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述covid-2019待测区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述表达载体为pcDNA3.1-myc-HisA载体，所述重组载体为pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19。
5.权利要求1所述的RNA探针在制备检测新型冠状病毒covid-2019的试剂盒或试剂中的应用。
6.一种非诊断治疗目的检测新型冠状病毒covid-2019的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)杂交预处理：取待测样本进行预处理；
(2)预杂交：将预杂交液加入到处理后的样本中，进行孵育；
(3)杂交：除去预杂交液，将待测样本和杂交液混合，进行孵育；
(4)杂交后处理：除去杂交液，将孵育后的RNA探针回收，漂洗待测样本后和阻断溶液混合，孵育得到杂交样本；
(5)显色、照相：将杂交样本加入到含有终体积分数为1％的羔羊血清的MABT溶液中，清洗后再以MABT溶液清洗，然后以检测缓冲液清洗；加入AP底物染色缓冲液进行室温孵育，包裹避光，当待测样本着色出现后，用PBS溶液清洗，显微镜观察，照相。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)所述杂交预处理是指将待测样品经蛋白酶K消化后，经PBST溶液漂洗后经多聚甲醛固定，再用PBST溶液漂洗。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)所述预杂交液用量200ul由以下成分构成：体积比50％的甲酰胺、5×SSCT、50μg/mL肝素、pH值8.0的5mM EDTA、50μg/mL核糖体RNA、1.84％V/V 1M柠檬酸和0.1％V/V Tween。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3)所述杂交液用量200μL，由所述预杂交液用量200ul和所述检测新型冠状病毒covid-2019的RNA探针混合构成，其中所述RNA探针终浓度为2ng/μL。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤5)所述AP底物染色缓冲液包括4.5μL/mL NBT，3.5μL/mL BCIP和4μL/mL左旋咪唑；所述检测缓冲液为每50mL溶液包含以下成分：100mM NaCl、50mM MgCl2、100mM三羟甲基氨基甲烷Tris-HCl、1mM 0.1％Tween-20和1mM左旋咪唑。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112266985A (zh) * 2020-11-24 2021-01-26 谢东阳 一种检测冠状病毒的反义rna探针及其制备方法、检测冠状病毒的试剂盒与方法
CN113308568A (zh) * 2020-04-29 2021-08-27 湖南师范大学 一种检测2019-nCOV的RNA探针及其制备方法与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111254227A (zh) * 2020-04-27 2020-06-09 上海吉玛制药技术有限公司 检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的FISH探针组及其制备方法、用途
CN111363860A (zh) * 2020-05-27 2020-07-03 吴江近岸蛋白质科技有限公司 一种检测新型冠状病毒covid-19的核酸组合物及应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111254227A (zh) * 2020-04-27 2020-06-09 上海吉玛制药技术有限公司 检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的FISH探针组及其制备方法、用途
CN111363860A (zh) * 2020-05-27 2020-07-03 吴江近岸蛋白质科技有限公司 一种检测新型冠状病毒covid-19的核酸组合物及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARIANO等: "Detection of SARS-CoV-2 by RNAscope® in situ hybridization and immunohistochemistry techniques", 《ARCHIVES OF VIROLOGY》 *
唐朝晖: "《国家级实验教学示范中心系列实验教材 生命科学综合设计实验指南》", 30 October 2018 *
董武: "《斑马鱼及相关实验技术》", 31 March 2006 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113308568A (zh) * 2020-04-29 2021-08-27 湖南师范大学 一种检测2019-nCOV的RNA探针及其制备方法与应用
CN112266985A (zh) * 2020-11-24 2021-01-26 谢东阳 一种检测冠状病毒的反义rna探针及其制备方法、检测冠状病毒的试剂盒与方法

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