CN108998440A - 一种还原酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的是一种还原酶的制备方法，解决了现有技术中固定化酶的稳定性依然不高的问题。本发明包括将醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶混合后加入海藻酸钠水溶液中，搅拌混匀后，搅拌下再将混合液滴加入CaCl2水溶液中，滴加结束后，4℃冰箱内静置，蒸馏水洗涤，真空抽滤，获得固定化颗粒；所述醛酮还原酶与葡萄糖脱氢酶质量比为1:0.5～3.5，所述海藻酸钠水溶液中海藻酸钠与醛酮还原酶质量比为30～170：1；其特征在于，所述海藻酸钠水溶液中还加入有聚乙二醇。本发明通过在海藻酸钠水溶液中混合聚乙二醇，能有效提高固定化酶的稳定性，效果十分显著。

Description

一种还原酶的制备方法
技术领域
本发明涉及酶制备领域，具体涉及的是一种还原酶的制备方法。
背景技术
酶作为一种生物催化剂，因其专一性强、催化效率高和作用条件温和等特性，广泛应用于医药、食品、化工等方面。但天然酶稳定性差，除了一些耐高温的酶及少数可以耐受较低pH条件的酶以外，大多数酶在高温、强酸、强碱条件下都容易变性失活；反应结束后酶与产物混合，不能重复利用，产物分离纯化困难；同时，酶的一次性使用，大大提高了生产成本，不利于连续化生产，限制了酶在工业上更广泛的应用。基于上述情况，固定化酶的概念得以提出，近年来，酶的固定化技术得到了不断发展，在综合不同固定化技术的基础上，又出现了酶的共固定化技术，目前，酶的共固定化技术在临床诊断、发酵过程控制及生物传感器制备等方面都发挥着重要作用。
酶的固定化，是指采用物理或化学方法，将酶与水不溶性载体相结合的技术。固定化之后酶既保持了其催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有稳定性增强，可反复或连续使用及易于和产物分离的显著优点。酶的共固定化即将不同来源的几种酶或酶与某一完整细胞同时固定在同一个载体上，不仅使不同酶及细胞的各自优势得到充分发挥，而且将不同酶与细胞的生物催化性能结合起来。酶的固定化方法分为四类：吸附法，包埋法，结合法以及交联法。
醛酮还原酶作为一类NAD(P)H依赖的氧化还原酶，具有广泛的底物特异性，可将脂肪族醛酮、芳香族醛酮、类固醇等很多羰基化合物还原成相应的醇类，在手性药物及药物中间体合成领域发挥着重要作用。利用醛酮还原酶催化4-氯-3-羰基乙酸乙酯(Ethyl4-chloro-3-oxobutanoate,COBE)不对称还原合成的(R)-或(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(Ethyl4-chloro-3-hydroxybutanoate,CHBE)，是多种药物活性成分如(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯、L-肉毒碱、大环内酯A和(R)-γ-氨基-β-羟基丁酸(GABOB)等合成的关键中间体，具有重要的应用价值。
目前催化反应使用的酮还原酶多是游离酶或全细胞，虽操作简单，但催化过程中所需辅因子NAD(P)H价格比较昂贵，且酶无法重复利用，生产成本偏高，限制了酶催化方法的大规模工业化应用。
对比文件CN201510351160.5公开了一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的固定化方法,其达到了规模化生产且酶可以重复利用的目的，但是使用过程中固定化酶的稳定性依然不高。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中固定化酶的稳定性依然不高的问题；提供解决上述问题的一种还原酶的制备方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种还原酶的制备方法，包括：
将醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶混合后加入海藻酸钠水溶液中，搅拌混匀后，搅拌下再将混合液滴加入CaCl2水溶液中，滴加结束后，4℃冰箱内静置，蒸馏水洗涤，真空抽滤，获得固定化颗粒；所述醛酮还原酶与葡萄糖脱氢酶质量比为1:0.5～3.5，所述海藻酸钠水溶液中海藻酸钠与醛酮还原酶质量比为30～170：1；
所述海藻酸钠水溶液中还加入有聚乙二醇。
本发明通过在海藻酸钠水溶液中混合聚乙二醇，能有效提高固定化酶的稳定性，效果十分显著。
