CN117025582A - 一种固定醛缩酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种固定醛缩酶的方法，属于生物工程技术领域，以树脂为固定化载体，包括醛缩酶的构建、环氧树脂载体的修饰和固定化醛缩酶的制备，本发明具体制备方法包括：以环氧官能团的树脂为载体，使用硼酸盐和亚氨基二乙酸修饰环氧基团，接下来用H2SO4水解剩余的环氧基团，用碘酸盐氧化酸解的二醇基为醛基，然后采用金属盐来修饰环氧树脂。最后借助环氧树脂表面的金属离子与还原剂还原希夫碱共价键对醛缩酶进行双官能团固定。本发明使用的树脂进行载体结合法，固定效率更高，更利于重复利用，降低用酶生产成本。

Description

一种固定醛缩酶的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种树脂双官能团固定醛缩酶的方法。
背景技术
酮酸作为一种有生物活性的双官能团物质，在生物体内拥有重要作用的有机酸，在氨基酸新陈代谢和维持氧化还原状态的过程中发挥中心作用。此外，酮酸是有机合成、药物合成及生物合成的重要中间体，在医药、饲料、食品、化学合成等领域有着重要的应用。例如，在医药领域，2-酮基-L-古洛糖酸已被广泛用于合成L-抗坏血酸，复方α-酮酸片用于治疗慢性肾功能衰竭。在化学合成中，酮酸被用作农药，诊断检测试剂，氨基酸和高性能弹性材料的合成前体。随着酮酸应用领域的不断增加，当前国内外市场对酮酸的需求也在随之增加。因此，发展绿色酮酸制备工业已成为国内外研究与产业界人员共同关注的热点。如申请公布号为CN111951898A的发明专利公开了一种筛选能将L-氨基酸转化为2-酮酸酶的方法，其中所述的AT酶(转氨酶)级联反应均为游离酶，无法进行回收。
目前，酮酸的工业化生产方式主要包括化学合成和生物合成。α-酮酸主要由化学合成法生产，该法反应步骤多、环境污染严重、产物得率较低。目前只有少数酮酸的生物合成方法已被应用于工业化生产。虽然酮酸的生物合成方法具有成本低、反应条件温和、环境友好等特点，但一些关键的问题和挑战仍然有待解决，包括不可再生资源的利用、化学途径造成的环境污染，酶法成本过多等，这些问题严重阻碍了酮酸工业的绿色发展。
综合工业化与节约成本等方面，提高生物催化工艺的可持续性，具有十分重大的价值和意义。固定化酶技术(immobilized enzyme)是20世纪60年代发展起来的一种新技术，与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处，呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃，得到迅速发展和广泛的应用，而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。
固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括吸附法，包埋法，酶整体结构保持不变，催化活性得到很好保留。但物理方法对酶结合效率低，在工业化生产中酶容易浸出，导致生产成本较高。如授权公告号为CN106434622B的发明专利中公开了一种共固定化酶的制备方法，所述固定化载体为海藻酸钠凝胶，所述的办法中将海藻酸钠溶液与酶液混合，滴入氯化钙水溶液中，得到固定化酶。然而上述的固定化办法为包埋法，结合效率低，而且固定化酶的机械强度低，容易破裂导致酶浸出。化学法包括结合法、交联法。将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上，使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来，而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种树脂双官能团固定醛缩酶的方法。本发明使用的树脂进行载体结合法，是化学法中一种更为有效、常见的固定化办法。相比于物理吸附法，酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接，固定效率更高，更利于重复利用，降低用酶生产成本。在工业生产、化学分析和医药等方面有诱人的应用前景。
本发明的技术方案是：一种固定醛缩酶的办法，具体包括下列步骤：
步骤1：提取酶液
将如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列(来源于Pseudomonas putida的反式-o-羟基亚苄基丙酮酸水合酶-醛缩酶基因)构建到pET-28a(+)载体上，并转入大肠杆菌中表达，最后用亲和层析纯化得到纯酶液
步骤2：环氧树脂载体的修饰方法
