CN117025694A - 一种基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法，涉及生物催化技术领域，包括以3,5‑2(三氟甲基)‑苯乙酮为原料，将其溶解于与水互溶的有机溶剂中，配成底物母液备用；将构建辅酶循环所需的NADP+、葡萄糖和pH 6.8的磷酸缓冲液混合得到辅底物溶液；分别通过注射泵将所述底物母液和所述辅底物溶液按照一定比例通入共固定有羰基还原酶‑葡萄糖脱氢酶的连续流装置中，进行立体选择性还原反应；收集反应产物并进行萃取，得到阿瑞匹坦中间体。本发明所述方法以羰基还原酶‑葡萄糖脱氢酶‑双酶共固定的固定化酶树脂作为催化剂，在连续流微反应装置中，用于阿瑞匹坦关键中间体(R)‑1‑[3,5‑二(三氟甲基)苯基]乙醇的合成。
Description
技术领域
本发明涉及生物催化技术领域，特别是一种基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法。
背景技术
阿瑞匹坦(Aprepitant)，原研药由默沙东研发，于2003年在美国获批上市，并于2013年获批进入中国。作为口服神经激肽-1受体拮抗剂，阿瑞匹坦与其他止吐药物联合给药，适用于预防高度致吐性抗肿瘤化疗的初次和重复治疗过程中出现的急性和迟发性恶心和呕吐。阿瑞吡坦有3个手性中心，制备的过程中(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基]-3-(4-氟苯基)吗啉(中间体2)为最重要的中间体。而该中间体步骤中关键前体为(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇。该醇不仅是阿瑞匹坦的重要手性中间体，同时也是NK1受体拮抗剂和合成抗抑郁药的重要手性中间体。目前已经报道的关于(R)-1-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的合成方法主要有化学法与生物法两类，尽管上述两种方法都取得了比较好的结果，但是这两种方法仍存在很多缺点。利用有机小分子催化的不对称合成法和采用Boc-L-脯氨酸进行手性拆分的化学方法，要用到多种有机试剂，合成路线不够绿色且ee值难以满足原料药的制备要求。传统生物方法则由于所使用的生物催化剂较为脆弱，容易失活，重复利用率低以及后处理难度较大等不利条件仍极大地限制其在工业生产中的应用。
连续流生物催化是解决传统生物催化工业化应用障碍的重要手段。相对于传统间歇式和搅拌式连续反应器，连续流装置(微反应器)更加具有高效性。由于连续流装置具有比表面积大﹑收率高、稳定性高、选择性高、低能耗、提高样品一致性、低反应体积和均匀性、接触时间短、副产物少、快速放大等优点，且连续流装置自动化程度高，大大节省了人力物料成本。因此以连续流装置为核心的连续流生物催化具有广阔的应用前景。
发明内容
鉴于上述现有的阿瑞匹坦中间体制备方法中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明所要解决的问题在于如何提供一种基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法，其包括，以3,5-2(三氟甲基)-苯乙酮为原料，将其溶解于与水互溶的有机溶剂中，配成底物母液备用；将构建辅酶循环所需的NADP+、葡萄糖和pH 6.8的磷酸缓冲液混合得到辅底物溶液；分别通过注射泵将所述底物母液和所述辅底物溶液按照一定比例通入共固定有羰基还原酶-葡萄糖脱氢酶的连续流装置中，进行立体选择性还原反应；收集反应产物并进行萃取，得到阿瑞匹坦中间体。
作为本发明所述基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法的一种优选方案，其中：所述有机溶剂为乙腈、甲基叔丁基醚、正己烷、异辛烷、二甲基亚砜中的任意一种。
作为本发明所述基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法的一种优选方案，其中：所述辅底物溶液中辅因子NADP+的浓度为0.2-0.4mmol/L，葡萄糖浓度为25-50mmol/L，磷酸盐缓冲液的pH值范围为6.8-7.1。
作为本发明所述基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法的一种优选方案，其中：所述羰基还原酶为Leifsonia Alcohol Dehydrogenase，所述葡萄糖脱氢酶来源于芽孢杆菌。
作为本发明所述基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法的一种优选方案，其中：所述连续流装置包括底物溶液罐、辅底物溶液罐、第一流量泵、第二流量泵、Y型混合器和酶填充柱；所述底物溶液罐与流量泵通过聚四氟乙烯管道并联连接在Y型混合器的一端，Y型混合器的另一端连接至酶填充柱；所述第一流量泵安装在底物溶液罐与Y型混合器之间的聚四氟乙烯管道上；所述第二流量泵安装在辅底物溶液罐与Y型混合器之间的聚四氟乙烯管道上；所述氧化酶固定在酶填充柱内。