进一步，所述聚乙二醇的加入量为醛酮还原酶质量的0.5～10％。所述海藻酸钠水溶液中还加入的是聚乙二醇6000。
更进一步，所述海藻酸钠水溶液的质量浓度为1～5％，CaCl2水溶液质量浓度为0.5～4％。
优选地，所述醛酮还原酶与葡萄糖脱氢酶质量比为1:1.2。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
1、本发明通过在海藻酸钠水溶液中混合聚乙二醇，能有效提高固定化酶的稳定性，效果十分显著；
2、本发明优化加入量和加入种类，显著提高了固定化酶的稳定性。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种还原酶的制备方法，包括：
将质量比为1:1.2的醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶混合，然后加入到海藻酸钠水溶液中，搅拌混匀后加入聚乙二醇4000制成混合液，搅拌下再将混合液滴加入浓度为CaCl2水溶液中，滴加结束后，4℃冰箱内静置，蒸馏水洗涤，真空抽滤，获得固定化颗粒；所述海藻酸钠水溶液中海藻酸钠与醛酮还原酶质量比为30:1。
聚乙二醇4000的加入量为醛酮还原酶质量的2％。
海藻酸钠水溶液的质量浓度为3％，CaCl2水溶液质量浓度为2％。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中加入的聚乙二醇的种类不同，具体设置如下：
将质量比为1:1.2的醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶混合，然后加入到海藻酸钠水溶液中，搅拌混匀后加入聚乙二醇6000制成混合液，搅拌下再将混合液滴加入浓度为CaCl2水溶液中，滴加结束后，4℃冰箱内静置，蒸馏水洗涤，真空抽滤，获得固定化颗粒；所述海藻酸钠水溶液中海藻酸钠与醛酮还原酶质量比为30:1。
聚乙二醇6000的加入量为醛酮还原酶质量的2％。
海藻酸钠水溶液的质量浓度为3％，CaCl2水溶液质量浓度为2％。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中部分参数设置不同，具体设置如下：
将质量比为1:2的醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶混合，然后加入到海藻酸钠水溶液中，搅拌混匀后加入聚乙二醇6000制成混合液，搅拌下再将混合液滴加入浓度为CaCl2水溶液中，滴加结束后，4℃冰箱内静置，蒸馏水洗涤，真空抽滤，获得固定化颗粒；所述海藻酸钠水溶液中海藻酸钠与醛酮还原酶质量比为50:1。
聚乙二醇6000的加入量为醛酮还原酶质量的8％。
海藻酸钠水溶液的质量浓度为4％，CaCl2水溶液质量浓度为1％。
上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明保护范围的限制，但凡采用本发明的设计原理，以及在此基础上进行非创造性劳动而作出的变化，均应属于本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种还原酶的制备方法，包括：
将醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶混合后加入海藻酸钠水溶液中，搅拌混匀后，搅拌下再将混合液滴加入CaCl2水溶液中，滴加结束后，4℃冰箱内静置，蒸馏水洗涤，真空抽滤，获得固定化颗粒；所述醛酮还原酶与葡萄糖脱氢酶质量比为1:0.5～3.5，所述海藻酸钠水溶液中海藻酸钠与醛酮还原酶质量比为30～170：1；
其特征在于，所述海藻酸钠水溶液中还加入有聚乙二醇。
2.根据权利要求1所述的一种还原酶的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇的加入量为醛酮还原酶质量的0.5～10％。
3.根据权利要求1所述的一种还原酶的制备方法，其特征在于，所述海藻酸钠水溶液中还加入的是聚乙二醇6000。
4.根据权利要求1所述的一种还原酶的制备方法，其特征在于，所述海藻酸钠水溶液的质量浓度为1～5％，CaCl2水溶液质量浓度为0.5～4％。
5.根据权利要求1所述的一种还原酶的制备方法，其特征在于，所述醛酮还原酶与葡萄糖脱氢酶质量比为1:1.2。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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