(1)以环氧官能团的树脂为载体，使用硼酸盐和亚氨基二乙酸修饰环氧基团；
所述的硼酸盐溶液包括硼酸钠、硼酸钾
(2)接下来用硫酸水解剩余的环氧基团，用碘酸盐氧化酸解的二醇基为醛基，然后采用金属盐来修饰环氧树脂得到修饰后的环氧树脂；
步骤3：修饰后的环氧树脂对醛缩酶双官能团固定方法
将环氧树脂表面的金属离子(金属盐)与还原剂还原希夫碱共价键对醛缩酶进行双官能团固定；
所述的还原剂包括硼氢化钠、氰基硼氢化钠、硼氢化钾。
优选所述的步骤2中所述的环氧树脂为ES-1、ES-108、ES-103B中的任意一种；所述的碘酸盐包括高碘酸钠、高碘酸钾、高碘酸钡；所述的金属盐溶液包括CaCl2、MgCl2、NiSO4、CuCl2。
优选所述的步骤2中所述的硼酸盐溶液浓度为0.05M～0.5M，pH为7.4～8.5；所述的亚氨基二乙酸浓度为0.1M～1.5M；所述的硫酸溶液浓度为0.5M～3M；所述的碘酸盐溶液浓度为0.05M～0.5M；所述的金属盐溶液浓度为2～15mg/mL。
优选所述的硼酸钠溶液浓度为0.1M，pH为8.5；所述的亚氨基二乙酸浓度为1M；所述的硫酸溶液浓度为2M；
所述的碘酸盐溶液浓度为0.1M；所述的金属盐溶液浓度为10mg/mL。
优选所述的步骤S1的具体步骤如下：
(1)醛缩酶的构建及制备：将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示构建到pET-28a(+)载体上，并转入到大肠杆菌BL 21(DE 3)中；
(2)取步骤(1)构建的NahE至LB培养基，并加入抗生素，培养过夜，再将该菌液转接至TB培养基中，并加入抗生素，振荡培养至OD600达到0.6～0.7，加入IPTG低温诱导；
(3)离心收集湿菌体沉淀，加入磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液以制成菌体悬浮液，然后利用超声波细胞粉碎仪破碎菌体，经冷冻离心后取上清液，即为醛缩酶全细胞裂解液；全细胞裂解液用Ni-NTA亲和层析洗脱杂蛋白再超滤洗脱，得到纯酶液。
优选所述的步骤2环氧树脂载体的修饰方法如下：
(1)取环氧树脂，将硼酸钠、亚氨基二乙酸、氯化盐溶液，依次搅拌树脂后洗涤；
(2)加入H2SO4和碘酸盐搅拌，洗涤过滤；依次与盐溶液、金属盐溶液搅拌后得到修饰后的环氧树脂；
氯化盐包括NaCl、KCl，溶液浓度为250mM～2M，pH为7.0～8.0；盐溶液包括NaCl、KCl、NaHCO3。
优选所述的步骤3修饰后的环氧树脂对醛缩酶双官能团固定方法如下：修饰后的环氧树脂加入醛缩酶和KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液进行孵育，结束后洗涤过滤；加入解吸附溶液缓冲液与还原剂搅拌得到固定化酶；
所述的缓冲液包括NaHCO3、Na2CO3。
优选所述的步骤3中环氧树脂、醛缩酶、KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液的质量与体积比为0.5～2∶1～10∶2～4；所述的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液浓度为50mM～500mM；
所述的解吸附液为EDTA-2Na或EDTA与NaCl的混合液，解吸附液的浓度比为0.01～0.1∶0.5～1：
所述的NaHCO3缓冲液浓度为20mM～200mM；
所述的硼氢化钠质量为5mg～30mg。
优选所述的解吸附液为EDTA-2Na与NaCl的混合液，解吸附液浓度比为0.05～1；
所述的NaHCO3缓冲液浓度为100mM；
所述的硼氢化钠质量为20mg。所述的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液浓度为500mM。
优选所述的步骤1提取酶液的步骤如下：
(1)醛缩酶的构建及制备：将如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列构建到pET-28a(+)载体上，并转入到大肠杆菌BL 21(DE 3)中得到NahE；
(2)取步骤(1)构建的NahE至LB培养基预培养，将预培养液转到TB培养基中培养，加入诱导剂表达，得到菌液；
(3)将菌液离心破碎后，用Ni-NTA亲和层析纯化，得到纯酶液。
SEQ ID NO.1：
氨基酸序列如下：
有益效果：
本发明以环氧树脂作为固定酶载体，经过对环氧树脂的修饰，最终以His-Tag亲和力与共价键双官能团的形式，实现了对醛缩酶的高效固定化。本发明所报道的固定化方法具有较高的恢复活性，与游离酶相比恢复了27％的催化活性。且本方法反应步骤简单，反应条件温和，安全，固定化酶极易与反应体系分离，利用控制反应过程。