作为本发明所述基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法的一种优选方案，其中：所述酶填充柱内采用环氧树脂对氧化酶进行固定的步骤包括，将环氧树脂加入到亚氨基二乙酸水溶液中搅拌2～4h，之后用去离子水洗去未反应的亚氨基二乙酸，得到第一混合溶液；将第一混合溶液加入到H2SO4水溶液中搅拌2～4h，之后用去离子水洗去残留的H2SO4，得到第二混合溶液；将第二混合溶液加入到高碘酸钠水溶液中搅拌2～4h，之后用去离子水洗涤过滤，得到第三混合溶液；将第三混合溶液加入到一定浓度的硫酸镍水溶液中孵育2～4h，之后用去离子水洗涤过滤，得到第四混合溶液；将第四混合溶液加入到甘氨酸水溶液中轻晃2～4h，之后用去离子水进行多次洗涤，得到双官能团修饰后的环氧树脂；将羰基还原酶LsADH加入到pH 7.0～7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液中，加入所述环氧树脂，孵育18～20h后，用pH 7.0～7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液洗涤过滤；先加入葡萄糖脱氢酶，之后再加入碳酸钠缓冲液和硼氢化钠轻晃30～60min，用pH 7.0～7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液洗涤过滤，得到双酶共固定的固定化酶树脂，装填至酶填充柱内。
作为本发明所述基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法的一种优选方案，其中：所述羰基还原酶与所述环氧树脂的用量比为20-25mg：1g；所述葡萄糖脱氢酶与所述环氧树脂二者的用量比为8-15mg：1g。
作为本发明所述基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法的一种优选方案，其中：所述底物母液以2.5-5μL/min的流速通入连续流装置，所述辅底物溶液以50-100μL/min的流速通入连续流装置。
作为本发明所述基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法的一种优选方案，其中：所述连续流装置中氧化反应的温度控制在25～32℃，反应停留时间为20～30分钟。
作为本发明所述基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法的一种优选方案，其中：所述反应产物经乙酸乙酯萃取后，得到阿瑞匹坦中间体。
本发明有益效果为：以羰基还原酶-葡萄糖脱氢酶-双酶共固定的固定化酶树脂作为催化剂，在连续流微反应装置中，用于阿瑞匹坦关键中间体(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的合成。本发明所采用的连续流生物催化方法有着较高的转化率，且本方法反应步骤简单，反应条件温和，工艺绿色，具备规模化生产的能力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法的反应式。
图2为基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法的Leifsonia AlcoholDehydrogenase(LSADH)的蛋白质序列。
图3为基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法的环氧树脂双官能团化修饰原理示意图。
图4为基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法的连续流装置示意图。
图5为基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法的阿瑞匹坦逆合成分析图。
图6为基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法的(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的H1-NMR谱图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
参照图1，为本发明第一个实施例，该实施例提供了一种基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法，基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法包括如下步骤：
S1、以3,5-2(三氟甲基)-苯乙酮为原料，将其溶解于与水互溶的有机溶剂中，配成底物母液备用，其中有机溶剂为乙腈、甲基叔丁基醚、正己烷、异辛烷、二甲基亚砜中的任意一种；
S2、将构建辅酶循环所需的NADP+、葡萄糖和pH 6.8的磷酸缓冲液混合得到辅底物溶液，所述辅底物溶液中辅因子NADP+的浓度为0.2-0.4mmol/L，葡萄糖浓度为25-50mmol/L，磷酸盐缓冲液的pH值范围为6.8-7.1；
S3、分别通过注射泵将所述底物母液和所述辅底物溶液按照一定比例通入共固定有羰基还原酶-葡萄糖脱氢酶的连续流装置中，进行立体选择性还原反应，优选的，所述羰基还原酶为Leifsonia Alcohol Dehydrogenase，所述葡萄糖脱氢酶来源于芽孢杆菌，所述底物母液以2.5-5μL/min的流速通入连续流装置，所述辅底物溶液以50-100μL/min的流速通入连续流装置，并且所述连续流装置中氧化反应的温度控制在25～32℃，反应停留时间为20～30分钟；