此外，本发明中的固定化方法较高地增强了酶的稳定性，在连续运行超过70h后，仍能达到90％以上的转化率，极大的提高了酶的重复利用率，显示出良好的操作稳定性。而且本方法对环境友好，操作过程简单，赋予固定化酶一定的机械强度，更利于工业化生产与运输，具有良好的工业化前景。
附图说明
图1本发明反应式。
图2环氧树脂修饰及过程示意图。
图3修饰后树脂示意图。
图4 1g树脂对酶的固定化效率图。
图5固定化酶的重复利用率评价。
图6为本发明的4-(2-硝基苯基)-2-氧代丁-3-烯酸核H1NMR谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
取构建的NahE甘油菌种50μL接种至5mL LB培养基，并加入终浓度为100δg/mL的卡那霉素，37℃、200rpm振荡培养12h，得到预培养菌液。将5mL预培养菌液转接至500mL TB(含100mL PBS)培养基中，并加入终浓度为100μg/mL的卡那霉素，37℃、200rpm振荡培养约3h至OD600达到0.6～0.7，冷却至培养基温度为4℃时，加入IPTG至终浓度0.3mM进行诱导表达，继续16℃振荡培养18h；
8000～10000rpm离心收集湿菌体，按质量体积比1∶10的比例加入0.05～0.10mol/L、pH 7.0～7.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液以制成菌体悬浮液，然后利用超声波细胞粉碎仪破碎菌体，经冷冻离心后取上清液，即为醛缩酶全细胞裂解液；粗酶液用硫酸镍吸附含His-tag标签的目标蛋白，采用不同浓度的咪唑逐层洗脱杂蛋白，得到目的蛋白，超滤洗脱去除纯酶中残留的咪唑，得到酶液(1.5mg/mL)。
游离态下醛缩酶活力的测定
首先，采用二甲基亚砜制备1M的邻硝基苯甲醛为溶液A，采用50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液制备1M的丙酮酸钠为溶液B。取1mL酶液(1.5mg/mL)于反应管中，采用50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液稀释至1.8mL。加入溶液B150μL，在摇动条件下，逐步滴加50μL溶液A。反应在0.5h、1h、2h取100μL反应液添加200μL甲醇淬灭，过0.45μm滤头用高效液相色谱仪检测转化率。
测得游离酶活性为游离酶比活性为53.8U mg-1。U定义为在参考条件下催化每分钟消耗1μmol底物的酶量。
固定化酶的重复利用率实验
取1000mg固定化酶(固定量为5mg)于反应管中，加入50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液稀释至4.8mL。加入溶液B150μL，在摇动条件下，逐步滴加50μL溶液A。反应时间设置为12h，反应结束后，立即用布氏漏斗将固液分离，取500μL反应液添加500μL甲醇淬灭，过0.45μm滤头用高效液相色谱仪检测转化率。固定化酶用50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤3次，重复上述反应操作过程8次，通过转化率比较固定化酶的重复利用率。
实施例1
1、环氧树脂载体的修饰；
(1)取500mg环氧树脂ES-108，将pH 8.5的0.1M硼酸钠、1M亚氨基二乙酸、500mM pH7.5的氯化钠溶液，依次温和搅拌树脂6h后，用去离子水洗涤；
(2)加入10ml 2M H2SO4温和搅拌2h，用去离子水洗去残留的H2SO4；接着加入10m10.1M NaIO4温和搅拌2h，用去离子水洗涤过滤；取pH 7.5的1M NaCl、10mg/ml NiSO4、500mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液，依次温和搅拌树脂6h后，去离子水洗涤多次，得到修饰后的环氧树脂。
2、修饰后树脂的双官能团固定；
(1)称取0.5g所制备的修饰后的环氧树脂加入5mL纯化的醛缩酶和2mL 100mMpH7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液，孵育20h，用50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤过滤；加入50mM EDTA-2Na、1M NaCl的解吸附溶液孵育1h，用50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤过滤；接着加入20mL的100mM的NaHCO3缓冲液与20mg的硼氢化钠轻晃60min，最后用50mM PH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤过滤，4℃冰箱保存备用。
3、固定化酶反应
取500mg固定化酶于反应管中，加入50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液稀释至1.8mL。加入溶液B150μL，在摇动条件下，逐步滴加50μL溶液A。反应时间设置为6h，反应结束后，取500μL反应液，添加500μL甲醇淬灭，过0.45μm滤头后用高效液相色谱仪检测转化率为99％。
实施例2
1、环氧树脂载体的修饰；
(1)取1000mg环氧树脂ES-108，将pH 8.5的0.1M硼酸钠、1M亚氨基二乙酸、500mMpH 7.5的氯化钠溶液，依次温和搅拌树脂6h后，用去离子水洗涤；
(2)加入10mL 2M H2SO4温和搅拌2h，用去离子水洗去残留的H2SO4；接着加入10ml0.1M NaIO4温和搅拌2h，用去离子水洗涤过滤；取pH 7.5的1M NaCl、10mg/ml NiSO4、500mMpH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液，依次温和搅拌树脂6h后，去离子水洗涤多次，得到修饰后的环氧树脂。
2、修饰后树脂的双官能团固定；
(1)称取1g所制备的修饰后的环氧树脂加入10mL纯化的醛缩酶，孵育20h，用50mMpH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤过滤；加入50mM EDTA-2Na、1M NaCl的解吸附溶液孵育1h，用50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤过滤；接着加入20mL的100mM的NaHCO3缓冲液与30mg的硼氢化钠轻晃90min，最后用50mM PH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤过滤，4℃冰箱保存备用。
3、固定化酶反应
取1000mg固定化酶于反应管中，加入50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液稀释至4.6mL。加入溶液B300μL，在摇动条件下，逐步滴加100μL溶液A。反应时间设置为6h，反应结束后，取500μL反应液，添加500μL甲醇淬灭，过0.45μm滤头后用高效液相色谱仪检测转化率为99％。
实施例3
1、环氧树脂载体的修饰；
(1)取1000mg环氧树脂ES-1，将pH 8.5的0.1M硼酸钠、1M亚氨基二乙酸、500mM pH7.0的氯化钠溶液，依次温和搅拌树脂6h后，用去离子水洗涤；
(2)加入15ml 2M H2SO4温和搅拌1～2h，用去离子水洗去残留的H2SO4；接着加入10ml 0.1M NaIO4温和搅拌1h，用去离子水洗涤过滤；取pH 7.5的1M NaCl、10mg/ml NiSO4、500mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液，依次温和搅拌树脂6h后，去离子水洗涤多次，得到修饰后的环氧树脂。
2、修饰后树脂的双官能团固定；
(1)称取1g所制备的修饰后的环氧树脂加入5mL纯化的醛缩酶和2mL 100mM pH7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液，孵育20h，用50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤过滤；加入50mM EDTA-2Na、1M NaCl的解吸附溶液孵育1h，用50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤过滤；接着加入20mL的100mM的NaHCO3缓冲液与20mg的硼氢化钠轻晃90min，最后用50mM PH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤过滤，4℃冰箱保存备用。
3、固定化酶反应
取1000mg固定化酶于反应管中，加入50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液稀释至4.6mL。加入溶液B300μL，在摇动条件下，逐步滴加100μL溶液A。反应时间设置为6h，反应结束后，取500μL反应液，添加500μL甲醇淬灭，过0.45μm滤头后用高效液相色谱仪检测转化率为99％。
实施例4
1、环氧树脂载体的修饰；