S4、收集反应产物并进行萃取，得到阿瑞匹坦中间体，具体的，所述反应产物经乙酸乙酯萃取后，得到阿瑞匹坦中间体。
较佳的，所述连续流装置包括底物溶液罐、辅底物溶液罐、第一流量泵、第二流量泵、Y型混合器和酶填充柱；所述底物溶液罐与流量泵通过聚四氟乙烯管道并联连接在Y型混合器的一端，Y型混合器的另一端连接至酶填充柱；所述第一流量泵安装在底物溶液罐与Y型混合器之间的聚四氟乙烯管道上；所述第二流量泵安装在辅底物溶液罐与Y型混合器之间的聚四氟乙烯管道上；所述氧化酶固定在酶填充柱内。
所述酶填充柱内采用环氧树脂对氧化酶进行固定的步骤包括，
将环氧树脂加入到亚氨基二乙酸水溶液中搅拌2～4h，之后用去离子水洗去未反应的亚氨基二乙酸，得到第一混合溶液；
将第一混合溶液加入到H2SO4水溶液中搅拌2～4h，之后用去离子水洗去残留的H2SO4，得到第二混合溶液；
将第二混合溶液加入到高碘酸钠水溶液中搅拌2～4h，之后用去离子水洗涤过滤，得到第三混合溶液；
将第三混合溶液加入到一定浓度的硫酸镍水溶液中孵育2～4h，之后用去离子水洗涤过滤，得到第四混合溶液；
将第四混合溶液加入到甘氨酸水溶液中轻晃2～4h，之后用去离子水进行多次洗涤，得到双官能团修饰后的环氧树脂；
将羰基还原酶LsADH加入到pH 7.0～7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液中，加入所述环氧树脂，孵育18～20h后，用pH 7.0～7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液洗涤过滤；
先加入葡萄糖脱氢酶，之后再加入碳酸钠缓冲液和硼氢化钠轻晃30～60min，用pH7.0～7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液洗涤过滤，得到双酶共固定的固定化酶树脂，装填至酶填充柱内。
在一优选实施例中，所述羰基还原酶与所述环氧树脂的用量比为20-25mg：1g；所述葡萄糖脱氢酶与所述环氧树脂二者的用量比为8-15mg：1g。
本发明以羰基还原酶-葡萄糖脱氢酶-双酶共固定的固定化酶树脂作为催化剂，在连续流微反应装置中，用于阿瑞匹坦关键中间体(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的合成。本发明所采用的连续流生物催化方法有着较高的转化率，底物浓度可达到50mM，转化率可达到96％，且本方法反应步骤简单，反应条件温和，工艺绿色，具备规模化生产的能力。将醇脱氢酶与葡萄糖脱氢酶共固定后，连续运行时间最高可达1000分钟，提高了酶的重复使用效率，展现了极佳的操作稳定性。而且本方法克服了传统生物催化中分离纯化困难的缺陷，仅需简单萃取即可得到纯度较高的产品，大大减少了分离纯化的资源耗费。另外通过双酶固定构建的辅因子循环极大地减少了昂贵的还原性辅因子添加。
实施例2
参照图1～图6，为本发明第二个实施例，该实施例提供一种基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法。
具体的，本实施例以羰基还原酶作为催化剂，在连续流反应装置中，用于将底物(3,5-2(三氟甲基)-苯乙酮)立体特异性还原为阿瑞匹坦关键中间体(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇，反应式如图1所示。
羰基还原酶为Leifsonia Alcohol Dehydrogenase(LSADH)；所述的葡萄糖脱氢酶(GDH)来源于芽孢杆菌。
LsADH采用环氧树脂进行固定，具体方法包括：
S1：环氧树脂的双官能团化修饰；
如图3所示，取1g环氧树脂，用去离子水洗涤3-4次过滤；然后，将环氧树脂加入到0.4M的亚氨基二乙酸水溶液中搅拌2～4h，然后用去离子水洗去未反应的亚氨基二乙酸；接着加入10～15ml 0.5M H2SO4温和搅拌2～4h，用去离子水洗去残留的H2SO4；再次加入到10～15mL含有5mg/mL的硫酸镍水溶液中孵育2～4h，然后用去离子水洗涤过滤；接着加入10～15ml 0.1M高碘酸钠温和搅拌2～4h，用去离子水洗涤过滤；最后加入10～15ml 0.3M甘氨酸溶液轻晃2～4h，去离子水洗涤多次，得到修饰后的环氧树脂用于漆酶的固定；
S2：羰基还原酶-葡萄糖脱氢酶树脂共固定；
向步骤S1中制备的修饰后的环氧树脂加入20mg羰基还原酶(Leifsonia AlcoholDehydrogenase，LSADH)和2～4ml 50mM pH 7.0～7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液，孵育18～20h，用20mM pH 7.0～7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液洗涤过滤；然后再向其中加入8mg葡萄糖脱氢酶，最后加入10～15ml碳酸钠缓冲液和5～15mg硼氢化钠轻晃30～60min，用10mM pH 7.0～7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液洗涤过滤，得到羰基还原酶-葡萄糖脱氢酶双酶共固定的树脂(固定化后酶的树脂只需简单过滤，即可快速有效地将固定化酶从反应体系中分离出来)，4℃冰箱储存备用。