(1)取500mg环氧树脂ES-1，将pH 8.5的0.1M硼酸钠、1M亚氨基二乙酸、500mM pH7.5的氯化钠溶液，依次温和搅拌树脂6h后，用去离子水洗涤；
(2)加入15ml 2M H2SO4温和搅拌1～2h，用去离子水洗去残留的H2SO4；接着加入15ml 0.1M NaIO4温和搅拌2h，用去离子水洗涤过滤；取pH 7.5的1M NaCl、10mg/ml NiSO4、500mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液，依次温和搅拌树脂6h后，去离子水洗涤多次，得到修饰后的环氧树脂。
2、修饰后树脂的双官能团固定；
(1)称取0.5g所制备的修饰后的环氧树脂加入1mL纯化的醛缩酶和4mL 100mM pH7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液，孵育20h，用50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤过滤；加入50mM EDTA-2Na、1M NaCl的解吸附溶液孵育1h，用50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤过滤；接着加入20mL的100mM的NaHCO3缓冲液与25mg的硼氢化钠轻晃80min，最后用50mM PH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤过滤，4℃冰箱保存备用。
3、固定化酶反应
取500mg固定化酶于反应管中，加入50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液稀释至4.2mL。加入溶液B600 μL，在摇动条件下，逐步滴加200μL溶液A。反应时间设置为6h，反应结束后，取500μL反应液，添加500μL甲醇淬灭，过0.45μm滤头后用高效液相色谱仪检测转化率为53％。
实施例5
1、环氧树脂载体的修饰；
(1)取1500mg环氧树脂ES-108，将pH 8.5的0.1M硼酸钠、1M亚氨基二乙酸、500mMpH 7.4的氯化钠溶液，依次温和搅拌树脂6h后，用去离子水洗涤；
(2)加入10ml 2M H2SO4温和搅拌2h，用去离子水洗去残留的H2SO4；接着加入15ml0.1M NaIO4温和搅拌2h，用去离子水洗涤过滤；取pH 7.5的1M NaCl、10mg/ml NiSO4、500mMpH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液，依次温和搅拌树脂6h后，去离子水洗涤多次，得到修饰后的环氧树脂。
2、修饰后树脂的双官能团固定；
(1)称取1.5g所制备的修饰后的环氧树脂加入10mL纯化的醛缩酶，孵育20h，用50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤过滤；加入50mM EDTA-2Na、1M NaCl的解吸附溶液孵育1h，用50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤过滤；接着加入20mL的100mM的NaHCO3缓冲液与30mg的硼氢化钠轻晃90min，最后用50mM PH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤过滤，4℃冰箱保存备用。
3、固定化酶反应
取1500mg固定化酶于反应管中，加入50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液稀释至4.8mL。加入溶液B600μL，在摇动条件下，逐步滴加200μL溶液A。反应时间设置为6h，反应结束后，取500μL反应液，添加500μL甲醇淬灭，过0.45μm滤头后用高效液相色谱仪检测转化率为99％。
实施例6
1、环氧树脂载体的修饰；
(1)取1000mg环氧树脂ES-103B，将pH 8.5的0.1M硼酸钠、1M亚氨基二乙酸、500mMpH 7.0的氯化钠溶液，依次温和搅拌树脂5h后，用去离子水洗涤；
(2)加入10ml 2M H2SO4温和搅拌2h，用去离子水洗去残留的H2SO4；接着加入15ml0.1M NaIO4温和搅拌1h，用去离子水洗涤过滤；取pH 7.5的1M NaCl、10mg/ml NiSO4、500mMpH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液，依次温和搅拌树脂4h后，去离子水洗涤多次，得到修饰后的环氧树脂。
2、修饰后树脂的双官能团固定；
(1)称取1g所制备的修饰后的环氧树脂加入5mL纯化的醛缩酶和2mL 100mM pH7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液，孵育20h，用50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤过滤；加入50mM EDTA-2Na、1M NaCl的解吸附溶液孵育1h，用50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤过滤；接着加入20mL的100mM的NaHCO3缓冲液与23mg的硼氢化钠轻晃75min，最后用50mM PH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤过滤，4℃冰箱保存备用。
3、固定化酶反应
取1000mg固定化酶于反应管中，加入50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液稀释至4.4mL。加入溶液B300μL，在摇动条件下，逐步滴加100μL溶液A。反应时间设置为6h，反应结束后，取500μL反应液，添加500μL甲醇淬灭，过0.45μm滤头后用高效液相色谱仪检测转化率为99％。
实施例7
1、环氧树脂载体的修饰；
(1)取1500mg环氧树脂ES-1，将pH 8.5的0.1M硼酸钠、1M亚氨基二乙酸、500mM pH7.4的氯化钠溶液，依次温和搅拌树脂4.5h后，用去离子水洗涤；
(2)加入15ml 2M H2SO4温和搅拌2h，用去离子水洗去残留的H2SO4；接着加入10ml0.1M NaIO4温和搅拌1h，用去离子水洗涤过滤；取pH 7.5的1M NaCl、10mg/ml NiSO4、500mMpH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液，依次温和搅拌树脂6h后，去离子水洗涤多次，得到修饰后的环氧树脂。
2、修饰后树脂的双官能团固定；
(1)称取1.5g所制备的修饰后的环氧树脂加入1mL纯化的醛缩酶和4mL 100mM pH7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液，孵育20h，用50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤过滤；加入50mM EDTA-2Na、1M NaCl的解吸附溶液孵育1h，用50mMpH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤过滤；接着加入20mL的100mM的NaHCO3缓冲液与26mg的硼氢化钠轻晃60min，最后用50mM PH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤过滤，4℃冰箱保存备用。
3、固定化酶反应
取1500mg固定化酶于反应管中，加入50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液稀释至4.8mL。加入溶液B150μL，在摇动条件下，逐步滴加50μL溶液A。反应时间设置为6h，反应结束后，取500μL反应液，添加500μL甲醇淬灭，过0.45μm滤头后用高效液相色谱仪检测转化率为37％。
实施例8
1、环氧树脂载体的修饰；
(1)取1000mg环氧树脂ES-1，将pH 8.5的0.1M硼酸钠、1M亚氨基二乙酸、500mM pH7.4的氯化钠溶液，依次温和搅拌树脂5h后，用去离子水洗涤；
(2)加入15ml 2M H2SO4温和搅拌1h，用去离子水洗去残留的H2SO4；接着加入15ml0.1M NaIO4温和搅拌1h，用去离子水洗涤过滤；取pH 7.5的1M NaCl、10mg/ml NiSO4、500mMpH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液，依次温和搅拌树脂6h后，去离子水洗涤多次，得到修饰后的环氧树脂。
2、修饰后树脂的双官能团固定；
(1)称取1g所制备的修饰后的环氧树脂加入9mL纯化的醛缩酶，孵育20h，用50mMpH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤过滤；加入50mM EDTA-2Na、1M NaCl的解吸附溶液孵育1h，用50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤过滤；接着加入20mL的100mM的NaHCO3缓冲液与30mg的硼氢化钠轻晃60min，最后用50mM PH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤过滤，4℃冰箱保存备用。