如图4所示，本实施例采用的连续流装置包括底物溶液罐1、辅底物溶液罐2、第一流量泵3、第二流量泵4、Y型混合器5以及酶填充柱6；所述底物溶液罐与泵通过聚四氟乙烯管道并联连接在Y型混合器的一端，Y型混合器的另一端连接至酶填充柱；所述第一流量泵安装在底物溶液罐与Y型混合器之间的聚四氟乙烯管道上；所述第二流量泵安装在辅底物溶液罐与Y型混合器之间的聚四氟乙烯管道上；所述羰基还原酶-葡萄糖脱氢酶双酶共固定的树脂填充在酶填充柱内。
本实施例所涉及到的原料药活性分子阿瑞匹坦，其逆合成分析如图5所示。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法，其特征在于：包括，
以3,5-2(三氟甲基)-苯乙酮为原料，将其溶解于与水互溶的有机溶剂中，配成底物母液备用；
将构建辅酶循环所需的NADP+、葡萄糖和pH 6.8的磷酸缓冲液混合得到辅底物溶液；
分别通过注射泵将所述底物母液和所述辅底物溶液按照一定比例通入共固定有羰基还原酶-葡萄糖脱氢酶的连续流装置中，进行立体选择性还原反应；
收集反应产物并进行萃取，得到阿瑞匹坦中间体。
2.如权利要求1所述的基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法，其特征在于：所述有机溶剂为乙腈、甲基叔丁基醚、正己烷、异辛烷、二甲基亚砜中的任意一种。
3.如权利要求1所述的基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法，其特征在于：所述辅底物溶液中辅因子NADP+的浓度为0.2-0.4mmol/L，葡萄糖浓度为25-50mmol/L，磷酸盐缓冲液的pH值范围为6.8-7.1。
4.如权利要求1所述的基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法，其特征在于：所述羰基还原酶为Leifsonia Alcohol Dehydrogenase，所述葡萄糖脱氢酶来源于芽孢杆菌。
5.如权利要求1所述的基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法，其特征在于：所述连续流装置包括底物溶液罐、辅底物溶液罐、第一流量泵、第二流量泵、Y型混合器和酶填充柱；所述底物溶液罐与流量泵通过聚四氟乙烯管道并联连接在Y型混合器的一端，Y型混合器的另一端连接至酶填充柱；所述第一流量泵安装在底物溶液罐与Y型混合器之间的聚四氟乙烯管道上；所述第二流量泵安装在辅底物溶液罐与Y型混合器之间的聚四氟乙烯管道上；所述氧化酶固定在酶填充柱内。
6.如权利要求5所述的基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法，其特征在于：所述酶填充柱内采用环氧树脂对氧化酶进行固定的步骤包括，
将环氧树脂加入到亚氨基二乙酸水溶液中搅拌2～4h，之后用去离子水洗去未反应的亚氨基二乙酸，得到第一混合溶液；
将第一混合溶液加入到H2SO4水溶液中搅拌2～4h，之后用去离子水洗去残留的H2SO4，得到第二混合溶液；
将第二混合溶液加入到高碘酸钠水溶液中搅拌2～4h，之后用去离子水洗涤过滤，得到第三混合溶液；
将第三混合溶液加入到一定浓度的硫酸镍水溶液中孵育2～4h，之后用去离子水洗涤过滤，得到第四混合溶液；
将第四混合溶液加入到甘氨酸水溶液中轻晃2～4h，之后用去离子水进行多次洗涤，得到双官能团修饰后的环氧树脂；
将羰基还原酶LsADH加入到pH 7.0～7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液中，加入所述环氧树脂，孵育18～20h后，用pH 7.0～7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液洗涤过滤；
先加入葡萄糖脱氢酶，之后再加入碳酸钠缓冲液和硼氢化钠轻晃30～60min，用pH 7.0～7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液洗涤过滤，得到双酶共固定的固定化酶树脂，装填至酶填充柱内。
7.如权利要求6所述的基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法，其特征在于：所述羰基还原酶与所述环氧树脂的用量比为20-25mg：1g；所述葡萄糖脱氢酶与所述环氧树脂二者的用量比为8-15mg：1g。
8.如权利要求1～7任一所述的基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法，其特征在于：所述底物母液以2.5-5μL/min的流速通入连续流装置，所述辅底物溶液以50-100μL/min的流速通入连续流装置。
9.如权利要求1～7任一所述的基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法，其特征在于：所述连续流装置中氧化反应的温度控制在25～32℃，反应停留时间为20～30分钟。
10.如权利要求1～7任一所述的基于连续流装置的阿瑞匹坦中间体制备方法，其特征在于：所述反应产物经乙酸乙酯萃取后，得到阿瑞匹坦中间体。
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