3、固定化酶反应
取1500mg固定化酶于反应管中，加入50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液稀释至4.2mL。加入溶液B600μL，在摇动条件下，逐步滴加200μL溶液A。反应时间设置为6h，反应结束后，取500μL反应液，添加500μL甲醇淬灭，过0.45μm滤头后用高效液相色谱仪检测转化率为99％。
实施例9
1、环氧树脂载体的修饰；
(1)取1100mg环氧树脂ES-1，将pH 8.5的0.1M硼酸钠、1M亚氨基二乙酸、500mM pH7.4的氯化钠溶液，依次温和搅拌树脂5h后，用去离子水洗涤；
(2)加入15ml 2M H2SO4温和搅拌2h，用去离子水洗去残留的H2SO4；接着加入20ml0.1M NaIO4温和搅拌1h，用去离子水洗涤过滤；取pH 7.5的1M NaCl、10mg/ml NiSO4、500mMpH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液，依次温和搅拌树脂5h后，去离子水洗涤多次，得到修饰后的环氧树脂。
2、修饰后树脂的双官能团固定；
(1)称取1g所制备的修饰后的环氧树脂加入10mL纯化的醛缩酶和1mL 100mM pH7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液，孵育20h，用50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤过滤；加入50mM EDTA-2Na、1M NaCl的解吸附溶液孵育1h，用50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤过滤；接着加入20mL的100mM的NaHCO3缓冲液与20mg的硼氢化钠轻晃90min，最后用50mM PH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液洗涤过滤，4℃冰箱保存备用。
3、固定化酶反应
取1100mg固定化酶于反应管中，加入50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液稀释至4mL。加入溶液B750μL，在摇动条件下，逐步滴加250μL溶液A。反应时间设置为6h，反应结束后，取500μL反应液，添加500μL甲醇淬灭，过0.45μm滤头后用高效液相色谱仪检测转化率为99％。
实施例9
固定化酶的活力测定及酶浸出实验
取1000mg固定化酶(固定量为10mg)于反应管中，加入50mM pH 7.4的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液稀释至1.8mL。加入溶液B150μL，在摇动条件下，逐步滴加50μL溶液A。反应在0.5h、1h、2h取100μL反应液添加200μL甲醇淬灭，过0.45μm滤头用高效液相色谱仪检测转化率。同时，反应进行到2h时，取500μL另一份反应液继续摇动2h后，加入500μL甲醇淬灭。过0.45μm滤头用高效液相色谱仪对比转化率，用于判断酶是否浸出。
测得10mg/1000mg固定化酶比活性(U/g)为145.7U g-1，恢复了27％的活性。固定化酶比活性(U/g)定义为每克固定化载体每分钟形成酮酸的μmol。
表1不同种树脂的酶负载量与恢复活性比较
环氧树脂 酶负载量mg/g 恢复活性(％)
ES-1 2mg/g 9
ES-1 8mg/g 13
ES-1 10mg/g 27
ES-1 14mg/g 16
ES-103B 2mg/g 8
ES-103B 8mg/g 5
ES-103B 10mg/g 11
ES-103B 14mg/g 12
ES-108 2mg/g 14
ES-108 8mg/g 20
ES-108 10mg/g 11
ES-108 14mg/g 22

Claims (10)

1.一种固定醛缩酶的方法，其特征在于：包括下列步骤：
步骤1：提取酶液
将如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列构建到pET-28a(+)载体上，并转入大肠杆菌中表达，最后用亲和层析纯化得到纯酶液
步骤2：环氧树脂载体的修饰方法
(1)以环氧官能团的树脂为载体，使用硼酸盐和亚氨基二乙酸修饰环氧基团；
所述的硼酸盐溶液包括硼酸钠、硼酸钾
(2)接下来用硫酸水解剩余的环氧基团，用碘酸盐氧化酸解的二醇基为醛基，然后采用金属盐来修饰环氧树脂得到修饰后的环氧树脂；
步骤3：修饰后的环氧树脂对醛缩酶双官能团固定方法
将环氧树脂表面的金属离子与还原剂还原希夫碱共价键对醛缩酶进行双官能团固定；
所述的还原剂包括硼氢化钠、氰基硼氢化钠、硼氢化钾。
2.根据权利要求1所述的固定醛缩酶的方法，其特征在于：所述的步骤2中所述的环氧树脂为ES-1、ES-108、ES-103B中的任意一种；所述的碘酸盐包括高碘酸钠、高碘酸钾、高碘酸钡；所述的金属盐溶液包括CaCl2、MgCl2、NiSO4、CuCl2。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤2环氧树脂载体的修饰方法如下：
(1)取环氧树脂，将硼酸钠、亚氨基二乙酸、氯化盐溶液，依次搅拌树脂后洗涤；
(2)加入H2SO4和碘酸盐搅拌，洗涤过滤；依次与盐溶液、金属盐溶液搅拌后得到修饰后的环氧树脂；
氯化盐包括NaCl、KCl，溶液浓度为250mM～2M，pH为7.0～8.0；
盐溶液包括NaCl、KCl、NaHCO3。
4.根据权利要求2或3所述的固定醛缩酶的方法，其特征在于：所述的步骤2中所述的硼酸盐溶液浓度为0.05M～0.5M，pH为7.4～8.5；所述的亚氨基二乙酸浓度为0.1M～1.5M；所述的硫酸溶液浓度为0.5M～3M；所述的碘酸盐溶液浓度为0.05M～0.5M；所述的金属盐溶液浓度为2～15mg/mL。
5.根据权利要求4所述的固定醛缩酶的方法，其特征在于：所述的硼酸钠溶液浓度为0.1M，pH为8.5；所述的亚氨基二乙酸浓度为1Mi所述的硫酸溶液浓度为2M；所述的碘酸盐溶液浓度为0.1M；所述的金属盐溶液浓度为10mg/mL。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤3修饰后的环氧树脂对醛缩酶双官能团固定方法如下：修饰后的环氧树脂加入醛缩酶和KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液进行孵育，结束后洗涤过滤；加入解吸附溶液缓冲液与还原剂搅拌得到固定化酶；
所述的缓冲液包括NaHCO3、Na2CO3。
7.根据权利要求6所述的固定醛缩酶的方法，其特征在于：
所述的步骤3中环氧树脂、醛缩酶、KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液的质量与体积比为0.5～2∶1～10∶2～4；所述的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液浓度为50mM～500mM；
所述的解吸附液为EDTA-2Na或EDTA与NaCl的混合液，解吸附液的浓度比为0.01～0.1∶0.5～1；
所述的NaHCO3缓冲液浓度为20mM～200mM；
所述的硼氢化钠质量为5mg～30mg。
8.根据权利要求7所述的固定醛缩酶的方法，其特征在于：
所述的解吸附液为EDTA-2Na与NaCl的混合液，解吸附液浓度比为0.05～1；
所述的NaHCO3缓冲液浓度为100mM；
所述的硼氢化钠质量为20mg；所述的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液浓度为500mM。
9.根据权利要求1所述的固定醛缩酶的方法，其特征在于：所述的步骤1提取酶液的步骤如下：
(1)醛缩酶的构建及制备：将如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列构建到pET-28a(+)载体上，并转入到大肠杆菌BL 21(DE 3)中得到NahE；
(2)取步骤(1)构建的NahE至LB培养基预培养，将预培养液转到TB培养基中培养，加入诱导剂表达，得到菌液；
(3)将菌液离心破碎后，用Ni-NTA亲和层析纯化，得到纯酶液。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤1的具体步骤如下：
(1)醛缩酶的构建及制备：将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示构建到pET-28a(+)载体上，并转入到大肠杆菌BL 21(DE 3)中；
(2)取步骤(1)构建的NahE至LB培养基，并加入抗生素，培养过夜，再将该菌液转接至TB培养基中，并加入抗生素，振荡培养至OD600达到0.6～0.7，加入IPTG低温诱导；
(3)离心收集湿菌体沉淀，加入磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液以制成菌体悬浮液，然后利用超声波细胞粉碎仪破碎菌体，经冷冻离心后取上清液，即为醛缩酶全细胞裂解液；全细胞裂解液用Ni-NTA亲和层析洗脱杂蛋白再超滤洗脱，得到纯酶液。
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